CN117858946A - 作为新型基因沉默技术的非对称短双链体dna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于调节细胞、组织、生物体和动物中的靶核酸和/或蛋白质的新型基因沉默技术。新技术提供了用于基因靶向或基因沉默应用的组合物，包括预防和治疗人类疾病。该组合物包含非对称的、短的、双链体DNA分子，其中有义链比反义链短。双链体DNA分子进一步包括至少一个核糖核苷酸单体间隔片段。本发明进一步提供了使用该组合物调节靶基因的表达或功能，或用于治疗或预防疾病以及用于其它医学或生物学应用的方法。

Description

作为新型基因沉默技术的非对称短双链体DNA及其应用

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年5月29日递交的申请号为63/195,008的美国临时专利申请的优先权并要求享有该申请的权益，该临时专利申请的全部内容并入本申请当中作为参考。

技术领域

本发明涉及作为基因沉默技术的非对称短双链体DNA，及其相关的组合物和方法，可用于生物或医学研究、疾病的治疗和预防、以及在其它生物领域中的基因沉默应用。

背景技术

现代医学疗法依赖于两项基本的技术，即小分子化学成分和蛋白质/抗体技术。然而，仅有约10％的被基因组学研究和生物医学研究所确定的靶点可以通过上述两项基础技术解决。寡核苷酸有望解决众多的靶点，包括通过小分子化学成分和蛋白质/抗体技术不可成药的靶点。经过40多年的研究创造了反义寡核苷酸(ASO，antisense oligonucleotide)和小干扰RNA(siRNA，small interfering RNA)技术(Cy A.Stein et al.,2017)。然而，尽管经过40多年的研究，除少数临床孤儿适应症外，显著的成药性问题阻碍了ASO和siRNA技术成为主流治疗平台的发展。这些成药性问题包括，除其他外：低沉默效率，脱靶效应，刺激非预期免疫反应，组织渗透性挑战和体内递送等。因此，在各种生物和医学应用中，创造新技术以靶向感兴趣的基因存在着显著未满足的需求。

ASO是一种基因沉默技术，其基于最初于1978年提出的概念(Zamecnik P.C.etal.,1978)。一般来说，ASO技术背后的原理是反义寡核苷酸与靶标核酸杂交，调节基因表达的活性或功能，例如转录/转录后或翻译。其机制大体上分为：(1)仅占位而不促进RNA的降解，其中ASO的结合导致翻译停滞(translational arrest)，剪接抑制或诱导可变剪接变体，或者(2)占位诱导的不稳定(occupancy-induced destabilization)，其中ASO的结合促进通过内源性酶降解RNA，例如核糖核酸酶H1(RNase H1)；和(3)翻译调节：ASO可阻断在5’UTR区域的上游开放阅读框(uORFs)或者其它抑制性或调控性元件，提高或调节翻译效率(Stanley T.Crooke et al.,2008；C.Frank Bennett,2010；Richard G.Lee,2013；StanleyT.Crooke,2017)。ASO是单链脱氧核糖核苷酸序列的结构，可以通过碱基配对与靶标RNA结合。经过40年的研究，通过各种对单链寡核苷酸的化学修饰使得ASO技术得到了改进，例如硫代磷酸酯取代或其它经修饰的核苷酸(参见Iwamoto N et al 2017,Crooke ST,2017；Crooke ST et al.,2018；U.S.Pat.Nos.7919472和9045754)。

短双链RNA通过RNAi机制触发同源序列RNA丢失，这种机制首次在植物中观察到，并在线虫(秀丽隐杆线虫)中得到证实(A.Fire et al,1998)。该机制涉及长dsRNA降解为短干扰双链体RNA(siRNA)，siRNA与多蛋白RNA诱导沉默复合物(RICS，RNA-InducedSilencing Complex)相互作用；在RISC中，siRNA是解旋的，其中的有义链丢弃，反义链或者引导链与RISC核酸内切酶AGO2结合，随后AGO2裂解靶标RNA(de Fougerolles et al.,2007；Ryszard Kole,2016)。在哺乳动物细胞中，合成的siRNA或非对称短干扰RNAs(aiRNA或非对称siRNA)可以通过依赖RISC的机制用于诱导基因沉默(参见Elbashir SM et al.,2001；Sun X et al.,2008；U.S.Pat.Nos.7056704和9328345)。

已研究几十年的寡核苷酸，其被认为很有望成为一类全新的疗法。然而其有限的沉默效率，递送挑战和剂量依赖性副作用(包括杂交依赖性毒性和杂交非依赖性毒性)一直限制着这些新型疗法的发展(C.Frank Bennett,2010；C.Frank Bennett,2019；Roberts TCet al.,2020；Crooke ST et al.,2018；和Setten RL et al.,2020)。一般来说，虽然ASO化合物在诱导基因沉默中的效能不及基于siRNA的化合物，但是ASO化合物与siRNA化合物相比，其具有一些药学上的优势。目前，ASO和siRNA仍然是设计基因沉默治疗疗法的两种同等重要的平台技术(Crooke ST et al 2018；Roberts TC et al 2020)。寡核苷酸的杂交依赖性毒性主要归于其与非靶标基因的杂交(“脱靶效应”)(Jackson et al.,2003；Lin X etal.,2005)。寡核苷酸的非杂交依赖性毒性是通过其与蛋白质的相互作用发生：这些作用包括增加凝血时间，促炎作用和激活补体途径。这些作用倾向于发生在较高剂量的寡核苷酸中，并且是剂量依赖性的。例如，在较高浓度下，ASO可导致肾小管病变和血小板减少(Geary,RS.et al.,2007；Kwoh JT,2008)。临床上，第一代PS反义寡脱氧核苷酸和第二代经2’-MOE修饰的反义寡核苷酸的主要耐受性和安全性问题已被证明是非杂交依赖的作用，如延长活化部分凝血活酶的时间、注射部位反应和诸如发热、发冷和头痛的全身症状(C.Frank Bennett,2010；Henry S P,2008；Kwoh J T,2008)。即使是最优化的ASO通常也仍然远不及siRNA有效，而且其被证明具有剂量依赖性的典型毒性(Kendall S.Frazier,2015)。在过去的40年里，为减轻寡核苷酸的剂量依赖性毒性，人们一直努力通过各种化学修饰来克服ASO有限的效能问题和相关的安全性问题(Iwamoto N et al 2017,Crooke STet al.,2018；和Roberts TC et al.,2020)。

与ASO相比，siRNA双链体的脱靶效应被认为是由有义链介导的沉默，与内源性miRNA通路的竞争，以及与TLR或其它蛋白质的相互作用所介导的(Setten RL et al2019)。另外，典型的21nt/19bp siRNA双链体在细胞和组织渗透力方面效率不高，也需要广泛的化学修饰以增强siRNA的稳定性和其它药物性质。为克服由对称siRNA的有义链介导的脱靶效应和其它脱靶机制，设计了非对称siRNA(或者aiRNA)(参见Sun X et al.,2008；Grimm D,2009；Selbly CR et al.,2010；和PCT专利WO2009029688)。

总之，经过40多年的ASO技术创新和20多年的基于RNAi技术研究后，成功开发针对近90％与人类疾病相关的靶点的基因靶向疗法仍然具有挑战性。此外，针对现在已批准的寡核苷酸药物，每位患者每年的花费超过50万美元，因此无法解决影响普通人群的疾病。因此，迫切需要新的技术来克服这些挑战。

本文引用的参考文献不视为承认是请求保护的本发明的现有技术。

发明概述

本发明基于由非对称短双链体脱氧核糖核苷酸(asdDNA，asymmetric shortduplex deoxyribonucleotides，非对称sdDNA)触发的有效的基因沉默的出人意料的发现。这种新型基因沉默技术由asdDNA实现，asdDNA采用了一种由连接着的核苷酸单体组成的短的双链体分子，并具有一个或更多个间隔的核糖核苷酸，其中每个核苷酸单体选自下组：天然存在的核苷酸、其类似物(analog)和经修饰的核苷酸(以下统称为“核苷酸单体”)。换句话说，本发明的一个实施方案中使用的核苷酸单体包含“脱氧核糖核苷酸单体”，其中“脱氧核糖核苷酸单体”选自下组：天然存在的脱氧核糖核苷酸、其类似物和经修饰的脱氧核糖核苷酸。进一步的，通过掺入一个或几个间隔的核糖核苷酸单体，可以显著实现或增强asdDNA的基因沉默功能。“核糖核苷酸单体”可选自下组：天然存在的核糖核苷酸、其类似物和经修饰的核糖核苷酸。

在本发明中，短双链体DNA(sdDNA)分子，或者更具体地，非对称短双链体DNA(asdDNA)分子进一步地被核糖核苷酸单体间隔开，形成至少一个核糖核苷酸单体的间隔片段(ISR，interspersed segment of ribonucleotide monomer(s))。

在一个实施例中，本公开所包含的基于asdDNA的新型平台技术的强大基因沉默效应是通过寡核苷酸单体有义链和寡核苷酸单体反义链实现的，其中寡核苷酸单体反义链与靶标核糖核苷酸序列基本上互补。我们的数据显示本申请的asdDNA分子因其独特、新颖的组成，可以在皮摩尔浓度下引起基因沉默，比现有的反义(ASO)技术和siRNA技术效能更强，因此可以减少剂量依赖性毒性。本申请的asdDNA分子还有望具有优于现有基因沉默技术的至少一个以下优势，包括更好的组织渗透力；相比于基于siRNA的基因沉默仅发生在细胞质中，asdDNA可以在细胞核、线粒体等中实现基因沉默；减少脱靶效应；更好的稳定性；消除或减少与siRNAs相关的与内源性microRNA途径不期望的竞争；低合成成本以及改进的药学性质。因此，本发明的asdDNA分子对解决ASO、siRNA和其它现有基因沉默技术面临的各种挑战方面具有巨大的潜能。本发明的asdDNA分子可以用于当前寡核苷酸所正在应用或预期使用的全部领域，包括研究、诊断、疾病预防和治疗以及生物领域的其它应用，还包括农药和兽药领域。

第一方面，本发明提供一种组合物，其包含短双链体DNA(sdDNA)分子，其中sdDNA分子具有比第二链长的第一链。换句话说，该sdDNA分子是非对称短双链体DNA(asdDNA)分子，其中asdDNA分子的第二链比第一链短。由于第一链通过至少一个靶向区与靶标RNA的靶标片段基本上互补，因此第一链可以被认为是反义链或者反义寡核苷酸。进一步地，第二链与第一链基本上互补，与第一链形成至少一个双链区，第二链也可以被视为是有义链或者有义寡核苷酸。asdDNA分子包含至少一个核糖核苷酸单体间隔片段(ISR)。在一个特征中，asdDNA分子中的ISR包含至少一个核糖核苷酸单体，其中ISR可以存在于任一条链中或者在两条链中均存在。

本发明提供的组合物用于调节真核细胞中的基因表达或功能，其中asdDNA与细胞接触或者向受试者施用。

在一些实施方案中，asdDNA分子包含至少一个或至少两个核糖核苷酸单体间隔片段(ISR)。在一个特征中，本发明的asdDNA分子的第一链包含至少一个ISR。在一个实施方案中，第一链包含至少一个ISR并且第二链也包含至少一个ISR。在一个特征中，每个ISR各自独立地由一个核糖核苷酸单体组成，或包含至少2、3、4或5个连续的核糖核苷酸单体。在另一个特征中，ISR包含至少2个核糖核苷酸单体，其中该核糖核苷酸单体是连续的或其被至少一个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)不同种类的单体掺入而隔开。在另一个特征中，第一链中所有ISR的核糖核苷酸单体总数至少为2。

在一个特征中，至少一个ISR分布在第一链(反义链)的至少一个靶向区中。在另一个特征中，至少一个ISR分布在第二链(有义链)的至少一个双链区中。在另一个特征中，至少一个ISR分布在第一链(反义链)的至少一个靶向区中且至少一个ISR分布在第二链(有义链)的至少一个双链区中。在一些实施方案中，至少一个ISR可以分布在第一链的任意位点。在一些实施方案中，至少一个ISR位于第一链的5’端或者靠近第一链的5’端(从所述链末端起数的7个核碱基以内，或者从所述链末端起数的核碱基总数的33％个以内，例如：长度约为21个核碱基的链，从所述末端起数的第1、2、3、4、5、6或7个核碱基位置)；和/或至少一个ISR位于第一链的3’端或者靠近第一链的3’端(从所述链末端起数的7个核碱基以内，或者从所述链末端起数的核碱基总数的33％个以内)；和/或至少一个ISR位于第一链的更中心位点。在一些实施方案中，第一链中分布的至少一个ISR仅位于第一链的突出区域。在一些实施方案中，第一链中分布的至少一个ISR位于第一链的突出区域和双链区。在一些实施方案中，第一链中的ISR包含至少一个位于第一链的5’端或3’端的核糖核苷酸单体。在一些实施方案中，至少一个ISR位于第二链的5’端或者靠近第二链的5’端(从所述链末端起数的7个核碱基以内，或者从所述链末端起数的核碱基总数的33％个以内)；和/或至少一个ISR位于第二链的3’端或者靠近第二链的3’端(从所述链末端起数的7个核碱基以内，或者从所述链末端起数的核碱基总数的33％个以内)；和/或至少一个ISR位于第二链的更中心位点。

在一个特征中，第一链或反义链包含多个连接着的核苷酸单体以形成核碱基序列，并且第一链或反义链至少70％、80％、85％、90％、95％或者完全地与靶标基因的RNA的靶标片段互补。在某些实施方案中，靶标RNA选自mRNA或非编码的RNA，其中RNA或者编码与疾病有关的蛋白质或者调控与疾病有关的部分生物学通路，例如哺乳动物疾病。术语“靶标(target)”和“靶标的(targeted)”在本公开中可互换地使用并具有相同的含义。

在各种实施方案中，第一链/反义链具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个连接着的核苷酸单体的主链长度，或其等值长度，或由上述任意两数值括起来的长度范围(范围的两个端点值均包括在其中)。例如，第一链的一些长度范围包括：(a)8-33个核苷酸单体，(b)10-30个核苷酸单体，(c)10-29个核苷酸单体，(d)12-29个核苷酸单体，(e)12-28个核苷酸单体，(f)12-26个核苷酸单体，(g)12-25个核苷酸单体，(h)13-25个核苷酸单体，(i)13-24个核苷酸单体，(j)13-23个核苷酸单体，(k)15-23个核苷酸单体，(l)8-50个核苷酸单体，(m)10-36个核苷酸单体，(n)12-36个核苷酸单体，(o)12-32个核苷酸单体，(p)14-36个核苷酸单体，和(q)至少8个核苷酸单体。

在一个特征中，第二链或有义链包含多个连接着的核苷酸单体以形成核碱基序列，并且第二链或有义链至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或者完全地与第一链或反义链的至少一个连接着的区域互补。在一些实施方案中，有义链完全地与第一链或反义链的至少一个连接着的区域互补，且形成至少一个没有任何错配的双链区。在一些实施方案中，有义链与第一链或反义链的至少一个连接着的区域互补，且形成至少一个具有1、2、3或者更多个错配的双链区。在一个特征中，有义链中的错配单体具有的核碱基选自由A、G、C和T组成的群组或选自经修饰的核碱基。在一些实施方案中，第二链的第一个碱基和最后一个碱基中的至少一个与第一链中的碱基互补。在一些实施方案中，至少第二链的第一个碱基和最后一个碱基与第一链中的核碱基互补。

在一个特征中，第二链或有义链具有的主链长度比第一链或反义链的短至少以下数量个的核苷酸单体：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38。在各种实施方案中，第二链或有义链具有的主链长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个连接着的核苷酸单体，或其等值长度，或由上述任意两数值括起来的长度范围(范围的两个端点值均包括在其中)。例如，在某些实施方案中，第二链的一些长度范围包括：(a)8-32个核苷酸单体，(b)8-30个核苷酸单体，(c)8-29个核苷酸单体，(d)9-29个核苷酸单体，(e)9-26个核苷酸单体，(f)9-25个核苷酸单体，(g)10-29个核苷酸单体，(h)10-28个核苷酸单体，(i)10-26个核苷酸单体，(j)10-25个核苷酸单体，(k)11-24个核苷酸单体，(l)12-23个核苷酸单体，(m)12-23个核苷酸单体，(n)12-22个核苷酸单体，(o)13-23个核苷酸单体，(p)15-23个核苷酸单体，(q)8-35个核苷酸单体，(r)8-33个核苷酸单体，(s)9-35个核苷酸单体，(t)9-34个核苷酸单体，(u)9-32个核苷酸单体，(v)9-30个核苷酸单体，(w)10-30个核苷酸单体，(x)10-32个核苷酸单体，(y)至少8个核苷酸单体和(z)至少6个核苷酸单体。在某些实施方案中，在第二链能够与第一链形成热力学稳定的双链体情况下，第二链的主链长度可以具有小于第一链长度的任何数量的核苷酸单体。

在一个特征中，第一链的两个末端是以下配置中的一种：3’突出端和5’突出端，3’突出端和5’端平末端，5’突出端和3’端平末端，3’突出端和5’凹陷端或5’突出端和3’凹陷端。在某些实施方案中，第一链的3’突出端具有的长度为：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸单体，或由上述任意两数值括起来的范围(范围的两个端点值均包括在其中)。在各种实施方案中，第一链的3’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体(范围的两个端点值均包括在其中)。

在某些实施方案中，第一链的5’突出端具有的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸单体，或由上述任意两数值括起来的范围(范围的两个端点值均包括在其中)。在各种实施方案中，第一链的5’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体(范围的两个端点值均包括在其中)。

在本发明的一个实施方案中，第一链具有1-15个核苷酸单体的3’突出端和1-15个核苷酸单体的5’突出端。在另一个实施方案中，第一链具有1-26个核苷酸单体的3’突出端和5’平末端或者5’凹陷端。在另一个实施方案中，第一链具有1-26个核苷酸单体的5’突出端和3’平末端或者3’凹陷端。

在一个特征中，第二链的两个末端是以下配置中的一种：3’突出端和5’凹陷端，5’突出端和3’凹陷端，3’端平末端和5’凹陷端，5’平末端和3’凹陷端，3’凹陷端和5’凹陷端。在某些实施方案中，第二链的3’突出端具有的长度为：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸单体。在各种实施方案中，第二链的3’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体(范围的两个端点值均包括在其中)。在某些实施方案中，第二链的5’突出端具有的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸单体。在各种实施方案中，第二链的5’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体(范围的两个端点值均包括在其中)。

在本发明asdDNA分子的一个特征中，第一链和/或第二链中至少一个核苷酸单体是经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，例如，糖经修饰的，主链经修饰的，和/或碱基经修饰的核苷酸。在一个实施方案中，主链经修饰的核苷酸至少在核苷间键中具有修饰，例如包括氮杂原子或硫杂原子中的至少一个。在某些实施方案中，经修饰的核苷间键是或包含：硫代磷酸酯基团(P＝S)、磷酸三酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯。

在某些实施方案中，第一链和/或第二链包含至少一个经修饰的核苷间键，其中经修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，第一链和/或第二链的每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在各种实施方案中，第一链和/或第二链的核苷间键是硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合。

在一个特征中，本发明分子的第一链和/或第二链包括至少一个的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，其中经修饰的核苷酸或核苷酸类似物包含经修饰的糖部分。在某个实施方案中，经修饰的糖部分的2’位被选自由下列的基团所取代：OR、R、卤基、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN，其中每个R独立地是C₁-C₆烷基、烯基或炔基，卤基是F、Cl、Br或I。在一些实施方案中，经修饰的糖部分的2’位被选由下列的基团取代：烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C₁-C₁₀烷基、OCF₃、OCH₂F、O(CH₂)₂SCH₃、O(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)、O-CH₂-C(＝O)-N(R_m)(R_n)、或O-CH₂-C(＝O)-N(R₁)-(CH₂)₂-N(R_m)(R_n)，其中每个R₁，R_m和R_n独立地是H或取代或未取代的C₁-C₁₀烷基。在一些实施方案中，经修饰的糖部分具有选自下组的取代基团：5’-乙烯基，5’甲基(R或S)，4’-S、2’-F、2’-OCH₃、2’-OCH₂CH₃、2’-OCH₂CH₂F、2'-O-氨基丙基化(2’-AP)，和2’-O(CH2)₂OCH₃。在一些实施方案中，经修饰的糖部分被选自由下组的双环糖取代：4′-(CH₂)—O-2′(LNA)、4′-(CH₂)—S-2′、4′-(CH₂)2—O-2′(ENA)、4′-CH(CH₃)—O-2′(cEt)和4′-CH(CH₂OCH₃)—O-2′、4′-C(CH₃)(CH₃)—O-2′、4′-CH₂—N(OCH₃)-2′、4′-CH₂—O—N(CH₃)-2′、4′-CH₂—N(R)—O-2′(其中R是H，C₁-C₁₂烷基或保护基团)，4′-CH₂—C(H)(CH₃)-2′、和4′-CH₂—C—(═CH₂)-2′。在一些实施方案中，经修饰的糖部分选自下组：2’-O-甲氧基乙基经修饰的糖(MOE)、4′-(CH₂)—O-2′双环糖(LNA)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖(2’-F阿拉伯糖，FANA)和甲基(亚甲氧基)(4′-CH(CH₃)—O-2双环糖(cEt)。

在本发明asdDNA分子的一个特征中，脱氧核糖核苷酸单体的糖部分是天然存在的脱氧核糖核苷酸的糖部分(2-H)或2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖(FA)。

在本发明asdDNA分子的一个特征中，核糖核苷酸单体的糖部分选自：天然存在的核糖核苷酸(2-OH)、2’-F修饰的糖、2’-OMe修饰的糖、2’-O-甲氧基乙基修饰的糖(MOE)、4′-(CH₂)—O-2′双环糖(LNA)和甲基(亚甲氧基)(4′-CH(CH₃)—O-2双环糖(cEt)。

在一个特征中，本发明分子的第一链和/或第二链包括至少一个核苷酸单体，其中核苷酸单体包含经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基选自下组：5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)，次黄嘌呤核苷碱基，三苯甲基化碱基，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH₃)尿嘧啶以及胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，1-甲基-假尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基以及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴代)、5-三氟甲基、5-甲基尿苷以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。在特定实施方案中，经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在一个实施方案中，本发明分子的每个胞嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶。在一个实施方案中，本发明asdDNA分子的ISR中每个尿苷碱基是5-甲基尿苷。

在一个特征中，现发明的asdDNA可能包含至少一个CpG基序，其中CpG基序可以被例如Toll样受体的模式识别受体(PRR)所识别。

在一个特征中，本发明分子的第一链和/或第二链与配体或部分相缀合。在某个实施方案中，配体或部分选自下组：多肽、抗体、多聚物、多糖、脂质、疏水部分或分子、阳离子部分或分子、亲脂性化合物或部分、寡核苷酸、胆固醇、GalNAc和核酸适体。

在本发明的一个特征中，asdDNA分子用于调节细胞(例如真核细胞，如哺乳动物细胞)中的基因表达或功能。

在某些实施方案中，靶标RNA，根据本发明原理决定了asdDNA分子的至少部分核苷酸单体序列，选自mRNA或非编码RNA，其中这些RNA或者编码与疾病有关的蛋白质或者调控与疾病有关的部分生物学通路。在各种实施方案中，这种靶标RNA可选自：与人类或动物的疾病或病症有关的基因的mRNA；致病微生物的基因的mRNA；病毒RNA，和与选自由自身免疫性疾病、炎症性疾病、退行性疾病、传染性疾病、增殖性疾病、代谢性疾病、免疫介导的紊乱、过敏性疾病、皮肤病、恶性病、胃肠道疾病、呼吸系统疾病、心血管疾病、肾脏疾病、类风湿性疾病、神经系统疾病、内分泌紊乱，和衰老相关疾病或紊乱组成的组的疾病或紊乱有关的RNA。

在一个实施方案中，本发明提供一种非对称短双链体DNA(asdDNA)分子，其包含第一链和第二链，每条链包含连接的核苷酸单体，其中核苷酸单体选自下组：核苷酸、其类似物和经修饰的核苷酸，其中：(a)第一链比第二链长至少选自下组数量的单体：1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个；(b)第一链通过至少一个靶向区与靶标RNA的靶标片段基本上互补，其中第一链由10-36个(范围的两个端点均包括在其中)通过键连接着的核苷单体组成，其中键选自由相邻单体间的硫代磷酸酯键，磷酸二酯键，和硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合组成的组；(c)第二链与第一链基本上互补，与第一链形成至少一个双链区，其中第二链由8-32个(范围的两个端点均包括在其中)通过键连接着的核苷单体组成，其中键选自由相邻单体间的硫代磷酸酯键，磷酸二酯键，和硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合组成的组；(d)asdDNA分子包含至少一个核糖核苷酸单体间隔片段(ISR)与至少一个脱氧核糖核苷酸单体相连，其中脱氧核糖核苷酸单体选自由脱氧核糖核苷酸，其类似物和经修饰的脱氧核糖核苷酸组成的组；(e)asdDNA分子的ISR包含至少一个核糖核苷酸单体，其中核糖核苷酸单体选自由核糖核苷酸，其类似物和经修饰的核糖核苷酸组成的组。在一个特征中，asdDNA分子用于调节细胞(例如真核细胞，如哺乳动物细胞)中的靶标基因表达或功能。在另一个特征中，asdDNA分子在细胞中使靶标基因表达的沉默作用比对应的ASO更强或更有效。

第二方面，本发明提供了一种药物组合物，包含作为活性剂的第一方面的组合物，和其药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。此类载体的实例包括，但不限于：药物载体、正电荷载体、脂质体、脂质纳米颗粒、蛋白质载体、疏水部分或分子、阳离子部分或分子、GalNAc、多糖聚合物、纳米颗粒、纳米乳剂、胆固醇、脂质、亲脂性化合物或部分、以及类脂。

第三方面，本发明提供了一种使用第一方面的组合物或第二方面的药物组合物以治疗或预防疾病或病症的方法，通过施用治疗有效量的本发明的asdDNA分子或包含该asdDNA分子的药物组合物。施用方法选自以下途径：静脉注射(iv)、皮下注射(sc)、口服(po)、肌肉注射(im)、经口施用、吸入、局部、鞘内和其它部位的施用方式。

在一个特征中，被预防性或治疗性治疗的疾病或病症选自下组：癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、退行性疾病、传染性疾病、增殖性疾病、代谢性疾病、免疫介导的紊乱、过敏性疾病、皮肤病、恶性病、胃肠道疾病、肝脏疾病、呼吸系统疾病、心血管疾病、皮肤病、肾脏疾病、类风湿疾病、神经系统疾病、精神疾病、内分泌紊乱和与衰老相关疾病或紊乱。

第四方面，本发明提供了一种使用第一方面的组合物或第二方面的药物组合物以调控或调节真核细胞中的基因表达或基因功能的方法。该方法包括以下步骤：使细胞与有效量的本发明的任一asdDNA分子或包含该asdDNA分子的药物组合物接触。

在一个实施方案中，所述接触步骤包括以下步骤：将包含所述asdDNA分子的组合物引入可以发生选择性基因沉默的培养中的靶细胞或生物体中。在进一步的实施方案中，引入步骤是选自由以下组成的组：简单混合、转染、脂质转染、电穿孔、感染、注射、经口施用、静脉注射(iv)、皮下注射(sc)、口服(po)、肌肉内(im)注射、吸入、局部、鞘内和和其它部位的施用方式。在另一个实施方案中，引入步骤包含使用药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，其中药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂选自下组：包括药物载体、正电荷载体、脂质纳米颗粒、脂质体、蛋白质载体、疏水部分或分子、阳离子部分或分子、GalNAc、多糖聚合物、纳米颗粒、纳米乳剂、胆固醇、脂质、亲脂性化合物或部分、以及类脂。

在某些实施方案中，靶标基因是mRNA。在某些实施方案中，靶标基因是例如microRNA和IncRNA的非编码RNA。

在一个实施方案中，靶标基因与哺乳动物的疾病、病理状况或不良状况相关。在进一步的实施方案中，靶标基因是病原微生物的基因。在更进一步的实施方案中，靶标基因是病毒基因。在另一个实施方案中，靶标基因是肿瘤相关基因。在又一个实施方案中，靶基因是与选自在第三方面列出的疾病群组相关的基因。

在另一方面，本发明提供的一种非对称寡聚双链体包含(a)一个或多个脱氧核糖核苷、其类似物或经修饰的脱氧核糖核苷，和(b)一个或多个ISR连接到至少8个核碱基长度的反义序列中，其中ISR包含核糖核苷，其类似物或经修饰的核糖核苷。反义序列至少70％与靶序列互补。

根据本文提供的附加描述(包括不同的实施例)，本发明的其它特征和优点是显而易见的。所提供的实施例示出了在实施本发明时有用的不同组分和方法。实施例不限制所要求保护的发明。根据本公开的内容，本领域的技术人员可以确认和采用对实施本发明有用的其它组分和方法。已经显示和描述了几个实施方案，但是在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行任何修改。

附图简述

图1显示了代表性靶标基因，和实施例使用的代表性靶标序列，以及可用于沉默靶标基因的相应的反义链分子的示例性序列。

图2A示出了非对称短双链体DNA(asdDNA)的一些实施方案的示例性结构，其中asdDNA在反义链(第一链)和/或有义链(第二链)中具有至少一个核糖核苷酸单体间隔片段(ISR)。本文所描述的每个双链体中，有义链都列在反义链的上方。图2B显示了具有图2A结构的靶向APOIII基因的asdDNA示例性序列。图2C显示了靶向APOIII的asdDNA(图2B)的基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图3A示出了在反义链中具有至少一个ISR的asdDNA的一些实施方案的示例性结构。图3B显示了具有图3A结构的靶向APOIII基因的asdDNA示例性序列。图3C显示了靶向APOIII的asdDNA(图3B)的基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图4A示出了asdDNA的一些实施方案的示例性结构，其中asdDNA具有未经修饰的DNA有义链和至少一个ISR的反义链。图4B显示了图4A中靶向APOIII基因的asdDNA示例性序列。图4C显示了靶向APOIII的asdDNA(图4B)的基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图5A示出了在反义链具有各种ISR基序的asdDNA示例性结构，以及靶向APOIII基因的asdDNA示例性序列。图5A中反义链中的各种ISR基序具有不同数量的核糖核苷酸单体和在反义链中的不同位置的ISR。图5B显示了靶向APOIII基因的asdDNA(图5A)的基因沉默效力以及与对应的ASO的基因沉默效力的比较(每个对应的ASO与图5A中每个asdDNA的反义链序列相同)。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA和对应ASO后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图6A示出了在反义链中具有不同位置的ISR的asdDNA的一些实施方案的示例性结构，以及靶向APOIII基因的asdDNA示例性序列。图6B显示了在图6A中靶向APOIII基因的asdDNA的基因沉默效力以及与对应的ASO的基因沉默效力的比较(每个对应ASO与图6A中每个asdDNA的反义链序列相同)。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA和对应的ASO后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图7A显示了具有不同反义链长度的asdDNA的一些实施方案的示例性结构，以及靶向APOIII基因的asdDNA示例性序列。图7B显示了在图7A中靶向APOIII基因的asdDNA的基因沉默效力，以及与对应的ASO的基因沉默效力的比较(每个对应ASO与图7A中每个asdDNA的反义链序列相同)。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA和对应的ASO后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图8A显示了具有不同长度的反义链和有义链基序的asdDNA的一些实施方案的示例性结构和序列。图8B显示了在图8A中靶向APOIII基因的asdDNA的基因沉默效力。图8C显示了与图8A中每个asdDNA的反义链序列相同的对应的ASO的APOCIII基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA和对应的ASO后，检测APOIIIC基因相对mRNA水平的基因沉默效力。

图9A显示了具有不同长度的反义链和有义链基序的asdDNA的一些实施方案的示例性结构和序列。图9B显示了在图9A中所示的asdDNA的APOCIII基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图10A显示了具有各种长度的有义链和固定长度的反义链的asdDNA的一些实施方案的示例性结构和序列。图10B显示了在图10A中所示的asdDNA的APOCIII基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图11A也显示了具有各种长度的有义链和固定长度的反义链的asdDNA的另一些实施方案的示例性结构和序列。图11B显示了在图11A中所示的asdDNAd的APOCIII基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDN后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图12A也显示了具有各种长度的反义链和固定长度的有义链的asdDNA的另一些实施方案的示例性结构和序列。图12B显示了在图12A中所示的asdDNA的APOCIII基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDN后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图13A显示了在反义链中具有各种ISR基序的asdDNA的一些实施方案的示例性结构和序列。图13B显示了在图13A中所示的asdDNA的APOCIII基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDN后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图14A显示了asdDNA的一些实施方案的示例性结构和序列，当反义链与靶标基因杂交时，该asdDNA的反义链中至少有一个错配。图14B显示了在图14A中所示的asdDNA的APOCIII基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图15A显示了asdDNA的一些实施方案的示例性结构和序列，当有义链与反义链形成双链区时该asdDNA的有义链中至少有一个错配，。图15B显示了在图15A中所示的asdDNA的APOCIII基因沉默效力。在HepaRG细胞转染100pM的asdDNA后，检测APOIIIC基因的相对mRNA水平。

图16A显示了靶向STAT3基因的本发明示例性asdDNA和与其对应的siRNA的结构和序列，以及由IC50和IC90值确定的asdDNA和siRNA的基因沉默效力之间的对比。图16B示出了在HepaRG细胞中，图16A中所示的asdDNA和siRNA分别在100pM，1nM和10nM浓度下的基因沉默效力对比。

图17显示了靶向APOCIII基因的示例性asdDNA的结构、序列和基因沉默效力与其对应的ASO的对比。

图18显示了靶向APOB基因的示例性asdDNA的结构、序列和基因沉默效力与其对应的ASO的对比。

图19显示了靶向TTR基因的示例性asdDNA结构、序列和基因沉默效力与其对应的ASO的对比。

图20显示了靶向STAT3基因的示例性asdDNA的结构、序列和基因沉默效力。

图21显示了靶向β-Catenin基因的示例性asdDNA的结构、序列，以及在DLD1细胞中，asdDNA分别在100pM、200pM、1nM、3nM、10nM和30nM浓度下的基因沉默效力。

发明详述

本发明涉及短双链体DNA的基因或RNA调节/沉默技术。这项新技术通过使用非对称短双链体DNA(asdDNA)组合物用于在体外和体内调节基因表达或功能。本发明还提供了使用该组合物调节靶基因的表达或功能，或用于治疗或预防疾病以及用于其它医学和生物学应用的方法。这些组合物和方法在调控基因表达或基因功能方面提供了高效力，而且还降低了剂量依赖性毒性。

1.定义

如本文所使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式的“一”、“一个”、“该”包括其复数形式。例如：术语“一个细胞”包含多个细胞，包括它们的混合物。

当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展这些数值的上下边界来限定该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于以高于和低于设定值20％、10％、5％或1％的变化幅度来限定该数值。在一些实施方案中，术语“约”用于以高于和低于设定值10％的变化幅度来限定该数值。在一些实施方案中，术语“约”用于以高于和低于设定值5％的变化幅度来限定该数值。在一些实施方案中，术语“约”用于以高于和低于设定值1％的变化幅度来限定该数值。

如本文所使用的，术语“类似(analog)”或“类似物(analogue)”可互换地表示功能上或结构上等效。例如，几十年来核苷和核苷酸类似物一直用于癌症和病毒感染的临床治疗，且研究人员和制药行业在不断合成和评估新化合物，参见，例如Jordheim L.P.et al.,Nat Rev Drug Discov 12,447-464(2013)。

如本文所使用的，术语“脱氧核糖核苷单体”是指包括天然存在的脱氧核糖核苷、其类似物和经修饰的脱氧核糖核苷的核苷单体。术语“脱氧核糖核苷酸单体”是指包括天然存在的脱氧核糖核苷酸、其类似物和经修饰的脱氧核糖核苷酸的核苷酸单体。

如本文所使用的，术语“核糖核苷单体”是指包括天然存在的核糖核苷、其类似物和经修饰的核糖核苷的核苷单体。术语“核糖核苷酸单体”是指包括天然存在的核糖核苷酸、其类似物和经修饰的核糖核苷酸的核苷酸单体。

如本文所使用的，术语“核苷”是指包含核碱基部分和糖部分的化合物。核苷单体包括，但不限于天然存在的核苷(例如，分别在DNA和RNA中发现的脱氧核糖核苷和核糖核苷)、其类似物和经修饰的核苷。核苷单体可以是脱氧核糖核苷单体或核糖核苷单体。例如，核苷单体可以与磷酸部分相连接以形成核苷酸单体。

如本文所使用的，术语“核苷酸”是指核苷进一步包含磷酸连接基团。核苷酸单体包括，但不限于天然存在的核苷酸(例如，分别在DNA和RNA中发现的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)、其类似物和经修饰的核苷酸。核苷酸单体可以是脱氧核糖核苷酸单体或核糖核苷酸单体。经修饰的核苷酸可以在以下中的一处或多处被修饰：含氮核碱基部分、五碳糖部分和导致核苷间键变化的磷酸连接基团。

如本文所使用的，术语“寡核苷酸(缩写为oligo)”或“寡核苷酸(oligonucleotide)”是指包含多个连接着的核苷单体的化合物。在某些实施方案中，一个或多个核苷单体被修饰，或一个或多个核苷间键被修饰。

术语“脱氧核苷”和“脱氧核糖核苷”在本文中可互换地使用。术语“脱氧核苷酸”和“脱氧核糖核苷酸”在本文中也可互换地使用。如本文所使用的，“脱氧核苷”或“脱氧核苷酸”分别是含有脱氧的糖部分的核苷或核苷酸。

如本文所使用的，在“短双链体DNA(sdDNA)”或“非对称短双链体DNA(asdDNA)”中的术语“双链体DNA”是指由两条核苷酸单体链组成的分子，他们相互杂交形成双链体寡核苷酸，并与细胞接触或施用于受试者，其中关键的RNA靶向的基序中的大多数，即50％或更多的，相连的核苷酸单体是脱氧核糖核苷酸单体，包含经修饰的脱氧核糖核苷酸。

如本文所用，术语“基序(motif)”是诸如在反义链或有义链中的化学上不同的区域的模式。

如本文所使用的，术语“紧邻”是指在两个元件之间，例如在区域、片段、核苷酸和/或核苷之间不存在介入的元件。

如本文所使用的，术语“经修饰的核苷酸”是指具有至少一个经修饰的糖部分、经修饰的核苷间键和/或经修饰的核碱基的核苷酸。

如本文所使用的，术语“经修饰的核苷”是指具有至少一个经修饰的糖部分和/或经修饰的核碱基的核苷。

如本文所使用的，术语“经修饰的寡核苷酸”是指包含至少一个经修饰的核苷酸的寡核苷酸。

如本文所使用的，术语“天然存在的核苷间键”是指3’至5’的磷酸二酯键。

如本文所使用的，术语“经修饰的核苷间键”是指来自天然存在的核苷间键的取代或任何变化。例如，硫代磷酸酯键是一种经修饰的核苷间键。

如本文所使用的，术语“天然的糖部分”是指天然存在于DNA(2-H)或RNA(2-OH)中的糖。

如本文所使用的，术语“经修饰的糖”是指来自天然的糖部分的取代或变化。例如，经2'-O-甲氧基乙基修饰的糖是一种经修饰的糖部分。

如本文所使用的，术语“双环糖”是指通过桥接两个非双环原子而修饰的呋喃糖基(furosyl)环。双环糖是一种经修饰的糖。

如本文所使用的，术语“双环核酸”、“BNA”、“双环核苷”或“双环核苷酸”是指核苷或核苷酸的呋喃糖部分包括连接呋喃糖环上的两个碳原子的桥连基从而形成双环糖系统的核苷或核苷酸。

如本文所使用的，术语“2'-O-甲氧基乙基”(也称为2'-MOE、2'-O(CH₂)₂—OCH₃和2'-O-(2-甲氧基乙基))是指呋喃糖基环的2'位被O-甲氧基乙基修饰。经2'-O-甲氧基乙基修饰的糖是一种经修饰的糖。如本文所使用的，术语“2'-O甲氧基乙基核苷酸”(也称为2'-MOE RNA)是指一种包含经2'-O甲氧基乙基修饰的糖部分的修饰的核苷酸。

如本文所使用的，术语“经修饰的核碱基”是指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之外的任何核碱基。例如，5-甲基胞嘧啶是一种经修饰的核碱基。相反地，如本文中所使用的“未经修饰的核碱基”是指嘌呤碱基的腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基的胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。

如本文所使用的，术语“5-甲基胞嘧啶”是指连接于5'位的甲基基团修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是一种经修饰的核碱基。

如本文所使用的，“RNA样核苷酸”是指一种在掺入寡核苷酸时采用Northern构型并且功能类似RNA的经修饰的核苷酸。RNA样核苷酸包括，但不限于：2'-内呋喃糖核苷酸、桥接核酸(BNA)、LNA、cEt、2'-O-甲基化核酸、2'-O-甲氧基乙基化(2'-MOE)核酸酸，2'-氟化核酸，2'-O-氨丙基化(2'-AP)核酸，己糖醇核酸(HNA)、环己烷核酸(CeNA)、肽核酸(PNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、吗啉代核酸、三环DNA(tcDNA)和RNA替代物。

如本文所使用的，“DNA样核苷酸”是指一种在掺入寡核苷酸时功能类似于DNA的修饰核苷酸。DNA样核苷酸包括，但不限于2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖(FANA)核苷酸和DNA替代物。

如本文所使用的，“非编码RNA”是指不翻译成蛋白质的RNA分子。非编码RNA的例子包括转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，以及小非编码RNA和长ncRNA(lncRNA)。如本文所使用的，“小非编码RNA”的例子包括，但不限于：microRNA(miRNA)、asRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA和任何前述模拟物(mimic)。如本文所使用的，“lncRNA”、“长非编码RNA”是一种包含超过200个不编码蛋白质的核苷酸的转录的RNA分子。LncRNA还可以进行常见的转录后修饰，包括5’-加帽、3’-多聚腺苷酸化和剪接。一般来说，IncRNA是一类多样化的分子，在调控基因和基因组的功能中发挥着各种作用。例如，众所周知lncRNAs调控基因转录、翻译和表观遗传调控。IncRNA的实例包括，但不限于：Kcnqlotl、Xlsirt、Xist、ANRIL、NEAT1、NRON、DANCR、OIP5-AS1、TUG1、CasC7、HOTAIR和MALAT1。如本文所使用的，“剪接”是指去除不必要的RNA区域并改造RNA的自然过程。通过寡核苷酸，包括其双链体，调节RNA靶功能的一个例子是对非编码RNA功能的调节。在一些实施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸双链体是为靶向前述的小非编码RNA之一设计的。在一些实施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸双链体是为靶向miRNA设计的。在一些实施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸双链体是为靶向pre-miRNA设计的。在一些实施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸双链体是为靶向lncRNA设计的。在一些实施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸双链体是为靶向剪接体设计的。

如本文所使用的，术语“分离的”或“纯化的”是指材料基本上不含在其天然状态下通常伴随它的组分。纯度和均一性通常使用分析化学技术来确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳法或高效液相色谱法。

如本文所使用的，术语“间隔(的)”是指在相邻空间具有不同种类的部分，例如，不同种类的核苷酸或核苷酸类似物、相同种类的核苷酸或核苷酸类似物的不同修饰。在本发明的各种实施方案中，“核糖核苷酸单体间隔片段(ISR)”是指在寡核苷酸链中的一段核糖核苷酸，其具有一个或多个核糖核苷酸，并与至少一个与所述核糖核苷酸不同种类的部分连接着。例如：如果所述核糖核苷酸是未修饰的，则不同种类的部分可以是脱氧核苷酸或其类似物、经修饰的脱氧核苷酸、经修饰的核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物。如果所述核糖核苷酸是经修饰的，则不同种类的部分可以是脱氧核苷酸或其类似物、经修饰的脱氧核苷酸、未经修饰的核糖核苷酸、经不同修饰的核糖核苷酸或不同种类的核糖核苷酸类似物。

如本文所使用的，“调节”、“调控”及其语法上的等同物指的是增加或减少(例如沉默)，换句话说，上调或下调。如本文所使用的，“基因沉默”是指基因表达的减少，并且可以指靶标基因的基因表达减少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

如本文所使用的，当用于生物活性的语境中时，术语“抑制”、“以抑制”及其语法上的等同物是指生物活性的下调，可能降低或消除靶标功能(例如蛋白质的产生，或分子磷酸化)。在特定实施方案中，抑制可指靶标活性降低约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。当用于紊乱或疾病的语境中使用时，该术语指成功预防症状的发作、减轻症状或消除疾病、状况(疾病)或紊乱。

如本文所使用的，术语“基本上互补的”或“互补的”是指在具有连接着的核苷的两条链之间的碱基配对的双链区中的互补性，而不是任何单链区(例如末端的突出端或两个双链区域之间的间隙区)。互补性是不需要完全的；例如，在两条具有连接着的核苷的链之间可能存在任意数量的碱基对错配。然而，如果错配的数目众多以至于即使在最不严格的杂交条件下也不会发生杂交，则该序列不是基本上互补的序列。具体而言，当在本文中的两个序列被称为“基本上互补”时，是指这些序列彼此充分互补，可在选择的反应条件下杂交。足以实现特异性的核酸互补性和杂交严格性的关系是本领域熟知的。两条基本上互补的链可以是例如，完全互补的，或可以包含1个到多个错配，只要杂交条件足以允许，例如区分配对序列和非配对序列。因此，基本上互补的序列可以指在双链区中具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、或介于上述任意两数字之间任何数字的碱基对互补性序列。

如本文所使用的，“完全互补”或“100％互补”是指具有连接着的核苷的第一链的核苷碱基序列中的每个核苷碱基在具有连接着的核苷的第二链的第二核苷碱基序列中具有互补的核苷碱基。在某些实施方案中，具有连接着的核苷的第一链是反义化合物，具有连接着的核苷的第二链是靶标核酸。在某个实施方案中，具有连接着的核苷的第一链是有义化合物，具有连接着的核苷的第二链是反义化合物，反之亦然。

如本文所使用的，术语“靶向区”是指寡核苷酸链中与另一条寡核苷酸链基本上或完全互补的区域，使得在合适的条件下，两条链在该靶向区处彼此杂交或退火。例如，反义链可以包括靶向区域，通过该靶向区域其可以与靶标mRNA杂交。

术语“施用”(“administer”、“administering”、“administration”)在本文中以其最宽泛的含义使用。这些术语是指给受试者引入本文所述的化合物或药用组合物的任何方法，可以包括，例如，全身地、局部地或原位地将所述化合物引入给受试者。因此，本文公开的化合物由组合物(无论组合物是否包括该化合物)在受试者体内产生的包含在这些术语中。当这些术语与“全身的”或“全身地”结合使用时，它们通常指化合物或组合物在体内全身的吸收或蓄积在血液中，随后在全身分布。

如本文中所使用的，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以影响预期结果的本文所述的化合物或药物组合物的量，所述预期结果包括但不限于疾病治疗，如下所示。在一些实施方案中，“治疗有效量”是指能够对以下的有效的量：可检测到的杀死或抑制癌细胞的生长或扩散、肿瘤的大小或数量、和/或癌症的水平、阶段、进展和/或严重程度的其他测量。在一些实施方案中，“治疗有效量”是指全身，局部或原位施用的量(例如，在受试者中原位产生的化合物的量)。治疗有效量可以根据预期应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病状况而变化(例如受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等等)，这些可以由本领域的普通技术人员容易地确定。该术语也适用于在靶细胞中诱导特定应答的剂量，例如，减少细胞迁移。具体剂量可以根据以下而变化：例如，特定的药物组合物、受试者及其年龄和现有的健康状况或健康状况的风险、要遵循的剂量方案、疾病的严重程度、是否与其它药剂联合施用、施用时间、施用的组织以及载有它的物理递送系统。

在受试者中，术语“癌症”是指存在具有致癌细胞典型特征的细胞，例如不受控制的增殖、永生性、转移潜能、快速生长和增殖率以及某些形态特征。通常，癌细胞会以肿瘤或肿块的形式存在，但癌细胞也可能单独存在于受试者体内，或者可能作为独立的细胞在血流中循环，例如白血病或淋巴瘤细胞。如本文所用的癌症的实例包括，但不限于：肺癌、胰腺癌、骨癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤黑色素瘤或眼内黑色素瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、腹膜癌、结肠癌、直肠癌、结直肠腺癌、肛门区域癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、胃肠癌、胃腺癌、肾上腺皮质癌(adrenocorticoid carcinoma)、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、胃食管结合部癌、胃食管腺癌、软骨肉瘤、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尤文氏肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸癌、输尿管癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、肾癌、肾细胞癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤、包括上述任何癌症的难治情形、或上述癌症中的一种或多种的组合。一些示例的癌症包括在一般术语中并且包括在本术语中。例如，一般术语泌尿系统癌症包括膀胱癌、前列腺癌、肾癌、睾丸癌等；而另一个一般术语肝胆系统癌症包括肝癌(其本身是包括肝细胞癌或胆管癌在内的一般术语)、胆囊癌、胆管癌或胰腺癌。本公开的内容涵盖泌尿系统癌症和肝胆系统癌症，并包括在术语“癌症”中。

术语“药物组合物”是含有诸如本文所公开的分子或组合物作为活性成分的制剂，通常与其它物质(例如药物载体，如无菌水)混合以形成适合施用于受试者的形式。在一个实施方案中，药物组合物是散装形式或单位剂型。单位剂型是多种形式中的任一种，包括，例如：胶囊、IV袋、片剂、气溶胶吸入器上的单泵、或小瓶。组合物的单位剂量中活性成分的量是一种有效量并且根据所涉及的具体治疗而变化。本领域技术人员将理解有时需要根据患者的年龄和状况对剂量进行常规调整。剂量还将取决于施用途径。多种途径被考虑，包括口服、肺部、直肠、肠胃外、透皮、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内等。本发明的asdDNA的局部或透皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏剂、乳液、凝胶、溶液剂、贴剂和吸入剂。

术语“药剂”是指当施用于个体时可提供治疗获益的物质。

术语“药学上可接受的载体”是指不干扰化合物结构的介质或稀释剂。某些这样的载体能够使药物组合物配制成例如片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体制剂、凝胶、糖浆剂、浆液、悬浮液和口含锭以便由受试者口服摄入。某些这样的载体能够使药物组合物配制用于注射、输注或局部施用。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液。

术语“药学上可接受的衍生物”包括本文所述化合物的衍生物，例如溶剂化物、水合物、酯、前药、多晶型物、异构体、同位素标记的变体、药学上可接受的盐和本领域已知的其它衍生物。

术语“药学上可接受的盐”是指化合物在生理学和药学上可接受的盐，即保留母体化合物所需的生物活性且不会赋予其不需要的毒理学作用的盐。术语“药学上可接受的盐”或“盐”包括由母体化合物与药学上可接受的无毒的酸或碱(包括无机或有机的酸和碱)反应制备的盐。本文所述的化合物的药学上可接受的盐可以通过本领域熟知的方法制备。关于药学上可接受的盐的综述，参见Stahl and Wermuth,Handbook of PharmaceuticalSalts:Properties,Selection and Use(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)。药学上可接受的盐包括，但不限于：包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐和酒石酸盐的酸加成盐；如Na、K、Li的碱金属阳离子盐，如Mg或Ca的碱土金属盐，或有机胺盐。特别地，寡核苷酸的钠盐已被证明是可用的并且被普遍接受用于治疗性施用于人类。因此，在一个实施方案中，本文所述的化合物是钠盐形式。

如本文所使用的，术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括，但不限于人类、非人类灵长类动物、啮齿类动物等，受试者是特定治疗的接受者。通常，就人类受试者而言，术语“受试者”和“患者”在本文可互换地使用。

如本文所使用的，术语如“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“以治疗(totreat)”、“减轻(alleviating)”或“以减轻(to alleviate)”是指(1)诊断的病理病症或紊乱的治愈、减缓、症状减轻和/或进展停止的治疗措施，和(2)预防或减缓靶标病理状况或紊乱的预防性(prophylactic)或防预性(preventative)措施。因此那些需要治疗的人，包括那些已经患有这种紊乱的人；那些容易发生紊乱的人；以及那些需要预防紊乱的人。如果受试者表现出以下一项或多项，则表示根据本发明的方法成功地“治疗”了该受试者：癌细胞的数量减少或完全不存在；肿瘤大小减小；癌细胞浸润到外周器官(包括癌症扩散到软组织和骨骼中)的抑制或不存在；肿瘤转移的抑制或不存在；肿瘤生长的抑制或不存在；与特定癌症相关的一种或多种症状的缓解；发病率和死亡率的降低；和生活质量的提高。

如本文所使用的，术语“载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如，参与或能够将主体药物化合物由一种器官或身体部分携带或运输至另一器官或身体部分的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。就与制剂中的其它成分相容且对患者无害这一意义上而言，各载体必须是“可接受的”。药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂的非限制性实例包括：例如乳糖、葡萄糖和蔗糖的糖类；例如玉米淀粉和马铃薯淀粉的淀粉；如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素的纤维素及其衍生物；粉状黄蓍胶；麦芽(malt)；明胶；滑石粉；例如可可脂和栓剂蜡的赋形剂；例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油的油类；例如丙二醇的二醇类；例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇的多元醇；例如油酸乙酯和月桂酸乙酯的酯类；琼脂；例如氢氧化镁和氢氧化铝的缓冲剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；Ringer's溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和其它用于药物制剂的无毒相容物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂(例如月桂基硫酸钠、硬脂酸镁和聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物)、以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和香料剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

2.某些实施方案

本发明的某些实施方案提供了一种双链体组合物，其中反义链和有义链均由连接着的核苷单体组成。在关键RNA靶向基序中，50％或更多的核苷单体是脱氧核糖核苷单体，或者50％或更多的核碱基对在asdDNA分子双链区的一条链上包含脱氧核糖核苷单体，其中包含的一些脱氧核糖核苷单体和/或核苷间键可以是修饰的，即对源自天然DNA中的那些结构的修饰。本发明的双链体DNA进一步的包含一个或多个在核糖核苷酸单体间隔片段(ISR)中的核糖核苷单体。一个或多个ISR可能存在于反义链或有义链，或两者中均存在。在一些实施方案中，每个ISR独立地由1个核糖核苷酸单体组成，或由2、3、4或5个连续的核糖核苷酸单体组成。在一些实施方案中，ISR具有至少两个连续的且连接着的核糖核苷酸单体。

本发明的双链体分子的反义链和有义链都相对较短的，其中反义链在两者中相对较长，因此称作“非对称短双链体DNA(asdDNA)”。

图2A、3A、4A、5A、6A、7A、17、18、19、20显示了本发明的双链体分子的示例性结构，其中在几乎所有双链体中ISR在两条链中均存在或仅存在于较长的反义链中，图5A中最后一个结构除外，其ISR仅存在于较短的有义链中，这也是唯一一个双链体分子在100pM浓度时显示相对较低的基因沉默活性。

在一些实施方案中，反义链和有义链之间长度的非对称性导致在反义链的5'端(例如图2A中右侧的前三个结构)或3’端(例如图2A中左侧的前十个结构)的至少一个突出端，和是平末端或凹陷端的另一端。在其它实施方案中，反义链的两端都有突出端(例如图2A中右侧的最后十三个结构)。

本发明的组合物可用于以至少三种方式调节真核细胞中的基因表达或功能：(i)使一种asdDNA分子与细胞接触或施用于受试者；(ii)使不同种类的asdDNA分子在不同时间与细胞接触或不同时间分别施用于受试者；(iii)使不同种类的asdDNA分子同时与细胞接触或施用于受试者。

在某些实施方案中，反义寡核苷酸链包括被称为“靶向区”的核碱基序列区，其至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％与所靶向的靶标基因的靶标片段互补，其中靶标基因包括mRNA和非编码RNA。在某些实施方案中，反义寡核苷酸链具有的核碱基序列包含与靶向的靶标基因的靶标片段完全互补的序列。在某些实施方案中，反义寡核苷酸链具有的核碱基序列，当其与靶向的靶标基因的靶标片段杂交时，包含不超过1、2或3个的错配。在某些实施方案中，靶标基因选自与哺乳动物疾病有关的mRNA或非编码RNA。在某些实施方案中，至少一个ISR分布在反义链的靶向区。在某些实施方案中，ISR位于或者靠近(即在该链长度的三分之一以内，例如，对于大约21个核碱基长的链，从末端起数的7个核碱基以内)反义链的5’端。可选的，ISR位于或者靠近(即在该链长度的三分之一以内，例如，对于大约21个核碱基长的链，从末端起数的7个核碱基以内)反义链的3’端。在一些实施方案中，ISR或至少ISR的一部分也位于反义链的更中心的部分，即在反义链长的中间三分之一长度处，例如，对于约21个核碱基长的反义链，距反义链两端都超过7个核碱基的位点。

在各种实施方案中，第一链/反义链具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个连接着的核苷酸单体的主链长度，或其等值长度，或由上述任意两数值括起来的长度范围(范围的两个端点值均包括在其中)。例如，第一链或反义链的一些长度范围包括：8-50个核苷酸单体；8-36个核苷酸单体；8-33个核苷酸单体；10-30个核苷酸单体；10-29个核苷酸单体；12-29个核苷酸单体；12-28个核苷酸单体；12-26个核苷酸单体；12-25个核苷酸单体；13-25个核苷酸单体；13-24个核苷酸单体；13-23个核苷酸单体；15-23个核苷酸单体；10-36个核苷酸单体；12-36个核苷酸单体；12-32个核苷酸单体；14-36个核苷酸单体和至少8核苷酸单体。

在某些实施方案中，反义寡核苷酸链的长度为10到36个(范围的两个端点值均包括在其中)核苷酸单体。换句话说，反义链是10到36个(范围的两个端点值均包括在其中)连接着的核碱基单体。在其它实施方案中，反义链包含经修饰的寡核苷酸，其由8至100、10至80、12至50、14至30、15至23、16至22、16至21或20个(范围的两个端点值均包括在其中)连接着的核碱基组成。

在某些实施方案中，反义寡核苷酸链由13-23个(范围的两个端点值均包括在其中)连接着的核苷酸单体组成。在某些实施方案中，反义寡核苷酸链由23个连接着的核苷酸单体组成。在某些实施方案中，反义寡核苷酸链由20个连接着的核苷酸单体组成。在某些实施方案中，反义寡核苷酸链由16个连接着的核苷酸单体组成。

在某些实施方案中，有义链包含与反义链基本上互补的核碱基序列，并且其核碱基序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(以有义链的全部核碱基序列为计)与反义寡核苷酸连接着的区域的序列互补。这些来自两条链的基本上互补的序列形成一个或多个双链区。在某些实施方案中，有义链具有包含与反义链连接着的区域的序列完全互补的核碱基序列。在一些实施方案中，至少一个ISR分布于有义链的双链区。

在某些实施方案中，ISR位于或者靠近(从所述末端起数的核碱基总数33％内)有义链的5’端，或ISR位于或者靠近(从所述末端起数的核碱基总数33％内)有义链的3’端。在一些实施方案中，ISR或ISR的至少一部分也位于有义链的更中心部分，即距有义链两端都超过核碱基总数33％的位点。在一些实施例中，ISR分布在有义链中不是必需的。

在一个特征中，有义寡核苷酸链的长度比反义寡核苷酸链短。在某些实施方案中，有义链具有的长度是反义链长度的约一半至约全长。在某些实施方案中，有义链具有的长度是反义链长度的约四分之一至约全长。在某些实施方案中，有义链的长度为6至29个(范围的两个端点值均包括在其中)核苷酸单体。换句话说，有义链是6至29个(范围的两个端点值均包括在其中)连接着的核碱基单体。在其它实施方案中，有义链包含由13、4至30、6至16、10至20，或12至16个(范围的两个端点值均包括在其中)连接着的核碱基组成的寡核苷酸。在某实施方案中，有义链包含寡核苷酸，其中寡核苷酸由长度为以下的连接着的核碱基组成：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和49个，或由上述任意两数值定义的范围(范围的两个端点值均包括在其中)。在一些实施方案中，有义链是有义寡核苷酸。

在一个特征中，第二链或有义链具有的主链长度比第一链或反义链的短以下数量个核苷酸单体：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38。在各种实施方案中，第二链或有义链具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个连接着的核苷酸单体的主链长度，或其等值长度，或由上述任意两数值括起来的长度范围(范围的两个端点值均包括在其中)。例如，在某些实施方案中，第二链(有义链)的一些长度范围包括：6-49个核苷酸单体，8-46个核苷酸单体，8-35个核苷酸单体，9-35个核苷酸单体，10-46个核苷酸单体，10-40个核苷酸单体，10-34个核苷酸单体，8-32个核苷酸单体，8-30个核苷酸单体，8-29个核苷酸单体，9-29个核苷酸单体，9-26个核苷酸单体，9-25个核苷酸单体，10-29个核苷酸单体，10-28个核苷酸单体，10-26个核苷酸单体，10-25个核苷酸单体，11-24个核苷酸单体，11-23个核苷酸单体，12-23个核苷酸单体，13-23个核苷酸单体，12-22个核苷酸单体，13-23个核苷酸单体，15-23个核苷酸单体和至少6个核苷酸单体。在某些实施例中，在第二链能够与第一链形成热力学稳定的双链体情况下，第二链可以具有任何数量的核苷酸单体的主链长度。

在某些实施方案中，有义链比反义链短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸单体。在某些实施方案中，有义链由8-23(范围的两个端点值均包括在其中)个连接着的核苷酸单体组成。在某些实施方案中，有义链由13个连接着的核苷酸单体组。在某些实施方案中，有义链由15个连接着的核苷酸单体组成。

在本发明的各种实施方案中，反义链的两个末端是以下配置中的一种：3’突出端和5’突出端，3’突出端和5’端平末端，5’突出端和3’端平末端，3’突出端和5’凹陷端，或5’突出端和3’凹陷端。

在某些实施方案中，反义链的3’突出端具有的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸单体。在各种实施方案中，反义链的3’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体(范围的两个端点值均包括在其中)。

在某些实施方案中，反义链的5’突出端具有的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸单体。在各种实施方案中，反义链的5’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体(范围的两个端点值均包括在其中)。

在本发明的一个实施方案中，反义链具有1-15(范围的两个端点值均包括在其中)个核苷酸单体的3’突出端和1-15(范围的两个端点值均包括在其中)个核苷酸单体的5’突出端。在另一个实施方案中，反义链具有1-26(范围的两个端点值均包括在其中)个核苷酸单体的3’突出端和5’平末端或者5’凹陷端。在另一个实施方案中，反义链具有1-26(范围的两个端点值均包括在其中)个核苷酸单体的5’突出端和3’平末端或者3’凹陷端。

在本发明的各种实施方案中，第二链(有义链)的两个末端是以下配置中的一种：3’突出端和5’凹陷端，5’突出端和3’凹陷端，3’端平末端和5’凹陷端，5’平末端和3’凹陷端，或3’凹陷端和5’凹陷端。在某些实施方案中，第二链3’突出端具有的长度为：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸单体。在各种实施方案中，第二链的3’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5(范围的两个端点值均包括在其中)个核苷酸单体。在某些实施方案中，第二链的5’突出端具有的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24,或25个核苷酸单体。在各种实施方案中，第二链的5’突出端具有的长度为1-15、1-10、1-8、或1-5个核苷酸单体。

在本发明asdDNA分子中，第一链和/或第二链中至少一个核苷酸单体可以是经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，例如糖经修饰的，主链经修饰的，和/或碱基经修饰的核苷酸。在一个实施方案中，主链经修饰的核苷酸在核苷间键中具有至少一个修饰，例如包括氮杂原子或硫杂原子中的至少一个。在一些实施方案中，经修饰的核苷间键是或包含：硫代磷酸酯基团(P＝S)、磷酸三酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯。

在某些实施方案中，反义链和/或有义链包含至少一个经修饰的核苷间键。这种经修饰的核苷间键可以在两个脱氧核糖核苷单体、两个核糖核苷单体，或一个脱氧核糖核苷单体和一个核糖核苷单体之间。可选地，至少一个末端的核苷单体上的磷酸基团可被修饰。在某些实施方案中，核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，核苷间键是硫代氨基磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，寡核苷酸链的每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，链(反义链或有义链或两者)中的所有核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，或硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合。

在某些实施方案中，反义链和/或有义链包含至少一个具有经修饰的糖部分的核苷单体。这样的核苷单体可以是脱氧核糖核苷单体或核糖核苷单体。

在某个实施方案中，经修饰的糖部分的2’位被选自下列的基团所取代：OR、R、卤素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN，其中每个R独立地是C₁-C₆烷基、烯基或炔基，卤素是F、Cl、Br或I。在一些实施方案中，经修饰的糖部分的2’位被选下列的基团所取代：烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C₁-C₁₀烷基、OCF₃、OCH₂F、O(CH₂)₂SCH₃、O(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)、O-CH₂-C(＝O)-N(R_m)(R_n)、或O-CH₂-C(＝O)-N(R₁)-(CH₂)₂-N(R_m)(R_n)，其中每个R₁，R_m和R_n独立地是H，或取代或未取代的C₁-C₁₀烷基。在一些实施方案中，经修饰的糖部分具有选自下组的取代基团：5’-乙烯基、5’甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH₃、2’-OCH₂CH₃、2’-OCH₂CH₂F、和2’-O(CH2)₂OCH₃。在一些实施方案中，经修饰的糖部分被选自下组的双环糖所取代：4′-(CH₂)—O-2′(LNA)、4′-(CH₂)—S-2′、4′-(CH₂)₂—O-2′(ENA)、4′-CH(CH₃)—O-2′(cEt)和4′-CH(CH₂OCH₃)—O-2′、4′-C(CH₃)(CH₃)—O-2′、4′-CH₂—N(OCH₃)-2′、4′-CH₂—O—N(CH₃)-2′、4′-CH₂—N(R)—O-2′(其中R是H，C₁-C₁₂烷基或保护基团)，4′-CH₂—C(H)(CH₃)-2′、和4′-CH₂—C—(═CH₂)-2′。

在一些实施方案中，经修饰的糖部分选自下组：经2’-O-甲氧基乙基修饰的糖(MOE)、4′-(CH₂)—O-2′双环糖(LNA)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖(FANA)和甲基(亚甲氧基)(4′-CH(CH₃)—O-2双环糖(cEt)。

在一些实施方案中，本发明分子的反义链和/或有义链包含至少一个具有经修饰的核碱基的核苷酸单体。这样的核苷单体可以是脱氧核糖核苷单体或核糖核苷单体。

在一些实施方案中，经修饰的核碱基选自下组：5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)，次黄嘌呤核苷碱基，三苯甲基化碱基，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH₃)尿嘧啶以及胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基以及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

在特定实施方案中，本发明分子中经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在一个实施方案中，本发明分子的每个胞嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，经修饰的核碱基是5-甲基尿嘧啶。在某些实施方案中，每个尿嘧啶是5-甲基尿嘧啶。

在某些实施方案中，本发明分子的反义链或有义链或两条链包含连接着的脱氧核苷单体。在某些实施方案中，整个反义链或整个有义链仅由连接着的脱氧核苷单体组成。在某些实施方案中，整个有义链仅由连接着的脱氧核苷单体组成。在一个特征中，反义链、或有义链、或两条链皆，除了连接着的脱氧核苷单体之外，还包括由一个或多个连接着的核糖核苷单体组成的ISR。在另一个特征中，反义链、或反义链和有义链两条链皆，除了连接着的脱氧核苷单体之外，还包括由一个或多个连接着的核糖核苷单体组成的ISR。此外，可能还有更多的ISR片段。ISR可以位于任一链中的任何位点。在一些实施方案中，一个或多个ISR包括末端的核苷单体或末端的倒数第二个核苷单体。在一些实施方案中，一个或多个ISR插入脱氧核苷单体的片段中，将脱氧核苷单体分成多个片段。在某些实施方案中，每个ISR独立地由1个核糖核苷单体，或由2、3、4或5个连接着的核糖核苷单体组成。

在某些实施方案中，双链区的至少一条链中的至少一半核碱基是脱氧核糖核苷酸单体。

在某些实施方案中，双链区的RNA靶向部分的一条链中至少50％的核苷酸是脱氧核糖核苷酸单体。

在某些实施方案中，asdDNA分子中核糖核苷酸单体的总数不超过同一asdDNA分子中脱氧核糖核苷酸单体的总数。

在某些实施方案中，ISR的至少一个或每个连接着的核糖核苷单体是经修饰的核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物。核糖核苷酸可以被如下相同或相似的方式修饰：具有经修饰的核苷间键、经修饰的糖部分和/或经修饰的核碱基。

在一些实施方案中，脱氧核糖核苷酸单体的糖部分是天然存在的脱氧核糖核苷酸的糖部分(2-H)或2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖(FANA)。

在一些实施方案中，核糖核苷酸单体的糖部分选自由以下组成的组：天然存在的核糖核苷酸(2-OH)、经2'-F修饰的糖、经2’-OMe修饰的糖、经2’-O-甲氧基乙基修饰的糖(MOE)、4′-(CH₂)—O-2′双环糖(LNA)和甲基(亚甲氧基)(4′-CH(CH₃)—O-2双环糖(cEt)。

在某些实施方案中，在反义链、有义链或两条链中，每个ISR中的至少一个或每个核糖核苷单体具有经修饰的糖部分，其中经修饰的糖部分选自下组：经2’-O-甲氧基乙基修饰的糖(MOE)、4′-(CH₂)—O-2′双环糖(LNA)和甲基(亚甲氧基)(4′-CH(CH₃)—O-2双环糖(cEt)。在某些实施方案中，在反义链、有义链或两条链中，至少一个脱氧核糖核苷单体具有经2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖(FANA)修饰的糖部分。在某些实施方案中，每个ISR的每个核糖核苷单体具有2'-O甲氧基乙基修饰糖、4'-(CH₂)—O-2'双环糖或甲基(亚甲氧基)(4'-CH(CH₃)—O-2)双环糖(cEt)，其中每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，其中每个尿嘧啶是5-甲基尿嘧啶或甲基-假尿嘧啶，并且其中每个核苷间键是硫代磷酸酯键。

在某些实施方案中，本发明的分子具有由脱氧核苷单体组成的反义链或有义链，其中每个核苷间键是硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，本发明的分子具有由脱氧核苷单体组成的反义链或有义链，其中每个核苷间键是没有经硫代磷酸酯修饰的天然磷酸键。

在某些实施方案中，本发明的分子包含有义链，其中有义链的每个核苷酸单体包含与反义链的互补核苷酸单体相同的修饰。

图2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A、11A、12A、13A、14A、15A、16A、17、18、19、20和21展示了本发明具有反义寡核苷酸链和有义寡核苷酸链的示例性分子的示例性结构和示例性序列。

在某些实施方案中，非对称短DNA双链体和在其双链体分子的反义链中的至少一个ISR能够实现强大的基因沉默。以下所有实施例中显示的数据表明，基于本发明的新平台技术，即具有反义寡脱氧核糖核苷酸和在反义寡脱氧核糖核苷酸中的至少一个ISR的非对称双链体，可实现极其强大的基因沉默。对asdDNA的SAR(结构-活性关系)特征进行了进一步研究，包括基序的长度、互补和错配、各种修饰基序等，其有助于确定可能影响基因沉默活性的各种结构因素。这些SAR因素对于设计优化的基因沉默子，以靶向典型的哺乳动物细胞中超过100,000种不同mRNA以及更多非编码RNA的各种序列和结构，非常重要。我们关于asdDNA的基因沉默活性和SAR的数据表明，asdDNA的基因沉默特征与siRNA和ASO有很大不同，这说明基因沉默机制的一种新颖而独特的机制尚待被确定。

在某些实施方案中，本发明的分子可以通过至少一种化学修饰或二级结构来稳定以防止降解。有义寡核苷酸链和反义寡核苷酸链可以具有不配对或不完美地配对的核苷酸单体。有义寡核苷酸链和/或反义寡核苷酸链可以具有一个或多个切口(核酸主链中的切口)、间隙(具有一个或多个缺失核苷酸的片段链)和经修饰的核苷酸或核苷酸类似物。不仅有义寡核苷酸链和反义寡核苷酸链中的任何或所有核苷酸单体可以被化学修饰，而且每条链可以缀合到一个或多个部分或配体以增强其功能性，例如，具有选自以下的部分或配体：多肽，抗体，抗体片段，多聚物，多糖，脂质，疏水部分或分子，阳离子部分或分子，亲脂性化合物或部分，寡核苷酸，胆固醇，GalNAc和核酸适体。

在某些实施方案中，本发明的双链体分子的双链区不包含任何错配或凸起，并且两条链在双链区中彼此完全互补。在另一个实施方案中，双链体的双链包含错配和/或凸起。

在某些实施方案中，靶标是与哺乳动物疾病相关的mRNA或非编码RNA。在某些实施方案中，靶标是mRNA。在某些实施方案中，靶标是非编码RNA，例如microRNA和lncRNA。只要反义链与靶序列基本上互补，反义链通过与靶序列杂交而占位靶标，使靶基因失活。

3.不配对或错配的区域

本发明的反义链和有义链之间的互补区可以具有至少一个不配对或不完美地配对的区域，例如，一个或多个错配。在一些实施方案中，本发明提供的asdDNA的有义链可以耐受三个或更多个(至少靶向区的15％)错配，而对asdDNA的基因沉默活性没有任何影响。有时需要有义链中的错配来减少脱靶效应或实现asdDNA的其它功能。

正如本领域技术人员所熟知的，可以在不消除活性的情况下引入错配碱基。类似地，本发明的asdDNA的反义寡核苷酸链可以包括不配对或错配的区域。在一些实施方案中，本发明的asdDNA的反义寡核苷酸链可以耐受至少三个(至少靶向区的15％)错配，同时保持asdDNA的基因沉默活性。有时需要反义链中的错配来减少脱靶效应或实现asdDNA的其它功能。

4.修饰

核苷单体是一种碱基-糖组合物。核苷单体的核碱基(也称为碱基)部分通常是杂环碱基部分。核苷酸单体是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷单体。对于那些包含戊呋喃糖基糖的核苷单体，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。寡核苷酸是通过相邻核苷单体彼此共价连接形成的，以形成线性的聚合的寡核苷酸。在寡核苷酸结构内，磷酸基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷间键。

对本发明的asdDNA分子、反义链和/或有义链的修饰包括对核苷间键、糖部分或核碱基的取代或改变。经修饰的asdDNA、反义链和/或有义链在某些情况下由于理想的特性比其天然形式更为优选，例如增加的抑制活性，增强的细胞摄取，增加的链亲和力、溶解度，减少非特异性相互作用，和对RNase降解的抗性或增强的稳定性。因此，通常可以得到与具有此类化学修饰的核苷单体的短反义链类似的结果。本发明的反义链和有义链中的一个或多个天然的核苷酸可以被经修饰的核苷酸或核苷酸类似物所取代。取代可以发生在反义链和有义链的任何位点。

已经研究了寡核苷酸分子的修饰可以提高各种寡核苷酸分子(包括反义寡核苷酸、核酶、核酸适体和RNA)的稳定性(Chiu and Rana,2003；Czauderna et al.,2003；deFougerolles et al.,2007；Kim and Rossi,2007；Mack,2007；Zhang et al.,2006；Schrnidt,2007；Setten RL et al.,2020；Crooke ST et al.,2018；和Roberts TC etal.,2020)。

本领域技术人员已知的任何稳定化修饰都可用于提高寡核苷酸分子的稳定性。在寡核苷酸分子内，可以将化学修饰引入磷酸主链(例如硫代磷酸酯键)、糖(例如锁核酸、甘油核酸、cEt、2’-MOE、2’-氟尿苷、2’-O-甲基)，和/或碱基(例如2’-氟嘧啶)中。

以下部分总结了此类化学修饰的几个实例。

在各种实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是糖经修饰、主链经修饰和/或碱基经修饰的核苷酸。

4.1经修饰的核苷间键或主链经修饰的核苷酸

RNA和DNA中天然存在的核苷间键是3’到5’磷酸二酯键。相比于仅具有天然存在的核苷间键的相应分子而言，在一条链中或在两条链中皆具有一个或多个经修饰的核苷间键(即非天然存在的核苷间键)的本发明asdDNA分子有时会因具有理想的特性(例如细胞摄取的增强、对靶核酸亲和力的增强以及在核酸酶存在下稳定性的增加)而被选择。

具有经修饰的核苷间键的寡核苷酸链包括保留磷原子的核苷间键以及不具有磷原子的核苷间键。在一个实施方案中，可以将磷酸二酯核苷间键修饰以包含氮杂原子或硫杂原子中的至少一个。代表性的含磷核苷间键包括，但不限于：磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代亚磷酰胺和硫代磷酸酯。制备含磷和不含磷的键的方法是众所周知的。

在一个实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是主链经修饰的核苷酸。主链经修饰的核苷酸可能具有在磷酸二酯核苷间键上的修饰。在另一个实施方案中，主链经修饰的核苷酸是硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

4.2经修饰的糖部分

本发明的反义链和/或有义链可任选地含有糖部分经修饰的一个或多个核苷单体。这些糖修饰的核苷单体可赋予所述反义链和/或有义链增强的核酸酶稳定性、增高的结合亲和力或一些其它有利的生物学性质。在某些实施方案中，核苷单体包含经化学修饰的呋喃核糖环部分。经化学修饰的呋喃核糖环的实例包括，但不限于：取代基的添加；包括5’和2’取代基，非偕位环原子桥连以形成双环核酸(BNA)，用S、N(R)或C(R₁)(R₂)(R、R₁和R₂各自独立地是H，C₁-C₁₂烷基或保护基团)置换核糖基环氧原子，和其组合。经化学修饰的糖的实例包括2’-F-5’-甲基取代的核苷(关于其它公开的5’,2’-双取代的核苷，参见2008年8月21日公开的PCT国际申请WO2008/101157)、或用S置换核糖基环氧原子且在2’-位上具有进一步取代(参见，于2005年6月16日公开的美国专利申请US2005-0130923)或者对BNA可选的5’-取代(参见于2007年11月22日公开的PCT国际申请WO2007/134181，其中LNA被例如5’-甲基或5’-乙烯基取代)。

具有经修饰的糖部分的核苷单体的实例包括而不限于：包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH₃、2’-OCH₂CH₃、2’-OCH₂CH₂F和2’-O(CH₂)₂OCH₃取代基的核苷。2’位上的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C₁-C₁₀烷基、OCF₃、OCH₂F、O(CH₂)₂SCH₃、O(CH₂)₂-O-N(Rm)(Rn)、O-CH₂-C(＝O)-N(Rm)(Rn)和O-CH₂-C(＝O)-N(R1)-(CH₂)₂-N(Rm)(Rn)，其中各Rl、Rm和Rn独立地为H、或经取代的或未经取代的C₁-C₁₀烷基。

双环核苷是具有双环糖部分的经修饰的核苷。双环核酸(BNA)的实例包括而不限于在4'和2'核糖基环原子之间包含桥连基的核苷。在某些实施方案中，本文中所提供的asdDNA、反义链和/或有义链包括一个或多个BNA核苷，BNA核苷中的桥连基包含以下各式之一：4′-(CH₂)—O-2′(LNA)、4′-(CH₂)—S-2、4′-(CH₂)₂—O-2′(ENA)、4′-CH(CH₃)—O-2′和4′-CH(CH₂OCH₃)—O-2′(和其类似物，参见于2008年7月15日授权的美国专利7,399,845)；4′-C(CH₃)(CH₃)—O-2′(和其类似物，参见于2009年1月8日公开为WO/2009/006478的PCT/US2008/068922)；4′-CH₂—N(OCH₃)-2′(和其类似物，参见2008年12月11日公开为WO/2008/150729的PCT/US2008/064591)；4′-CH₂—O—N(CH₃)-2′(参见于2004年9月2日公开的美国专利申请US2004-0171570)；4′-CH₂—N(R)—O-2′，其中R是H、C₁-C₁₂烷基或保护基团(参见于2008年9月23日授权的美国专利7,427,672)；4′-CH₂—C(H)(CH₃)-2′(参见，Chattopadhyayaet al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和4′-CH₂—C—(═CH₂)-2′(和其类似物，参见于2008年12月8日公开的公开为W2008/154401的PCT/US2008/066154)。

在某些实施方案中，双环核苷包括，但不限于：(A)α-L-亚甲氧基(4′-CH₂—O-2)BNA、(B)β-D-亚甲氧基(4′-CH₂—O-2)BNA、(C)乙烯氧基(4′-(CH₂)₂—O-2′)BNA、(D)氨氧基(4′-CH₂—O—N(R)-2′)BNA、(E)氧氨基(4′-CH₂—N(R)—O-2)BNA、(F)甲基(亚甲氧基)(4′-CH(CH₃)—O-2)BNA(也称为约束乙基(constrained ethyl)或cEt)、(G)亚甲基硫基(4′-CH₂—S-2′)BNA,、(H)亚甲基氨基(4′-CH₂—N(R)-2′)BNA、(I)甲基碳环(4′-CH₂—CH(CH₃)-2)BNA、(J)丙烯碳环(4′-(CH₂)₃-2′)BNA和(K)乙烯基BNA。

在某些实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH基团被选自以下的基团所取代：H、OR、R、卤素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂和CN，其中各R独立地选自由以下组成的组：C₁-C₆烷基、烯基或炔基，和选自下组：F，Cl，Br或I的卤素。在某些实施方案中，糖经修饰的核糖核苷酸选自下组：经2'-OMe修饰的核苷酸、经2'-F修饰的核苷酸、经2’-O-甲氧基乙基(2’MOE)修饰的核苷酸、经LNA(锁核酸)修饰的核苷酸，经GNA(甘油核酸)修饰的核苷酸和经cEt(约束乙基)修饰的核苷酸。

采用在核糖2'位的化学修饰可以稳定本发明的分子，例如2’-O-甲基嘌呤和2'-氟嘧啶可增加其对血清中核酸内切酶活性的抵抗。应仔细选择引入修饰的位点，以避免显着降低分子沉默/调控的能力。在某些实施方案中，与反义链的5'-末端核苷酸单体相邻的第一个核苷酸单体是2’-氟核糖核苷酸。

4.3经修饰的核碱基

asdDNA分子中的反义链和/或有义链也可以具有修饰或取代的核碱基(或碱基)。核碱基(或碱基)修饰或取代虽然在结构上与天然存在的或合成的未经修饰的核碱基不同，但在功能上可与之互换。天然的和经修饰的核碱基都能够参与氢键结合。所述核碱基修饰可赋予asdDNA分子核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其它有利的生物学性质。经修饰的核碱基包括合成的和天然的核碱基，诸如，例如，5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)。某些核碱基取代，包括5-甲基胞嘧啶取代，对于提高反义链和有义链的结合亲和力特别有用。例如，已证明5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.andLebleu,B.,eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)。

其它经修饰的核碱基包括，但不限于：5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，1-甲基假尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH₃)尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴代)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

杂环碱基部分可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环取代的那些，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。对于增加反义链和有义链的结合亲和力特别有用的核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。

在某些实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是碱基经修饰的核苷酸。在一个实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷酸类似物具有稀有碱基或经修饰的碱基。在某些实施方案中，经修饰的碱基是5-甲基胞嘧啶(5’-Me-C)。在某些实施方案中，每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，经修饰的碱基是5-甲基尿嘧啶(5'-Me-U)。在某些实施方案中，每个尿嘧啶是5-甲基尿嘧啶。

可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下制备任何可能有利于稳定性或亲和力的修饰核苷酸或类似物。这种化学修饰的几个实例与上面总结的相同。

5.药物组合物

在一些实施方案中，本发明还提供药物制剂，其包含本发明的asdDNA或其药学上可接受的衍生物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体在“Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Twentieth Edition,"Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA”中进行了描述，该文献通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的实例包括，但不限于：水、盐水、Ringer's溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水载体，例如也可使用不挥发油。本领域众所周知，此类介质和试剂可用于药物活性物质中。除非任何常规介质或试剂与asdDNA分子不相容，否则考虑将其用于组合物中。

可与本发明的分子一起使用的药学上可接受的载体的实例包括，但不限于：药用载体、正电荷载体、脂质体、脂质纳米颗粒、蛋白质载体、疏水部分或分子、阳离子部分或分子、GalNAc、多糖聚合物、纳米颗粒、纳米乳剂、胆固醇、脂质、亲脂性化合物或部分、和类脂。

在某个实施方案中，本发明提供了一种治疗方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物通过选自以下的途径施用：静脉内注射(iv)、皮下注射(sc)、口服(po)、肌肉(im)注射、经口施用、吸入、局部、鞘内和其它部位的施用方式。在另一个实施方案中，治疗有效量为每天1ng至1g、每天100ng至1g、或每天1μg至1000mg。

在PCT国际申请PCT/US02/24262(WO03/011224)、美国专利申请公开号2003/0091639和美国专利申请公开号2004/0071775中公开了制剂方法，每一个都通过引用并入本文。

本发明的asdDNA分子以合适的剂型施用，该剂型通过根据常规步骤(即生产本发明的药物组合物)将治疗有效量(例如，通过抑制肿瘤生长、杀死肿瘤细胞、治疗或预防细胞增殖性疾病等，足以达到所需治疗效果的有效水平)的本发明的asdDNA分子(作为活性成分)与标准药用载体或稀释剂组合以制备。

这些步骤可能涉及适当地混合、制粒和压缩或溶解所述成分，以获得所需的制剂。在另一个实施方案中，治疗有效量的asdDNA分子以没有标准药用载体或稀释剂的合适剂型施用。在一些实施方案中，治疗有效量的本发明双链体分子以合适的剂型施用。药学上可接受的载体包括固体载体，例如乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性的液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、水等。类似地，载体或稀释剂可包括本领域已知的时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，单独或与蜡、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等一起使用。其它填充剂、赋形剂、调味剂和其它如本领域已知的添加剂也可以包含在根据本发明的药物组合物中。

本发明的药物组合物可以以众所周知的方式制备，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、包糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干工艺。可以使用一种或多种生理上可接受的载体以常规方式配制药物组合物，所述载体包括可促进有义寡核苷酸和反义寡核苷酸加工成可药用制剂的赋形剂和/或助剂。当然，合适的制剂取决于所选择的施用途径。

本发明的组合物、化合物、组合或药物组合物可以以目前用于化疗治疗的许多众所周知的方法施用于受试者。例如，为了治疗癌症，本发明的asdDNA分子可以直接注射到肿瘤中，注射到血流或体腔中，或者采用口服或通过皮肤贴片施用。对于银屑病病症的治疗，全身施用(例如经口施用)或给受影响的皮肤区域局部施用都是优选的施用途径。选择的剂量应该足以构成有效的治疗，但不能高到引起不可接受的副作用。在治疗期间和治疗后的一段合理时间内，应密切监测疾病状况(例如癌症、牛皮癣等)和患者的健康状况。

6.使用

6.1使用方法

本发明提供了一种调节细胞或生物体中基因表达或功能的方法。该细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。该方法包括以下步骤：在可以发生选择性基因沉默的条件下，使所述细胞或生物体与本文公开的asdDNA分子接触，并对具有与asdDNA分子的反义链基本上互补的序列部分的靶核酸介导由asdDNA分子产生的选择性的基因沉默。靶核酸可以是RNA，例如mRNA或非编码RNA，这些RNA或者编码与疾病有关的蛋白质，或者调控与疾病有关的部分生物学通路。

在一个实施方案中，接触步骤包括将asdDNA分子引入可以发生选择性基因沉默的培养中的靶细胞或生物体中。在进一步的实施方案中，引入步骤包括混合、转染、脂质转染、感染、电穿孔或其它递送技术。在另一个实施方案中，引入步骤包括使用药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂通过静脉内、皮下、鞘内、口服、吸入、局部或其它临床上可接受的施用方法施用，其中药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂选自药用载体、正电荷载体、脂质体、脂质纳米颗粒、蛋白质载体、聚合物、纳米颗粒、纳米乳剂、脂质、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、亲脂性化合物或部分，和类脂。

在一个实施方案中，沉默方法用于确定细胞或生物体中基因的功能或效用。

在一个实施方案中，本发明的组合物靶向的基因或RNA与疾病(例如人类疾病或动物疾病)、病理状况或不良状况相关。在进一步的实施方案中，靶基因或靶RNA是病原微生物的基因或RNA。在更进一步的实施方案中，靶基因或靶RNA是病毒来源的基因或RNA。在另一个实施方案中，靶基因或靶RNA是肿瘤相关的基因或RNA。

在一个可选地实施方案中，本发明的组合物靶向的基因或RNA是与下列疾病相关的基因或RNA：癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、退行性疾病、传染性疾病、增殖性疾病、代谢性疾病，免疫介导的紊乱，过敏性疾病，皮肤病，恶性病，胃肠道疾病，肝脏疾病，呼吸系统障碍，心血管障碍，皮肤病，肾病，类风湿疾病，神经系统障碍，精神障碍，内分泌紊乱，或与衰老相关疾病或紊乱。

6.2治疗方法

本发明还提供治疗或预防各种疾病或病症的方法，其中各种疾病或病症包括ASO和siRNA总结的可治疗或预防的那些(Czech,2006；de Fougerolles et al.,2007；Dykxhoorn et al.,2003；Kim and Rossi,2007；Mack,2007；Crooke ST et al.,2018；Setten RL et al.,2019；Roberts TC et al.,2020)。该方法包括在可发生所需的基因抑制(上述6.1部分所述的)的条件下，将有效量的asdDNA分子施用于有需要的受试者。

在一个示例性实施方案中，向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物以治疗或预防疾病或不良状况，其中该药物组合物具有asdDNA分子和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

在一些实施方案中，本发明可用于癌症治疗或预防癌症。asdDNA组合物可用于沉默或敲低与细胞增殖紊乱或恶性病有关的基因。这些基因的实例是k-Ras、β-catenin、Stat3。这些癌基因在大量人类癌症中活跃且与之相关。

本发明的新型组合物还可用于治疗或预防眼部疾病(例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病性视网膜病变(DR))；传染病(例如HIV/AIDS、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、RCV、巨细胞病毒(CMV)、登革热、西尼罗河病毒)；呼吸道疾病(例如呼吸道合胞病毒(RSC)、哮喘、囊性纤维化)；神经系统疾病(例如亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、脊髓损伤、帕金森病、阿尔茨海默病、疼痛)；心血管疾病；代谢紊乱(例如高脂血症、高胆固醇血症和糖尿病)；遗传疾病；和炎症状况(例如炎症性肠病(IBD)、关节炎、类风湿病、自身免疫性疾病)、皮肤病。

在另一个实施方案中，施用方法选自下列途径：静脉内注射(iv)、皮下注射(sc)、口服(po)、鞘内、吸入、局部和区域施用。

实施例

下面提供的实施例以进一步阐述本发明的不同特征。实施例还阐述了实施本发明的有用的方法。这些示例不限制所要求保护的发明。

方法和材料

细胞培养

DLD1细胞购买自ATCC。DLD1细胞在添加了10％灭活胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中生长。

HepaRG细胞在添加了10％ FBS、10mg/ml氢化可的松，和4mg/ml人重组胰岛素的William培养基中生长。

asdDNA转染DLD1细胞或HepaRG细胞

转染前24小时，将DLD1或HepaRG细胞接种到6孔板中(1x10⁵个细胞/2mL/孔)。按照制备方法所描述的，通过RNAiMAX(Thermo Fisher，USA)将终浓度为100pM、200pM、1nM、3nM、10nM、30nM或100nM的非对称sdDNA进行转染，简而言之，非对称sdDNA和RNAiMAX在无血清OPTI-MEM(Thermo Fisher)中孵育20分钟，然后将其加入到含有培养基的细胞中。

定量PCR

用指定的非对称sdDNA转染细胞48小时后收获转染的细胞。用TRIZOL分离RNA，并使用TaqMan一步法RT-PCR试剂进行qRT-PCR，CTNNB1试验(Thermo Fisher)用于β-cateninmRNA检测；APOCIII试验用于APOCIII mRNA检测；APOCB试验用于APOCB mRNA检测；TTR试验用于TTRmRNA检测；STAT3试验用于STAT3检测；和基因GAPDH mRNA水平用作内部对照。

靶标序列

为了研究本发明公开的asdDNA的基因沉默效应，设计并制造了靶向不同基因的asdDNA。图1显示了以下实施例中设计和使用的靶基因、靶序列，也显示了asdDNA、ASO或siRNA相应的反义链的示例性序列。

实施例1：AS和SS中均具有ISR的asdDNA的构效关系(SAR)

设计和使用了在AS(反义链)和SS(有义链)中均有ISR的非对称sdDNA，或仅在AS中有ISR的非对称sdDNA的结构和序列，并列示于图2A和图2B中。

所有设计的靶向APOCIII的asdDNA(sdDNA a1-a33)均转染到HepaRG细胞中。将sdDNA a1-a33分子以100pM的浓度转染到HepaRG细胞后，检测APOCIII的相对mRNA水平。基因沉默的结果如图2C所示，其表明所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性。

在图2A中，所示结构中的所有字母“D”代表DNA残基或者脱氧核糖核苷酸单体；所示结构中的所有字母“R”代表RNA残基或者核糖核苷酸单体；所示结构中的所有“*”代表PS(硫代磷酸酯核苷间键)。

在图2B中，序列中的所有小写字母“a、c、g、t”代表DNA残基；序列中的所有大写字母“A、C、G、U”代表经2’-MOE修饰的RNA残基，其中所有“U”是5-甲基尿苷2’-MOE RNA残基；其中序列中所有“C”和“c”是5-Me-C；序列中所有“*”代表PS(硫代磷酸酯核苷间键)。

实施例2：ISR仅分布在AS中，且具有不同位置和长度的经PS修饰的DNA SS的 asdDNA的SAR

图3A显示了仅在AS中存在ISR的asdDNA的一系列实施方案的多种结构。通过保持含ISR的反义链(AS)不变，并改变仅由PS修饰的DNA组成的有义链(SS)的位置和长度得到多种结构变体(sdDNA b1-b31)，测试这些结构变体的基因沉默效应。具体地，设计了靶向APOCIII基因的asdDNA b1-b31(图3B显示了asdDNA b1-b31的结构和序列)。在HepaRG细胞中检测这些asdDNA的基因沉默活性(图3C)。

在图3A中，所示结构的所有字母“D”、“R”和“*”与图2A中所表示的含义相同。在图3B中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，所有大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。

结果表明所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性，与实施例1中的结论相同。

实施例3：ISR仅分布在AS中，且具有不同位置的未修饰的DNA SS的asdDNA的SAR

图4A显示了ISR仅分布在AS的asdDNA的另一系列实施方案的不同结构设计。在这些asdDNA中，保持AS不变且使用由纯自然的DNA单体组成的SS。设计了具有不同位置和长度的SS的asdDNA(sdDNA c1-c31)(结构和序列显示在图4B中)。在HepaRG细胞中检测这些asdDNA c1-c31靶向APOCIII基因的沉默效应(图4C)。

在图4A中，所示结构的所有字母“D”、“R”和“*”与图2A中所表示的含义相同。在图4B中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，所有大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。

结果表明所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性，与实施例1和2中的结论相同。

实施例4：具有分布在AS的不同位点的包含不同数量个核糖核苷酸单体的ISR的 asdDNA的SAR

图5A显示了另外一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，保持SS不变，同时改变反义链中ISR的核糖核苷酸单体(sdDNA d1-d24)(结构和序列显示在图5A中)。设计了与asdDNA d1-d20的反义链有相同结构和序列的单链的反义寡核苷酸，作为每个asdDNA对应的ASO。在HepaRG细胞中检测这些asdDNA d1-d24和每个对应的ASO靶向APOCIII基因的沉默活性(比较结果如图5B所示)。

在图5A中，所示结构和序列中的所有字母“D”、“R”，小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2A和2B中所表示的含义相同。

结果表明所有设计的在AS中至少有一个ISR的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性，并且明显比对应的ASO更强和更有效。

实施例5：ISR分布在AS的不同位点，同时保持AS中核糖核苷酸单体的总数不变的 asdDNA的SAR

图6A显示了又一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，有义链保持不变，同时改变ISR在反义链的位点，反义链中包含总数量固定的核糖核苷酸单体(sdDNAe1-e11，其结构和序列在图6A中)。也设计了与sdDNAe1-e11的反义链具有相同结构和序列的单链的反义寡核苷酸，作为每个asdDNA对应的ASO。在HepaRG细胞中检测这些asdDNAe1-e11和每个对应的ASO靶向APOCIII基因的沉默活性(比较结果如图6B所示)。

在图6A中，所示结构和序列中的所有字母“D”、“R”，小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2A和2B中所表示的含义相同。

结果表明所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性，并且明显比对应的ASO更强和更有效。与实施例4的结论相同。

实施例6：具有不同长度的AS的asdDNA的SAR

图7A显示了另外一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，有义链保持不变，同时改变反义链的长度(sdDNA f1-f9，其结构和序列显示在图7A中)。也设计了与asdDNA f1-f9的反义链具有相同结构和序列的单链的反义寡核苷酸，作为每个asdDNA对应的ASO。在HepaRG细胞中检测这些sdDNA f1-f9和每个对应的ASO靶向APOCIII基因的沉默活性(比较结果如图7B所示)。

在图7A中，所示结构和序列中的所有字母“D”、“R”，小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2A和2B中所表示的含义相同。

结果表明所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性，并且明显比对应的ASO更强和更有效。与实施例4和实施例5的结论相同。

实施例7：具有不同长度的AS和SS的asdDNA的SAR

图8A显示了另外一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，设计了不同长度的反义链和有义链，用于靶向APOCIII基因(sdDNA_1-10，其结构和序列显示在图8A中)。也设计了与asdDNA_1-10的反义链具有相同结构和序列的单链的反义寡核苷酸，作为每个asdDNA对应的单链AS(ASO)。在HepaRG细胞中检测这些asdDNA_1-10和每个对应的单链AS靶向APOCIII基因的沉默活性(asdDNA的结果如图8B所示，对应的ASO的结果如图8C所示)。

在图8A中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。

结果表明所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性，并且明显比对应的单链AS更强和更有效。与实施例4-6的结论相似。对应的单链AS在皮摩尔水平显示了普遍非常低的活性，但是在纳摩尔水平(大约10nM-30nM)显示出基因沉默活性，与众所周知的ASO技术的已知发展相同。同样令人惊讶的是，发现具有比典型的ASO(一般具有16nt到20nt的长度)更长许多的单链AS寡核苷酸比典型的ASO显示出更强的基因沉默活性。然而，本发明的asdDNA的基因沉默活性总是比对应的单链AS寡核苷酸更强和更有效，包括已知优化的ASO。

实施例8：具有不同长度的AS和SS的asdDNA的SAR

图9A显示了另外一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，设计了不同长度的反义链和有义链，用于靶向APOCIII基因(sdDNA1-4，图9A显示了其结构和序列)。在图9A中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”和“*”与图2B中所表示的含义相同，所示序列的所有下划线的大写字母“A、C、G、U”代表经LNA修饰的RNA残基，其中所有“U”是5-甲基尿苷LNA RNA残基，所有“C”是5-Me-C LNA RNA残基。

在HepaRG细胞中检测这些sdDNA1-4和每个对应的单链ASO靶向APOCIII基因的沉默活性(asdDNA结果如图9B所示)。结果表明所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性，与实施例1-3的结论相似。

实施例9：具有不同长度的SS的asdDNA的SAR

图10A显示了另外一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，反义链保持32nt的长度不变而有义链的长度从8nt至28nt变化(asdDNA_1-8，其结构和序列显示图10A中)。在图10A中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。与所有asdDNA的反义链具有相同结构和序列的具有32nt长度的单链的反义寡核苷酸，也被设计为对应的单链ASO以进行比较。在HepaRG细胞中检测这些asdDNA_1-8和对应的单链ASO靶向APOCIII基因的沉默活性(结果如图10B所示)。

结果表明所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性，并且比对应的单链ASO更强和更有效，即使当对应的ASO具有相当长的长度，比已知的典型ASO(一般具有16nt到20nt的长度)的长度更长，与实施7的结论相同。

实施例10：具有不同长度的SS的asdDNA的SAR

图11A显示了另外一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，反义链保持36nt的长度不变而有义链的长度从8nt至28nt变化(sdDNA_1-9，图11A显示了其结构和序列)。在图11A中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。与所有asdDNA的反义链具有相同结构和序列的具有36nt长度的单链的反义寡核苷酸，也被设计为对应的单链ASO以进行比较。在HepaRG细胞中检测这些asdDNA_1-9和对应的单链ASO靶向APOCIII基因的沉默活性(结果如图11B所示)。

结果表明所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性，并且比对应的单链ASO更强和更有效，包括当对应的ASO比已知的典型ASO技术(一般具有16nt到20nt的长度)要长得多时。与实施例7和9的结论相同。

实施例11：具有不同长度的AS的asdDNA的SAR

图12A显示了另外一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，有义链保持12nt的长度不变而反义链的长度从20nt至36nt变化(sdDNA_1-5，图12A显示了其结构和序列)。在图12A中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。与每个sdDNA的反义链具有相同结构和序列的单链的反义寡核苷酸，也被设计为对应的单链ASO以进行比较。在HepaRG细胞中检测这些sdDNA_1-5和每个对应的单链ASO靶向APOCIII基因的沉默活性(结果如图12B所示)。

结果表明所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性，并且比对应的单链ASO更强和更有效，包括比最先进的技术优化的对应单链ASO，如单链ASO SEQ ID No.:11(即ISIS304801)更强和更有效。结果表明其与实施例7、9和10的结论相同。

实施例12：具有分布在AS中的不同位点的各种ISR基序的asdDNA的SAR

图13A显示了另外一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，有义链保持不变而改变AS中ISR的核糖核苷酸单体总数和位置(ISR_0-5，其结构和序列显示在图13A中)。图13A中反义链的各种ISR基序显示，每个ISR具有低至1个或2个数量的核糖核苷酸单体，且每个ISR被至少一个其间的脱氧核糖核苷酸单体间隔开。在图13A中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。在HepaRG细胞中检测ISR_0-5靶向APOCIII基因的沉默活性(结果如图13B所示)。

所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性。这些结果进一步表明在AS中的至少一个ISR(ISR具有不同数量的核糖核苷酸单体，分布在AS中的任何位点)能够使本发明提供的asdDNA具有高效的基因沉默活性。

实施例13：AS中具有错配的asdDNA的SAR

图14A显示了另外一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，设计的反义链与靶标基因杂交时包含至少一个错配(Mis1-3，其结构和序列显示在图14A中)，且设计了在反义链中没有错配的(Mis0)作为对照。在图14A中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。在HepaRG细胞中检测Mis 0-3靶向APOCIII基因的沉默活性(结果如图14B所示)。

所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性。结果进一步的表明本发明提供的asdDNA的反义链可以容忍至少3个(至少靶向区的15％)的错配而同时保持本发明提供的asdDNA的基因沉默活性。在AS中某些位点的一些错配或者多个错配可能会降低asdDNA的基因沉默活性。

实施例14：SS中具有错配的asdDNA的SAR

图15A显示了另外一系列asdDNA的不同结构设计。在这些asdDNA中，设计的有义链当与反义链形成双链区域时，有义链包含至少一个错配(Mis1-4，其结构和序列显示在图15A中)，且设计了在有义链中没有错配的(Mis0)作为对照。在图15A中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。在HepaRG细胞中检测靶向APOCIII的Mis 0-4的基因沉默活性(结果如图15B所示)。

所有设计的asdDNA在非常低的浓度下(皮摩尔水平)都具有高效的基因沉默活性。结果进一步的表明本发明提供的asdDNA的有义链可以容忍3个或更多(至少靶向区的15％)的错配而同时保持本发明提供的asdDNA的高效基因沉默活性。有义链中的错配常常有助于降低潜在的脱靶效应。

实施例15：asdDNA与siRNA的之间的对比

图16A显示了靶向STAT3基因的本发明的示例性asdNDA的序列及其对应的siRNA。在图16A中，所示asdDNA序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同，所示siRNA序列中的大写字母“A、C、G、U”代表RNA残基。对应的siRNA与asdDNA的反义链具有相同的核碱基序列。图16A通过IC₅₀和IC₉₀比较了设计用于靶向STAT3的asdDNA和其对应siRNA的基因沉默效力。图16B显示了，在HepaRG细胞中在100pM,1nM和10nM浓度下检测的asdDNA和其对应的siRNA的基因沉默活性对比。

结果表明，本发明提供的asdDNA与对应的siRNA相比，除了前面提及的各种药学上的优势，也能够提高基因沉默活性的强度和效力。

实施例16：靶向APOCIII的asdDNA的基因沉默效力

测试了靶向APOCIII的示例性asdNDA序列及对应的ASO的基因沉默效力。图17显示了靶向APOCIII的asdDNA和对应的ASO的结构、序列和测试的IC₅₀和IC₉₀值。在图17中，所示序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。

实施例17：靶向APOB的asdDNA的基因沉默效力

图18显示了设计和使用的靶向APOB的示例性asdNDA及对应的ASO的结构和序列。在图18中，所示asdDNA序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。

测试了靶向APOB的示例性asdNDAs及对应的ASO的基因沉默效力。图18显示了靶向APOB的asdDNA和对应的ASO的结构和IC₅₀和IC₉₀值。

实施例18：靶向TTR的asdDNA的基因沉默效力

图19显示了设计和使用的靶向TTR的示例性asdNDA及对应的ASO的结构和序列。在图19中，所示asdDNA序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。

测试了靶向TTR的示例性asdNDAs及对应的ASO的基因沉默效力。图19显示了靶向APOB的asdDNA和对应的ASO的结构和IC₅₀和IC₉₀值。

实施例19：靶向STAT3的asdDNA的基因沉默效力

图20显示了设计和使用的靶向STAT3的示例性asdNDA及对应的ASO的结构和序列。在图20中，所示asdDNA序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，下划线的大写字母“A、C、G、U”和“*”与图9A中所表示的含义相同。

测试了靶向STAT3的示例性asdNDAs及对应的ASO的基因沉默效力。图20显示了靶向STAT3的asdDNA和对应的ASO的结构和IC₅₀和IC₉₀值。

实施例20：靶向β-Catenin的asdDNA的基因沉默效力

图21列出了设计和使用的靶向β-Catenin的asdDNA的结构和序列。在DLD1细胞中检测了在100pM，200pM，1nM，3nM，10nM和30nM浓度下靶向β-Catenin的asdDNA基因沉默效力。结果如图21所示。在图21中，所示asdDNA序列中的所有小写字母“a、c、g、t”，大写字母“A、C、G、U”和“*”与图2B中所表示的含义相同。

实施例1-20的结果强烈表明，基于本发明设计的asdDNA可以实现靶向不同基因的强大基因沉默效力。

等效物

代表性实施例旨在帮助说明本发明，并不旨在也不应解释为限制本发明的范围。实际上，除了本文所展示的和描述的之外，对于本领域技术人员而言，从本文档的全部内容，包括实施例和本文所包含的科学文献和专利文献的引用，本发明的各种修改及其许多进一步实施例是显而易见的。实施例包含重要的附加信息、示例和指导，可适用于实施本发明的各种实施例及其等效物中。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料也可以用于实施或测试本公开，但是现在描述的是优选方法和材料。除了公开的特定顺序之外，本文所述的方法可以以逻辑上可能的任何顺序执行。

通过引用合并

在本公开中已经对其它文件进行了参考和引用，例如专利、专利申请、专利出版物、期刊、书籍、论文、网络内容。出于所有目的，所有此类文档均通过引用整体并入本文。通过引用并入本文的任何材料或其部分，但与现有定义、声明或本文明确阐述的其它公开材料相冲突的，仅在该并入的材料是与本公开材料之间不发生冲突的范围内被并入。在发生冲突的情况下，将支持本公开的材料或其部分作为优选的公开，以解决冲突。

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Claims (60)

1.一种非对称短双链体DNA(asdDNA)分子包含第一链和第二链，

其中所述第二链比所述第一链短；

其中所述第一链通过至少一个靶向区与靶标RNA的靶标片段基本上互补；

其中所述第二链与所述第一链基本上互补，并与所述第一链形成至少一个双链区；和

其中所述asdDNA分子包含至少一个核糖核苷酸单体间隔片段(ISR)，其ISR包含至少一个核糖核苷酸单体。

2.根据权利要求1所述的asdDNA分子，其中所述第一链包含至少一个ISR。

3.根据权利要求1所述的asdDNA分子，其中所述第二链包含至少一个ISR。

4.根据权利要求1所述的asdDNA分子，其中所述第一链包含至少一个ISR，且所述第二链也包含至少一个ISR。

5.根据权利要求2或4所述的asdDNA分子，其中所述至少一个ISR分布在所述第一链的至少一个靶向区中。

6.根据权利要求5所述的asdDNA分子，其中所述第一链中所有的ISR的核糖核苷酸单体的总数至少为2。

7.根据权利要求3或4所述的asdDNA分子，其中所述至少一个ISR分布在所述第二链的至少一个双链区中。

8.根据权利要求1-7任一项所述的asdDNA分子，其中所述asdDNA分子包含至少两个或更多个ISR，其中每个ISR彼此独立地由1个核糖核苷酸单体组成，或包含至少2、3、4或5个连续的核糖核苷酸单体。

9.根据权利要求1-7任一项所述的asdDNA分子，其中所述至少一个ISR包含至少2、3、4或5个连续的核糖核苷酸单体。

10.根据权利要求1-9任一项所述的asdDNA分子，其中所述第一链至少70％、80％、85％、90％、95％或者完全地与所述靶标RNA的靶标片段互补。

11.根据权利要求1-10任一项所述的asdDNA分子，其中所述第一链与所述靶标RNA杂交时包含不超过1、2或3个错配。

12.根据权利要求1-11任一项所述的asdDNA分子，其中所述第一链具有的长度选自由以下组成的群组：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个核苷酸单体。

13.根据权利要求1-11任一项所述的asdDNA分子，其中所述第一链具有的长度选自由以下组成的群组：

a)8-50个核苷酸单体，

b)10-36个核苷酸单体，

c)12-36个核苷酸单体，和

d)12-25个核苷酸单体。

14.根据权利要求1-11任一项所述的asdDNA分子，其中所述第二链包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或者完全地与所述第一链的至少一个区域基本上互补的区域。

15.根据权利要求14所述的asdDNA分子，其中所述第二链与所述第一链的至少一个区域形成互补双链体时包含1、2、3或更多个错配。

16.根据权利要求15所述的asdDNA分子，其中所述第二链中的错配单体具有选自由A、G、C和T组成的群组的核碱基。

17.根据权利要求14所述的asdDNA分子，其中所述第二链比所述第一链短至少选自由以下数量个组成的群组的单体：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38个。

18.根据权利要求14所述的asdDNA分子，其中所述第二链具有的长度选自由以下组成的群组：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36个核苷酸单体。

19.根据权利要求14所述的asdDNA分子，其中所述第二链具有比所述第一链少任何数量的核苷酸单体的长度，前提是其能够与第一链形成双链体。

20.根据权利要求14所述的asdDNA分子，其中所述第二链的第一个碱基和最后一个碱基中的至少一个与所述第一链的核碱基互补。

21.根据权利要求14-20任一项所述的asdDNA分子，其中所述第二链具有的长度选自由以下组成的群组：

a)6-36个核苷酸单体，

b)6-32个核苷酸单体，

c)8-25个核苷酸单体，和

d)8-23个核苷酸单体。

22.根据权利要求1-21任一项所述的asdDNA分子，其中所述第一链的两端选自由以下组成的群组：

a)3’突出端和5’突出端，

b)3’突出端和5’端平末端，

c)5’突出端和3’端平末端，

d)3’突出端和5’凹陷端，和

e)5’端突出和3’凹陷端。

23.根据权利要求22所述的asdDNA分子，其中所述第一链的3’突出端具有的长度选自由以下组成的群组：

a)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸单体，

b)1-15个核苷酸单体，

c)1-10个核苷酸单体，

d)1-8个核苷酸单体，和

e)1-5个核苷酸单体。

24.根据权利要求22所述的asdDNA分子，其中所述第一链的5’突出端具有的长度选自由以下组成的群组：

a)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸单体，

b)1-15个核苷酸单体，

c)1-10个核苷酸单体，

d)1-8个核苷酸单体，和

e)1-5个核苷酸单体。

25.根据权利要求22所述的asdDNA分子，其中所述第一链具有1-15个核苷酸单体的3’突出端和1-15个核苷酸单体的5’突出端。

26.根据权利要求22所述的asdDNA分子，其中所述第一链具有1-28个核苷酸单体的3’突出端和5’平末端或者5’凹陷端。

27.根据权利要求22所述的asdDNA分子，其中所述第一链具有1-28个核苷酸单体的5’突出端和3’平末端或者3’凹陷端。

28.根据权利要求1-27任一项所述的asdDNA分子，其中至少一个核苷酸单体是经修饰的核苷酸或核苷酸类似物。

29.根据权利要求28所述的asdDNA分子，其中所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物是糖经修饰，主链经修饰，和/或碱基经修饰的核苷酸。

30.根据权利要求29所述的asdDNA分子，其中所述主链经修饰的核苷酸在核苷间键上具有修饰。

31.根据权利要求30所述的asdDNA分子，其中所述核苷间键被修饰以包含氮杂原子或硫杂原子中的至少一个。

32.根据权利要求31所述的asdDNA分子，其中经修饰的所述核苷间键选自由以下组成的群组：硫代磷酸酯基团(P＝S)，磷酸三酯，甲基膦酸酯和氨基磷酸酯。

33.根据权利要求28所述的asdDNA分子，其中所述第一链和/或所述第二链包含至少一个经修饰的核苷间键，其中所述经修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

34.根据权利要求33所述的asdDNA分子，其中所述第一链和/或所述第二链的每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

35.根据权利要求28所述的asdDNA分子，其中所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物包含经修饰的糖部分。

36.根据权利要求35所述的asdDNA分子，其中所述经修饰的糖部分的2’位被选自由以下组成的群组的基团所取代：OR、R、卤素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂和CN，其中每个R独立地是C₁-C₆烷基、烯基或炔基，卤素是F、Cl、Br或I。

37.根据权利要求35所述的asdDNA分子，其中所述经修饰的糖部分的2’位被选自由以下组成的群组的基团所取代：烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C₁-C₁₀烷基、OCF₃、OCH₂F、O(CH₂)₂SCH₃、O(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)、O-CH₂-C(＝O)-N(R_m)(R_n)和O-CH₂-C(＝O)-N(R₁)-(CH₂)₂-N(R_m)(R_n)，其中每个R₁，R_m和R_n独立地是H、或取代的或未取代的C₁-C₁₀烷基。

38.根据权利要求35所述的asdDNA分子，所述经修饰的糖部分选自由以下组成的群组：5’-乙烯基、5’甲基(R或S)、4’-S,2’-F,2’-OCH₃、2’-OCH₂CH₃、2’-OCH₂CH₂F和2’-O(CH₂)₂OCH₃取代基。

39.根据权利要求35所述的asdDNA分子，其中所述经修饰的糖部分被选自由以下组成的群组的双环糖所取代：4′-(CH₂)—O-2′(LNA)、4′-(CH₂)—S-2′、4′-(CH₂)₂—O-2′(ENA)、4′-CH(CH₃)—O-2′(cEt)和4′-CH(CH₂OCH₃)—O-2′、4′-C(CH₃)(CH₃)—O-2′、4′-CH₂—N(OCH₃)-2′、4′-CH₂—O—N(CH₃)-2′、4′-CH₂—N(R)—O-2′(其中R是H，C₁-C₁₂烷基或保护基团)、4′-CH₂—C(H)(CH₃)-2′,和4′-CH₂—C—(═CH₂)-2′。

40.根据权利要求35所述的asdDNA分子，其中所述经修饰的糖部分选自由以下组成的群组：经2’-O-甲氧基乙基修饰的糖(MOE)、4′-(CH₂)—O-2′双环糖(LNA)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖(FANA)和甲基(亚甲氧基)(4′-CH(CH₃)-O-2)双环糖(cEt)。

41.根据权利要求28所述的asdDNA分子，其中所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物包含经修饰的核碱基。

42.根据权利要求41所述的asdDNA分子，其中所述经修饰的核碱基选自由以下组成的群组：5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)，次黄嘌呤核苷碱基，三苯甲基化碱基，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶以及2-巯胞嘧啶，1-甲基-假尿嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶以及胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基以及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴代)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

43.根据权利要求41所述的asdDNA分子，其中所述经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。

44.根据权利要求41所述的asdDNA分子，其中每个胞嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶。

45.根据权利要求1-44任一项所述的asdDNA分子，其中所述asdDNA用于调节细胞中基因表达或功能。

46.根据权利要求1-45任一项所述的asdDNA分子，其中所述asdDNA分子比其对应的单链反义寡核苷酸在沉默靶标RNA上更强或更有效。

47.根据权利要求1-46任一项所述的asdDNA分子，其中所述asdDNA分子用于调节细胞中基因表达或功能。

48.根据权利要求47所述的asdDNA分子，其中所述细胞是真核细胞。

49.根据权利要求48所述的asdDNA分子，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。

50.根据权利要求1所述的asdDNA分子，其中所述靶标RNA是mRNA或非编码RNA，这些RNA或者编码与疾病有关的蛋白质或者调控与疾病有关的部分生物学通路。

51.根据权利要求1所述的asdDNA分子，其中所述靶标RNA选自由以下组成的群组：

a)与人类或动物的疾病或病症有关的基因的mRNA，

b)致病微生物的基因的mRNA，

c)病毒RNA，和

d)与选自由自身免疫性疾病、炎症性疾病、退行性疾病、传染性疾病、增殖性疾病、代谢性疾病、免疫介导的紊乱、过敏性疾病、皮肤病、恶病、胃肠道疾病、呼吸系统障碍、心血管障碍、肾病、类风湿疾病、神经系统障碍、内分泌紊乱，和与衰老相关疾病组成的群组的疾病或紊乱有关的RNA。

52.根据权利要求1-51任一项所述的asdDNA分子，其中所述第一链和/或所述第二链与配体或部分相缀合。

53.根据权利要求52所述的asdDNA分子，其中所述配体或部分选自由以下组成的群组：多肽/蛋白质，抗体，多聚物，多糖，脂质，疏水部分或分子，阳离子部分或分子，亲脂性化合物或部分，寡核苷酸，胆固醇，GalNAc和核酸适体。

54.一种药物组合物，包含作为活性剂的权利要求1-53任一项所述的asdDNA分子及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

55.根据权利要求54所述的药物组合物，其中所述载体选自由以下组成的群组：药物载体，正电荷载体，脂质纳米颗粒，脂质体，蛋白质载体，疏水部分或分子，阳离子部分或分子，GalNAc，多糖聚合物，纳米颗粒，纳米乳剂，胆固醇，脂质，亲脂性化合物或部分，以及类脂。

56.一种治疗或预防疾病或病症的方法，其中所述方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的权利要求1-53任一项所述的asdDNA分子或权利要求54或55所述的药物组合物。

57.根据权利要求56的方法，其中所述疾病或病症选自由以下组成的群组：癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、退行性疾病、传染病、增殖性疾病、代谢性疾病、免疫介导的紊乱、过敏性疾病、皮肤病、恶性病、胃肠道疾病、肝脏疾病、呼吸系统障碍、心血管障碍、皮肤病、肾病、类风湿疾病、神经系统障碍、精神障碍、内分泌紊乱和与衰老相关紊乱或疾病。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述asdDNA分子或药物组合物通过选自由以下组成的群组的途径施用：静脉注射(iv)、皮下注射(sc)、口服(po)、肌肉注射(im)、经口施用、吸入、局部、鞘内和其它部位的施用。

59.一种调节真核细胞中基因表达或功能的方法，其中所述方法包括细胞与有效量的权利要求1-53任一项所述的asdDNA分子或权利要求54或55所述的药物组合物接触。

60.一种非对称短双链体DNA(asdDNA)分子，包含第一链和第二链，其中所述第一链和所述第二链都包含连接着的核苷酸单体，其中核苷酸单体选自由核苷酸、其类似物和经修饰的核苷酸组成的组，

其中所述第一链比所述第二链长选自由以下数量个组成的组的单体：1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个单体，

其中所述第一链通过至少一个靶向区与靶标RNA的靶标片段基本上互补，其中所述第一链由10-36个(范围的两个端点值均包括在其中)通过键连接的核苷单体组成，其中键选自由相邻单体间的硫代磷酸酯键、磷酸二酯键或硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的混合组成的组，

其中所述第二链与所述第一链基本上互补，且与所述第一链形成至少一个双链区，其中所述第二链由8-32个(范围的两个端点值均包括在其中)通过键连接的核苷单体组成，其中键选自由相邻单体间的硫代磷酸酯键，磷酸二酯键或硫代磷酸酯和磷酸二酯键的混合组成的组，

其中所述asdDNA分子包含至少一个核糖核苷酸单体间隔片段(ISR)与至少一个脱氧核糖核苷酸单体相连，其中脱氧核糖核苷酸单体选自由脱氧核糖核苷酸，其类似物和经修饰的脱氧核糖核苷酸组成的组，

其中所述asdDNA分子中的所述ISR包含至少一个核糖核苷酸单体，其中核糖核苷酸单体选自由核糖核苷酸，其类似物和经修饰的核糖核苷酸组成的组，

其中所述asdDNA分子用于调节细胞中的基因表达和功能，

和其中所述asdDNA分子在细胞中，沉默靶标基因表达上，比其对应的ASO更强或更有效。