CN117899079A - 癌症的治疗方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了在有此需要的对象中治疗癌症的方法，其通过施用药剂或其药学上可接受的衍生物，任选地与另一药剂一起，诱导非癌性正常细胞产生前列腺凋亡反应‑4(Par‑4)，以促进癌细胞中的凋亡。

Description

癌症的治疗方法

本申请是申请号为201880049507.2、申请日为2018年6月22日、题目为“癌症的治疗方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域：

本发明涉及通过向有此需要的对象施用前列腺凋亡反应-4(PAR-4)诱导剂来治疗对象中的癌症的方法。以足以诱导由细胞产生和/或分泌肿瘤抑制物PAR-4的量，优选以足以抑制癌细胞的增殖和/或转移和/或减少肿瘤复发的量，施用PAR-4诱导剂(通常称为促分泌素(Secretagogues))。该PAR-4诱导剂可在有或无化学治疗剂以及其他抗癌疗法的情况下施用。该PAR-4诱导剂还可任选地与电离辐射一起施用。

发明背景：

癌症的发生和进展是一个多步骤过程，其涉及多种遗传畸变的积累。在这样的畸变中，最值得注意的是凋亡反应的丧失，该反应通常作为内在检查点起作用的，所述检查点针对具有功能失调特征的细胞群体的出现或绕过凋亡信号的促存活机制的获得。凋亡机制的丧失通常导致对癌症疗法的反应消减。因此，研究人员和医师积极寻求杀死癌细胞并诱导肿瘤消退的替代方法或组合方法。

特别难以治疗的是那些与激素有关的癌症和/或转移性癌症。这些癌症包括，例如，前列腺癌、乳腺癌和肺癌。黑色素瘤也难以治疗，并且相对于许多其他癌症而言，其存活率低。

抗癌策略的基本特征为针对癌细胞的选择性作用，而使正常细胞遭受的损害很小或没有损害。但是，癌症疗法的副作用往往是严重的。该副作用包括恶心、呕吐、疼痛、食欲不振、消瘦、恶病质、腹泻、胃内灼热、应激反应(stress)、足底疣(planter warts)、神经死亡-神经病变、辐射烧伤、疲劳、便秘、贫血、焦虑、免疫系统变弱、皮肤干燥、骨髓抑制和脱发。这样，对可以特异性靶向肿瘤细胞而对正常细胞的不良影响最小或对正常细胞没有不良影响的分子的鉴定，构成了癌症研究的重要领域。这种针对肿瘤细胞有选择性作用的分子不仅因其治疗潜力而具有价值；也因其作为用于分析正常细胞和癌细胞之间的基本差异的工具的潜在应用而具有价值。因此，特异性靶向某些类型的激素相关性癌症的治疗方法将是非常有用的。另外，靶向位于高度血管化组织(例如，肺、肾、肝或血液)中的癌症的治疗方法以及靶向难以治疗的癌症(例如，黑素瘤)的方法也将是高度有益的。

发明目的：

本发明的一个目的为提供一种治疗癌症的方法。

本发明的另一目的为提供一种在包含癌细胞和正常细胞的细胞群体中治疗癌症的方法。

本发明的另一目的为提供一种以足够长的时间用有效量的药剂或其药学上可接受的衍生物在包含癌细胞和正常细胞的细胞群体中治疗癌症的方法。

本发明的另一目的为提供一种通过施用PAR-4诱导剂治疗癌症的方法。

本发明的另一目的为提供PAR-4诱导剂用于治疗癌症的用途。

本发明的另一目的为提供一种用于癌症治疗的包含PAR-4诱导剂的药物组合物。

本发明的另一目的为提供PAR-4诱导剂用于在细胞中诱导PAR-4的用途。

本发明的另一目的为提供PAR-4诱导剂用于在细胞中诱导GRP-78的用途。

发明内容：

根据本发明的一方面，提供了一种治疗癌症的方法，其包含施用PAR-4诱导剂。

本发明的另一方面为提供一种在包含癌细胞和正常细胞的细胞群体中治疗癌症的方法。

本发明的另一方面为提供一种以足够长的时间用有效量的药剂或其药学上可接受的衍生物在包含癌细胞和正常细胞的细胞群体中治疗癌症的方法。

根据本发明的另一方面，提供了PAR-4诱导剂用于治疗癌症的用途。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于癌症治疗的包含PAR-4诱导剂的药物组合物。

根据本发明的一个方面，提供了PAR-4诱导剂用于在细胞中诱导PAR-4的用途。

根据本发明的一方面，提供了PAR-4诱导剂用于在细胞中诱导GRP-78的用途。

附图简述：

图1：在小鼠胚胎成纤维细胞中，咯萘啶(Pyronaridine)对PAR-4的剂量依赖性诱导。

图2：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，特康唑(Terconazole)对PAR-4的剂量依赖性诱导。

图3：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞裂解物中，特康唑对PAR-4的诱导。

图4：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，甲氟喹(Mefloquine)对PAR-4的诱导。

图5：相对于载剂处理，在小鼠中，甲氟喹在51.2mg/kg诱导PAR-4的强烈升高。

图6：在卵巢癌细胞系和肾癌细胞系中，甲氟喹对GRP-78的诱导。

图7：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，甲基盐霉素(Narasin)对PAR-4的诱导。

图8：相对于载剂处理，在小鼠中，甲基盐霉素在1.5mg/kg诱导PAR-4的强烈升高。

图9：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液和裂解物中，甲苯咪唑(Mebendazole)对PAR-4的诱导。

图10：在卵巢癌细胞系和肾癌细胞系中，甲苯咪唑对GRP-78的诱导。

图11：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液和裂解物中，他非诺喹(Tafenoquine)对PAR-4的诱导。

图12：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液和裂解物中，他非诺喹对PAR-4的剂量依赖性诱导。

图13：在卵巢癌细胞系和肾癌细胞系中，他非诺喹对GRP-78的诱导。

图14：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，米诺地尔(Minoxidil)对PAR-4的诱导。

图15：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，萘啶酸(Nalidixic Acid)对PAR-4的诱导。

图16：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，司帕沙星(sparfloxacin)对PAR-4的诱导。

图17：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，吡哌酸(Pipemidic Acid)对PAR-4的诱导。

图18：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，洛匹那韦(Lopinavir)对PAR-4的诱导。

图19：在小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，氧氟沙星(Ofloxacin)对PAR-4的诱导。

发明详述：

肿瘤抑制物PAR-4(前列腺凋亡反应-4)在癌细胞中而不在正常细胞中诱导凋亡细胞死亡。这种癌症选择性作用归因于其位于中心的SAC结构域(EI-Guendy et al.(2003)"Identification of a unique core domain of PAR-4sufficient for selectiveapoptosis-induction in cancer cells."Mol.Cell.Biol.23,5516-5525)。

PAR-4蛋白不仅具有细胞内功能，而且还被正常细胞和癌细胞分泌(Burikhanovet al.(2009)."The tumor suppressor PAR-4activates an extrinsic pathway forapoptosis"Cell 138,377-388)。分泌的PAR-4与其受体GRP-78结合，后者在癌细胞表面上调，并诱导凋亡(Burikhanov et al.(2009)；Bhattarai,T,and Rangnekar VM(2010)"Cancer-selective apoptotic effects of extracellular and intracellular PAR-4"Oncogene 29,3873-3880)。正常细胞分泌的PAR-4的基础水平不足以诱导癌细胞凋亡或抑制肿瘤的生长(Burikhanov et al.(2009))。但是，通过在小鼠中注射重组PAR-4产生的细胞外PAR-4水平升高，造成对转移性肺肿瘤的抑制(Zhao et al.(2011)"Systemic PAR-4inhibits metastatic tumor growth".Cancer Biol Ther.12,152-157)。有若干未经FDA批准的小分子，例如Nutlin-3a、PS-1145和Arylquin-1(INV13/1947)，其可以增加从小鼠中正常细胞中分泌PAR-4，并且来自这些小鼠的血清在癌细胞培养物中诱导离体凋亡(Burikhanov et al.(2014)"Paracrine apoptotic effect of p53 mediated by tumorsuppressor PAR-4".Cell Reports 6,271-277；以及Burikhanov et al.,"Arylquin-1targets vimentin to trigger PAR-4secretion for tumor cell apoptosis"NatureChem Biol.10,924-926(2014))。

根据本发明，PAR-4诱导剂为那些诱导从正常细胞分泌PAR-4的分子，所述PAR-4在癌细胞中而不在正常细胞中特异性地诱导凋亡细胞死亡。

根据本发明，PAR-4诱导剂为阿达帕林(Adapalene)、甲基盐霉素、甲氟喹、甲苯咪唑、特康唑、咯萘啶、他非诺喹、米诺地尔、萘啶酸、司帕沙星、吡哌酸、洛匹那韦和氧氟沙星。

出人意料的是，发明人发现阿达帕林、甲基盐霉素、甲氟喹、甲苯咪唑、特康唑、咯萘啶、他非诺喹、米诺地尔、萘啶酸、司帕沙星、吡哌酸、洛匹那韦和氧氟沙星被发现具有PAR-4诱导活性。特别是，本文描述了阿达帕林、甲基盐霉素、甲氟喹、甲苯咪唑、特康唑、咯萘啶、他非诺喹、米诺地尔、萘啶酸、司帕沙星、吡哌酸、洛匹那韦和氧氟沙星(包括其多种盐形式)的出人意料的作用为诱导从人和小鼠细胞中强烈的PAR-4产生，并且可用于在有此需要的对象中抑制癌细胞的增殖和/或转移，并抑制复发性肿瘤的形成。

本文描述了利用从细胞分泌的PAR-4来诱导凋亡和抑制癌细胞的肿瘤生长的能力的方法。在本文所述的方法中，本发明的另一方面为通过向对象施用有效量的PAR-4诱导剂来治疗具有癌细胞的对象的方法，所述癌细胞是p53缺陷型但仍然意外地响应于暴露于PAR-4而发生凋亡。有效量的PAR-4诱导剂足以使细胞分泌PAR-4增加至这样的水平，该水平诱导癌细胞凋亡和/或抑制该癌细胞的增殖和/或抑制该癌细胞的转移。在一实施方式中，本发明的方法包括使包含癌细胞和正常细胞的细胞群体与有效量的PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物接触，其中用有效量的PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物进行的治疗杀死癌细胞、抑制癌细胞增殖、癌细胞转移和/或一种或多种肿瘤的复发。

p53缺陷型癌细胞可具有p53缺陷型基因型或表型。为了本文所述的目的，p53缺陷型癌细胞具有例如p53基因内的突变，例如该基因的部分或全部的插入、缺失，取代等，使得没有p53产生或产生突变的p53(例如不能有效结合DNA的突变的p53)。

前列腺凋亡反应-4(PAR-4)是在经历凋亡的前列腺癌细胞中鉴定的促凋亡基因。PAR-4蛋白存在于细胞质、内质网和细胞核中。在羧基末端包含一个亮氨酸拉链结构域的PAR-4蛋白在细胞核中起转录阻遏物的作用。在细胞核中，PAR-4与转录因子WT1相互作用以抑制抗凋亡蛋白Bcl2，并且PAR-4也抑制拓扑异构酶TOPI。在细胞质中，PAR-4可以由Akt和ζPKC激酶调节，并可以抑制转录因子NFκB来促进细胞死亡。PAR-4在多种癌细胞中诱导凋亡但不在正常细胞中诱导凋亡。PAR-4在正常细胞和组织中普遍表达。胞内PAR-4在PAR-4的SAC(在癌细胞中选择性诱导凋亡)结构域中发现的特异性T155残基处被蛋白激酶A(PKA)磷酸化。Thrl55残基的磷酸化使Fas/FasL转运至质膜。Fas/FasL与FADD相互作用导致Fas/FasL-FADD-半胱天冬酶8凋亡死亡途径的激活。正常细胞中PKA的基础水平不足以引起T155磷酸化，从而使正常细胞对PAR-4介导的凋亡具有抗性。

细胞外PAR-4与其在癌细胞表面的受体GRP-78结合并诱导凋亡。相反，正常细胞表达低至不可检测水平的基础或可诱导细胞表面GRP-78，并且对由细胞外PAR-4的凋亡具有抗性。GRP-78，以前称为促存活蛋白，参与PAR-4和TRAIL诱导的细胞凋亡信号传导。TRAIL结合细胞表面受体，例如DR5和DR4，该细胞表面受体在DISC(诱导死亡的信号传导复合物)中募集FADD和半胱天冬酶8来引发外源性细胞死亡。细胞内和分泌的PAR-4均通过半胱天冬酶依赖性机制在凋亡诱导中起作用。

由于由正常细胞分泌的PAR-4的基线水平通常不足以在癌细胞培养物中引起大量凋亡，激励PAR-4释放的促分泌素(secretogogue)构成一种重要的治疗进展。Nutlin-3a，最初是作为MDM2抑制剂开发的，其在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞中以微摩尔水平刺激PAR-4分泌。

PAR-4与波形蛋白共定位。波形蛋白为在间充质细胞中表达的III型中间丝(IF)蛋白质，并且其为间充质细胞的主要细胞骨架组分。引起刺激PAR-4分泌的促分泌素(如nutlin/arylquin 1)通过与波形蛋白结合并释放与波形蛋白结合的PAR-4以分泌来表现出该功能。这种分泌的PAR-4与其受体GRP-78结合，后者在癌细胞表面上调，并诱导凋亡。有若干未经FDA批准的小分子，其可以增加从小鼠正常细胞中PAR-4的分泌，并且来自这些小鼠的血清在癌细胞培养物中诱导离体凋亡。

根据本发明的一方面，出人意料地发现PAR-4诱导剂在体外和体内均被发现促进PAR-4的分泌。

咯萘啶描述于Croft et al Malar.J,2012,11,270，其通过引用整体并入本文。

甲基盐霉素及其生物学活性描述于Miller et.al Biochem Pharmacol.2010年5月1日；79(9):1272-1280，其通过引用整体并入本文。

阿达帕林及其生物学活性描述于Piskin&Uzunali Therapeutics and ClinicalRisk Management 2007:3(4)621-624，其通过引用整体并入本文。

甲苯咪唑描述于美国专利号3,657,267和Brugmans et al.,J.Am.Med.Assoc.217,313(1971)，其通过引用整体并入本文。

甲氟喹及其制备最早由Ohnmacht等人于1971年描述(J.Med.Chem.1971,14,926)。1974年，Carroll和Blackwell给出了甲氟喹的异构体的立体化学、合成和抗疟疾活性的更详细的说明(J.Med.Chem.1974,17,210-219)。这些参考文献通过引用整体并入本文。

特康唑描述于美国专利号4,223,036，其通过引用整体并入本文。

他非诺喹描述于美国专利号4,617,394，其通过引用整体并入本文。

米诺地尔描述于美国专利号3,382,247，其通过引用整体并入本文。

萘啶酸描述于美国专利号3,590,036，其通过引用整体并入本文。

司帕沙星描述于美国专利号4,795,751，其通过引用整体并入本文。

吡哌酸描述于美国专利号3,887,557，其通过引用整体并入本文。

洛匹那韦描述于美国专利号5,914,332，其通过引用整体并入本文。

氧氟沙星描述于美国专利号4,382,892，其通过引用整体并入本文。

本文描述的本发明的一方面为一种用PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物以及其他促进由正常细胞产生PAR-4的药剂以增加癌细胞的凋亡并减少癌细胞的转移和增殖和/或存活来治疗有此需要的对象的方法。

通过本发明，PAR-4诱导剂的其药学上可接受的衍生物可包括其这样的药学上可接受的衍生物，该药学上可接受的衍生物具有的体外和/或体内药理活性类似于本文所述的PAR-4诱导剂的药理活性。这种其药学上可接受的衍生物对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可以基于本领域的知识由本领域技术人员容易地制备。

术语“PAR-4诱导剂”在广义上使用来不仅包括“PAR-4诱导剂”本身，还包括其药学上可接受的衍生物。合适的药学上可接受的衍生物包括药学上可接受的盐、药学上可接受的溶剂化物、药学上可接受的水合物、药学上可接受的无水物、药学上可接受的对映异构体、药学上可接受的酯、药学上可接受的同分异构体、药学上可接受的多晶型物、药学上可接受的前药、药学上可接受的互变异构体、药学上可接受的复合物等。

本发明包括一种杀死癌细胞的方法，例如通过在对象中诱导凋亡或抑制癌细胞增殖、癌细胞转移和/或肿瘤复发，该方法包括将有效量的药剂施用于需要治疗的对象足够的时间以增加所述对象中从正常细胞的前列腺凋亡反应4(PAR-4)的分泌，其中该药剂为PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物，并且其中该药剂可以或可以不与化学治疗剂一起施用。

术语“化学治疗剂”可以与“抗癌剂”同义使用，并且在广义上使用来不仅包括DNA-相互作用剂、抗代谢剂、微管蛋白-相互作用剂、激素剂及其他诸如天冬酰胺酶或羟基脲。

在本发明的方法中，PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物包含使包含癌细胞和正常细胞的细胞群体与有效量的药剂或其药学上可接受的衍生物接触足够的时间，包含通过任何合适的施用途径以有效量(例如，足以提高PAR-4表达和/或分泌水平至高于施用所述PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物之前由细胞表达、分泌或两者的PAR-4水平的量)施用于有此需要的对象。在另一方面，PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物的有效量为足以在所述对象中增加癌细胞的凋亡和/或减少癌细胞的增殖和/或减少癌细胞的转移的量。优选地，所述PAR-4诱导剂或其盐或其药学上可接受的衍生物以在癌细胞中诱导凋亡的量施用。

作为非限制性实例，与细胞接触的PAR-4诱导剂的有效量可包括例如约10nM至约1000μM、约200nM至约100μM、约150nM至约75μM、约100nM至约50μM、约100nM至约40μM、约100nM至约35μM、约100nM至约30μM、约100nM至约25μM。

在多种实施方式中，将有效量的PAR-4诱导剂与细胞接触至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约5天、至少约1周、至少约2周或超过2周。

通过进一步的非限制性实例，向有此需要的对象施用的PAR-4诱导剂的有效量可包括每天约0.1-2000mg、每天约100-1500mg、每天约150-1200mg、每天约200-1200mg、每天约100mg、每天约200mg、每天约300mg、每天约400mg、每天约500mg、每天约750mg、每天约1000mg、每天约1200mg或每天超过约1200mg。

在多种实施方式中，将有效量的PAR-4诱导剂向有此需要的对象施用1天、2天、5天、约1周、约2周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约6个月、至少约8个月、至少约1年或超过1年。理解的是，治疗的持续时间将取决于癌症的阶段以及癌症是否已经缓解。

术语有效量所涵盖的实际量将取决于施用途径、所治疗的对象的类型以及所考虑的具体对象的身体特征，例如其年龄、体重、疾病的严重程度、合并症。这些因素及其与确定该量的关系对于医学领域和其他相关领域的技术人员来说是众所周知的，并且本领域技术人员可以容易地确定要施用于对象的PAR-4诱导剂的适当有效剂量以达到期望的PAR-4分泌水平。同样，本领域技术人员可以容易地确定给药方案。

优选地，PAR-4诱导剂可通过本领域当前使用的任何方式(例如，口服、皮下、透皮、静脉内、肌内、肠胃外、直肠、鼻内、肿瘤内等)施用于所述对象。例如，PAR-4诱导剂可以以任何药学上可接受的形式(例如，以片剂、胶囊剂、糖浆剂或酏剂的形式)口服施用于所述对象，或通过例如腹膜内或静脉内或肌肉内的途径输注或注射，并且以足以增加所述对象中PAR-4的水平的量，优选至足以杀死癌细胞(例如，诱导癌细胞中的凋亡)和/或抑制增殖和/或抑制转移的水平。药学上可接受的形式还可包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂在本领域中是已知的，例如在例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaroedit.1985)中描述的那些，该文献通过引用并入本文。

优选地，PAR-4诱导剂可以以药物组合物的形式提供，例如但不限于单位剂型，包括片剂、胶囊剂(填充有粉末、小丸(pellet)、小珠、迷你片、丸(pill)、微丸(micro-pellet)、小型片剂单位、多单位颗粒系统(multiple unit pellet system，MUPS)、崩解片、分散片、颗粒、和微球、多微粒(multiparticulate))、小袋(sachet)(填充有粉末、小丸、小珠、迷你片、丸、微丸、小型片剂单位、MUPS、崩解片、分散片、颗粒、和微球、多微粒)、用于重建的粉末(powder for reconstitution)和撒剂(sprinkle)，还有，其他剂型例如控释制剂、冻干制剂、调释制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、双重释放制剂等。液体或半固体剂型(液体剂、悬浮剂、溶液剂、分散剂、膏剂、霜剂、乳剂、微乳剂、喷雾剂、点滴剂(spot-on)等)、注射剂、肠胃外剂型、局部剂型、吸入剂型、口腔剂型、鼻剂型等也可以设想在本发明的范围内。

本发明的发明人还发现，通过纳米化改善PAR-4诱导剂的溶解性质，从而导致更好的生物利用度并降低药物剂量。

在一实施方式中，PAR-4诱导剂可以以平均颗粒大小小于2000nm的纳米颗粒形式存在。

合适的赋形剂可用于配制根据本发明的剂型，例如，但不限于，表面稳定剂或表面活性剂、粘度调节剂、包括延长释放聚合物的聚合物、稳定剂、崩解剂或超崩解剂、稀释剂、增塑剂、粘合剂、助流剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、抗结块剂、遮光剂、抗微生物剂、消泡剂、乳化剂、缓冲剂、着色剂、载体、填充剂、抗粘剂、溶剂、掩味剂、防腐剂、抗氧化剂、质地增强剂、表面稳定剂、通道形成剂(channeling agent)、包衣剂或其组合。

所治疗的癌细胞和癌症可为任何类型，例如，但不限于，肉瘤、癌(Carcinoma)、白血病、生殖细胞瘤、母细胞瘤和淋巴瘤和骨髓瘤和/或其任意组合。

在本发明的一实施方式中，癌细胞或肿瘤位于高度血管化的组织中。在本发明的上下文中，高度血管化的组织包括具有超过一般血管化的任何组织。例如，但不限于，高度血管化的组织包括血液、肺、肝、皮肤或肾。

位于高度血管化组织中的癌细胞或癌可起源于该高度血管化组织或另一个高度血管化组织，或者可已经通过转移从任何其他组织来到高度血管化组织。

优选地，PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物可以或可以不与化学治疗剂或其他抗癌药物共同施用。

本发明的方法还可包括用PAR-4诱导剂以及有效量的电离辐射进行治疗。电离辐射已用于治疗多种癌症，包括黑色素瘤(Khan et al.Onco Targets Ther.2011；4:137-148)。电离辐射的有效量可包括足以杀死癌细胞，抑制癌细胞增殖、癌细胞转移和/或一种或多种肿瘤复发的任何量。在一实施方式中，有效量为约1-5Gy的辐射、2-4Gy的辐射或约2Gy、约3Gy、约4Gy或约5Gy的辐射。电离辐射的有效量对本领域技术人员将是显而易见的，并且在优选的实施方式中，其为小于在没有用PAR-4诱导剂治疗的情况下杀死癌细胞，抑制癌细胞增殖、癌细胞转移和/或一种或多种肿瘤复发所需的电离辐射的量。

有效量的PAR-4诱导剂可与电离辐射治疗共同施用。与用相同量的电离辐射但未用PAR-4诱导剂治疗而治疗的有此需求的相似对象相比，将辐射治疗与施用PAR-4诱导剂一起而改善的有效性可体现为癌细胞杀伤(例如癌细胞凋亡)、癌细胞的增殖抑制或癌细胞的转移抑制的提高。可选地或额外地，将辐射治疗与施用PAR-4诱导剂一起而改善的有效性可体现为以比以往实现这种抗癌作用所需的电离辐射的减少的量来实现癌细胞杀伤(例如癌细胞凋亡)、癌细胞增殖抑制或癌细胞转移抑制。在一实施方式中，PAR-4诱导剂治疗和电离辐射的效果出乎意料地超过相加。

需要治疗的对象为患有癌症的对象、已经针对癌症进行了治疗并且处于缓解或无癌症的对象或者患有复发性癌症的对象。癌症可为任何癌症，包括但不限于，例如前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌(例如黑素瘤)和/或肺癌，或本文公开的任何癌症。癌症可为雄激素非依赖性前列腺癌，不表达或表达低水平的PAR-4的乳腺癌，高度侵袭性、雌激素受体阴性、高级别(3级)或基底样肿瘤的乳腺癌，或非小细胞肺癌，小细胞肺癌或肺类癌肿瘤或脑瘤。癌症可为黑色素瘤，例如浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤或促纤维增生性黑色素瘤(desmoplastic melanoma)。需要治疗的对象还可包括需要预防性治疗的对象，其中需要预防性治疗的对象会是，例如，当前未患癌症但与一般群体发展该癌症的风险相比，已确定具有发展癌症(特别是前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌或肺癌或本文所述的任何癌症)的更高风险的对象。

本发明的另一方面还包括用于减少癌症复发的方法，该方法包括以足以减少该对象癌症复发的量将PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物，与化学治疗剂一起或不与化学治疗剂一起，施用于有此需要的对象。在本文所述的方法中，可将PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物与增加PAR-4的产生和/或分泌的另一种药剂组合施用于有此需要的对象。

本发明的另一方面为一种预防性降低对象发展癌症的风险的方法，该方法包括将PAR-4诱导剂或其药学上可接受的衍生物施用于有此需要的对象，以将从正常细胞的PAR-4表达提高至增强癌细胞凋亡的水平。

理解的是，在一些实施方式中，本发明的方法可包括如下步骤：通过识别患有本文所述的癌症的对象或已经针对该癌症进行过治疗且处于缓解或无癌症的对象或具有复发性癌症的对象或需要预防性治疗的对象来选择有此需要的对象，以及然后将有效量的PAR-4诱导剂，与有效量的其他抗癌剂或电离辐射或其组合一起或不与有效量的其他抗癌剂或电离辐射或其组合一起施用于本文所述的这样的对象。

下列模型和实施例仅出于说明本发明的目的，且不旨在以任何方式限制本发明的范围。

实施例1.咯萘啶在体外诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查咯萘啶诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：

从指数期培养物中收获小鼠胚胎成纤维细胞。24h的恢复期使细胞恢复指数生长后，将细胞用25μM咯萘啶处理，然后再进行18-21h的孵育。通过用特异于PAR-4和肌动蛋白的抗体对样品进行免疫印迹分析，检查细胞上清液和细胞裂解物中PAR-4的诱导。还对样品进行SDS/PAGE和考马斯亮蓝染色，以确定来自条件培养基(CM)的血清中的白蛋白水平作为另一种上样对照。

结果：

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，咯萘啶能够以剂量依赖性方式诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图1所示。

实施例2.特康唑在体外诱导PAR-4：

目的：

本研究的目的为检查特康唑诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：

从指数期培养物中收获小鼠胚胎成纤维细胞。24h的恢复期使细胞恢复指数生长后，将细胞用25μM特康唑处理，然后再进行18-21h的孵育。通过用特异于PAR-4和肌动蛋白的抗体对样品进行免疫印迹分析，检查细胞上清液和细胞裂解物中PAR-4的诱导。还对样品进行SDS/PAGE和考马斯亮蓝染色，以确定来自CM的血清中的白蛋白水平作为另一种上样对照。

结果：

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，特康唑能够以剂量依赖性方式诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图2和图3所示。

实施例3.甲氟喹在体外诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查甲氟喹诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：

从指数期培养物中收获小鼠胚胎成纤维细胞。24h的恢复期使细胞恢复指数生长后，将细胞用25μM甲氟喹处理，然后再进行18-21h的孵育。通过用特异于PAR-4和肌动蛋白的抗体对样品进行免疫印迹分析，检查细胞上清液和细胞裂解物中PAR-4的诱导。还对样品进行SDS/PAGE和考马斯亮蓝染色，以确定来自细胞上清液的血清中的白蛋白水平作为另一种上样对照。还检查了小鼠胚胎成纤维细胞中甲氟喹对PAR-4的剂量依赖性诱导。

结果：

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，甲氟喹能够诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图4所示。

实施例4.甲氟喹在体内诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查甲氟喹在C57/BL6小鼠中全身性诱导PAR-4分泌的能力。

方法：

给免疫活性小鼠连续3天口服施用10mg/kg和51.2mg/kg体重的甲氟喹或载剂，然后在24小时后采血，分离血清并测试全身PAR-4水平。

结果：

相对于载剂处理，甲氟喹在小鼠血清中并且在51.2mg/kg下诱导PAR-4的强烈升高。结果如图5所示。

实施例5.甲氟喹在体外诱导GRP-78

目的：

本研究的目的为检查甲氟喹在人卵巢癌细胞系和肾癌细胞系中诱导GRP-78表达的能力。

方法

从指数期培养物中收获人卵巢癌细胞系SKOV-3和肾癌细胞系786-O。24h的恢复期使细胞恢复指数生长后，将细胞用25μM甲氟喹处理，然后再进行18-21h的孵育。通过用特异于GRP-78的抗体对样品进行免疫印迹分析，检查细胞裂解物中对GRP-78表达的诱导。

结果

在25μM的测试浓度下，甲氟喹在SKOV-3和786-O中均诱导GRP-78表达。结果如图6所示。

实施例6.甲基盐霉素在体外诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查甲基盐霉素诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：

从指数期培养物中收获小鼠胚胎成纤维细胞。24h的恢复期使细胞恢复指数生长后，将细胞用25μM甲基盐霉素处理，然后再进行18-21h的孵育。通过用特异于PAR-4和肌动蛋白的抗体对样品进行免疫印迹分析，检查细胞上清液和细胞裂解物中PAR-4的诱导。还对样品进行SDS/PAGE和考马斯亮蓝染色，以确定来自CM的血清中的白蛋白水平作为另一种上样对照。

结果：

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，甲基盐霉素能够诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图7所示。

实施例7.甲基盐霉素在体内诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查甲基盐霉素在C57/BL6小鼠中全身性诱导PAR-4分泌的能力。

方法：

给免疫活性小鼠连续3天口服施用1.5mg/kg体重的甲基盐霉素或载剂，然后在24小时后采血，分离血清并测试全身PAR-4水平。

结果：

相对于载剂处理，甲基盐霉素诱导在小鼠血清中PAR-4的强烈升高。结果如图8所示。

实施例8.甲苯咪唑在体外诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查甲苯咪唑诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：

从指数期培养物中收获小鼠胚胎成纤维细胞。24h的恢复期使细胞恢复指数生长后，将细胞用25μM甲苯咪唑处理，然后再进行18-21h的孵育。通过用特异于PAR-4和肌动蛋白的抗体对样品进行免疫印迹分析，检查细胞上清液和细胞裂解物中PAR-4的诱导。还对样品进行SDS/PAGE和考马斯亮蓝染色，以确定来自细胞上清液的血清中的白蛋白水平作为另一种上样对照。还检查了小鼠胚胎成纤维细胞中甲苯咪唑对PAR-4的剂量依赖性诱导。

结果：

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，甲苯咪唑能够诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图9所示。

实施例9.甲苯咪唑在体外诱导GRP-78

目的：

本研究的目的为检查甲苯咪唑在人卵巢癌细胞系和肾癌细胞系中诱导GRP-78表达的能力。

方法：

从指数期培养物中收获人卵巢癌细胞系SKOV-3和肾癌细胞系786-O。24h的恢复期使细胞恢复指数生长后，将细胞用25μM甲苯咪唑处理，然后再进行18-21h的孵育。通过用特异于GRP-78的抗体对样品进行免疫印迹分析，检查细胞裂解物中对GRP-78表达的诱导。

结果：

在25μM的测试浓度下，甲苯咪唑在SKOV-3和786-O中均诱导GRP-78表达。结果如图10所示。

实施例10.他非诺喹在体外诱导PAR-4

目的

本研究的目的为检查他非诺喹诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：

从指数期培养物中收获小鼠胚胎成纤维细胞。24h的恢复期使细胞恢复指数生长后，将细胞用25μM他非诺喹处理，然后再进行18-21h的孵育。通过用特异于PAR-4和肌动蛋白的抗体对样品进行免疫印迹分析，检查细胞上清液和细胞裂解物中PAR-4的诱导。还对样品进行SDS/PAGE和考马斯亮蓝染色，以确定来自细胞上清液的血清中的白蛋白水平作为另一种上样对照。还检查了小鼠胚胎成纤维细胞中他非诺喹对PAR-4的剂量依赖性诱导。

结果：

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，他非诺喹能够诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图11&12所示。

实施例11.他非诺喹在体外诱导GRP-78

目的

本研究的目的为检查他非诺喹在人卵巢癌细胞系和肾癌细胞系中诱导GRP-78表达的能力。

方法

从指数期培养物中收获人卵巢癌细胞系SKOV-3和肾癌细胞系786-O。24h的恢复期使细胞恢复指数生长后，将细胞用25μM他非诺喹处理，然后再进行18-21h的孵育。通过用特异于GRP-78的抗体对样品进行免疫印迹分析，检查细胞裂解物中对GRP-78表达的诱导。

结果

在25μM的测试浓度下，他非诺喹在SKOV-3和786-O中均诱导GRP-78表达。结果如图13所示。

实施例12.米诺地尔在体外诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查米诺地尔诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：实验按照实施例1中设定的方法进行。

结果：

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，米诺地尔能够诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图14所示。

实施例13.萘啶酸在体外诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查萘啶酸诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：实验按照实施例1中设定的方法进行。

结果

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，萘啶酸能够诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图15所示。

实施例14.司帕沙星在体外诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查司帕沙星诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：实验按照实施例1中设定的方法进行。

结果

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，司帕沙星能够诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图16所示。

实施例15.吡哌酸在体外诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查吡哌酸诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：实验按照实施例1中设定的方法进行。

结果

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，吡哌酸能够诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图17所示。

实施例16.洛匹那韦在体外诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查洛匹那韦诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：实验按照实施例1中设定的方法进行。

结果

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，洛匹那韦能够诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图18所示。

实施例17.氧氟沙星在体外诱导PAR-4

目的：

本研究的目的为检查氧氟沙星诱导从小鼠胚胎成纤维细胞分泌PAR-4的能力。

方法：实验按照实施例1中设定的方法进行。

结果

在来自正常小鼠胚胎成纤维细胞的细胞上清液中，氧氟沙星能够诱导强烈的PAR-4分泌。结果如图19所示。

将对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方式和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念采取修改和变型，并且这种修改和变型被认为落入本发明的范围内。

可理解的是，本文所使用的措词和术语是出于描述的目的，并且不应被认为是限制性的。本文中“包括(including)”、“包含(comprising)”或“具有(having)”及其变体的使用意在涵盖其后列出的项及其等同物以及额外的项。

Claims (13)

1.咯萘啶在制备诱导剂中的用途，其中所述诱导剂诱导从正常细胞分泌前列腺凋亡反应-4(PAR-4)，所述PAR-4在癌细胞中但不在正常细胞中诱导凋亡细胞死亡。

2.权利要求1的用途，其中所述诱导剂的有效量为10nM至1000μM。

3.权利要求2的用途，其中所述诱导剂的有效量为100nM至25μM。

4.权利要求1的用途，其中所述诱导剂的有效量为每天0.1mg至2000mg。

5.权利要求1的用途，其中将所述诱导剂与包含癌细胞和正常细胞的细胞群体接触至少2小时。

6.权利要求1的用途，其中所述癌细胞为p53缺陷型。

7.权利要求1的用途，其中所述诱导剂为片剂、胶囊剂、糖浆剂、酏剂、输注剂或注射剂的形式。

8.权利要求1的用途，其中所述诱导剂为平均颗粒大小小于2000nm的纳米颗粒形式。

9.权利要求1的用途，其中所述癌细胞为肉瘤、癌、白血病、生殖细胞瘤、母细胞瘤、淋巴瘤、骨髓瘤癌细胞或其任意组合。

10.权利要求1的用途，其中所述癌细胞位于高度血管化的组织中。

11.权利要求1的用途，其中所述诱导剂与至少一种其他癌症疗法组合施用。

12.权利要求11的用途，其中所述其他癌症疗法包括(i)与其他化学治疗剂共同施用、(ii)对患者施用电离辐射、或(iii)施用额外的PAR-4诱导剂。

13.权利要求1的用途，其中所述癌症可为前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌或其任意组合。