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CN117866866A - 一种利用富马酸生产依克多因的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种利用富马酸生产依克多因的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 Download PDF

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CN117866866A
CN117866866A CN202410056944.4A CN202410056944A CN117866866A CN 117866866 A CN117866866 A CN 117866866A CN 202410056944 A CN202410056944 A CN 202410056944A CN 117866866 A CN117866866 A CN 117866866A
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escherichia coli
ectoin
fermentation
gene
glucose
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徐顺清
储消和
陈万河
叶开
沈建
熊莉
范俊颖
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Zhejiang Lyuchuang Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Lyuchuang Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明利用代谢工程和合成生物学技术，在嗜盐菌依克多因生物合成途径基础上，用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)做为底盘表达细胞，表达了嗜盐菌来源的依克多因合成基因簇ectA、ectB、ectC，实现依克多因的异源生物合成；在依克多因原始重组菌中加强表达了大肠杆菌来源的天冬氨酸酶基因aspA、天冬氨酸激酶基因ask和天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd，最终获得了能够从富马酸高效生物合成依克多因的重组大肠杆菌。该基因工程菌表现出优良的依克多因生产性能，补葡萄糖和富马酸铵连续补料发酵，产量可以达30.8g/L，生产效率0.616g/L/h，比产量0.6864g/g DCW，葡萄糖转化率0.201g/g，富马酸转化率23.7％。该依克多因基因工程菌株有很好的工业应用前景。

Description

一种利用富马酸生产依克多因的重组大肠杆菌及其构建方法 和应用
技术领域
本发明具体涉及一种利用富马酸生产依克多因的重组大肠杆菌及其构建方法和应用，属于基因工程和生物技术领域。
背景技术
依克多因(Ectoine)化学名称为1,4,5,6-四氢-2-甲基4-嘧啶羧酸。商品名：依克多因。它是一种杂环氨基酸衍生物，具有强极性且易溶于水的特性，能够稳定细胞膨胀压力但不影响细胞正常生理功能，从而能够维持细胞与环境的渗透平衡。由于依克多因可以在蛋白质等生物大分子表面形成水化层，因此它可以作为细胞及大分子物质的生物保护剂，可缓解和减轻高渗、高温、冻融、干燥、辐射和化学试剂等不良环境对蛋白、核酸、生物膜及整个细胞的毒害作用。由于依克多因是目前所有己知的相容性溶质中对生物细胞及大分子物质保护效果最好的化合物，所以近年来它广泛应用于在化妆品、生物技术和医药行业等领域。因此如何高效生产制备依克多因成为当前的研究热点。
依克多因(Ectoine)
依克多因的主要生产方法主要有微生物发酵法和活细胞转化法。传统的微生物发酵法是利用嗜盐微生物在高盐培养条件下采用“挤奶”工艺进行依克多因生产，但此方法生产过程中会产生大量的高盐废水，对生产设备和环境污染影响较大，此方法正在逐步被淘汰。随着基因工程技术的发展，研究者通过对依克多因的生物合成代谢途径进行深入的研究，采用代谢工程手段构建了一系列的基因工程菌株进行微生物发酵合成生产依克多因。主要是对构建的重组大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等进行高密度发酵培养合成依克多因。此方法生产依克多因对发酵设备的要求比较高，过程中也容易出现结构相似的副产物，导致后续分离成本过高；活细胞转化法是以L-天冬氨酸盐和甘油(或者葡萄糖)为底物利用重组工程菌细胞进行生物催化合成依克多因，目前已经有企业通过此生产方法进行依克多因的大规模生产。活细胞转化制备依克多因的催化过程如下：L-天冬氨酸(Asp)在L-天冬氨酸激酶(Ask)的催化作用下形成磷酸化L-天冬氨酸，磷酸化L-天冬氨酸在L-天冬氨酸β半醛脱氢酶(Asd)的催化下形成依克多因的前体物质L-天冬氨酸β半醛(ASA)。ASA在依克多因合成基因簇ectABC的作用下逐步合成依克多因。首先前体ASA在L-2，4二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)的催化作用下形成L-2，4-二氨基丁酸(DABA)，接着DABA在L-2，4二氨基丁酸γ-乙酰转移酶(EctA)的催化作用下形成N-γ-乙酰-2，4-二氨基丁酸(ADABA)，最后ADABA在依克多因合成酶(EctC)的催化作用下形成依克多因。
许多研究者以天冬氨酸为底物前体，采用活细胞转化法制备依克多因进行了大量研究。He YZ将伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的依克多因合成基因簇ectABC在大肠杆菌BW25113中进行异源表达，在培养过程中用阿拉伯糖诱导ectA、ectB、ectC基因的表达。收集菌体后添加天冬氨酸进行依克多因的制备，24h依克多因的转化水平达到25.1g/L(Heet al.High production of ectoine from aspartate and glycerol by use of whole-cell biocatalysis in recombinant Escherichia coli.Microbial CellFactories.2015；14(1):55)。中国专利CN104560844B将含有延长盐单胞菌Halomonaselongate依克多因合成基因簇EctABC的重组质粒导入大肠杆菌。重组大肠杆菌实现了依克多因合成的三个关键酶在阿拉伯糖启动子的调控下可溶性表达。诱导表达后的菌体以天冬氨酸钠为前体通过生物转化的方法实现了依克多因的高效分泌型合成。每克菌体可以合成1.1克依克多因。中国专利CN104593442B提供了一种重组大肠杆菌高密度培养生产依克多因的方法，将含有延长盐单胞菌Halomonas elongate依克多因合成基因簇EctABC的重组质粒的大肠杆菌进行高密度培养后收集菌体，加入L-天冬氨酸钠经菌体生物转化制备依克多因，合成效率达到11.67g/L.d。
以上现有技术都是以L天冬氨酸为底物，利用活细胞生物转化制备依克多因，但是利用该专利的基因重组构建大肠杆菌，进行依克多因合成的转化率不高。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本专利将打通从富马酸到依克多因的代谢通路(图1)，构建依克多因生物合成途径，构建新型的依克多因生产菌株，从而简化生产工艺、提高合成和转化效率，进一步降低生产成本，提高产品市场竞争力，对依克多因的应用有重要的实践意义。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明利用代谢工程和合成生物学技术，用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)做为底盘表达细胞，表达了嗜盐菌来源的依克多因合成基因簇ectA、ectB、ectC，实现依克多因的异源生物合成；并通过双质粒表达系统，在依克多因原始菌中加强表达了大肠杆菌来源的天冬氨酸酶基因aspA、天冬氨酸激酶基因ask和天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd，最终获得了能够高效生物合成依克多因的重组大肠杆菌。
作为本发明的第一个方面，本发明提供了一种利用富马酸生产依克多因的大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌表达了嗜盐菌来源的依克多因合成基因簇ectABC，其中ectB、ectA、ectC基因(序列表SEQ ID NO.1-3所示序列)分别编码2-氨基丁酸转氨酶、2-氨基丁酸乙酰转移酶和依克多因合成酶，所述基因工程菌还表达了(a)、(b)、(c)三个基因中的任意一种或几种，其中：
(a)天冬氨酸酶基因aspA来源于大肠杆菌(序列表SEQ ID NO.4所示序列)；
(b)天冬氨酸激酶基因ask来源于大肠杆菌(序列表SEQ ID NO.5所示序列)；
(c)天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd来源于大肠杆菌(序列表SEQ ID NO.6所示序列)。
在一种实施方式中，所述基因工程菌同时表达了(a)、(b)、(c)三个基因。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌基因工程菌有两质粒表达系统，所述质粒包括pET24a(+)和pACYCDuet-1。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌基因工程菌，依克多因合成基因簇ectA、ectB、ectC在pET24a(+)质粒中表达，aspA、ask、asd基因在pACYCDuet-1质粒中表达。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌基因工程菌，通过T7启动子和lac操纵子分别调控ectA、ectB、ectC、aspA、ask、asd基因的表达。lac操纵子和基因序列之间有RBS序列。
在一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主为E.coliBL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。
作为本发明的第二个方面，本发明还提供大肠杆菌基因工程菌的构建方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1，将嗜盐菌来源的分别编码2-氨基丁酸转氨酶、2-氨基丁酸乙酰转移酶和依克多因合成酶的基因簇ectABC构建到pET24a(+)表达载体，得到重组表达载体E；
步骤2，将天冬氨酸酶基因aspA、天冬氨酸激酶基因ask、天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd构建到pACYCDuet-1表达载体，得到重组表达载体AAA；
步骤3，将所构建的E、AAA重组表达载体依次通过氯化钙法转入到大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌基因工程菌E-AAA/BL21。
作为本发明的第三个方面，本发明还提供一种利用所述重组大肠杆菌基因工程菌发酵生产依克多因的方法，所述方法为：将所述大肠杆菌工程菌在连续补料发酵培养基中发酵培养至少46h。
在一种实施方式中，所述发酵培养具体步骤如下：
在一种实施方式中，所述发酵培养具体步骤如下：
步骤(1)，种子培养：将重组大肠杆菌接种种子培养基中进行种子培养；
步骤(2)，补葡萄糖发酵培养：将培养好的种子接种至发酵培养基中进行培养，在发酵过程中控制pH7.0；当培养基中葡糖耗尽，流加80％浓度葡萄糖液；当发酵液中菌体浓度(OD600)达到30以上，加入0.2mM IPTG诱导剂。
在一种实施方式中，所述发酵培养具体步骤如下：
步骤1，种子培养：将重组大肠杆菌接种种子培养基中进行种子培养；
步骤2，补葡萄糖和富马酸发酵培养：将培养好的种子接种至发酵培养基进行培养，在发酵过程中控制pH7.0；当培养基中葡糖耗尽，流加80％浓度葡萄糖液；当发酵液中菌体浓度(OD600)达到30以上，加入0.2mM IPTG诱导剂，当发酵诱导12h后，流加20％天冬氨酸钠溶液，当发酵诱导12h后，流加30％富马酸铵溶液。
在一种优选的实施方式中，所述发酵培养具体步骤如下：
步骤1，种子培养：将0.1ml重组大肠杆菌甘油管种子接种至10ml LB摇瓶(添加50ppm卡那霉素，25ppm氯霉素)，37度，250转培养12h。将7ml一级种瓶种子接种700ml LB摇瓶，37度、250转培养12h。
步骤2，补葡萄糖发酵培养：将培养好的700ml二级种子按照10％接种量接种至7L灭菌好的发酵培养基中(接种前用氨水调节pH7.0)，在37度、300转、空气流量400L/h条件下进行培养，在发酵过程中用氨水控制pH7.0，调节转速和空气流量保持溶氧在30％以上。当培养基中葡糖耗尽，流加80％浓度葡萄糖液。当发酵液中菌体浓度(OD600)达到30以上，加入0.2mMIPTG诱导剂，同时控制pH8.0。
在一种实施方式中，步骤2为补葡萄糖和富马酸发酵培养：将培养好的700ml二级种子按照10％接种量接种至7L灭菌好的发酵培养基中(接种前用氨水调节pH7.0)，在37度、300转、空气流量400L/h条件下进行培养，在发酵过程中用氨水控制pH7.0，调节转速和空气流量保持溶氧在30％以上。当培养基中葡糖耗尽，流加80％浓度葡萄糖液。当发酵液中菌体浓度(OD600)达到30以上，加入0.2mMIPTG诱导剂，当发酵诱导12h后，流加30％富马酸铵溶液，同时控制pH8.0。
在一种实施方式中，用于步骤(1)中种子培养基成分为1-10g/L蛋白胨，1-5g/L酵母提取物，1-10g/L氯化钠。
在一种实施方式中，用于步骤(2)中所述的发酵培养基为2-10g/L葡萄糖，4-20g/L(NH4)2SO4，2-10g/L酵母浸粉，4-20g/L玉米浆，0.4-2g/L K2HPO4，0.4-2g/L KH2PO4，0.2-1g/L MgSO4.7H2O，0.04-0.02g/L FeSO4.7H2O，0.004-0.02g/L MnSO4.H2O。
作为本发明的第四个方面，本发明还提供所述大肠杆菌基因工程菌在生产含依克多因的食品、药品、保健品或化妆品方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明首次使用T7启动子和lac操纵子表达系统在大肠杆菌中表达依克多因基因簇ectA、ectB、ectC，同时也加强表达aspA、ask和asd基因，同时对依克多因基因工程菌发酵工艺进行优化，取得了如下效果：
(1)本发明在嗜盐菌中依克多因合成途径的基础上，在大肠杆菌中构建了依克多因生物合成过程中前体代谢途径，同时加强富马酸到天冬氨酸代谢途径，最终构建了一个有一套完整依克多因生物合成途径的大肠杆菌基因工程菌。
(2)本发明对该工程菌进行分批补料高密度发酵培养，该工程菌表现出优良的依克多因生产性能。发酵50h产量可以达30.8g/L，生产效率0.616g/L/h，比产量0.6864g/gDCW，葡萄糖转化率0.201g/g，富马酸转化率23.7％。该依克多因基因工程菌株有很好的工业应用前景。
(3)He YZ、中国专利CN104560844B、中国专利CN104593442B都是同一单位的文献报道，研究内容都是将伸长盐单胞菌依克多因合成基因簇ectABC在大肠杆菌BW25113中进行异源诱导表达，收集诱导后的菌体添加天冬氨酸、氯化钾和甘油进行依克多因的生物转化制备。
与以上文献报道相比，本发明有如下显著进步：(1)本发明中构建的基因工程菌E-AAA/BL21可以不添加底物制备依克多因，可以直接以葡萄糖发酵制备依克多因，发酵46h依克多因产量达到11.4g/L，不添加底物制备依克多因，发酵液中依克多因纯度高，杂质少，可以避免后续提取过程中底物对依克多因分离提取的影响。(2)本发明中构建的基因工程菌不用离心收集菌体，可以直接在发酵过程中添加富马酸发酵制备依克多因，省去离心收集菌体的步骤，依克多因制备工艺简单。(3)本发明中构建的基因工程菌使用富马酸底物发酵转化，富马酸价格比天冬氨酸便宜，可以降低成本。(4)本发明中构建的基因工程菌使用富马酸底物发酵，转化中不添加0.1M氯化钾，减少高浓度的盐对环境的污染。(5)本发明中构建的基因工程菌补富马酸发酵50h产量可以达30.8g/L，合成效率达到14.78g/L.d，高于中国专利CN104593442B报道的依克多因合成效率11.67g/L.d。
附图说明
图1依克多因生物合成代谢图；
图2重组表达载体构建图；
图3重组菌补葡萄糖发酵生产依克多因；
图4重组菌补葡萄糖和富马酸铵发酵生产依克多因。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
实施例1重组表达载体的构建
依克多因的生物合成途径主要由ectABC基因簇控制，其中ectA、ectB、ectC基因(序列表SEQ ID NO.1-3所示序列)分别编码2-氨基丁酸转氨酶、2-氨基丁酸乙酰转移酶和依克多因合成酶。根据大肠杆菌的密码子偏爱性对文献公开报道的嗜盐菌ectABC基因簇序列进行了密码子优化。由基因合成公司对ectABC基因簇进行全基因合成。在ectB、ectC基因上游引物前面添加PT7启动子、lac操纵子和RBS序列，对合成的ectABC基因簇片段分别进行PCR扩增，从而得到ectA基因片段和含有PT7启动子的PT7ectB、PT7ectC基因片段。通过融合PCR对3片段进行融合得到ectA-PT7ectB-PT7ectC片段，将该片段与经过限制性内切酶BamHⅠ和XholⅠ线性化的pET-24a载体进行一步克隆重组，得到重组表达载体E(pET24a-PT7ectA-PT7ectB-PT7ectC)(图2)。
根据需要在各基因上游引物前面添加PT7启动子、lac操纵子和RBS序列，以大肠杆菌基因组为模板进行PCR扩增天冬氨酸激酶基因ask(序列表SEQ ID NO.5所示序列)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd(序列表SEQ ID NO.6所示序列)、天冬氨酸酶基因aspA(序列表SEQID NO.4所示序列)得到ask、PT7asd、aspA基因片段。将pACYCDuet-1载体经限制性内切酶EcoRV和XhoI线性化(第二个多克隆位点)，在引物两端加入与线性化pACYCDuet-1载体两端同源的20bp核酸序列，将ask和PT7asd片段进行融合PCR得到带同源臂的ask-PT7asd片段，将该片段用一步克隆试剂盒重组到pACYCDuet-1表达载体，得到重组表达载体AA(pACYCDuet-PT7ask-PT7asd)。
将AA载体经限制性内切酶BamHI和HindIII线性化(第一个多克隆位点)，在aspA引物两端加入与线性化AA载体两端同源的20bp核酸序列，PCR扩增得到带同源臂的aspA片段，将该aspA片段一步克隆到AA表达载体，得到重组表达载体AAA(pACYCDuet-PT7aspA-PT7ask-PT7asd)(图2)。
将E、AAA重组表达载体依次通过氯化钙法转入到大肠杆菌BL21(DE3)，最终得到可以生产依克多因的重组大肠杆菌E-AAA/BL21。
重组表达载体构建过程中所使用引物见表1。
表1重组表达载体构建过程中所使用引物列表
下划线部分为一步克隆或融合PCR同源臂序列。
实施例2重组菌补葡萄糖发酵生产依克多因
对整合有依克多因生物合成路径的E-AAA/BL21重组菌株进行15L发酵罐高密度发酵培养，验证依克多因的发酵生产水平。将0.1ml重组大肠杆菌甘油管种子接种至10ml LB摇瓶(蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，添加50ppm卡那霉素，25ppm氯霉素)，37度，250转培养12h。将7ml一级种瓶种子接种700ml LB摇瓶，37度，250转培养12h。将培养好的700ml二级种子按照10％接种量接种至7L灭菌好的发酵培养基(10g/L葡萄糖，20g/L(NH4)2SO4，10g/L酵母浸粉，20g/L玉米浆，2g/L K2HPO4，2g/L KH2PO4，1g/L MgSO4.7H2O，0.02g/LFeSO4.7H2O，0.02g/L MnSO4.H2O，接种前用氨水调节pH7.0。)，在37度、300转、空气流量400L/h条件下进行培养，在发酵过程中用氨水控制pH7.0，调节转速和空气流量保持溶氧在30％以上。当培养基中葡糖耗尽，流加80％浓度葡萄糖液。当发酵液中菌体浓度(OD600)达到30以上，加入0.2mMIPTG诱导剂，同时控制pH8.0。每隔一段时间取样检测菌体浓度OD600，依克多因含量，葡萄糖浓度。发酵46h后，菌体浓度OD600达到80，发酵过程中葡萄糖残留低于1g/L。依克多因产量11.4g/L，生产效率0.247g/L/h，比产量0.3149g/g DCW，葡萄糖转化率0.094g/g。(图3)
实施例3重组菌补葡萄糖和富马酸铵发酵生产依克多因
对整合有依克多因生物合成路径的E-AAA/BL21重组菌株进行15L发酵罐罐高密度发酵培养，验证依克多因的发酵生产水平。将0.1ml重组大肠杆菌甘油管种子接种至10mlLB摇瓶(蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，添加50ppm卡那霉素，25ppm氯霉素)，37度，250转培养12h。将7ml一级种瓶种子接种700ml LB摇瓶，37度，250转培养12h。将培养好的700ml二级种子按照10％接种量接种至7L灭菌好的发酵培养基(10g/L葡萄糖，20g/L(NH4)2SO4，10g/L酵母浸粉，20g/L玉米浆，2g/L K2HPO4，2g/L KH2PO4，1g/L MgSO4.7H2O，0.02g/L FeSO4.7H2O，0.02g/L MnSO4.H2O，接种前用氨水调节pH7.0。)，在37度、300转、空气流量400L/h条件下进行培养，在发酵过程中用氨水控制pH7.0，调节转速和空气流量保持溶氧在30％以上。当培养基中葡糖耗尽，流加80％浓度葡萄糖液。当发酵液中菌体浓度(OD600)达到30以上，加入0.2mMIPTG诱导剂。当发酵诱导12h后，流加30％富马酸铵溶液，同时控制pH8.0。每隔一段时间取样检测菌体浓度OD600，依克多因含量，葡萄糖浓度。发酵50h后，菌体浓度OD600达到101，发酵过程中葡萄糖残留低于1g/L。依克多因产量30.8g/L，生产效率0.616g/L/h，比产量0.6864g/g DCW，葡萄糖转化率0.201g/g，富马酸转化率23.7％。(图4)。

Claims (10)

1.一种利用富马酸生产依克多因的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达了嗜盐菌来源的依克多因合成基因簇ectABC，其中ectB、ectA、ectC基因分别编码2-氨基丁酸转氨酶、2-氨基丁酸乙酰转移酶和依克多因合成酶，所述基因工程菌还表达了(a)、(b)、(c)三个基因中的任意一种或几种，其中：
(a)天冬氨酸酶基因aspA来源于大肠杆菌；
(b)天冬氨酸激酶基因ask来源于大肠杆菌；
(c)天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd来源于大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌有两质粒表达系统，所述质粒包括pET24a(+)和pACYCDuet-1。
3.如权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，依克多因生物合成基因簇ectA、ectB、ectC在pET24a(+)质粒中表达，aspA、ask、asd基因在pACYCDuet-1质粒中表达。
4.如权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，通过T7启动子和lac操纵子分别调控ectA、ectB、ectC、aspA、ask、asd基因的表达。lac操纵子和基因序列之间有RBS序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主为E.coliBL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。
6.如权利要求1-4任一项所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1，将嗜盐菌来源的分别编码2-氨基丁酸转氨酶、2-氨基丁酸乙酰转移酶和依克多因合成酶的基因簇ectABC构建到pET24a(+)表达载体，得到重组表达载体E；
步骤2，将天冬氨酸酶基因aspA、天冬氨酸激酶基因ask、天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd构建到pACYCDuet-1表达载体，得到重组表达载体AAA；
步骤3，将所构建的E、AAA重组表达载体依次通过氯化钙法转入到大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌基因工程菌。
7.一种利用权利要求1-4任一项所述大肠杆菌基因工程菌发酵生产依克多因的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1，步骤(1)，种子培养：将重组大肠杆菌接种种子培养基中进行种子培养；
步骤(2)，补葡萄糖发酵培养：将培养好的种子接种至发酵培养基中进行培养，在发酵过程中控制pH7.0；当培养基中葡糖耗尽，流加80％浓度葡萄糖液；当发酵液中菌体浓度(OD600)达到30以上，加入0.2mM IPTG诱导剂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2为补葡萄糖和富马酸发酵培养：将培养好的种子接种至发酵培养基进行培养，在发酵过程中控制pH7.0；当培养基中葡糖耗尽，流加80％浓度葡萄糖液；当发酵液中菌体浓度(OD600)达到30以上，加入0.2mM IPTG诱导剂，当发酵诱导12h后，流加20％天冬氨酸钠溶液，当发酵诱导12h后，流加30％富马酸铵溶液。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，用于步骤(1)中种子培养基成分为1-10g/L蛋白胨，1-5g/L酵母提取物，1-10g/L氯化钠；用于步骤(2)中所述的发酵培养基为2-10g/L葡萄糖，4-20g/L(NH4)2SO4，2-10g/L酵母浸粉，4-20g/L玉米浆，0.4-2g/L K2HPO4，0.4-2g/LKH2PO4，0.2-1g/LMgSO4.7H2O，0.04-0.02g/L FeSO4.7H2O，0.004-0.02g/L MnSO4.H2O。
10.如权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌基因工程菌在生产含依克多因的食品、药品、保健品或化妆品方面的应用。
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CN118272286A (zh) * 2024-06-04 2024-07-02 江西唯铂莱生物制药有限公司 一种生产γ-氨基丁酸的基因工程菌及其制备方法和应用

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