CN117858900A - 刺激nk细胞介导的细胞毒性的抗体 - Google Patents

Abstract

癌症免疫疗法在过去十年已经取得了巨大的成功。基于抗体的疗法尤其成功。考虑到NK细胞的关键作用，鉴定能够靶向并重定向NK细胞的细胞毒性的新颖的免疫疗法至关重要。在本文中，我们公开了快速鉴定能够激活NK细胞的抗体的功能性筛选以及在所述筛选中鉴定的抗体及其用途。

Description

刺激NK细胞介导的细胞毒性的抗体

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求于2021年6月11日提交的美国临时专利申请号63/209,671的优先权，其出于所有目的通过引用并入本文。

关于在联邦政府资助的研究和开发下所作出的发明权利的声明

本发明是在由美国国家卫生研究院授予的资助号为R35GM122451的政府支持下作出的。政府对本发明享有一定的权利。

发明背景

癌症免疫疗法在过去十年已经取得了巨大的成功。这种成功很大程度上是由基于抗体的疗法的发展所推动的，这些疗法通过免疫检查点阻断或CD3/T细胞受体(TCR)复合物刺激来重定向和增强CD8+T细胞的细胞毒性潜能。与CD8+T细胞类似，自然杀伤(NK)细胞是介导抗肿瘤应答的细胞毒性效应细胞[Waldhauer,I.&Steinle,A.,Oncogene 27(45),5932-5943(2008)；Raulet,D.H.&Guerra,N.,Nat.Rev.Immunol 9(8),568-580(2009)；Marcus,A.et al.,Adv.Immunol.122,91-128(2014)]。它们在肿瘤免疫监测中起关键作用，并且能够通过识别常在癌细胞上过表达的应激诱导的配体来鉴定和除去靶细胞。还已知NK细胞执行抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，这是多种目前治疗性单克隆抗体用于根除肿瘤细胞的机制[Weng,W.K.&Levy,R.,J Clin Oncol.21(21),3940-3947(2003)；Musolino,A.etal.,J Clin Oncol.26(11),1789-1796(2008)；Rodriguez,J.et al.,Eur.J.Cancer.48(12),1774-1780(2012)]。考虑到NK细胞在肿瘤免疫监测中所起的关键作用，鉴定能靶向和重定向NK细胞细胞毒性的新免疫疗法值得进一步研究。

尽管所有T细胞都表达可被免疫调节分子利用来重定向T细胞活性的CD3/TCR复合体，但是NK细胞表达控制NK细胞活性的多种激活、共刺激和抑制受体[Lanier,L.L.,Nat.Immunol.9(5),495-502(2008)；Chester,C.,Fritsch,K.,Kohrt,H.E.,FrontImmunol.6,601(2015)]。此外，NK细胞库是高度多样化的，并且不同细胞亚群中这些激活和抑制性受体的表达在个体内和个体间差异很大[Horowitz,A.et al.,Sci.Transl.Med.5(208),208ra145(2013)；Strauss-Albee,D.M.et al.,Sci.Transl.Med.7(297),297ra115(2015)]。这些因素使得难以开发能募集和刺激NK细胞的抗体。

发明概述

在一些实施方案中，本公开提供特异性结合人自然细胞毒性触发受体3(NCR3)的抗体，其中所述抗体至少包含：

(1)包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，所述LCDR1包含SEQ ID NO:2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:4；和

包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，所述HCDR1包含SEQID NO:6，所述HCDR2包含SEQ ID NO:7，所述HCDR3包含SEQ ID NO:8；或

(2)包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，所述LCDR1包含SEQ ID NO:10，所述LCDR2包含SEQ ID NO:11，所述LCDR3包含SEQ ID NO:12；和

包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，所述HCDR1包含SEQID NO:14，所述HCDR2包含SEQ ID NO:15，所述HCDR3包含SEQ ID NO:41；或

(3)包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，所述LCDR1包含SEQ ID NO:18，所述LCDR2包含SEQ ID NO:19，所述LCDR3包含SEQ ID NO:20；和

包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，所述HCDR1包含SEQID NO:22，所述HCDR2包含SEQ ID NO:23，所述HCDR3包含SEQ ID NO:24。

在一些实施方案中，所述轻链可变区包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO:10，所述LCDR2包含SEQ ID NO:11，所述LCDR3包含SEQ ID NO:12；和所述重链可变区包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:14，所述HCDR2包含SEQ ID NO:15，所述HCDR3包含SEQ ID NO:41。

在一些实施方案中，所述HCDR3包含以下之一：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:42、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57。

在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1；和所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5。

在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:9；和所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13。

在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:17；和所述轻链可变区包含SEQ ID NO:21。

在一些实施方案中，所述抗体是结合NCR3和第二靶蛋白的双特异性抗体。在一些实施方案中，所述第二靶蛋白在癌细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二靶蛋白是CD20或BCMA或HER2。

还提供了编码上述抗体的多核苷酸。

还提供了表达上述抗体的细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。

还提供了在有需要的人中刺激自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以足以刺激NK细胞介导的细胞毒性的量向人施用如上所述的抗体。在一些实施方案中，人患有癌症，并且NK细胞介导的细胞毒性杀死癌细胞。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤、白血病、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。

还提供了特异性结合人自然细胞毒性触发受体1(NCR1)的抗体，其中所述抗体至少包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:26，所述LCDR2包含SEQ ID NO:27，所述LCDR3包含SEQ IDNO:28；所述重链可变区包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQID NO:30，所述HCDR2包含SEQ ID NO:31，所述HCDR3包含SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25；和所述轻链可变区包含SEQ ID NO:29。

在一些实施方案中，所述抗体是结合NCR1和第二靶蛋白的双特异性抗体。在一些实施方案中，所述第二靶蛋白在癌细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二靶蛋白是CD20或BCMA或HER2。

还提供了编码上述抗体的多核苷酸。

还提供了表达上述抗体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。

还提供了在有需要的人中刺激自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性的方法，所述方法包括以足以刺激NK细胞介导的细胞毒性的量向人施用如上所述的抗体。

在一些实施方案中，人患有癌症，并且NK细胞介导的细胞毒性杀死癌细胞。在一些实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤、白血病、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。

还提供了特异性结合人CD-16的抗体，其中所述抗体至少包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO:34，所述LCDR2包含SEQ ID NO:35，所述LCDR3包含SEQ ID NO:36；所述重链可变区包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:38，所述HCDR2包含SEQ ID NO:39，所述HCDR3包含SEQ ID NO:40。

在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25；和所述轻链可变区包含SEQ ID NO:29。

在一些实施方案中，所述抗体是结合CD-16和第二靶蛋白的双特异性抗体。在一些实施方案中，所述第二靶蛋白在癌细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二靶蛋白是CD20或BCMA或HER2。

还提供了编码上述抗体的多核苷酸。

还提供了表达上述抗体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。

还提供了在有需要的人中刺激自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性的方法，所述方法包括以足以刺激NK细胞介导的细胞毒性的量向人施用如上所述的抗体。在一些实施方案中，人患有癌症，并且NK细胞介导的细胞毒性杀死癌细胞。在一些实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤、白血病、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。

还提供了鉴定激活自然杀伤(NK)细胞的抗体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供与NK细胞上的蛋白结合的抗体文库；在哺乳动物细胞表面表达抗体文库；在NK细胞基于细胞上表达的抗体杀死至少一些哺乳动物细胞的条件下，将哺乳动物细胞群与NK细胞一起孵育；孵育后，定量剩余细胞的比例；将剩余细胞的比例与对照哺乳动物细胞群进行比较，其中表达特定抗体的细胞的比例降低表明所述特定抗体激活NK细胞。

在一些实施方案中，所述方法还包括使特定抗体与NK细胞接触并测量接触的NK细胞的激活。在一些实施方案中，所述蛋白选自自然细胞毒性触发受体1(NCR1)、NCR3和CD-16。

附图简述

图1a-b：功能筛选的示意图。(a)通过ELISA筛选来自NK细胞抗原选择的噬菌体，并将具有独特CDR的Fab转化为scFab。Jurkat细胞用膜结合(MB)scFab进行转导以产生哺乳动物展示文库。在存在或不存在外周血NK细胞的情况下孵育文库，并对存活细胞进行下一代DNA测序以鉴定被NK细胞耗尽的scFab。(b)将scFab基因整合到Jurkat基因组中。利用测序CDR H3来区分不同scFab。

图2：功能性哺乳动物展示筛选鉴定刺激NK细胞毒性的抗体。在Jurkat细胞上展示靶向6种NK细胞抗原的69个scFab，以产生哺乳动物展示文库。将文库与来自两个不同供体的静息或IL2刺激的外周血NK细胞孵育4小时或24小时。将NGS计数归一化为在不存在NK细胞的情况下培养4小时或24小时的哺乳动物展示文库。只有四种scFab：CD16.03、NCR1.11、NCR3.18和NCR3.19被NK细胞耗尽。正NGS信号(富集的)以红色示出，负NGS信号(耗尽的)以蓝色示出。

图3a-b：从针对FcγR+细胞系的功能筛选中鉴定的抗体的体外活性。(a)在存在不同浓度抗体的情况下，使用针对FcγR+THP-1细胞的外周血NK细胞进行重定向裂解测定。数据代表3个独立实验。(b)在存在或不存在不同浓度的抗体的情况下，使用针对FcγR+P815细胞的外周血NK细胞进行IFN-γ分泌测定。在功能筛选中被鉴定为激活的所有四种抗体都能够引起NK细胞毒性和IFN-γ分泌。在功能筛选中仅一种被鉴定为非刺激的抗体能够引起NK细胞毒性和IFN-γ分泌。数值代表8个不同供体的平均值±SEM。***p<0.001，****p<0.0001。

图4a-f：所产生的双特异性构建体和由针对CD20+Daudi的双特异性构建体诱导的细胞毒性。(a)将各NK靶向抗体转化为scFv(蓝色)并连接到肿瘤靶向Fab的轻链或重链(灰色)。肿瘤抗原是CD20或HER2。由针对CD20+Daudi的双特异性构建体诱导的细胞毒性。(b)在抗-CD20-scFv CD16.03双特异性抗体存在下，由PBMC诱导的细胞毒性，E:T为10:1。(c)在抗-CD20-scFv NCR1.11双特异性抗体存在下，由NCR1+NKL细胞诱导的细胞毒性，E:T为3:1。(d)在抗-CD20-scFv NCR3.12双特异性抗体存在下，由NCR3+NK92MI细胞诱导的细胞毒性，E:T为1:9。(E)在抗-CD20-scFv NCR3.19双特异性抗体存在下，由NCR3+NK92MI细胞诱导的细胞毒性，E:T为1:9。(f)由PBMC诱导的细胞毒性与抗-CD20人IgG1 mAb的比较。

图5a-e：双特异性抗体对SC1淋巴瘤细胞的细胞毒性。(a)抗CD20Fab。(b)抗CD20人IgG1 mAb。(c)抗CD20-scFv CD16.03双特异性抗体。(d)抗CD20-scFv NCR1.11双特异性抗体。(e)抗-CD20-scFv NCR3.12双特异性抗体。

图6(S1).用于富集选择性结合NK细胞抗原的Fab噬菌体的噬菌体展示选择和Fc-融合构建体的示意图。

图7(S2).来自针对NK细胞抗原的选择以鉴定高亲和力结合物的Fab噬菌体ELISA。在y轴上，绘制Fab噬菌体与目的抗原的定向结合。在x轴上，示出竞争与定向比。为了竞争性结合，将Fab噬菌体与20nM可溶性抗原预先孵育，然后使其与抗原包被的板结合。

图8a-b(S3).在哺乳动物靶细胞上表达膜结合(MB)scFab文库。(a)用于在哺乳动物靶细胞上展示scFab的构建体形式。(b)在Jurkat靶细胞上表达MB scFab文库。WTJurkats为红色。表达MB-scFab的Jurkats为蓝色。scFab在细胞表面的表达用抗人Fab抗体检测。

图9(S4).来自两个不同血液供体的生物学重复的比较相关性好。

图10(S5).代表性流式细胞术直方图显示所产生Fab针对它们被选择针对的抗原的选择性。产生6个四环素诱导的FlpIn细胞系，以在添加四环素时过表达每个NK细胞抗原。

图11(S6).从针对外周血NK细胞的功能筛选中鉴定的抗体滴定。在抗体浓度范围内绘制NK细胞的中值荧光强度。与几乎所有被鉴定为非功能性的抗体相比，由功能筛选鉴定为激活的抗体以更低的浓度结合。

图12a-d(S7).针对过表达目的NK抗原的HEK293 FlpIn细胞系的双特异性抗体的滴定。(a)抗-CD20-scFv CD16.03双特异性抗体与CD16过表达细胞系的结合。(b)抗-CD20-scFv NCR1.11双特异性抗体与NCR1过表达细胞系的结合。(c)抗-CD20-scFv NCR3.12双特异性抗体与NCR3过表达细胞系的结合。(d)抗-CD20-scFv NCR3.19双特异性与NCR3过表达细胞系的结合。

图13(S8).HER2靶向双特异性构建体诱导的细胞毒性。

图14a-b(S9).SC1淋巴瘤细胞和CD20+Daudi细胞的CD20表达水平。将(a)SC1淋巴瘤细胞或(b)CD20+Daudi细胞与10、1、0.1或0μg/mL生物素化抗-CD20 IgG1 mAb一起孵育，随后用链霉亲和素-AlexaFluor-647二次染色以确定CD20表达水平。

定义

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非内容另外明确指明。因此，例如，提及“抗体”任选地包括两种或更多种这类分子的组合等。

如本文所用，术语“抗体”是指分离或重组的结合因子，其包含特异性结合抗原表位必需的可变区序列。因此，本文所用的“抗体”是显示期望的生物活性(如，结合特异性靶抗原)的任何种类或亚类或其片段的任何形式的抗体。因此，它以最广泛的意义使用，并且包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，人抗体，嵌合抗体，单域抗体，例如纳米抗体，双体抗体，骆驼科动物衍生的抗体，单价抗体，二价抗体，多价抗体，多特异性抗体(如，双特异性抗体)以及抗体片段，包括但不限于scFv、Fab等(只要它们显示期望的生物活性即可)。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性或多价抗体。“Fab”片段含有轻链的可变区和恒定区以及重链的可变区和第一恒定区(CH1)。F(ab')₂片段具有一对Fab片段，该对Fab片段通常通过铰链半胱氨酸在其羧基末端附近共价连接。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段，是一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体。

抗体的“类”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。本文所述的抗体可以是这些类别或亚类中的任一种。

如本文所用，“V区”是指包含框架1、CDR1、框架2、CDR2和包括CDR3的框架3以及框架4的片段的抗体可变区结构域。

如本文所用，“互补决定区(CDR)”是指中断可变结构域的四个“框架”区的三个高变区。CDR是结合抗原表位的主要贡献者。每条重链或轻链的CDR从N-末端开始依次编号被称为CDR1、CDR2和CDR3，。

CDR和框架区的氨基酸序列可使用本领域所熟知的不同定义来确定，例如，Kabat、Chothia、国际免疫遗传学数据库(IMGT)和AbM(参见，例如，Johnson et al.,同上；Chothia&Lesk,1987,Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins.J.Mol.Biol.196,901-917；Chothia C.et al.,1989,Conformations ofimmunoglobulin hypervariable regions.Nature 342,877-883；Chothia C.et al.,1992,structural repertoire of the human VH segments J.Mol.Biol.227,799-817；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol 1997,273(4))。以下也描述了CDR的定义：Ruiz et al.,IMGT,the international ImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Res.,28,219–221(2000)；以及Lefranc,M.-P.IMGT,the international ImMunoGeneTicsdatabase.Nucleic Acids Res.Jan 1；29(1):207-9(2001)；MacCallum et al,Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,J.Mol.Biol.,262(5),732-745(1996)；以及Martin et al,Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268–9272(1989)；Martin,et al,Methods Enzymol.,203,121–153,(1991)；Pedersen etal,Immunomethods,1,126,(1992)；and Rees et al,In Sternberg M.J.E.(ed.),ProteinStructure Prediction.Oxford University Press,Oxford,141–172 1996)。提及通过Kabat编号确定的CDR是基于，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institute ofHealth,Bethesda,MD(1991))。如Chothia所定义确定Chothia CDR(参见，例如Chothia andLesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。

在抗体结合的上下文中，如本文所用的“表位”或“抗原决定簇”是指抗体结合的抗原上的位点。表位可由通过蛋白的三级折叠并置的连续氨基酸和/或非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保留，而通过三级折叠形成的表位用变性溶剂处理时通常丧失。表位通常在独特的空间构象中包含至少3个，更通常至少5或8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括，例如，x-射线晶体学和2-维核磁共振。参见，例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,GlennE.Morris,Ed(1996)。抗体与表位的结合可受其他环境因素的影响，例如钙离子的存在。

如本文所用，术语“效价”是指抗体对抗原的不同结合位点的数目。单价抗体包含一个抗原结合位点。多价抗体包含多个结合位点。

如本文所用，术语“单价抗体”是指与靶分子上的单个表位结合的抗体。

如本文所用，术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体。

术语“多价抗体”是指具有多于一个效价的单个结合分子，其中“效价”被描述为抗体构建体的每个分子中存在的抗原结合部分的数目。因此，单个结合分子可与靶分子上的一个以上的结合位点结合。多价抗体的示例包括但不限于二价抗体、三价抗体、四价抗体、五价抗体等，以及双特异性抗体。

如本文所用，术语“双特异性抗体”是指与两个或多个不同表位结合的抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体结合两种不同靶抗原的表位。在一些实施方案中，双特异性抗体结合同一靶抗原的两个不同表位。双特异性抗体可以几种方式制备。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体是孔内旋钮IgG抗体或使用孔内旋钮技术。参见，例如Xu,et al.,MAbs7(1):231-42(2015)。

如本文所用，短语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指多肽，包括抗体、双特异性抗体等，其具有基本上相同的氨基酸序列或源自同一遗传来源。该术语还包括制备单一分子组成的抗体分子。单克隆抗体组合物显示对特定表位具有单一的结合特异性和亲和力。

如本文所用，术语与靶标(如，NCR1、NCR3或CD-16)“特异性结合”，是指结合反应，由此抗体以比其与不同靶标结合更大的亲和力、更大的亲合度和/或更长的持续时间结合靶标。在一些实施方案中，当在相同的结合亲和力测定条件下测定时，与对不相关靶标的亲和力相比，靶结合蛋白对靶标具有至少2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，25倍，50倍，100倍，1,000倍，10,000倍或更高的亲和力。如本文所用，术语“特异性结合特定靶标”,“与特定靶标特异性结合”或“对特定靶标具有特异性”，可通过例如对靶标具有如10^-2M或更小，如10^-3M、10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M的平衡解离常数K_D的分子(如，抗体)来显示。在一些实施方案中，抗体具有小于100nM或小于10nM的K_D。

术语“处理”和“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施二者，其中目的是预防或减缓非期望的生理变化或病症。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻，疾病程度的减轻，疾病的稳定状态(即，不恶化)，疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或减轻，以及缓解(不论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可指与未接受治疗的预期存活相比存活延长。在其他实施方案中，术语“处理”、“治疗”和“医治”是指抑制增生性病症的进展，物理上通过例如稳定可辨别的症状，生理上通过例如稳定的物理参数，或两者。在其他实施方案中，术语“处理”、“治疗”和“医治”是指肿瘤大小或癌细胞计数的降低或稳定。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，例如优选人。哺乳动物包括但不限于人以及家畜和农场动物，例如猴(如，食蟹猴)、小鼠、狗、猫、马和牛等。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指药物组合物中的赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载体必须与制剂的其他成分相容并且对接受者无害。在本发明中，药学上可接受的载体必须为活性成分提供足够的药物稳定性。载体的性质与施用方式不同。例如，对于静脉内施用，通常使用水溶液载体；对于口服施用，优选固体载体。

发明详述

本发明人发现结合并激活NK细胞的新抗体以及用于鉴定激活NK细胞的新试剂的方法。开发了快速鉴定能激活NK细胞的抗体的功能筛选。在哺乳动物靶细胞系上展示抗体并探查其刺激NK细胞介导的细胞毒性的能力。由该筛选鉴定了对NCCR1、NCCR3和CD-16具有特异性的抗体，它们以高亲和力结合NK细胞，随后开发的双特异性抗体构建体显示将NK细胞介导的细胞毒性重定向到CD20+B细胞淋巴瘤。因此，通过将本文所述的抗体(例如但不限于通过双特异性抗体)靶向目的细胞，NK细胞可靶向该细胞以杀死它。

本文所述的示例性抗体包括与NCR1、NCR3和CD-16特异性结合的抗体。除了本文所述的那些抗体如实施例所证明的那样，并非所有与这些靶标结合的抗体都能激活NK细胞。

本文所述的示例性抗NCR1抗体包括具有轻链可变区和重链可变区的抗体，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含RASQSVSSAV(SEQ ID NO:26)，所述LCDR2包含SASSLYS(SEQ ID NO:27)，所述LCDR3包含SSSSLI(SEQ ID NO:28)，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含VYYSYI(SEQ ID NO:30)，所述HCDR2包含SISSYYGSTY(SEQ ID NO:31)，所述HCDR3包含SRYLQDYWSSWWVSWYGL(SEQ ID NO:32)。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25(任选具有1、2或3个氨基酸变化，其可以是保守氨基酸变化)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29(任选具有1、2或3个氨基酸变化，其可以是保守氨基酸变化)，或两者。

本文所述的示例性抗NCR3抗体包括：

(1)具有轻链可变区和重链可变区的抗体，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含RASQSVSSAV(SEQ ID NO:2)，所述LCDR2包含SASSLYS(SEQ IDNO:3)，所述LCDR3包含SSYWPF(SEQ ID NO:4)，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR，其中所述HCDR1包含ISSSSI(SEQ ID NO:6)，所述HCDR2包含YISSSSGYTS(SEQ ID NO:7)，所述HCDR3包含YSYFYGGYFY WTSWGAF(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1(任选具有1、2或3个氨基酸变化，其可以是保守氨基酸变化)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:5(任选具有1、2或3个氨基酸变化，其可以是保守氨基酸变化)，或两者。

(2)具有轻链可变区和重链可变区的抗体，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含RASQSVSSAV(SEQ ID NO:10)、所述LCDR2包含SASSLYS(SEQ IDNO:11)，所述LCDR3包含SSSSLI(SEQ ID NO:12)，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR，其中所述HCDR1包含VSSSSI(SEQ ID NO:14)、所述HCDR2包含SISSSSGSTS(SEQ ID NO:15)，所述HCDR3包含RX(G/A/S)SX(Y/F)X(S/T)YYDSFYYAG(M/L)，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，所述HCDR3包含以下之一：RISSYYMSYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:16)；RASSRFRSYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:42)；RIGSIYRSYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:43)；RISSHYMSYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:44)；RISSSYM SYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:45)；RISSYYISYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:46)；RISSYYVSYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:47)；RKSSSYWSYYDS FYYAGM(SEQ ID NO:48)；RKSSYYMSYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:49)；RLGSRYRSYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:50)；RRASYYKTYYDSFY YAGM(SEQ ID NO:51)；RRSSYYMTYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:52)；RTGSYYMTYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:53)；RTSSHYISYYDSFYYA GM(SEQ ID NO:54)；RVGSYYMSYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:55)；RVSSNYMSYYDSFYYAGM(SEQ ID NO:56)；或RVSSPYMSYYDSFY YAGL(SEQ ID NO:57)。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:9(任选具有1、2或3个氨基酸变化，其可以是保守氨基酸变化)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:13(任选具有1、2或3个氨基酸变化，其可以是保守氨基酸变化)，或两者。

(3)具有轻链可变区和重链可变区的抗体，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含RASQSVSSAV(SEQ ID NO:18)，所述LCDR2包含SASSLYS(SEQ IDNO:19)，所述LCDR3包含QWYPLI(SEQ ID NO:20)，所述重链可变区包含HCDR1、和HCDR3，其中所述HCDR1包含VYSYSI(SEQ ID NO:22)，所述HCDR2包含SIYS YYGSTS(SEQ ID NO:23)，所述HCDR3包含WYQYYIGTAAM(SEQ ID NO:24)。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:17(任选具有1、2或3个氨基酸变化，其可以是保守氨基酸变化)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:21(任选具有1、2或3个氨基酸变化，其可以是保守氨基酸变化)，或两者。

本文所述的示例性抗-NCR1抗体包括具有轻链可变区和重链可变区的抗体，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR，其中所述LCDR1包含RASQSVSSAV(SEQ ID NO:34)，所述LCDR2包含SASSLYS(SEQ ID NO:35)，所述LCDR3包含SSAELI(SEQ ID NO:36)，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含FSSYSI(SEQ ID NO:38)，所述HCDR2包含SIYSSSGSTS(SEQ ID NO:39)，所述HCDR3包含HCDR3 WSYDQYYDQHGYYFYYWGF(SEQ ID NO:40)。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:33(任选具有1、2或3个氨基酸变化，其可以是保守氨基酸变化)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:37(任选具有1、2或3个氨基酸变化，其可以是保守氨基酸变化)，或两者。

考虑到本文所述抗体的NK激活活性，将本文所述抗体连接或标记到靶细胞会导致NK细胞攻击和杀死该靶细胞。本文所述的抗体可以任何所需的方式连接或标记到靶细胞。在一些实施方案中，将靶向NK蛋白(NCR1、NCR3或CD-16)的重链和/或轻链可变区与单独的氨基酸序列融合，由此将所得到的融合蛋白靶向靶细胞。在这些实施方案中，融合蛋白与靶细胞表面接触。作为一个示例，如下文更充分描述的，可以使用包含NK细胞结合域(如，NCR1、NCR3或CD-16结合域)以及靶向靶细胞的结合域的双特异性抗体。示例性结合结构域可以是，例如至少包含本文所述的CDR的重链和轻链可变序列。示例性抗体和抗体片段形式详细描述于Brinkmann等(MABS,2017,Vol.9,No.2,182-212)中。因此，在一些实施方案中，可将如本文所述的抗体的NCR1、NCR3或CD-16结合域(如，VH区和/或VL区)并入同时结合不同抗原(如，如上所述的靶细胞上的特定蛋白或其他抗原)的二价抗体或多价抗体中。例如，在一些实施方案中，提供了与NCR1、NCR3或CD-16结合并且同时与靶细胞上的表位结合的多价(如，二价)抗体，其允许使靶细胞接近抗体，该抗体也与NK细胞结合并刺激NK细胞。尽管双特异性抗体是可将NK细胞结合域靶向不同靶细胞的一种方式，但是靶细胞的任何类型的亲和因子都可以与本文所述的NK细胞结合域连接或融合。

在一些实施方案中，如实施例所示，本文所述的NK细胞结合域可在靶细胞中表达，从而杀死表达NK结合域的细胞。在一些实施方案中，表达NK细胞结合域的细胞可以仅在特定条件下(如，在诱导型启动子的控制下)表达NK细胞结合域。因此，只有在NK细胞结合结构域的诱导下，这些细胞才能被有条件地靶向杀伤。任何可以导入动物的细胞都可以用这种方法设计。例如，在一些实施方案中，通过诱导NK细胞结合域的表达，可以在所需的细胞治疗效果之后结束基于细胞的疗法。

在本文所述的任何实施方案中，NK细胞结合域靶向靶细胞，使得NK细胞杀死靶细胞。任何不需要的细胞都可以是靶细胞。示例性靶细胞可包括但不限于癌细胞。示例性癌细胞可包括但不限于骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。在一些实施方案中，NK细胞结合域靶向在靶细胞表面表达的特异性蛋白或其他抗原。在一些实施方案中，与动物(如，接受治疗的人)的其他细胞相比，在靶细胞上表达的特异性蛋白或其他抗原在靶细胞上特异性表达或主要表达。这将减少潜在的不需要的靶外细胞杀伤。可以靶向癌细胞的示例性蛋白可包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD33、CD30、CDCP1、EpCAM、GD2、HER2、BCMA、EGFR、PDGFRa、SLAMF7。还参见，万维网址Actip.org/products/monoclonal-antibodies-augated-by-the-ema-and-fda-for-therapeutic-use/，其描述了由EMA和FDA于2017年批准用于治疗用途的单克隆抗体和它们的靶标，其中在细胞表面上的那些可用于本文所述的方法和组合物中。其他癌症抗原是已知的并且也可以使用。在例如PCT/US2017/045632中描述了示例性的其他癌症抗原。结合CD20且其可变区可用于产生如本文所述的双特异性抗体的示例性抗体是已知的，例如专利EP0605442；EP0669836；US7381560；US8529902；和US8206711。结合HER2且其可变区可用于产生如本文所述的双特异性抗体的示例性抗体是已知的，例如专利EP0590058,US8937159；US9862769；US5677171。结合BCMA且其可变区可用于产生如本文所述的双特异性抗体的示例性抗体是已知的，例如GSK2857916(Belantamab Mafodotin)；Tai Y.T.,etal.Blood 2014；123:3128–3138。

在一些实施方案中，如本文所述的包含NCR1、NCR3或CD-16结合域的抗体还包含Fc区。本文所用的术语“Fc区”是指包含抗体恒定区的CH3、CH2和至少一部分铰链区的多肽。在一些实施方案中，Fc区可包含存在于一些抗体类别中的CH4结构域。在一些实施方案中，Fc区可包含抗体恒定区的整个铰链区。在一个实施方案中，抗体包含Fc区和CH1区。在一个实施方案中，抗体包含Fc区、CH1区和Cκ/λ区。在一个实施方案中，抗体包含恒定区，如重链恒定区。在一些实施方案中，与野生型恒定区相比，这种恒定区被修饰。即，恒定区可包括对CH1、CH2或CH3结构域和/或CL结构域中的一个或多个的改变或修饰。示例修饰包括在一个或多个结构域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。示例性突变是已知的，例如调节效应功能和/或血清半衰期的突变。

在一些实施方案中，NCR1、NCR3或CD-16结合域包含抗体片段，例如Fab、F(ab')₂、Fv、scFv抗体、V_H或VHH。在一些实施方案中，在scFV抗体中作为双特异性抗体的一部分提供NCR1、NCR3或CD-16结合域。因此，例如，在一些方面，可将NCR1、NCR3或CD-16结合域并入具有第二结合域的双特异性抗体中，所述第二结合域靶向非NK细胞(如，癌细胞)的不同抗原。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体(如，包含NCR1、NCR3或CD-16结合域)可以是嵌合抗体、亲和成熟抗体、人源化抗体或人抗体。

编码目的抗体的重链和轻链的基因可从细胞克隆，例如，编码单克隆抗体的基因可从杂交瘤克隆并用于产生重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库也可以由杂交瘤或浆细胞制备。任选地，可将噬菌体或酵母展示技术用于鉴定特异性结合靶标(如，NK细胞靶蛋白)和/或双特异性抗体的其他选择抗原的抗体和Fab片段。用于产生单链抗体或重组抗体的技术也可适合于生产抗体。

例如，本公开提供了编码如本文所述的重链可变区，轻链可变区或两者的多核苷酸。例如，所述多核苷酸可以编码特异性结合人自然细胞毒性触发受体3(NCR3)的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO:2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:4；所述重链可变区包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:6，所述HCDR2包含SEQ ID NO:7，所述HCDR3包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，由多核苷酸编码的轻链可变区包含SEQ ID NO:1；和/或由多核苷酸编码的轻链可变区包含SEQ ID NO:5。

在一些实施方案中，所述多核苷酸可编码特异性结合人自然细胞毒性触发受体3(NCR3)的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO:10，所述LCDR2包含SEQID NO:11，所述LCDR3包含SEQ ID NO:12；所述重链可变区包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:14，所述HCDR2包含SEQ ID NO:15，所述HCDR3包含SEQ ID NO:41。在一些实施方案中，所述HCDR3包含{#78和新变体}SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57中的一种。在一些实施方案中，由多核苷酸编码的轻链可变区包含SEQ ID NO:9；和/或由多核苷酸编码的轻链可变区包含SEQ ID NO:13。

在一些实施方案中，所述多核苷酸可编码特异性结合人自然细胞毒性触发受体3(NCR3)的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:18，所述LCDR2包含SEQ IDNO:19，所述LCDR3包含SEQ ID NO:20；所述重链可变区包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:22，所述HCDR2包含SEQ ID NO:23，所述HCDR3包含SEQID NO:24。在一些实施方案中，由多核苷酸编码的轻链可变区包含SEQ ID NO:17；和/或由多核苷酸编码的轻链可变区包含SEQ ID NO:21。

在一些实施方案中，所述多核苷酸可编码特异性结合人自然细胞毒性触发受体1(NCR1)的抗体，其中所述抗体至少包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:26，所述LCDR2包含SEQID NO:27，所述LCDR3包含SEQ ID NO:28；所述重链可变区包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:30，所述HCDR2包含SEQ ID NO:31，所述HCDR3包含SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO:25；和轻链可变区包含SEQ ID NO:29。

在一些实施方案中，所述多核苷酸可编码特异性结合人CD-16的抗体，其中所述抗体至少包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR 1包含SEQ ID NO:34，所述LCDR2包含SEQ ID NO:35，所述LCDR3包含SEQ IDNO:36；所述重链可变区包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:38，所述HCDR2包含SEQ ID NO:39，所述HCDR3包含SEQ ID NO:40。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25；和所述轻链可变区包含SEQ ID NO:29。

编码上述抗体序列的示例性序列以SEQ ID NO:58-67示出，但是将认识到，考虑到遗传密码的简并性，其他多核苷酸序列也可以编码相同的氨基酸序列，并且通过使用“多核苷酸”所涵盖。

抗体可以使用任何数量的表达系统产生，包括原核细胞和真核细胞表达系统。在一些实施方案中，表达系统是哺乳动物细胞表达，如杂交瘤，或CHO细胞表达系统。许多这样的系统可广泛获自商业供应商。在抗体包含V_H和V_L区的实施方案中，所述V_H和V_L区可以使用单个载体表达，例如在双顺反子表达单元中，或在不同启动子的控制下表达。在其他实施方案中，所述V_H和V_L区可以使用单独的载体表达。如本文所述的V_H或V_L区可任选地包含N-末端甲硫氨酸。产生和筛查杂交瘤细胞系的方法是本领域普通技术人员已知的，包括选择和免疫合适的动物，分离和融合合适的细胞以产生杂交瘤，筛选用于所需抗体分泌的杂交瘤，以及表征抗体。

在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。例如，可以制备嵌合抗体，其中来自一种物种(如，小鼠)的抗原结合区(重链可变区和轻链可变区)与另一种物种(如，人)的效应区(恒定区)融合。作为另一个示例，可以制备“类别转换”嵌合抗体，其中用不同免疫球蛋白类别或亚类的效应区取代抗体的效应区。

在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。通常，非人抗体经人源化，以降低其免疫原性。人源化抗体通常包含一个或多个非人可变区(如，CDR)或其部分(如，衍生自小鼠可变区序列)，以及可能一些非人的框架区或其部分，并且还包含一个或多个衍生自人抗体序列的恒定区。用于人源化非人抗体的方法是本领域已知的。转基因小鼠或其他生物体(如，其他哺乳动物)可用于表达人源化或人抗体。人源化抗体的其他方法包括，例如，可变区表面重建，CDR移植，移植特异性决定残基(SDR)，引导选择和框架改组(shuffling)。

包含如本文所述的抗体的药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的载体。药物组合物中可接受的载体和赋形剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。可接受的载体和赋形剂可包括缓冲液、抗氧化剂、防腐剂、聚合物、氨基酸和碳水化合物。药物组合物可以可注射制剂的形式肠胃外给药。用于注射(即，静脉内注射)的药物组合物可使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为载体来配制。药学上可接受的载体包括(但不限于)无菌水、生理盐水和细胞培养基(如，Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、α-改良Eagle培养基(α-MEM)、F-12培养基)。配制方法是本领域已知的，参见，例如Banga(ed.)TherapeuticPeptides and Proteins:Formulation,Processing and Delivery Systems(2nd ed.)Taylor&Francis Group,CRC Press(2006)。

药物组合物可根据需要以单位剂量形式形成。包含在药物制剂中的活性组分(如，如本文所述的抗体)的量提供在指定范围内的合适剂量(如，在0.01-500mg/kg体重范围内的剂量)。

本文所述的药物组合物可配制用于皮下施用、肌内施用、静脉内施用、肠胃外施用、动脉内施用、鞘内施用或腹膜内施用。药物组合物还可配制用于口服、鼻、喷雾、气溶胶、直肠或阴道施用，或者通过口服、鼻、喷雾、气溶胶、直肠或阴道施用来施用。对于可注射制剂，各种有效的药物载体是本领域已知的。在一些实施方案中，药物组合物可以局部或全身性(如，局部)施用。在特定实施方案中，药物组合物可在受影响的区域(如，皮肤或癌组织)局部施用。

药物组合物的剂量取决于包括施用途径、待治疗的疾病和受试者的身体特征(如，年龄、体重、一般健康状况)的因素。在一些实施方案中，包含在单一剂量内的活性成分(如，如本文所述的抗体)的量以有效预防、延迟或治疗疾病而不诱导明显毒性的量施用。剂量可由医师根据常规因素(如，疾病的程度和受试者的不同参数)进行调整。

药物组合物可与剂量制剂相容的方式施用，并且以治疗有效地导致改善或补救症状的量施用。药物组合物可以多种剂型施用，如皮下剂型、静脉内剂型和口服剂型(如，可吸收的溶液、药物释放胶囊)。包含活性成分(如，抗NK细胞蛋白靶，如抗NCR1、NCR3或CD-16抗体)的药物组合物可施用于有需要的受试者，例如，每天、每周、每月、每两年、每年或按医学需要一次或多次(如，1-10次或更多次)。剂量可以以单剂量方案或多剂量方案提供。施用之间的时间间隔会随着医疗状况的改善而减少，或者随着患者健康状况的恶化而增加。

可将本文所述的抗体(包括其结合片段，标记的抗体，免疫偶联物，药物组合物等)用于通过将抗体靶向靶细胞而吸引和激活NK细胞来诱导靶细胞的NK细胞杀伤。在一些实施方案中，抗体可用于治疗、改善或预防如本文所述的癌症。因此，本文所述的抗体和药物组合物可以适当的剂量施用于患有或疑似患有癌症的人，以改善或治疗一种癌症或其至少一种症状。

还提供了用于鉴定激活NK细胞的因子的方法。例如，可通过以下鉴定激活NK细胞的抗体或其他结合因子(如，适体，肽等)：(i)在细胞上表达结合已知或潜在NK激活受体的结合因子(如，抗体)，(ii)将细胞暴露于NK细胞，以及(iii)确定被杀死的细胞上的单个结合因子(如，抗体)的序列，由此鉴定NK受体激活抗体。在一些实施方案中，已经针对结合NK细胞上的表面蛋白(如，NCR1、NCR3或CD-16)的能力选择所用的结合因子，但是这一列举不应被认为是限制性的。然后可以在细胞表面上表达结合因子。可以认为多种结合因子是“文库”，即多于一种不同的结合因子。在一些实施方案中，所测试的结合因子存在多于5、10、20或更多种。在一些实施方案中，可以测定单一结合因子的活性。除非NK细胞激活因子在其表面上表达，否则所使用的细胞不会被NK细胞攻击。例如，细胞可以是哺乳动物细胞，如人细胞，例如Jurkat细胞。然后可以在一定条件下将细胞暴露于NK细胞足够的时间，使得表达NK细胞激活结合因子的细胞被NK细胞杀死，但其他细胞不被杀死。通过将所得到的细胞群与对照细胞群(如，未与NK细胞接触的细胞群)进行比较，可以鉴定哪些细胞被杀死，从而鉴定哪些结合因子能够激活NK细胞以杀死细胞。在一些实施方案中，激活结合因子的身份可通过以下确定：与NK细胞处理的细胞相比，对对照细胞的细胞中的结合因子进行核苷酸测序，并定量结合因子的序列读数。可使用任何数量的“下一代测序(NGS)”平台来进行，例如深度测序，其允许测量代表在不同细胞中表达的特定结合因子的测序读数的量。通过将NK细胞处理的细胞中的剩余细胞比例与对照哺乳动物细胞群进行比较，可以鉴定与NK细胞杀伤相关的结合因子。结合因子在处理细胞中的出现减少表明结合因子能够激活NK细胞。

以下实施例说明所要求保护的本发明的某些方面。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且鉴于此向本领域技术人员建议的各种修改或变化包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。

实施例

我们开发了筛选能诱导NK细胞介导的细胞毒性的抗体的方法。NK细胞具有鉴定和杀死靶细胞的先天能力。将结合NK细胞表面蛋白的抗体锚定到靶细胞系的细胞表面并探索它们刺激NK细胞毒性的能力。将展示诱导NK细胞介导的细胞毒性的抗体的靶细胞从抗体库中耗尽。因为抗体是基于相同的骨架，可以通过互补决定区(CDR)H3的下一代测序(NGS)来鉴定存活靶细胞上的抗体。该方法有助于鉴定可刺激免疫细胞激活的抗体，并可用于设计新的免疫疗法。

我们将哺乳动物展示筛选与NGS读数结合以表征结合并激活NK细胞的抗体。从基于曲妥单抗骨架的Fab噬菌体文库中选择针对6种NK细胞受体的抗体，并将其展示在靶细胞系上以产生哺乳动物展示文库。NK细胞具有识别和杀死不健康细胞的先天能力。我们推断针对在潜在靶细胞上展示的NK细胞表面蛋白的抗体可以驱动NK细胞和靶细胞之间的相互作用。如果抗体也能激活NK细胞，那么将杀死且淘汰展示抗体的细胞。在相同的骨架上构建我们的所有抗体，允许使用相同的引物组来扩增和测序每个克隆的CDR H3。因此，我们合理解释，我们应当能够以汇集的方式筛选这些抗体，并通过CDR H3的NGS对特异性抗体克隆的耗尽进行定量。实际上，在我们的功能筛选中耗尽的抗体结合物能够刺激NK细胞的细胞毒性和IFN-γ分泌。我们发现NK细胞介导的细胞毒性的最有效的刺激物是对先前鉴定的激活NK受体(如CD16、NCR1和NCR3)的高亲和性结合物，并且与其他测试的NK细胞表面蛋白的结合不能刺激NK细胞活性。将这些激活抗体用于产生双特异性抗体，以将NK细胞重定向到CD20+B细胞淋巴瘤细胞和HER2+乳腺癌细胞。这些结果表明，该方法有利于发现新的罕见抗体，所述抗体可刺激免疫细胞激活并促进设计新免疫疗法。

结果

开发针对NK细胞的抗体

为了确定如何最好地靶向NK细胞以产生基于NK细胞的免疫疗法，我们尝试产生针对NK细胞抗原的抗体，这些抗体在NK细胞激活中具有充分了解的作用。我们选择开发针对三种已知启动NK细胞介导的细胞毒性的充分表征的激活受体CD16A[Mandelboim,O.etal.,Proc Natl Acad Sci U S A.96(10),5640-5644(1999)；Trinchieri,G.Valiante,N.,Nat Immun.12(4-5),218-34(1993)]、NCR1[Sivori,S.et al.,J Exp Med.186(7),1129-36(1997)；Sivori,S.et al.,Eur J Immunol.29(5),1656-66(199]和NCR3[Pende,D.et al.,J Exp Med.190(10),1505-16(1991)]的抗体。我们还选择产生针对共刺激受体CD244[Sivori,S.et al.,Eur J Immunol.30(3),787-93(2000)]和TNFRSF9(4-1BB)[Srivastava,R.M.et al.,Clin Cancer Res.23(3),707-716(2017)]的抗体，因为共刺激受体可与其它激活受体和信号协同作用[Bryceson,Y.T.et al.,Blood.107(1),159-166(2006)；Bryceson,Y.T.,Ljunggren,H.G.&Long,E.O.,Blood.114(13),2657-2666(2009)]来刺激NK细胞。最后，我们选择开发针对可在NK刺激时上调的配体TNFSF4(OX40L)[Zingoni,A.,J Immunol.173(6),3716-3724(2004)]的抗体，但该配体对于调节NK细胞介导的细胞毒性是未知的。

为了产生针对这些抗原的抗体，我们将这些蛋白的细胞外结构域(ECD)表达为TEV可切割的Fc-融合体，并进行Fab噬菌体展示选择，以富集高亲和性抗体结合物(图S1)，如先前所述[Hornsby,M.et al.,Mol Cell Proteomics.14(10),2833–2847(2015)]。每次选择后，进行Fab噬菌体ELISA以确定这些结合物对其抗原靶标的相对亲和力和选择性(图S2)。产生针对每种受体的多种抗体，针对6种NK细胞受体分离了总共69种抗体(表S1)。

功能筛选鉴定激活抗体

为了评估产生有效NK细胞衔接器(engagers)所需的特性，我们开发了汇集功能筛选来评估所选择的抗体克隆诱导NK细胞毒性的能力。汇集了所产生的69种抗体以及抗GFP对照，并转化成单链Fab(scFab)。将这些展示在Jurkat细胞系(图1A)上以产生小哺乳动物展示文库。如通过染色人特异性Fab所测定的，scFab在细胞表面稳健地表达(图S3)。将该scFab哺乳动物展示文库在存在或不存在静息或IL-2-刺激的纯化外周血NK细胞的情况下孵育4小时或24小时。我们假设当存在NK细胞时，展示可刺激NK细胞毒性的抗体克隆的Jurkat细胞会从文库中耗尽。这种耗尽可通过抗体的最独特CDR——CDR H3的NGS来定量(图1B)。

因为NK细胞是高度异质性的，并且在个体之间存在很大的变化[Horowitz,A.etal.,Sci.Transl.Med.5(208),208ra145(2013)；Strauss-Albee,D.M.et al.,Sci.Transl.Med.7(297),297ra115(2015)]，我们使用从两个不同的血液供体分离的NK细胞进行单独的实验。生物学重复的归一化NGS信号的成对比较显示良好的再现性；特别是在24小时的时间点(图S4)。尽管功能筛选的结果不是完全可再现的，特别是对于供体2的4小时时间点，但是生物学重复的归一化NGS信号的成对比较通常显示良好的再现性；特别是在24小时的时间点(图S4)。令人惊奇的是，尽管所有的抗体都是针对NK细胞表面蛋白产生的，但是在NK细胞的存在下，只有4种抗体CD16.03、NCR1.11、NCR3.18和NCR3.19被耗尽(图2)。有趣的是，只有靶向已知激活受体的抗体似乎诱导NK细胞介导的细胞毒性。已知许多肿瘤过表达可刺激NK细胞活性的应激诱导的配体[Raulet,D.H.&Guerra,N.,Nat.Rev.Immunol9(8),568-580(2009)；Marcus,A.et al.,Adv.Immunol.122,91-128(2014)]。与这些肿瘤中的许多类似，已表明Jurkat细胞表达NK细胞配体[Bae,D.S.,Hwang,Y.K.&Lee,J.K.,Cell.Immunol.276(1-2),122-127(2012)；Giuliani,E.,Desimio,M.G.&Doria,M.,Sci.Rep.9(1),4373(2009)]。这些配体可能与共刺激受体信号传导协同促进NK细胞介导的细胞毒性。然而，靶向NK细胞上的共刺激受体或其他细胞表面蛋白的抗体未被耗尽。这意味着即使肿瘤过表达NK细胞配体，NK细胞通过共刺激受体或其他NK细胞表面抗原的募集可能不足以驱动肿瘤细胞裂解。可能需要刺激NK细胞激活受体来开发有效的基于NK细胞的疗法。

筛选中鉴定的抗体命中的验证

为了验证通过功能筛选进行的观察，我们选择表征9种抗体克隆的活性，其中4种被鉴定为激活的，5种被鉴定为非功能性的。我们产生了这些抗体的IgG形式，并在抗体重定向裂解测定中测试了它们刺激NK细胞细胞毒性的能力(图3A)。在该测定中，FcγR⁺THP-1细胞会结合IgG的Fc部分，并且Fab臂会结合效应NK细胞。如果Fab臂能够刺激NK细胞介导的细胞毒性，那么THP-1靶细胞会被裂解。令人满意的是，被鉴定为激活的所有四种抗体CD16.03、NCR1.11、NCR3.18和NCR3.19都能够诱导NK细胞毒性。此外，被鉴定为非功能性的五种抗体中，有四种CD16.08、NCR1.01、NCR1.05和TNFRSF9.01似乎没有刺激NK细胞毒性。然而，一种被鉴定为非功能性的抗体NCR3.12似乎刺激NK细胞毒性。

我们还尝试确定是否可以用我们的抗体刺激其他NK细胞效应功能，如细胞因子分泌。为了确定我们的抗体是否也能够诱导细胞因子分泌，我们测量了由与FcγR⁺P815细胞和IgG共孵育的NK细胞产生的IFN-γ的量。只有激活抗体CD16.03、NCR1.11、NCR3.18和NCR3.19，以及推定的非功能性抗体NCR3.12能够分泌显著增加量的IFN-γ(图3B)。尽管NCR3.12能够刺激NK细胞活性，但其不刺激与其他激活抗体一样多的细胞毒性或IFN-γ分泌。

激活抗体对其受体靶标具有高亲和力

尽管许多抗体靶向相同的细胞表面受体，但不是每种抗体都能够刺激NK细胞活性。为了更好地理解激活抗体和非功能性抗体之间的差异，我们确定了抗体的特异性和亲和力。为了研究激活抗体和非功能性抗体两者对它们的受体靶标的特异性，我们开发了针对每种蛋白靶标——CD16、NCR1、NCR3、CD244、TNFRSF9和TNFSF4的四环素诱导的细胞系。将这些蛋白的ECD与一般跨膜结构域融合，并在加入四环素时表达。激活抗体克隆和非功能性抗体克隆仅与过表达它们各自受体靶标的细胞结合。未观察到脱靶结合(图S5)，表明激活抗体和非功能性抗体对它们已经选择针对的受体靶标都是高度选择性的。

我们还确定了抗体亲和力是否在激活抗体和非功能性抗体之间的差异中起作用。为了评估所选择的抗体对NK细胞的亲和力，我们在外周血NK细胞上滴定了9个Fab克隆。对于结合激活受体CD16、NCR1和NCR3的抗体，发现激活抗体比非功能性抗体更紧密地结合NK细胞(图S6)。另外，NCR3.12，即推定的能够刺激NK细胞活性的非功能性抗体，具有比激活抗体NCR3.18和NCR3.19低得多的亲和力。这表明针对激活受体的高亲和力抗体能够更好地诱导NK细胞毒性，并且在功能筛选中耗尽的抗体是高亲和力NK细胞结合物。重要的是，与共刺激受体结合的非功能性抗体TNFRSF9以高亲和力结合，但显示几乎没有NK细胞活性。这进一步支持我们的功能筛选结果，表明必须靶向激活受体以诱导NK细胞毒性。

产生针对CD20+B细胞淋巴瘤细胞和HER2+乳腺癌细胞的双特异性抗体

为了证明这些抗体可用于进一步开发NK疗法，我们产生了靶向CD20的双特异性抗体。将CD16.03、NCR1.11、NCR3.12和NCR3.19转化为单链可变片段(scFv)，并与具有柔性接头的抗-CD20利妥昔单抗Fab结合。另外，为了测试scFv结构域排序或Fab臂连接对结合或刺激细胞毒性是否有影响，我们产生了具有不同结构域顺序的构建体，无论是VH-VL(HL)还是VL-VH(LH)，并将scFv连接到CD20 Fab的重链或轻链(图4A)。然后我们评估了它们将NK细胞介导的细胞毒性重定向到CD20+Daudi B细胞淋巴瘤细胞的能力。产生的所有双特异性构建体都能够以剂量依赖性方式与它们各自的抗原结合(图S7A-D)，并促进Daudi细胞的裂解(图4B-E)。此外，CD20xNCR3.12_B与抗CD20人IgG1 mAb一样有效，并且发现CD20xCD16.03_D、CD20xNCR1.11_B和CD20xNCR1.11_D甚至比抗-CD20人IgG1 mAb更有效(图4F)。这表明设计靶向其他激活受体(如，NCR1或NCR3)的高亲和力双特异性抗体可能与诱导ADCC的抗体一样有效，如果不是比诱导ADCC的抗体更有效的话。

尽管所有构建体都能够刺激NK细胞毒性，但观察到一些细微但一致的差异。尽管几乎所有的基于NCR1.11的双特异性抗体似乎都有一些相同的功效，但是某些基于CD16.03、NCR3.12和NCR3.19的双特异性抗体比其他抗体更有效。在基于CD16.03的双特异性抗体中，LH结构域排序比其HL对应物更有效。另外，CD16.03 scFv与抗-CD20轻链的连接比与重链的连接有效。相比之下，CD20xNCR3.12_B双特异性抗体比任何其他基于NCR3.12的双特异性抗体更好地刺激NK细胞毒性。此外，在基于NCR3.19的双特异性抗体中，具有基于LH的结构域排序的双特异性似乎优于具有基于HL的结构域排序的双特异性。总之，LH排序诱导的NK细胞介导的细胞毒性比HL排序更稳健。然而，由于scFv与肿瘤靶向臂的轻链或重链的连接而导致的效力差异可能依赖于靶向scFv的NK细胞。

为了证明这些构建体的多功能性，我们还从NCR1.11产生HER2靶向双特异性抗体。将NCR1.11抗体转化为scFv并与抗HER2曲妥单抗Fab结合。再次，产生具有不同结构域排序和与Fab的任一链连接的构建体，并评估它们裂解HER2+SK-BR3乳腺癌细胞的能力。再一次，所有构建体都能够将NK细胞介导的细胞毒性重定向到SK-BR3细胞(图S8)，表明这些抗体可被重新格式化以靶向不同的肿瘤细胞类型。

双特异性抗体促进利妥昔单抗-难治性B细胞淋巴瘤细胞的细胞毒性

为了确定所产生的双特异性抗体是否能够将NK细胞介导的细胞毒性重定向到原发性B细胞淋巴瘤，我们测试了三种最有效的双特异性抗体CD20xCD16.03_D、CD20xNCR1.11_B和CD20xNCR3.12_B针对SC1淋巴瘤系的效力。SC1细胞系来源于患有高度难治性CD79突变弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者，起源于皮肤并转移至脑和脑脊液。该肿瘤是利妥昔单抗联合环磷酰胺、长春新碱、阿霉素和泼尼松以及大剂量甲氨蝶呤联合利妥昔单抗难治的。也是依托泊苷联合阿糖胞苷和辐射难治的。所有测试的双特异性抗体都能够将NK细胞介导的细胞毒性重定向到SC1淋巴瘤细胞(图5)。尽管所产生的双特异性抗体比针对CD20+Daudi细胞系的抗CD20人IgG1 mAb更有效，但是针对SC1淋巴瘤细胞，抗CD20人IgG1mAb比双特异性抗体稍微更有效。在Daudi和SC1淋巴瘤细胞之间观察到的不同细胞毒性可能是由于双特异性抗体和抗CD20人IgG1 mAb对两种不同淋巴瘤细胞系的不同结合亲和力。实际上，SC1淋巴瘤细胞中的CD20表达水平比CD20+Daudi细胞系中的表达水平更低且更易变化(图S9A-B)。与仅具有单个CD20结合臂的双特异性抗体相反，抗-CD20人IgG1 mAb的二价性质可允许IgG更好地结合SC1淋巴瘤细胞。

讨论

NK细胞具有独特的识别和杀死不健康细胞的能力，并且已知其在癌症免疫监测中起关键作用。因此，它们已经成为开发新癌症免疫疗法的有吸引力的靶标。在本研究中，我们描述了鉴定能够募集和刺激NK细胞活性的功能性抗体的方法。从我们的哺乳动物展示筛选中鉴定的命中，我们证明了通过构建双特异性抗体来将NK细胞介导的细胞毒性重定向到CD20+淋巴瘤细胞和HER2+乳腺癌细胞，从而产生各种NK细胞靶向疗法的潜力。

为了促进NK细胞靶向疗法的进步，我们开发了功能性哺乳动物展示筛选以快速评估一组精心设计的69种抗体刺激NK细胞毒性的能力。其他人以前已使用了噬菌体展示[Reusch,U.et al.,MAbs.6(3),728-739(2014)]和杂交瘤技术[Gauthier,L.et al.,Cell.177(7),1701-1713(2019)]来鉴定NK细胞结合物。使用哺乳动物展示，我们能够评估这些独特的功能效果并快速鉴定用于进一步研究的克隆。实际上，其他组也使用哺乳动物展示成功地鉴定了诱导独特表型的单个抗体或肽克隆[Han,K.H.et al.,Proc Natl AcadSci U S A.115(3),E372-E381(2018)；Blanchard,J.W.et al.,Nat Biotechnol.35(10),960-968(2017)]或刺激特定的功能效应[Stepanov,A.V.et al.,Sci Adv.4(11),eaau4580(2018)]。受此类工作的启发，我们创建了评估NK细胞的独特细胞毒性作用的功能筛选。此外，由于我们所需的表型符合NGS的大测序能力，我们能够平行地定量所有克隆的功能效应。

我们开发了靶向不同NK细胞表面蛋白的多种抗体，包括已知的激活受体——CD16、NCR1和NCR3、共刺激受体——TNFRSF9和CD244，以及没有已知调节作用的NK细胞受体——TNFSF4。令人惊奇的是，通过引入NK细胞，69个抗体中仅有4个被哺乳动物展示文库耗尽，表明我们的筛查方法的有效性。有趣的是，所有这些抗体靶向已知的NK激活受体，如CD16、NCR1和NCR3。然而，应注意的是，我们的抗体在功能筛选中大部分靶向NCR1和NCR3。这可能使我们的功能筛选偏向于刺激NCR1或NCR3的抗体。

在进一步分析时，我们确定靶向激活受体的高亲和力抗体能够刺激NK细胞毒性和IFN-γ分泌。这与表明较高亲和力CD16多态性能够更好地介导ADCC的先前发现[Koene,H.R.et al.,Blood.90(3),1109-1114(1997)；Wu,J.et al.,J.Clin.Invest.100(5),1059–1070(1997)]是一致的，并且与对利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗治疗的更高响应速率相关[Weng,W.K.&Levy,R.,J Clin Oncol.21(21),3940-3947(2003)；Musolino,A.etal.,J Clin Oncol.26(11),1789-1796(2008)；Rodriguez,J.et al.,Eur.J.Cancer.48(12),1774-1780(2012)]。尽管仅选择选定数量的抗体进行另外的测试，但我们发现抗体亲和力和NK细胞活性之间的相关性与描述针对CD16和NCR1的结合物的先前报道一致。其他人先前已表明结合CD16的Fc-结合位点之外的表位的抗体会刺激ADCC，并且较高亲和力CD16结合物比其较低亲和力对应物更有效[Gleason,M.K.et al.,Mol Cancer Ther.11(12),2674-2684(2012)；Ellwanger,K.et al.,MAbs.11(5),899-918(2019)]。另外，NCR1结合抗体能够刺激NK细胞介导的细胞毒性，无论靶向NCR1的哪一个结构域[Gauthier,L.et al.,Cell.177(7),1701-1713(2019)]。这表明需要高亲和力抗体来刺激NK细胞活性。

尽管开发针对NK细胞受体的高亲和力抗体似乎是刺激NK细胞活性所必需的，我们发现在已知的激活NK细胞受体之外，靶向其他NK细胞受体的高亲和力抗体不能刺激NK细胞介导的细胞毒性。靶向共刺激受体不会导致NK细胞激活并不完全令人惊讶，因为其他人先前已表明NK细胞激活通常需要不同的激活和共刺激NK细胞受体的共结合[Bryceson,Y.T.et al.,Blood.107(1),159-166(2006)；Bryceson,Y.T.,Ljunggren,H.G.&Long,E.O.,Blood.114(13),2657-2666(2009)]。

为了证明通过功能筛选鉴定的抗体的效用，我们将四种激活抗体CD16.03、NCR1.11、NCR3.12和NCR3.19转化为NK靶向双特异性抗体。所有产生的CD20靶向双特异性抗体和Her2靶向双特异性抗体分别能够将NK细胞毒性重定向到CD20+Daudi B细胞淋巴瘤细胞和Her2+SK-BR3乳腺癌细胞。这表明通过筛选鉴定的抗体可用于进一步开发不同的NK细胞靶向疗法。实际上，靶向CD16[Gleason,M.K.et al.,Mol Cancer Ther.11(12),2674-2684(2012)；Ellwanger,K.et al.,MAbs.11(5),899-918(2019)]和NCR1[Gauthier,L.etal.,Cell.177(7),1701-1713(2019)]的高亲和力抗体先前已被开发用于产生双特异性和三特异性NK细胞接合器并重定向NK细胞细胞毒性，并且似乎在体外和体内均有良好效力。在该研究中，一些双特异性抗体，包括NCR3靶向双特异性抗体，至少与抗-CD20人IgG1 mAb一样有效，表明开发针对NCR3的抗体也可能是募集和刺激NK活性的有效方式。

除了促进公认的CD20+Daudi B细胞淋巴瘤细胞系的稳健裂解外，我们的双特异性抗体还能够将NK细胞细胞毒性重定向到高度难治性SC1 B细胞淋巴瘤细胞系。然而，我们的双特异性抗体在促进SC1 B细胞淋巴瘤细胞裂解方面并没有比抗-CD20人IgG1 mAb更有效。这可能是由于抗-CD20人IgG1 mAb对CD20+细胞具有亲合力作用。尽管在这种情况下，我们的双特异性抗体没有比抗-CD20人IgG1 mAb更有效，但改进肿瘤靶向部分的亲和力的额外工程化可进一步促进所开发的双特异性抗体的细胞毒性潜力。更重要的是，通过我们的功能筛选鉴定的抗体似乎适用于开发另外的NK细胞靶向接合器。

考虑到开发靶向肿瘤微环境的其他免疫细胞类型的抗体的兴趣日益增长，我们相信这种方法可用于鉴定可重定向其他免疫细胞类型的细胞毒性或吞噬功能的新靶标和抗体。可以增加哺乳动物展示文库的大小以探测更大组的免疫细胞受体。另外，可将相同的哺乳动物展示文库用于筛选多种免疫细胞类型的功能，以确定抗体的某些子集是否可用于与不同细胞类型交叉反应。此外，由于所有这些抗体都基于相同的骨架，因此可以容易地将所需的抗体克隆并转化成不同的多特异性形式。我们认为，这项工作为NK细胞靶向抗体的设计提供了重要的启示，并阐明了用于鉴定新的免疫疗法抗体的新方法。

SI材料和方法

细胞

HEK293T细胞在补充有10％ FBS和100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中培养。Jurkat细胞和Raji细胞在含有2mM L-谷氨酰胺、含有10％ FBS和100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640中培养。NK92MI细胞在没有核糖核苷和脱氧核糖核苷但含有2mML-谷氨酰胺且补充有0.2mM肌醇、0.1mM 2-巯基乙醇、0.02mM叶酸、12.5％马血清、12.5％FBS和100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的α-MEM中培养。用NCR1稳定转导的NKL细胞维持在含有2mM L-谷氨酰胺，含有10％ FBS和100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素且补充有200U/mL IL-2的RPMI-1640(National Cancer Institute BRB PrecclinicalRepository)中。SK-BR3细胞在补充有10％ FBS和100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的McCoy's 5a中培养。

通过Ficoll-Paque分离PBMC，并维持在含有2mM L-谷氨酰胺，含有10％ FBS和100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640中。使用RosetteSep(干细胞)接着Ficoll-Paque从去标签的健康供体的外周血液中分离原代人NK细胞(Blood Centers of thePacific or Vitalant)。将细胞维持在含有2mM L-谷氨酰胺，含有10％ FBS和100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640中。过表达NK细胞表面蛋白ECD的四环素诱导的细胞系通过共转染pOG44载体和一种构建体而产生，所述构建体编码融合至pcDNA5/FRT哺乳动物表达载体中具有HA标签的血小板衍生生长因子的跨膜结构域的每种ECD。

噬菌体展示选择

使用标准表达方案在Expi293F细胞中表达和生物素化TEV-可切割的Fc-融合蛋白。表达4天后收获培养基并通过蛋白A亲和层析纯化蛋白。根据先前建立的方案1用Fab噬菌体文库E2进行噬菌体选择。通过将噬菌体库与固定在链霉亲和素微珠上的Fc-结构域孵育，从文库中除去非特异性结合物。使用被捕获在链霉亲和素包被的磁珠上的生物素化Fc-融合体选择Fab噬菌体，并通过TEV洗脱释放。每次选择由四轮组成。每一轮使用逐渐减少量的Fc-融合体(1μM、100nM、10nM和10nM)。对从第三轮或第四轮选择的96个独立的Fab噬菌体克隆进行ELISA以评估亲和力和选择性。合并最佳克隆并转化成scFab，亚克隆到慢病毒表达载体上，用我们的功能筛选进一步表征。

Fab噬菌体ELISA

如前所述进行ELISA1。简言之，于4℃用10μg/mL中性亲和素过夜包被Maxisorp板。在中性亲和素包被的板上捕获生物素化靶抗原(20nM)30分钟，然后暴露于以1:5稀释的噬菌体上清液30分钟。结合的噬菌体通过辣根过氧化物酶缀合的抗噬菌体单克隆抗体(GELifesciences)进行检测。

在HEK293T细胞中产生慢病毒

在T-25瓶中，通过使用来自合并的scFab NK细胞结合物的3μg慢病毒表达载体，0.33μg pMD2.G和2.7μg pCMV-dR8.91以及15μL FuGENE HD转染试剂(Promega)转染2.2×10⁶HEK 293T细胞来产生慢病毒。48小时后，收集细胞上清液并通过45μm孔过滤器除去细胞碎片。以MOI<0.3转导Jurkat细胞。

scFab哺乳动物展示系统的功能筛选

在存在或不存在400U/mL IL-2的情况下，培养新分离的NK细胞16小时。洗涤scFab哺乳动物展示文库，并在存在或不存在静息或IL-2-刺激的NK细胞的情况下与10μg/mLDNase I一起孵育4小时或24小时。收集存活的细胞并分离基因组DNA，用作NGS的PCR模板。使用Q5DNA聚合酶(NEB)，用侧翼引物从基因组DNA扩增H3序列。将混合物热循环20个循环。将扩增子凝胶纯化并提交至CZBiohub进行NextSeq(Illumina)分析，利用自定义测序引物(如所示)：

TGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGC。

使用Galaxy(https://usegalaxy.org/)处理.fastq.gz文件。去除测序假象，并用自定义序列(如图所示)剪切适配器序列：

TACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC。

当质量分数下降到30以下时，应用FASTQ masker。并且输出序列计数用于进一步分析。将每种条件的原始NGS计数归一化为每百万计数(CPM)，并且将特异性抗体克隆的耗尽报告为NK细胞上存在或不存在时文库之间的log2(倍数变化)。

IgG和双特异性抗体表达

如前所述(Martinko,A.J.et al.Targeting RAS-driven human cancer cellswith antibodies to upregulated and essential cell-surface proteins.Elife.7,e31098(2018))表达IgG。简言之，用含有1:1比例的目的重链和轻链的两种PFUSE载体瞬时共转染Expi293细胞。对于IgG，将含有Fab重链的PFUSE载体与小鼠IgG1 Fc或Fab轻链融合。对于双特异性抗体，PFUSE载体含有与目的scFv融合的Fab重链或Fab轻链。按照制造商说明书，将ExpiFectamine293转染试剂盒用于转染。表达5-7天后收获上清液，并通过蛋白A或蛋白L亲和层析纯化蛋白。通过SDS-PAGE评估蛋白的纯度和质量。

钙黄绿素释放细胞毒性测定

如前所述(Neri,S.,Mariani,E.,Meneghetti,A.,Cattini,L.&Facchini,A.Calcein-acetyoxymethyl Cytotoxicity Assay:Standardization of a MethodAllowing Additional Analyses on Recovered Effector Cells andSupernatants.Clin Diagn Lab Immunol.8(6),1131-1135(2001))进行钙黄绿素释放细胞细胞毒性测定。将靶细胞洗涤并重悬至1-5×10⁶/mL的最终浓度，并在15μM钙黄绿素-AM中于37℃标记30分钟。将细胞洗涤两次，并与效应物细胞(纯化的NK细胞、PBMC、NK92MI或NCR1+NKL细胞)以指定的效应物与靶细胞比在不同的抗体浓度的存在下一式三份共孵育。用1％Triton X-100诱导最大裂解。2小时后，收集上清液，并用Infinite 200Pro读板仪测量钙黄绿素释放(Ex：485±9nm；Em：530±20nm)。将特异性裂解计算为100×(实验靶细胞释放-靶细胞自发释放)/(最大释放-靶细胞自发释放)。

Fab表达

如先前所述(Elledge,S.K.et al.Systematic identification of engineeredmethionines and oxaziridines for efficient,stable,and site-specific antibodybioconjugation.Proc Natl Acad Sci U S A.117(11),5733-5740(2020))表达Fab。简言之，用表达质粒转化C43(DE3)Pro+大肠杆菌，并于37℃在TB自诱导培养基中生长6小时。然后将孵育温度降低至30℃并再生长16至18小时。通过离心收获细胞并通过蛋白A亲和层析纯化Fab。通过SDS-PAGE评估Fab纯度和完整性。

细胞滴定进行流式细胞术

如所示对原代人NK细胞或四环素诱导的过表达细胞系进行滴定。当使用四环素诱导的过表达细胞系时，在染色前向细胞施用10μg/mL四环素2天。每种Fab或双特异性抗体的起始浓度为1μM，并进行连续1:5稀释。将抗体与细胞于4℃孵育1小时，在3％ BSA的PBS(pH7.4)溶液中洗涤2次，并用以1:50稀释的AlexaFluor-647缀合的山羊抗人IgG F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories)染色30分钟。额外洗涤3次后，固定细胞并使用CytoFLEX(Beckman Coulter)定量荧光。使用FlowJo软件分析所有流式细胞术数据。

基于流式细胞术的细胞细胞毒性测定

如前所述(Kandarian,F.,Sunga,G.M.,Arango-Saenz,D.&Rossetti,M.A FlowCytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK CellActivity.J Vis Exp.9(126),56191(2017))进行基于流式细胞术的细胞细胞毒性测定。简言之，于37℃将靶细胞用1μM CFSE染色20分钟。洗涤细胞，并在不同的抗体浓度的存在下，以所示的效应物与靶细胞比与静息的NK细胞共孵育，一式两份。用0.1％ Tween-20诱导最大裂解。2小时后，死细胞用5nM SYTOX Red染色，并使用CytoFLEX(Beckman Coulter)定量荧光。使用FlowJo软件分析所有流式细胞术数据。

IFN-γ分泌试验

按照制造商说明书，用ELISA max deluxe set(Biolegend)定量IFN-γ分泌。简言之，在存在或不存在P815靶细胞的情况下，将NK细胞以1:1的效应物与靶标比与1μg/mL每种所选抗体一起孵育24小时，或无抗体孵育24小时。收集上清液并测定IFN-γ含量。

数据分析

使用单向ANOVA和Dunnett事后检验比较由所选抗体诱导的IFN-γ分泌。使用GraphPad Prism 6.0软件分析数据。用三参数逻辑模型拟合IgG的剂量响应曲线。使用python script用四参数逻辑模型拟合双特异性抗体的剂量响应曲线。

进一步的信息：

亲和成熟后，测试了17个独特的Fab克隆。在17个克隆中，所表达的16个足够用于另外的测试。我们通过ELISA和在细胞上测试了与NCR3的结合。当通过ELISA测试时，我们确定13个克隆具有比亲本NCR3.18克隆更低的EC50。通过细胞结合，我们发现8个克隆具有比亲本NCR3.18克隆更低的EC50。为了测试可开发性，我们用SEC表征了抗体的洗脱曲线。在17个克隆中，有11个克隆保持它们的SEC谱图。总之，我们认为有5个高亲和性克隆具有良好的洗脱特性，可用于双特异性或三特异性构建体中。

表S1：

序列

所有抗体均基于曲妥珠单抗骨架。只有CDR L3、H1、H2和H3是变化的。编号基于IMGT方案。可变链序列中CDR加下划线。

抗NCR3 Fab#72

轻链：

SEQ ID NO:1:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSYWPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDSQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:2:LCDR1 RASQSVSSAV

SEQ ID NO:3:LCDR2 SASSLYS

SEQ ID NO:4:LCDR3 SSYWPF

重链：

SEQ ID NO:5:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNISSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYISSSSG YTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYSYFYGGYFYWTSWGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

SEQ ID NO:6:HCDR1 ISSSSI

SEQ ID NO:7:HCDR2 YISSSSGYTS

SEQ ID NO:8:HCDR3 YSYFYGGYFYWTSWGAF

抗-NCR3 Fab#78

轻链:

SEQ ID NO:9:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSSSLITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDSQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:10:LCDR1 RASQSVSSAV

SEQ ID NO:11:LCDR2 SASSLYS

SEQ ID NO:12:LCDR3 SSSSLI

重链

SEQ ID NO:13:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVASISSSSGSTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRISSYYMSYYDSFYYAGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

SEQ ID NO:14:HCDR1 VSSSSI

SEQ ID NO:15:HCDR2 SISSSSGSTS

SEQ ID NO:16:HCDR3 RISSYYMSYYDSFYYAGM

抗-NCR3 Fab#79

轻链:

SEQ ID NO:17:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLY SGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQQWYPLITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDSQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:18:LCDR1 RASQSVSSAV

SEQ ID NO:19:LCDR2 SASSLYS

SEQ ID NO:20:LCDR3 QWYPLI

重链:

SEQ ID NO:21:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNVYSYSIHWVRQAPGKGLEWVASIYSYYGSTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYQYYYIGTAAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

SEQ ID NO:22:HCDR1 VYSYSI

SEQ ID NO:23:HCDR2 SIYSYYGSTS

SEQ ID NO:24:HCDR3 WYQYYYIGTAAM

抗-NCR1 Fab#27

轻链:

SEQ ID NO:25:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSSSLITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDSQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:26:LCDR1 RASQSVSSAV

SEQ ID NO:27:LCDR2 SASSLYS

SEQ ID NO:28:LCDR3 SSSSLI

重链:

SEQ ID NO:29:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNVYYSYIHWVRQAPGKGLEWVASISSYYGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSRYLQDYWSSWWVSWYGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

SEQ ID NO:30:HCDR1 VYYSYI

SEQ ID NO:31:HCDR2 SISSYYGSTY

SEQ ID NO:32:HCDR3 SRYLQDYWSSWWVSWYGL

抗-CD16 Fab#3

轻链:

SEQ ID NO:33:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSAELITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDSQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:34:LCDR1 RASQSVSSAV

SEQ ID NO:35:LCDR2 SASSLYS

SEQ ID NO:36:LCDR3 SSAELI

重链:

SEQ ID NO:37:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNFSSYSIHWVRQAPGKGLEWVASIYSSSGSTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARWSYDQYYDQHGYYFYYWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

SEQ ID NO:38:HCDR1 FSSYSI

SEQ ID NO:39:HCDR2 SIYSSSGSTS

SEQ ID NO:40:HCDR3 WSYDQYYDQHGYYFYYWGF

抗-NCR3 Fab#78CDR H3序列的总结:

SEQ ID NO:41:RX(G/A/S)SX(Y/F)X(S/T)YYDSFYYAG(M/L)

X可为任何氨基酸。

抗-NCR3 Fab#78的其他特定交替CDR H3序列:

SEQ ID NO:42:RASSRFRSYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:43:RIGSIYRSYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:44:RISSHYMSYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:45:RISSSYMSYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:46:RISSYYISYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:47:RISSYYVSYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:48:RKSSSYWSYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:49:RKSSYYMSYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:50:RLGSRYRSYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:51:RRASYYKTYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:52:RRSSYYMTYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:53:RTGSYYMTYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:54:RTSSHYISYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:55:RVGSYYMSYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:56:RVSSNYMSYYDSFYYAGM

SEQ ID NO:57:RVSSPYMSYYDSFYYAGL

·轻链中，加下划线序列编码CDR L1、L2、L3

·重链中，加下划线序列编码CDR H1、H2、H3

抗-NCR3 Fab#72

轻链:

SEQ ID NO:58:

gatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcagtccgtgtccagcgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaagcttctgatttactcggcatccagcctctactctggagtcccttctcgcttctctggtagccgttccgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaaTCTTCTTACTGGCCGTTCacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgattcacagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaaaaacataaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

重链:

SEQ ID NO:59:

gaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacATCTCTTCTTCTTCTATAcactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaTATATTTCTTCTTCTTCTGGCTATACTTCTtatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctacaaatgaacagcttaagagctgaggacactgccgtctattattGTGCTCGCTA CTCTTACTTCTACGGTGGTTACTTCTACTGGACTTCTTGGGGTGCTTTTGACTACTGgggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcggcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtcgacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca

抗-NCR3 Fab#78

轻链:

SEQ ID NO:60:

gatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcagtccgtgtccagcgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaagcttctgatttactcggcatccagcctctactctggagtcccttctcgcttctctggtagccgttccgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaatcttcttcttctctgatcacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgattcacagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaaaaacataaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

重链:

SEQ ID NO:61:

gaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacGTCTCTTCTTCTTCTATAcactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcatctatttcttcttcttctggctctacttcttatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctacaaatgaacagcttaagagctgaggacactgcggtctattattGTGCTCGCCG TATCTCTTCTTACTACATGTCTTACTACGACTCTTTCTACTACGCTGGTATGGACTACTGgggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcggcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtcgacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca

抗-NCR3 Fab#79

轻链:

SEQ ID NO:62:

gatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcagtccgtgtccagcgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaagcttctgatttactcggcatccagcctctactctggagtcccttctcgcttctctggtagccgttccgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaaCAGTGGTACCCGCTGATCacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgattcacagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaaaaacataaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

重链:

SEQ ID NO:63:

gaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacGTCTATTCTTATTCTATAcactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaTCTATTTATTCTTATTATGGCTCTACTTCTtatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctacaaatgaacagcttaagagctgaggacactgccgtctattattGTGCTCGCTG GTACCAGTACTACTACATCGGTACTGCTGCTATGGACTACTGgggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcggcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtcgacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca

抗-NCR1 Fab#27

轻链:

SEQ ID NO:64:

gatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcagtccgtgtccagcgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaagcttctgatttactcggcatccagcctctactctggagtcccttctcgcttctctggtagccgttccgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaaTCTTCTTCTTCTCTGATCacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgattcacagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacc

tacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaaaaacataaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

重链:

SEQ ID NO:65:

gaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacGTCTATTATTCTTATATAcactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaTCTATTTCTTCTTATTATGGCTCTACTTATtatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctacaaatgaacagcttaagagctgaggacactgccgtctattattGTGCTCGCTC TCGTTACCTGCAGGACTACTGGTCTTCTTGGTGGGTTTCTTGGTACGGTTTGGACTACTGgggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcggcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtcgacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca

抗-CD16 Fab#3

轻链:

SEQ ID NO:66:

gatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcagtccgtgtccagcgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaagcttctgatttactcggcatccagcctctactctggagtcccttctcgcttctctggtagccgttccgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaaTCTTCTGCTGAACTGATCacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgattcacagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaaaaacataaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

重链:

SEQ ID NO:67:

gaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacTTCTCTTCTTATTCTATAcactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaTCTATTTATTCTTCTTCTGGCTCTACTTCTtatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctacaaatgaacagcttaagagctgaggacactgccgtctattattGTGCTCGCTG GTCTTACGACCAGTACTACGACCAGCATGGTTACTACTTCTACTACTGGGGTTTTGACTACTGgggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcggcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtcgacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca

Claims (40)

1.特异性结合人自然细胞毒性触发受体3(NCR3)的抗体，其中所述抗体至少包含：

(1)包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，所述LCDR1包含SEQ IDNO:2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:4；和

包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，所述HCDR1包含SEQ IDNO:6，所述HCDR2包含SEQ ID NO:7，所述HCDR3包含SEQ ID NO:8；或

(2)包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，所述LCDR1包含SEQ IDNO:10，所述LCDR2包含SEQ ID NO:11，所述LCDR3包含SEQ ID NO:12；和

包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，所述HCDR1包含SEQ IDNO:14，所述HCDR2包含SEQ ID NO:15，所述HCDR3包含SEQ ID NO:41；或

(3)包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，所述LCDR1包含SEQ IDNO:18，所述LCDR2包含SEQ ID NO:19，所述LCDR3包含SEQ ID NO:20；和

包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，所述HCDR1包含SEQ IDNO:22，所述HCDR2包含SEQ ID NO:23，所述HCDR3包含SEQ ID NO:24。

2.如权利要求1所述的抗体，其包含：

包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，所述LCDR1包含SEQ IDNO:10，所述LCDR2包含SEQ ID NO:11，所述LCDR3包含SEQ ID NO:12；和

包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，所述HCDR1包含SEQ IDNO:14，所述HCDR2包含SEQ ID NO:15，所述HCDR3包含SEQ ID NO:41。

3.如权利要求2所述的抗体，其中所述HCDR3包含以下之一：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57。

4.如权利要求1所述的抗体，其中

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1；和

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5。

5.如权利要求1所述的抗体，其中

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:9；和

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13。

6.如权利要求1所述的抗体，其中

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:17；和

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:21。

7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述抗体是结合NCR3和第二靶蛋白的双特异性抗体。

8.如权利要求7所述的抗体，其中所述第二靶蛋白在癌细胞上表达。

9.如权利要求7所述的抗体，其中所述第二靶蛋白是CD20或BCMA或HER2。

10.多核苷酸，其编码权利要求1至9中任一项所述的抗体。

11.细胞，其表达权利要求1至9中任一项所述的抗体。

12.如权利要求11所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

13.在有需要的人中刺激自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性的方法，所述方法包括以足以刺激NK细胞介导的细胞毒性的量向所述人施用权利要求8至9中任一项所述的抗体。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述人患有癌症，并且所述NK细胞介导的细胞毒性杀死癌细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

16.特异性结合人自然细胞毒性触发受体1(NCR1)的抗体，其中所述抗体至少包含：

包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，所述LCDR1包含SEQ IDNO:26，所述LCDR2包含SEQ ID NO:27，所述LCDR3包含SEQ ID NO:28；和

包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，所述HCDR1包含SEQ IDNO:30，所述HCDR2包含SEQ ID NO:31，所述HCDR3包含SEQ ID NO:32。

17.如权利要求16所述的抗体，其中

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25；和

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:29。

18.如权利要求16至17中任一项所述的抗体，其中所述抗体是结合NCR1和第二靶蛋白的双特异性抗体。

19.如权利要求18所述的抗体，其中所述第二靶蛋白在癌细胞上表达。

20.如权利要求18所述的抗体，其中所述第二靶蛋白是CD20或BCMA或HER2。

21.多核苷酸，其编码权利要求16至20中任一项所述的抗体。

22.细胞，其表达权利要求16至20中任一项所述的抗体。

23.如权利要求11所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

24.在有需要的人中刺激自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性的方法，所述方法包括以足以刺激NK细胞介导的细胞毒性的量向所述人施用权利要求19至20中任一项所述的抗体。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述人患有癌症，并且所述NK细胞介导的细胞毒性杀死癌细胞。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

27.特异性结合人CD-16的抗体，其中所述抗体至少包含：

包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，所述LCDR1包含SEQ IDNO:34，所述LCDR2包含SEQ ID NO:35，所述LCDR3包含SEQ ID NO:36；和

包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，所述HCDR1包含SEQ IDNO:38，所述HCDR2包含SEQ ID NO:39，所述HCDR3包含SEQ ID NO:40。

28.如权利要求27所述的抗体，其中

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25；和

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:29。

29.如权利要求27至28中任一项所述的抗体，其中所述抗体是结合CD-16和第二靶蛋白的双特异性抗体。

30.如权利要求29所述的抗体，其中所述第二靶蛋白在癌细胞上表达。

31.如权利要求29所述的抗体，其中所述第二靶蛋白是CD20或BCMA或HER2。

32.多核苷酸，其编码权利要求27至31中任一项所述的抗体。

33.细胞，其表达权利要求27至31中任一项所述的抗体。

34.如权利要求11所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

35.在有需要的人中刺激自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性的方法，所述方法包括以足以刺激NK细胞介导的细胞毒性的量向所述人施用权利要求中任30至31中任一项所述的抗体。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述人患有癌症，并且所述NK细胞介导的细胞毒性杀死癌细胞。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

38.鉴定激活自然杀伤(NK)细胞的抗体的方法，所述方法包括：

提供与NK细胞上的蛋白结合的抗体文库；

在哺乳动物细胞表面表达抗体文库；

在NK细胞基于细胞上表达的抗体杀死至少一些哺乳动物细胞的条件下，将哺乳动物细胞群与NK细胞一起孵育；和

孵育后，定量剩余细胞的比例；

将剩余细胞的比例与对照哺乳动物细胞群进行比较，其中表达特定抗体的细胞的比例降低表明所述特定抗体激活NK细胞。

39.如权利要求38所述的方法，其还包括将所述特定抗体与NK细胞接触并测量所述接触的NK细胞的激活。

40.如权利要求38或39所述的方法，其中所述蛋白选自自然细胞毒性触发受体1(NCR1)、NCR3和CD-16。