CN117736456A - 超支化结构氧化还原聚合物、葡萄糖传感材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了超支化结构氧化还原聚合物、葡萄糖传感材料及其制备方法与应用，属于葡萄糖检测技术领域。该聚合物的制备方法包括以下步骤：使用环状二酸酐类化合物修饰端羟基超支化聚合物，得到端羧基超支化聚合物；将端羧基超支化聚合物与含有氨基官能团的氧化还原配体耦合，得到该聚合物。该聚合物为三维的球状结构，分子链不易缠结的特性，能够保证每个氧化还原配体都有充分的自由活动能力，能被充分利用，且能够相互之间自由活动碰撞，传递电子，增加了电子转移速率，克服了目前有线酶技术当中的氧效应问题；此外超支化结构氧化还原聚合物的分子链不易缠结，使得相同分子量的情况下，其粘度较线性聚合物低，具有优异的流动性和成膜性。

Description

超支化结构氧化还原聚合物、葡萄糖传感材料及其制备方法 与应用

技术领域

本申请涉及超支化结构氧化还原聚合物、葡萄糖传感材料及其制备方法与应用，属于葡萄糖检测技术领域。

背景技术

目前，糖尿病患者的临床治疗方法是每天数次测量手指扎取的血液中的血糖水平，然后注射胰岛素使血糖回到正常范围。但这种治疗方式对糖尿病患者餐后出现的高血糖以及夜间的低血糖事件难以做到较为精准的控制，因为患者需要依靠血糖水平的实时数据才能及时调整胰岛素注射剂量。这些缺陷加上重复刺指试验带来的疼痛，使得该方法对患者和医生都是不利的做法。在过去的几十年里，更复杂的植入式血糖追踪设备，如连续血糖监测仪(CGM)已经被开发出来。CGM可以连续捕捉血糖波动，因此能够完全跟踪一段时间内的血糖趋势。

第二代CGM的工作原理是通过人工化学合成媒介体，实现葡萄糖氧化酶和电极之间的电子传递，即有线酶技术。电子媒介体通过一个长的柔性链接枝到水溶性的线性聚合物的侧链，具体技术详情如公开号为US6605200 B1的美国专利申请文件。葡萄糖氧化酶的氧化还原中心黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)被一层较厚的绝缘层包裹，带有长柔性链的媒介体可以实现与FAD的有效接触，将电子转移出来。并通过快速还原和快速氧化形成电子或空穴等载流子，通过自交换来传导电流。还原的媒介体与氧化的媒介体碰撞，还原的媒介体转移电子，或者氧化的媒介体转移空穴。尽管在理论上，电子或空穴也可以通过在固定位置的媒介体之间跳跃而传播，但在氧化还原水凝胶中很少见到固态物理的trap-trap跳变现象。长柔性链的媒介体转移电子速度比短链的媒介体快，这是因为长柔性链增大了被栓系的媒介体的位移幅度，显著增加接触碰撞频率。此外，专利申请号为CN200980139400.8的专利申请文件中，通过调整合成媒介体的配体合成了不同氧化还原电位的电子媒介体，这些电子媒介体氧化还原电位一般都是小于0.3V，提高了CGMS的抗干扰能力。虽然人工合成媒介体实现葡萄糖氧化酶和电极之间进行的电子传递，但是氧气仍然会与葡萄糖氧化酶发生电子传递。所以氧气和人工合成媒介体会存在一个竞争关系。接枝在线性聚合物的侧链的电子媒介体往往通过相邻的电子媒介体的相互碰撞传递电子和空穴。但是线性聚合物往往存在链缠结的问题，电子媒介体局部浓度过高或过低，导致电子媒介体利用不充分。另外电子传递的效率也受限于电子媒介体只能相邻之间传递电子和空穴。所以，为了减少氧气的竞争干扰影响(氧效应)，在CN113521399 A、US6932894 B2等专利中，制备了一种生物相容性外膜来减少氧气向传感层的渗透，同时还要控制葡萄糖向传感层的通量。通过此外膜，减少了氧气的干扰。但是氧气作为一种溶解在体液里的小分子，仍然会在微溶涨的孔隙中随着水分子扩散到传感层，与电子媒介体竞争转移葡萄糖氧化酶的电子。

此外，在制备电极的过程中，需要将氧化还原聚合物(人工电子媒介体)、葡萄糖氧化酶溶液和交联剂混合后的稀溶液通过旋涂、点涂、浸涂或喷涂的方式在工作电极表面形成一层厚度约为5μm左右的酶膜层。这种加工方式需要混合溶液的粘度比较低。而传统的氧化还原聚合物是一种高分子量的线性聚合物，聚合物溶液的粘度随着分子量增大而急剧增大，限制了传统的高分子量的线性氧化还原聚合物的应用。

发明内容

为了解决上述问题，提供了超支化结构氧化还原聚合物、葡萄糖传感材料及其制备方法与应用，制备得到的超支化结构氧化还原聚合物为三维的球状结构，分子链不易缠结的特性，能够保证每个氧化还原配体都有充分的自由活动能力，能被充分利用，且能够相互之间自由活动碰撞，传递电子，增加了电子转移速率，克服了目前有线酶技术当中的氧效应问题；此外三维球状结构的超支化结构氧化还原聚合物的分子链不易缠结，使得相同分子量的情况下，其粘度较线性聚合物低，具有优异的流动性能和成膜性能，提高了制备电极批次之间灵敏度的一致性。

根据本申请的一个方面，提供了一种超支化结构氧化还原聚合物的制备方法，包括以下步骤：使用环状二酸酐类化合物修饰端羟基超支化聚合物，得到端羧基超支化聚合物；将所述端羧基超支化聚合物与含有氨基官能团的氧化还原配体耦合，得到所述超支化结构氧化还原聚合物。

可选地，所述端羧基超支化聚合物与含有氨基官能团的氧化还原配体的重量比为10:1-1:1，优选为3：1。

可选地，所述含有氨基官能团的氧化还原配体为双齿氮杂环化合物和金属离子的配合物；

优选的，所述双齿氮杂环化合物为N,N′-二甲基-2,2′-联咪唑；所述金属离子为锇或者钌。

可选地，所述环状二酸酐类化合物包括马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、衣康酸酐和已二酸酐中的至少一种；优选的，所述环状二酸酐类化合物为戊二酸酐；和/或

所述端羟基超支化聚合物为端羟基超支化聚酯和/或端羟基超支化聚醚，优选为端羟基超支化聚酯。

根据本申请的另一方面，还提供了一种超支化结构氧化还原聚合物，所述超支化结构氧化还原聚合物采用上述制备方法制得。

根据本申请的另一方面，还提供了一种葡萄糖传感材料的制备方法，所述葡萄糖传感材料由上述超支化结构氧化还原聚合物的水溶液、葡萄糖氧化酶溶液、交联剂溶液共价交联反应得到。

可选地，所述共价交联反应的反应温度为20～50℃，反应时间为1～60h；

优选的，所述共价交联反应的反应温度为45℃，反应时间为48h。

可选地，所述超支化结构氧化还原聚合物的水溶液的浓度为1～20mg/mL、葡萄糖氧化酶溶液的浓度为1～10mg/mL、交联剂溶液的浓度为1～10mg/mL；所述超支化结构氧化还原聚合物、葡萄糖氧化酶、交联剂的质量比为1：(0.1-5)：(0.01-0.5)。

具体地，所述交联剂包括三羟甲基丙烷三[3-(氮杂环丙烷-1-基)丙酸酯。

根据本申请的又一方面，还提供了一种葡萄糖传感材料，所述葡萄糖传感材料采用上述的制备方法制得。

根据本申请的又一方面，还提供了上述葡萄糖传感材料在葡萄糖智能监控仪器和糖尿病管理仪器中的应用。

本申请的有益效果包括但不限于：

1.根据本申请的超支化结构氧化还原聚合物，超支化结构氧化还原聚合物为三维的球状结构，分子链不易缠结的特性，能够保证每个氧化还原配体都有充分的自由活动能力，能被充分利用，且能够相互之间自由活动碰撞，传递电子，增加了电子转移速率，克服了目前有线酶技术当中的氧效应问题。

2.根据本申请的超支化结构氧化还原聚合物，超支化结构氧化还原聚合物，有大量短支链存在，再加上是三维球状结构，分子链不易缠结，分子间的相互作用力小，因而粘度较低；而线性聚合物容易缠绕打结，分子间的作用力大，因此，相同分子量的情况下，超支化结构氧化还原聚合物的粘度较线性聚合物低，具有优异的流动性能和成膜性能,利于保证批量化生产的电极酶膜层大小和厚度的一致性,进而保证批量化生产的电极的灵敏度一致性。

3.根据本申请的超支化结构氧化还原聚合物，通过对端羧基超支化聚合物与含有氨基官能团的氧化还原配体的重量比进行限定，使得端羧基超支化聚合物中的羧基含量远远多于氧化还原配体中氨基的量，以保证每个氧化还原配体都能够充分反应到聚合物链上。

4.根据本申请提供的葡萄糖传感材料能够应用于葡萄糖智能监控仪器和糖尿病管理仪器中，以特异性检测葡萄糖，其稳定电流信号与葡萄糖浓度线性相关系数高，且能排除干扰物质对乙酰氨基酚、抗坏血酸对葡萄糖检测的影响，因此，本发明涉及的葡萄糖传感材料在葡萄糖智能检测上具有广泛的应用价值。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为本申请实施例1涉及的工作电极在PBS中的循环伏安图。

图2为本申请实施例2涉及的工作电极在0-30mM葡萄糖PBS溶液中的时间电流曲线图。

图3为本申请实施例3涉及的工作电极横截面在显微镜下的图片。

图4为本申请实施例涉及的工作电极在不同氧气浓度下的灵敏度测试图。

图5为本申请实施例1涉及的工作电极对干扰物对乙酰氨基酚、抗坏血酸的响应测试图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本专利中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1#工作电极1#

工作电极1#的制备包括以下步骤：

(1)将5.2g端羟基超支化聚酯(H104，羟值520mg KOH/g)溶于500mL丙酮，接着加入45mmol戊二酸酐及2mL催化剂三乙胺；该混合反应液在60℃油浴中反应8h，产物在乙醇的氢氧化钠溶液中沉淀，沉淀用乙醇洗涤三次后在50℃真空干燥箱中干燥48h，得到端羧基超支化聚合物H104-COOH；

(2)将步骤1)得到的1.1g端羧基超支化聚合物H104-COOH加入至100mL PBS缓冲溶液中，pH值使用0.1M HCl溶液调至4.5，加入0.47mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.71mmol N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌20min，然后加入0.365g含有氨基官能团的N,N′-二甲基-2,2′-联咪唑与锇的配合物，室温搅拌反应48h，反应完成后在去离子水中透析三天，期间不断换水，透析完成后冷冻干燥得到超支化结构氧化还原聚合物；

(3)将20μL步骤(2)中得到的超支化结构的氧化还原聚合物的水溶液(10mg/mL)和80μL葡萄糖氧化酶溶液(5mg/mL)及8μL三羟甲基丙烷三[3-(氮杂环丙烷-1-基)丙酸酯交联剂溶液(5mg/mL)混合均匀后，滴涂到电极表面，待水分蒸发后45℃真空干燥48h，得到具有超支化结构的氧化还原聚合物葡萄糖传感层的电极；

(4)将步骤(3)中得到的具有超支化结构的氧化还原聚合物葡萄糖传感层的电极表面通过刮涂的方式形成半渗透的聚合物葡萄糖限制层膜，限制层膜采用现有的葡萄糖限制膜液即可。

实施例2工作电极2#

工作电极2#的制备步骤与实施例1中的不同之处在于：步骤(3)中，将200μL步骤(2)中得到的超支化结构的氧化还原聚合物的水溶液(1mg/mL)和1ml葡萄糖氧化酶溶液(1mg/mL)及100μL三羟甲基丙烷三[3-(氮杂环丙烷-1-基)丙酸酯交联剂溶液(1mg/mL)混合均匀后，滴涂到电极表面，待水分蒸发后50℃真空干燥60h，得到基于超支化结构的氧化还原聚合物葡萄糖传感层试剂的电极；

其余步骤与实施例1相同。

实施例3工作电极3#

工作电极3#的制备步骤与实施例1中的不同之处在于：步骤(3)中，将5μL步骤2中得到的超支化结构的氧化还原聚合物的水溶液(20mg/mL)和1μL葡萄糖氧化酶溶液(10mg/mL)及0.1μL三羟甲基丙烷三[3-(氮杂环丙烷-1-基)丙酸酯交联剂溶液(10mg/mL)混合均匀后，滴涂到电极表面，待水分蒸发后20℃真空干燥2h，得到基于超支化结构的氧化还原聚合物葡萄糖传感层试剂的电极；

其余步骤与实施例1相同。

实施例4工作电极4#

工作电极4#的制备步骤与实施例1中的不同之处在于：步骤(3)中，将20μL步骤2中得到的超支化结构的氧化还原聚合物的水溶液(10mg/mL)和80μL葡萄糖氧化酶溶液(5mg/mL)及8μL三羟甲基丙烷三[3-(氮杂环丙烷-1-基)丙酸酯交联剂溶液(5mg/mL)混合均匀后，滴涂到电极表面，待水分蒸发后30℃真空干燥16h，得到基于超支化结构的氧化还原聚合物葡萄糖传感层试剂的电极；

其余步骤与实施例1相同。

实施例5工作电极5#

工作电极5#的制备步骤与实施例1中的不同之处在于：步骤1)中，将5.2g端羟基超支化聚酯(H104，羟值520mg KOH/g)溶于500mL丙酮，接着加入45mmol丁二酸酐及2mL催化剂三乙胺；该混合反应液在60℃油浴中反应8h，产物在乙醇的氢氧化钠溶液中沉淀，沉淀用乙醇洗涤三次后在50℃真空干燥箱中干燥48h，得到端羧基超支化聚合物H104-COOH；

其余步骤与实施例1相同。

实施例6工作电极6#

工作电极6#的制备步骤与实施例1中的不同之处在于：步骤1)中，将5.2g端羟基超支化聚酯(H104，羟值520mg KOH/g)溶于500mL丙酮，接着加入45mmol马来酸酐及2mL催化剂三乙胺；该混合反应液在60℃油浴中反应8h，产物在乙醇的氢氧化钠溶液中沉淀，沉淀用乙醇洗涤三次后在50℃真空干燥箱中干燥48h，得到端羧基超支化聚合物H104-COOH；

其余步骤与实施例1相同。

实施例7工作电极7#

工作电极7#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：(2)将步骤1)得到的1.1g端羧基超支化聚合物H104-COOH加入至100mL PBS缓冲溶液中，pH值使用0.1M HCl溶液调至5，加入1.41mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和2.12mmol N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌20min，然后加入1.1g含有氨基官能团的N,N′-二甲基-2,2′-联咪唑与锇的配合物，室温搅拌反应48h，反应完成后在去离子水中透析三天，期间不断换水，透析完成后冷冻干燥得到超支化结构氧化还原聚合物；

其余步骤与实施例1相同。

实施例8工作电极8#

工作电极7#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：(2)将步骤1)得到的1.1g端羧基超支化聚合物H104-COOH加入至100mL PBS缓冲溶液中，pH值使用0.1M HCl溶液调至4.5，加入0.14mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.21mmol N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌20min，然后加入0.11g含有氨基官能团的N,N′-二甲基-2,2′-联咪唑与锇的配合物，室温搅拌反应48h，反应完成后在去离子水中透析三天，期间不断换水，透析完成后冷冻干燥得到超支化结构氧化还原聚合物；

其余步骤与实施例1相同。

实施例9工作电极9#

实施例9与实施例1的不同之处在于，采用的含有氨基官能团的N,N′-二甲基-2,2′-联咪唑与钌的配合物，其余均相同。

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于，对比例1采用侧链含有羟基的线性聚酯类聚合物，而非端羧基超支化聚合物H104-COOH，侧链含有羟基的线性聚酯类聚合物为甲基丙烯酸羟乙酯和乙烯基吡咯烷酮的共聚物。

实验例1

将实施例1得到的工作电极浸渍于PBS中，进行电位扫描，得到图1实施例1涉及的工作电极在PBS中的循环伏安图；将实施例2得到的工作电极在0-30mM葡萄糖PBS溶液中进行时间电流曲线的测定，得到图2时间电流曲线图；将实施例3得到的工作电极的横截面置于显微镜下观察，得到图3工作电极横截面在显微镜下的照片。

如图1所示，本申请实施例1得到的工作电极上的超支化结构的氧化还原聚合物的氧化还原电位比较低，能够避免干扰物，例如对乙酰氨基酚、抗坏血酸的干扰，使得检测结果更加准确灵敏；如图2所示，在葡萄糖0～30mM葡萄糖浓度中，电流值与葡萄糖浓度呈线性关系，葡萄糖应答良好，能够特异性检测葡萄糖，其稳定电流信号与葡萄糖浓度线性相关系数高；如图3所示，在实施例3的工作电极横截面在显微镜下的照片可以看出，超支化结构的氧化还原聚合物优异的流动性和成膜性，使得酶膜层平整，有利于保证批量化生产的电极的灵敏度一致性。

实验例2

实施例1及对比例1所制备的工作电极在不同氧气浓度下的灵敏度测试。

测试方法：将工作电极置于10mM的葡萄糖PBS溶液中，该测试液的氧气浓度5％。测试电极的电流值，待电极的电流值稳定后，将电极置换到氧浓度为1％的10mM葡萄糖PBS溶液中继续测试，直至电流值稳定，测试结果如图4所示。

由图4可以得到，实施例1的工作电极在1％和5％氧浓度的10mM葡萄糖浓度下测得的电流值变化较小，而对比例1的工作电极在1％和5％氧浓度的10mM葡萄糖浓度下测得的电流值变化较大，说明实施例1的工作电极与对比例1的工作电极相比，减少氧气的竞争干扰影响，具有更低的氧效应问题。

实验例3

实施例1所制备的工作电极对干扰物对乙酰氨基酚、抗坏血酸的响应测试图.

测试方法：将工作电极依次置于3.3mM的葡萄糖PBS溶液、3.3mM葡萄糖和20mg/dL对乙酰氨基酚的PBS溶液、3.3mM的葡萄糖PBS溶液、3.3mM葡萄糖、6mg/dL抗坏血酸的PBS溶液和3.3mM的葡萄糖PBS溶液中，测试电极的电流值。待电极在一个测试液中测试2000秒至电流值稳定后，将电极置换到下一次测试液中继续测试，依次往复，测试结果如图5所示。

由图5可以得知，实施例1的工作电极在干扰物对乙酰氨基酚和抗坏血酸存在的条件下，工作电流变化较小。这说明实施例1的工作电极能排除干扰物质对乙酰氨基酚、抗坏血酸对葡萄糖检测的影响，具有良好的抗干扰性能。

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种超支化结构氧化还原聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：使用环状二酸酐类化合物修饰端羟基超支化聚合物，得到端羧基超支化聚合物；将所述端羧基超支化聚合物与含有氨基官能团的氧化还原配体耦合，得到所述超支化结构氧化还原聚合物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述端羧基超支化聚合物与含有氨基官能团的氧化还原配体的重量比为10:1-1:1，优选为3：1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含有氨基官能团的氧化还原配体为双齿氮杂环化合物和金属离子的配合物；

优选的，所述双齿氮杂环化合物为N,N′-二甲基-2,2′-联咪唑；所述金属离子为锇或者钌。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环状二酸酐类化合物包括马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、衣康酸酐和已二酸酐中的至少一种；优选的，所述环状二酸酐类化合物为戊二酸酐；和/或

所述端羟基超支化聚合物为端羟基超支化聚酯和/或端羟基超支化聚醚，优选为端羟基超支化聚酯。

5.一种超支化结构氧化还原聚合物，其特征在于，所述超支化结构氧化还原聚合物采用权利要求1～4任一项所述制备方法制得。

6.一种葡萄糖传感材料的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖传感材料由权利要求5所述的超支化结构氧化还原聚合物的水溶液、葡萄糖氧化酶溶液、交联剂溶液共价交联反应得到。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述共价交联反应的反应温度为20～50℃，反应时间为1～60h；

优选的，所述共价交联反应的反应温度为45℃，反应时间为48h。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述超支化结构氧化还原聚合物的水溶液的浓度为1～20mg/mL、葡萄糖氧化酶溶液的浓度为1～10mg/mL、交联剂溶液的浓度为1～10mg/mL；所述超支化结构氧化还原聚合物、葡萄糖氧化酶、交联剂的质量比为1：(0.1-5)：(0.01-0.5)。

9.一种葡萄糖传感材料，其特征在于，所述葡萄糖传感材料采用权利要求6～8任一项所述的制备方法制得。

10.权利要求9所述的葡萄糖传感材料在葡萄糖智能监控仪器和糖尿病管理仪器中的应用。