CN117716036A - 用于病毒性疾病的温度可控型自我复制rna疫苗 - Google Patents

Abstract

本公开文本涉及编码与哺乳动物信号肽可操作组合的冠状病毒核衣壳蛋白或流感病毒核衣壳蛋白的mRNA、自我复制RNA和温度敏感型自我复制RNA。本公开文本涉及编码与哺乳动物信号肽可操作组合的一种或多种其他病毒核衣壳蛋白的mRNA、自我复制RNA和温度敏感型自我复制RNA。RNA构建体适合用于在诸如人类受试者的哺乳动物受试者中针对病毒的主动免疫。

Description

用于病毒性疾病的温度可控型自我复制RNA疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年11月3日提交的美国临时申请号63/275,398、2021年9月2日提交的美国临时申请号63/240,278和2021年6月17日提交的美国临时申请号63/211,974的权益，将其各自通过引用以其整体特此并入。

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技术领域

本公开文本涉及编码与哺乳动物信号肽可操作组合的冠状病毒核衣壳蛋白或流感病毒核衣壳蛋白的mRNA、自我复制RNA和温度敏感型自我复制RNA。本公开文本涉及编码与哺乳动物信号肽可操作组合的一种或多种其他病毒核衣壳蛋白的mRNA、自我复制RNA和温度敏感型自我复制RNA。RNA构建体适合用于在诸如人类受试者的哺乳动物受试者中针对病毒的主动免疫。

背景技术

β冠状病毒属涵盖引起COVID-19大流行的严重急性呼吸系统综合征(SARS)-CoV-2、引起2002-2004SARS爆发的SARS-CoV-1和中东呼吸综合征(MERS)-CoV。COVID-19大流行使得疫苗的设计和生产成为全球大量人口免疫的迫切需要。

美国食品和药物管理局(U.S.Food&Drug Administration)当前批准的SARS-CoV-2疫苗被设计为在感染前引发针对刺突(S)蛋白或S蛋白的受体结合结构域(RBD)的中和抗体(nAb)。然而，这种方法带来了巨大的挑战，因为即使在SARS-CoV-1与SARS-CoV-2毒株之间，S蛋白也不是很保守。特别地，在变种之间发生的小的氨基酸变化通常导致S蛋白的构象变化，这可能显著降低由COVID-19疫苗的特定S蛋白引发的nAb的有效性。

因此，预期仅靶向β冠状病毒S蛋白的持续疫苗开发遵循季节性流感疫苗的路径。这意味着变种的持续出现可能将需要定期开发和生产新疫苗。尽管每年生产β冠状病毒疫苗在技术上可能是可行的，但是涉及每年施用新疫苗的全球疫苗接种工作在经济和后勤上是不切实际的。每年施用新疫苗带来的问题给低收入和中等收入国家造成了尤其过度的负担。

因此，本领域存在对于安全地诱导针对SARS-CoV-2变种具有广泛反应性的持久免疫应答的β冠状病毒疫苗的需要。优选地，对于引起人类疾病的其他β冠状病毒，所述持久免疫应答是广泛反应的。本领域还存在对于在诱导针对甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的广泛反应性免疫应答中安全且有效的流感病毒疫苗的需要。

发明内容

本公开文本涉及来自β冠状病毒的核蛋白(在本文中也称为核衣壳蛋白)作为疫苗抗原来诱导对β冠状病毒变种具有广泛反应性的细胞免疫应答的用途。在一些实施方案中，利用温度可控型自我复制RNA(在本文中称为srRNAts和c-srRNA)疫苗平台。c-srRNA疫苗平台有利于在皮内施用后诱导有效的细胞免疫应答。在一些实施方案中，来自SARS-CoV-2的核蛋白在宿主细胞中表达以应对由SARS-CoV-2和SARS-CoV-1两者以及其变种引起的感染。在一些实施方案中，将来自冠状病毒的核蛋白与人类CD5抗原的信号肽融合并且在宿主细胞中表达以增强针对所述冠状病毒引发的细胞免疫应答。在一些实施方案中，将来自第一冠状病毒的核蛋白与来自第二冠状病毒的核蛋白融合，所述第二冠状病毒与所述第一冠状病毒不同。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含两种或三种冠状病毒核蛋白的串联阵列。在这些实施方案的子集中，所述融合蛋白包含SARS-CoV-2核蛋白和MERS-CoV核蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含冠状病毒刺突蛋白或其片段。以这种方式，刺激更广泛反应性的冠状病毒特异性免疫应答。

本公开文本还涉及来自流感病毒的核蛋白(在本文中也称为核衣壳蛋白)作为疫苗抗原诱导对甲型流感病毒和/或乙型流感病毒具有广泛反应性的细胞免疫应答的用途，所述甲型流感病毒和/或乙型流感病毒由于抗原漂移和抗原转变而随时间快速变化。在一些实施方案中，利用温度可控型自我复制RNA疫苗平台。c-srRNA疫苗平台有利于在皮内施用后诱导有效的细胞免疫应答。在一些实施方案中，来自甲型流感(FluA)病毒的一种亚型的核蛋白在宿主细胞中表达以应对由FluA的相同和不同亚型引起的感染。在一些实施方案中，来自乙型流感(FluB)病毒的一个谱系的核蛋白在宿主细胞中表达以应对由FluB的相同和不同谱系引起的感染。在一些实施方案中，将来自流感病毒的核蛋白与人类CD5抗原的信号肽融合并且在宿主细胞中表达以增强针对流感病毒引发的细胞免疫应答。在一些实施方案中，将来自FluA病毒的核蛋白与来自FluB病毒的核蛋白融合。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含来自FluA的一种或多种毒株和/或FluB的一种或多种谱系的两种或三种核蛋白的串联阵列。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含流感血凝素或其片段。以这种方式，刺激更广泛反应性的流感特异性免疫应答。

本公开文本还涉及来自埃博拉病毒的核蛋白(在本文中也称为核衣壳蛋白)作为疫苗抗原诱导对感染人类的两种、三种或四种埃博拉病毒物种的广泛反应性的细胞免疫应答的用途。在一些实施方案中，利用温度可控型自我复制RNA疫苗平台。c-srRNA疫苗平台有利于在皮内施用后诱导有效的细胞免疫应答。在一些实施方案中，将来自埃博拉病毒的核蛋白与人类CD5抗原的信号肽融合并且在宿主细胞中表达以增强针对所述埃博拉病毒引发的细胞免疫应答。在一些实施方案中，将来自第一埃博拉病毒物种的核蛋白与来自第二埃博拉病毒物种的核蛋白融合，将所述来自第二埃博拉病毒物种的核蛋白任选地与第三埃博拉病毒物种的核蛋白融合，将所述第三埃博拉病毒物种的核蛋白任选地与第四埃博拉病毒物种的核蛋白融合。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含来自两种或更多种埃博拉病毒物种的两种、三种或四种核蛋白或其片段的串联阵列。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含埃博拉病毒包膜糖蛋白或其片段。以这种方式，刺激更广泛反应性的埃博拉病毒特异性免疫应答。

在其他实施方案中，本公开文本提供了包含赋形剂和温度可控型自我复制RNA的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含壳聚糖。在一些实施方案中，所述壳聚糖是低分子量(约3-5kDa)壳聚糖寡糖，如壳聚糖寡糖乳酸。在一些实施方案中，所述组合物不包含脂质体或脂质纳米颗粒。

附图说明

图1示出了在皮内注射温度可控型自我复制RNA(本文称为srRNAts和c-srRNA)疫苗后诱导细胞(CD4+和CD8+T细胞)免疫应答的机制的示意图。

图2示出了由递送至哺乳动物宿主细胞的mRNA、自我复制RNA或温度敏感型自我复制RNA(srRNAts)表达的SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白的示意图。在示例性实施方案中，N蛋白的编码区是插入srRNAts内的目的基因(GOI)。G5004抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。G5004抗原是缺乏信号肽的SARS-CoV-2N蛋白。G5005抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。G5005抗原是包含如SEQ ID NO:8所示的来自人类CD5抗原的信号肽(CD5-SP)序列和SARS-CoV-2N蛋白的融合蛋白，其中CD5-SP替代N蛋白的位置1处的起始甲硫氨酸。G5006抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。G5006抗原是包含CD5-SP的信号肽序列、SARS-CoV-2N蛋白和MERS-CoV N蛋白的融合蛋白。编码G5004抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。编码G5005抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码G5006抗原的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，并作为密码子优化的形式示于SEQ ID NO:4中。

图3示出了用于在人类受试者中刺激针对冠状病毒的免疫应答的示例性方法的示意图。温度敏感型药剂(ts药剂)如srRNAts在许可温度下是功能性的，但是在非许可温度下是非功能性的。在人类受试者的体表处或体表以下的温度(表面体温)是许可温度，而人类受试者的核心体温是较高的非许可温度。因此，皮内施用于人类受试者的ts药剂在人类受试者的体表以下的许可温度下是功能性的。

图4A和图4B示出了从CD-1远交小鼠获得的脾细胞样品中细胞因子分泌细胞的频率，通过单次皮内注射含有5μg或25μg编码G5004抗原的温度可控型自我复制RNA(srRNA1ts2[PCT/US20/67506])或安慰剂(PBO：仅缓冲液)的100μL溶液已经对所述CD-1远交小鼠进行免疫。图4A示出了通过在存在或不存在SARS-CoV-2核蛋白肽池的情况下培养脾细胞进行再刺激后1x 10^6个脾细胞中干扰素-γ(INF-γ)斑点形成细胞(SFC)的频率，并且图4B示出了所述脾细胞中白介素-4(IL-4)SFC的频率。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。示出了每组五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。在皮内注射后14天分离脾细胞。

图5A和图5B示出了从CD-1远交小鼠获得的脾细胞样品中细胞因子分泌细胞的频率，通过单次皮内注射含有5μg或25μg编码G5005抗原的温度可控型自我复制RNA(srRNA1ts2[PCT/US20/67506])或安慰剂(PBO：仅缓冲液)的100μL溶液已经对所述CD-1远交小鼠进行免疫。图5A示出了通过在存在或不存在SARS-CoV-2核蛋白肽池的情况下培养脾细胞进行再刺激后1x 10^6个脾细胞中干扰素-γ(INF-γ)斑点形成细胞(SFC)的频率，并且图5B示出了所述脾细胞中白介素-4(IL-4)SFC的频率。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。示出了每组五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。在皮内注射后14天分离脾细胞。

图6A和图6B示出了从BALB/c小鼠获得的脾细胞样品中细胞因子分泌细胞的频率，通过单次皮内注射含有5μg或25μg编码G5005抗原的温度可控型自我复制RNA(srRNA1ts2[PCT/US20/67506])或安慰剂(PBO：仅缓冲液)的100μL溶液已经对所述BALB/c小鼠进行免疫。图6A示出了通过在存在或不存在SARS-CoV-2核蛋白肽池的情况下培养脾细胞进行再刺激后1x 10^6个脾细胞中干扰素-γ(INF-γ)斑点形成细胞(SFC)的频率，并且图6B示出了所述脾细胞中白介素-4(IL-4)SFC的频率。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。示出了每组五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。在疫苗接种后30天分离脾细胞。

图7示出了BALB/c小鼠的血清中的SARS-CoV-2抗原反应性免疫球蛋白G(IgG)的水平，通过单次皮内注射含有5μg或25μg编码G5005抗原的温度可控型自我复制RNA(srRNA1ts2[PCT/US20/67506])或安慰剂(PBO：仅缓冲液)的100μL溶液已经对所述BALB/c小鼠进行免疫。在ELISA中IgG水平由OD450表示。示出了疫苗接种(第0天)之前(第-1天)和之后(第30天)的IgG水平。示出了每组五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。

图8示出了从BALB/c小鼠获得的脾细胞样品中干扰素-γ(INF-γ)分泌细胞的频率，通过单次皮内注射含有5μg或25μg编码G5006抗原的温度可控型自我复制RNA(srRNA1ts2[PCT/US20/67506])或安慰剂(PBO：仅缓冲液)的100μL溶液已经对所述BALB/c小鼠进行免疫。具体地，图8示出了通过在存在或不存在SARS-CoV-2核蛋白肽池的情况下培养脾细胞进行再刺激后1x 10^6个脾细胞中INF-γ斑点形成细胞(SFC)的频率。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。示出了每组五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。在疫苗接种后14天分离脾细胞。

图9示出了示例性泛型流感疫苗的示意图。简言之，包含来自甲型流感病毒(FluA)的核蛋白和来自乙型流感病毒(FluB)的核蛋白的融合蛋白由递送至哺乳动物宿主细胞的mRNA、自我复制RNA或温度敏感型自我复制RNA(srRNAts)表达。在示例性实施方案中，融合蛋白的编码区是插入srRNAts内的目的基因(GOI)。具体地，G5010是包含以下的融合蛋白：如SEQ ID NO:8所示的来自人类CD5抗原的信号肽序列(CD5-SP)、FluA核蛋白(甲型流感，H5N8亚型[A/breeder duck/Korea/Gochang1/2014]，GenBank号KJ413835.1，ProteinID号AHL21420.1)和FluB核蛋白(乙型流感[B/Florida/4/2006]，GenBank号CY033879.1，ProteinID号ACF54251.1)。在G5010中，CD5-SP替代FluA核蛋白的起始甲硫氨酸，并且将FluA核蛋白与FluB核蛋白的起始密码子的甲硫氨酸融合。

图10示出了在G5010中用作疫苗抗原的甲型流感(H5N8毒株；ProteinIDAHL21420.1)的核蛋白(SEQ ID NO:13)和用作用于ELISpot测定的肽池的来源的甲型流感(NP/AnnArbor H2N2；ProteinID P21433)的核蛋白(SEQ ID NO:17)的比对。

图11A和图11B示出了从BALB/c小鼠获得的脾细胞样品中细胞因子分泌细胞的频率，通过单次皮内注射含有5μg或25μg编码G5010抗原的温度可控型自我复制RNA(srRNA1ts2[PCT/US20/67506])或安慰剂(PBO：仅缓冲液)的100μL溶液已经对所述BALB/c小鼠进行免疫。图11A示出了通过在存在或不存在甲型流感(H2N2)核蛋白肽池的情况下培养脾细胞进行再刺激后1x 10^6个脾细胞中干扰素-γ(INF-γ)斑点形成细胞(SFC)的频率，并且图11B示出了所述脾细胞中白介素-4(IL-4)SFC的频率。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。示出了每组五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。在疫苗接种后14天分离脾细胞。

图12示出了示例性泛型埃博拉病毒疫苗的示意图。简言之，包含四种不同埃博拉病毒株的核蛋白的融合蛋白由递送至哺乳动物宿主细胞的mRNA、自我复制RNA或温度敏感型自我复制RNA(srRNAts)表达。在示例性实施方案中，融合蛋白的编码区是插入srRNAts内的目的基因(GOI)。具体地，示例性泛型埃博拉抗原是包含以下的融合蛋白：如SEQ ID NO:8所示的来自人类CD5抗原的信号肽序列(CD5-SP)、如SEQ ID NO:18所示的扎伊尔型埃博拉病毒的核蛋白的一部分(残基2-739；总共738aa；GenBank ID:AF272001)、如SEQ ID NO:19所示的苏丹型埃博拉病毒的核蛋白的一部分(残基403-738；总共336aa；GenBank ID:AF173836)、如SEQ ID NO:20所示的本迪布焦型埃博拉病毒的核蛋白的一部分(残基403-739；总共337aa；GenBank ID:FJ217161)、以及如SEQ ID NO:21所示的塔伊森林型埃博拉病毒的核蛋白的一部分(残基483-651；总共169aa；GenBank ID:FJ217162)。泛型埃博拉抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，而编码泛型埃博拉抗原的核酸序列如SEQ ID NO:23所示。

图13示出了四种埃博拉病毒物种之间的作为同一性百分比的氨基酸序列相似性。通过使用NCBI BlastP算法，将扎伊尔型埃博拉病毒NP(GenBank ID:AF272001)、苏丹型埃博拉病毒NP(GenBank ID:AF173836)、本迪布焦型埃博拉病毒NP(GenBank ID:FJ217161)、塔伊森林型埃博拉病毒NP(GenBank ID:FJ217162)的氨基酸序列进行相互比较。基于序列比对，将蛋白质分为良好保守的区域(A)和不太保守的区域(B)。对于区域A，在扎伊尔型埃博拉病毒NP与苏丹型埃博拉病毒NP之间的氨基酸序列同一性为88％，而对于区域B，所述氨基酸序列同一性为42％。对于区域A，在扎伊尔型埃博拉病毒NP与本迪布焦型埃博拉病毒NP之间的氨基酸序列同一性为92％，而对于区域B，所述氨基酸序列同一性为53％。对于区域A，在扎伊尔型埃博拉病毒NP与塔伊森林型埃博拉病毒NP之间的氨基酸序列同一性为92％，而对于区域B，所述氨基酸序列同一性为54％。对于区域B，本迪布焦型(B)和塔伊森林型(B)序列具有相对高水平的序列相似性。基于区域B的序列比对，将蛋白质分为良好保守的区域(80％和86％相似性；无标记)和不太保守的区域(40％同一性；在本文中称为区域C)。

图14A和图14B示出了从BALB/c小鼠获得的脾细胞样品中细胞因子分泌细胞的频率，通过单次皮内注射含有25μg编码泛型埃博拉抗原(srRNA1ts2-泛型埃博拉，也称为G5011)的温度可控型自我复制RNA(如WO 2021/138447 A1中所描述的srRNA1ts2，也称为c-srRNA)或安慰剂(PBO：仅缓冲液)的100μL溶液已经对所述BALB/c小鼠进行免疫。图14A示出了通过在存在或不存在从通过塔伊森林型埃博拉病毒的核蛋白(Swiss-Prot ID:B8XCN6)[JPT peptide；PepMix塔伊森林型埃博拉病毒(NP)；JPT产品代码：PM-TEBOV-NP]的肽扫描得到的182种肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池的情况下培养脾细胞进行再刺激后1x10^6个脾细胞中干扰素-γ(INF-γ)斑点形成细胞(SFC)的频率，并且图14B示出了所述脾细胞中白介素-4(IL-4)SFC的频率。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。示出了每组五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。在疫苗接种后14天分离脾细胞。

图15描绘了显示编码严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)的示例性srRNA1ts2构建体的示意图。G5003是与WO 2021/138447A1的图21中呈现的“srRNA1ts2-2019-nCoV-RBD1”相同的抗原；并且G5003编码融合蛋白，所述融合蛋白包含CD5的信号肽(残基1-24)和SARS-CoV-2(原始毒株)的刺突蛋白的RBD。G5003o编码融合蛋白(SEQ ID NO:25)，所述融合蛋白包含CD5的信号肽(残基1-24)和SARS-CoV-2的刺突蛋白(奥密克戎毒株B.1.1.529：Science Brief：奥密克戎(B.1.1.529)变种|CDC)的RBD。G5003o开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。

图16A和图16B示出了从C57BL/6小鼠获得的脾细胞样品中细胞因子分泌细胞的频率，通过单次皮内注射含有安慰剂(PBO：仅缓冲液)或25μg编码G5003o抗原的温度可控型自我复制RNA(如WO 2021/138447 A1中所述的srRNA1ts2)的100μL溶液已经对所述C57BL/6小鼠进行免疫。图16A示出了来自免疫小鼠的通过以下方式再刺激的1x 10^6个脾细胞中干扰素-γ(INF-γ)斑点形成细胞(SFC)的频率并且图16B示出了所述脾细胞中白介素-4(IL-4)SFC的频率：在存在或不存在从通过SARS-CoV-2奥密克戎变种(B.1.1.529)的RBD[JPTpeptide产品代码：PM-SARS2-RBDMUT08-1]的肽扫描得到的53种肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池的情况下培养脾细胞。通过ELISpot测定进行测定。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。示出了每组五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。在疫苗接种后14天分离脾细胞。

图17A-17C示出了作为施用包含编码抗原的c-srRNA的组合物、随后施用包含蛋白质抗原的组合物的结果，小鼠中细胞免疫和体液免疫两者的诱导。图17A描绘了实验程序的示意图。在第-40天，从雌性BALB/c小鼠抽取血液用于蚀斑降低中和测试(PRNT)。在第-36天，将这些小鼠用编码G5003抗原的c-srRNA处理。在不用任何纳米颗粒或转染试剂的情况下，将c-srRNA作为裸RNA皮内注射到小鼠皮肤中。在第-22天(c-srRNA-G5003疫苗接种后14天)，将一半的小鼠处死以获得脾细胞以用于ELISpot测定。在第0天，向剩余小鼠皮内注射与佐剂(由Invivogen市售的AddaVax^TM佐剂)混合的SARS-CoV-2δ变种(B.1.617.2)的刺突蛋白。在第7天(刺突蛋白注射后7天)，抽取血液以用于PRNT测定。图17B示出了通过单次皮内疫苗接种c-srRNA-G5003疫苗诱导针对RBD蛋白的细胞免疫。该图示出了来自免疫小鼠的通过以下方式再刺激的1x 10^6个脾细胞中干扰素-γ(INF-γ)斑点形成细胞(SFC)的频率：在存在或不存在覆盖SARS-CoV-2RBD(原始毒株)的53种肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池的情况下培养脾细胞。通过ELISpot测定进行测定。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。示出了每组五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。在第-22天(疫苗接种后14天)分离脾细胞。图17C示出了通过蚀斑降低中和测定(PRNT)测量的可以中和(50％)SARS-CoV-2病毒(δ变种B.1.617.2)的血清抗体的滴度。暴露于SARS-CoV-2病毒(δ变种B.1.617.2)的刺突蛋白仅在用疫苗c-srRNA-G5003(编码SARS-CoV-2(原始毒株)的RBD)进行疫苗接种的小鼠中诱导了特异性针对SARS-CoV-2病毒的δ变种的中和抗体。

图18A-图18C示出了作为施用包含蛋白质抗原的组合物、随后施用包含编码抗原的c-srRNA的组合物的结果，小鼠中细胞免疫的诱导。图18A描绘了实验程序的示意图。在第0天(第1次处理)，将雌性C57BL/6小鼠用皮内注射10μg RBD蛋白(Sino Biological SARS-CoV-2[2019-nCoV])+佐剂(由Invivogen市售的AddaVax^TM佐剂)处理。在第14天(第2次处理)，将小鼠用皮内注射安慰剂(PBO：仅缓冲液)、25μg编码G5003抗原的c-srRNA、25μg编码G5003o抗原的c-srRNA、或10μg RBD蛋白(Sino Biological SARS-CoV-2[2019-nCoV])+佐剂(AddaVax^TM佐剂)处理。在第28天，处死小鼠，并且收集脾细胞和血清。图18B示出了通过在存在或不存在覆盖SARS-CoV-2RBD(原始毒株)的53种肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池的情况下培养进行再刺激的1x 10^6个脾细胞中干扰素-γ(INF-γ)斑点形成细胞(SFC)的频率，并且图18C示出了所述脾细胞中白介素4(IL-4)SFC的频率。通过ELISpot测定进行测定。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。

图19示出了如通过ELISA测定确定的测定的针对SARS-CoV-2病毒(原始毒株)的RBD的血清抗体水平(由OD450测量结果表示)。示出了每组五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。示出了每组第-1天(第1次处理前)的数据和第28天(第2次处理后)的数据。

图20A-图20D示出了从BALB/c小鼠获得的脾细胞样品中干扰素-γ(INF-γ)分泌细胞或白介素4(IL-4)分泌细胞的频率，通过单次皮内注射含有5μg(n＝1)或25μg(n＝4)编码G5006抗原的温度可控型自我复制RNA(如WO 2021/138447 A1中所描述的srRNA1ts2)(图2)或安慰剂(PBO：仅缓冲液：n＝5)的100μL溶液已经对所述BALB/c小鼠进行免疫。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。示出了每组一只小鼠(n＝1)或四只小鼠(n＝4)的平均值和标准差(误差条)。在疫苗接种后14天分离脾细胞。图20A和图20B示出了通过在存在或不存在SARS-CoV-2核蛋白肽池的情况下培养脾细胞进行再刺激后的结果。图20C和图20D示出了通过在存在或不存在MERS-CoV-2核蛋白肽池的情况下培养脾细胞进行再刺激后的结果。

图21示出了用c-srRNA-G5006进行疫苗接种，随后注射表达G5006抗原的肿瘤细胞的雌性BALB/c小鼠的存活率(％)。

图22描绘了显示编码这样的融合蛋白(在此命名为G5006d)的示例性srRNA1ts2构建体的示意图，所述融合蛋白为CD5的信号肽(残基1-24)、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)、SARS-CoV-2的核蛋白、MERS-CoV的核蛋白、以及MERS-CoV的RBD的融合蛋白。泛型冠状病毒抗原(G5006d)的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示，并且其开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。

图23A-图23B示出了从雌性C57BL/6小鼠获得的脾细胞样品中细胞因子分泌细胞的频率，通过单次皮内注射含有安慰剂(PBO：仅缓冲液)、25μg编码G5006抗原的温度可控型自我复制RNA(如WO 2021/138447 A1中所述的srRNA1ts2)、或25μg编码G5006d抗原的温度可控型自我复制RNA(如WO 2021/138447 A1中所述的srRNA1ts2)的100μL溶液已经对所述雌性C57BL/6小鼠进行免疫。图23A示出了来自免疫小鼠的通过以下方式再刺激的1x 10^6个脾细胞中的干扰素-γ(INF-γ)斑点形成细胞(SFC)的频率，并且图23B示出了所述脾细胞中白介素-4(IL-4)SFC的频率：在存在或不存在从通过(A)SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD[JPT peptide产品代码：PM-WCPV-S-RBD-2]；(B)SARS-CoV-2的核蛋白[JPT peptide产品代码：PM-WCPV-NCAP]；(C)MERS-CoV的核蛋白[JPT peptide，定制]；和(D)MERS-CoV的刺突蛋白[JPT peptide产品代码：PM-MERS-CoV-S-1]的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池的情况下培养脾细胞。通过ELISpot测定进行测定。在减去在不存在肽的情况下获得的频率(背景)后，在图中绘制在存在肽的情况下获得的频率。示出了每组用于PBO的五只小鼠(n＝5)、用于G5006的四只小鼠(n＝4)和用于G5006d的五只小鼠(n＝5)的平均值和标准差(误差条)。在疫苗接种后14天分离脾细胞。

图24描绘了显示编码这样的融合蛋白(G5012)的示例性srRNA1ts2构建体的示意图，所述融合蛋白是CD5的信号肽(残基1-24)、甲型流感(A/New Caledonia/20/1999(H1N1))的血凝素(HA)的一部分(残基25-165)、甲型流感的核蛋白(A/breeder duck/Korea/Gochang1/2014(H5N8))(残基166-662)、乙型流感的核蛋白(B/Florida/4/2006)(残基663-1222)、以及乙型流感(B/Florida/4/2006)的血凝素(HA)的一部分(残基1223-1365)的融合蛋白。泛型流感病毒抗原(G5012)的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，并且其开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。

图25示出了壳聚糖寡聚物对小鼠中来自srRNA1ts2(示例性c-srRNA)的基因(萤光素酶)表达的影响。在以下条件下将编码萤光素酶的c-srRNA皮内注射到小鼠中：1，对照-仅c-srRNA；2，与壳聚糖寡糖(0.001μg/mL)混合的c-srRNA；3，与壳聚糖寡糖(0.01μg/mL)混合的c-srRNA；4，与壳聚糖寡糖(0.5μg/mL)混合的c-srRNA；和5，与壳聚糖寡糖乳酸(0.1μg/mL)混合的c-srRNA。

具体实施方式

针对SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV及其变种的更广泛、更持久的保护最好通过诱导细胞免疫的疫苗(即，涉及CD8+杀伤T细胞和CD4+辅助T细胞的T细胞诱导疫苗)来实现。这与如背景技术部分中所讨论的当前的聚焦于中和抗体的COVID-19疫苗范例不同。已经通过实验证明并且广泛讨论了细胞免疫在对抗冠状病毒中的关键重要性[Sette和Crotty 2021]。单独的细胞免疫可以经由CD8+杀伤T细胞提供保护[Matchett等人,2021]。此外，细胞免疫依赖于线性T细胞表位，而体液免疫依赖于构象(以及线性)B细胞表位。因此，与体液免疫相比，细胞免疫对变种的抵抗力稳健得多。此外，与记忆B细胞相比，记忆T细胞持续更长时间，因此可能提供终身免疫。这需要合适的抗原和基于细胞免疫的疫苗平台两者。

基于细胞免疫的mRNA疫苗平台

疫苗平台描述于Elixirgen的早期专利申请[PCT/US20/67506，现公开为WO 2021/138447A1]中。此疫苗平台经过优化以诱导细胞免疫，这通过将疫苗生物学的现有知识与基于甲病毒属(如委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV))的温度可控型自我复制mRNA(srRNAts)组合而变成为可能。术语c-srRNA和srRNAts在整个本公开文本中可互换使用，其中srRNA1ts2(描述于WO 2021/138447 A1中)是示例性实施方案。srRNAts基于srRNA，也称为自扩增mRNA(saRNA或SAM)，通过在甲病毒属复制酶中掺入小的氨基酸变化来提供温度敏感性。Elixirgen Therapeutic Inc.的srRNAts在30℃-35℃下起作用，但是在等于或高于37℃±0.5℃时不起作用。它具有mRNA平台的所有优点：无基因组整合、快速开发和部署、和简单的优良制造过程(GMP)以及与mRNA平台相比srRNA平台的其他优势，特别是更长久的表达[Johanning等人,1995]和较低剂量下的较高免疫原性[Brito等人,2014]。然而，这种简单的温度可控特征使得将本文所述的T细胞诱导疫苗的许多期望特征结合在一起成为可能。

简言之，srRNA1ts2是一种被开发用于异源蛋白的瞬时表达的温度敏感型自我复制的基于VEEV的RNA复制子。通过在VEEV的非结构蛋白2(nsP2)内插入五个氨基酸残基来赋予温度敏感性。nsP2蛋白是解旋酶/蛋白酶，其与nsP1、nsP3和nsP4一起构成VEEV复制酶。srRNA1ts2不含VEEV结构蛋白(衣壳、E1、E2和E3)。将Elixirgen Therapeutics,Inc.的WO2021/138447 A1的披露内容通过引用特此并入。特别地，将WO 2021/138447 A1的实施例3、图12和SEQ ID NO.29-49通过引用特此并入。

总体而言，srRNAts平台令人信服的对于免疫原性(剂量节制)和安全性益处(温度控制和裸递送)的潜力、提供持久的基线细胞免疫以及提供跨变种的快速体液应答的能力使所述平台成为可满足对于提供长期免疫的不昂贵、安全、应对变种的疫苗的全球需求的大规模部署的强候选物。

通用技术和定义

除非另有指示，否则本公开文本的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术都在本领域的技术范围内。

除非另有说明，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，“一种”赋形剂包括一种或多种赋形剂。

本文使用的短语“包含”是开放式的，表明这些实施方案可以包括另外的要素。相比之下，短语“由……组成”是封闭性的，表明此类实施方案不包括另外的要素(除了痕量杂质以外)。短语“基本上由……组成”是部分封闭的，表明这些实施方案可以进一步包括不在实质上改变这些实施方案的基本特征的要素。

如本文所用，关于值的术语“约”涵盖该值的90％至110％(例如，当关于壳聚糖寡糖使用时，约5,000道尔顿的分子量是指4,500道尔顿至5,500道尔顿)。

术语“抗原”是指被抗体或T细胞抗原受体识别并特异性结合的物质。抗原可包括肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、复合碳水化合物、糖、神经节苷脂、脂质和磷脂；其部分及其组合。在本公开文本的上下文中，术语“抗原”典型地是指长度为至少八个氨基酸残基的多肽或蛋白质抗原，其可以包含一个或多个翻译后修饰。

除非另有规定，否则术语“多肽”和“蛋白质”可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于某些长度。多肽可以包括天然氨基酸残基或者天然氨基酸残基和非天然氨基酸残基的组合。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，多肽可以含有关于原生或天然序列的修饰，只要蛋白质保持所需活性(例如，抗原性)即可。

如本文所用，术语“分离的”和“纯化的”是指从与其天然缔合的至少一种组分取出(例如，从其原始环境取出)的材料。术语“分离的”在关于重组蛋白使用时是指已经从产生所述蛋白质的宿主细胞的培养基移出的蛋白质。在一些实施方案中，如通过HPLC确定的，分离的蛋白质(例如，SARS-CoV-2刺突蛋白)是至少75％、90％、95％、96％、97％、98％或99％纯的。

物质的“有效量”或“足够量”是足以实现有益或所需结果，包括临床结果的量，并且因此，“有效量”取决于其所应用的背景。在施用包含编码抗原的mRNA的本公开文本的组合物的上下文中，有效量含有足够的mRNA以刺激免疫应答(优选针对抗原的细胞免疫应答)。

在本公开文本中，术语“个体”和“受试者”是指哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于人类、非人灵长类动物(例如，猴)、农场动物、运动动物、啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)和宠物(例如，狗和猫)。在一些优选的实施方案中，受试者是人类受试者。

如本文所用的关于包含编码抗原的mRNA的组合物的术语“剂量”是指受试者在任何一次服用(施用或接受)的测量的部分。向有需要的受试者施用本公开文本的组合物包括施用有效量的包含编码抗原的mRNA的组合物以在受试者中刺激对抗原的免疫应答。

应答或参数的“刺激”包括当与除目的参数外其他方面都相同的条件相比时，或者可替代地，如与另一条件相比，引发和/或增强该应答或参数(例如，与施用不包含或不编码抗原的对照组合物相比，施用包含或编码该抗原的组合物后抗原特异性细胞因子分泌增加)。例如，免疫应答(例如，Th1应答)的“刺激”意指应答的增加。取决于所测量的参数，增加可以是2倍至200倍或更多、5倍至500倍或更多、10倍至1000倍或更多、或2、5、10、50或100倍至200、500、1,000、5,000或10,000倍。

相反地，应答或参数的“抑制”包括当与除目的参数外其他方面都相同的条件相比时，或者可替代地，如与另一条件相比，降低和/或抑制该应答或参数。例如，免疫应答(例如，Th2应答)的“抑制”意指应答的降低。取决于所测量的参数，降低可以是2倍至200倍、5倍至500倍或更多、10倍至1000倍或更多、或2、5、10、50或100倍至200、500、1,000、2,000、5,000或10,000倍。

相对术语“较高”和“较低”分别是指当与除目的参数外其他方面都相同的条件相比时，或者可替代地，如与另一条件相比，应答或参数的可测量的增加或减少。例如，“较高的抗体滴度”是指作为施用包含编码抗原的mRNA的本公开文本的组合物的结果的抗原反应性抗体滴度比作为对照条件(例如，施用不包含mRNA或包含不编码抗原的对照mRNA的比较组合物)的结果的抗原反应性抗体滴度高至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍。同样地，“较低的抗体滴度”是指作为对照条件(例如，施用不包含mRNA或包含不编码抗原的对照mRNA的比较组合物)的结果的抗原反应性抗体滴度比作为施用包含编码抗原的mRNA的本公开文本的组合物的结果的抗原反应性抗体滴度低至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍。

如本文所用，术语“免疫”是指增加哺乳动物受试者对抗原的应答，并且因此改善其抵抗或克服感染和/或抵抗疾病的能力的过程。

如本文所用，术语“疫苗接种”是指将疫苗引入哺乳动物受试者的体内。

如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”和“序列同一性”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，主题抗原)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

氨基酸取代可以包括用另一种氨基酸替代多肽中的一个氨基酸。可以将氨基酸取代引入目的抗原中，并针对所期望的活性(例如增加的稳定性和/或免疫原性)来筛选产物。

通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及

(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

保守氨基酸取代将涉及这些类别中一个类别的成员与同一类别中另一个成员的交换。非保守氨基酸取代将涉及将这些类别之一的成员与另一个类别的成员交换。

如本文所用，术语“赋形剂”是指存在于包含活性成分(例如，编码抗原的mRNA)的组合物中的化合物。药学上可接受的赋形剂是惰性药物化合物，并且可以包括例如溶剂、填充剂、缓冲剂、张力调节剂和防腐剂(Pramanick等人,Pharma Times,45:65-77,2013)。在一些实施方案中，本公开文本的组合物包含赋形剂，其用作溶剂、填充剂、缓冲剂和张力调节剂中的一种或多种(例如，盐水中的氯化钠可以充当水性媒介物和张力调节剂两者)。

针对皮内递送进行优化

皮内疫苗接种导致持久的细胞免疫和增加的免疫原性[Hickling和Jones,2009]。人类皮肤(表皮和真皮)富含抗原呈递细胞(APC)，包括朗格汉斯细胞和真皮树突细胞(DC)。已知皮内疫苗接种比皮下或肌内疫苗接种有效5至10倍，因为它靶向皮肤中存在的APC[Hickling和Jones,2009]，从而激活T细胞免疫途径以获得持久的免疫。通过皮内注射，srRNAts主要被皮肤APC吸收，其中所述srRNAts被复制，产生抗原，将抗原消化成肽，并且将肽呈递给T细胞(图1)。通过此途径呈递的肽刺激MHC-I限制性CD8+杀伤T细胞。在另一种途径中，APC还吸收由附近皮肤细胞产生的抗原。通过此途径呈递的肽刺激MHC-II限制性CD4+辅助T细胞，这有助于B细胞产生中和抗体(nAb)以抵抗病毒感染。

皮内注射的问题及解决方案

此处是我们已经确定的潜在问题以及srRNAts平台提供的解决方案。

(1)应用srRNA作为皮内疫苗平台的一个关键的未认识到的障碍是mRNA和srRNA两者在皮肤温度下都不能很好地表达抗原[PCT/US20/67506]。非直观地，人类皮肤的温度(约30℃-35℃)低于人类核心体温(约37℃)；这意味着在37℃下开发的载体和平台对于皮内注射不是最佳的。srRNAts平台的一个创新是它在皮肤温度下强烈表达抗原[PCT/US20/67506]。此外，这种温度控制还使由srRNAts的不期望的全身分布引起的安全性风险最小化，因为一旦srRNAts的温度升高到高于其允许阈值(当其更靠近身体核心时)，srRNAts就会失活。换句话说，与mRNA和srRNA相比，srRNAts平台在皮内注射的情况下表达抗原最佳，并且其另外具有安全特征：在受试者身体的其他区域中载体的传播和产生的能力是有限的或者所述载体是失活的。

(2)皮内疫苗接种的另一个挑战是缺乏合适的添加剂。因为佐剂(如铝盐和水包油)在通过皮内途径递送时局部反应原性太强，所以没有将佐剂掺入临床批准的皮内疫苗中，导致较低的免疫原性[Hickling和Jones,2009]。用于肌内施用的mRNA和srRNA疫苗的脂质纳米颗粒(LNP)也是水包油的，这可能引起皮肤反应原性并增加对LNP组分(如PEG)的过敏反应的风险。c-srRNA平台是此问题的解决方案，因为所述平台以裸c-srRNA(无LNP，无佐剂)注射。首先，RNA在细胞(特别是APC)内的自我复制诱导了强的先天免疫，这取代了佐剂的主要功能。其次，文献中的数据和在本公开文本的开发期间获得的数据表明，特别是对于皮内注射，与mRNA/srRNA的电穿孔[Johansson等人,2012]和与LNP组合的mRNA/srRNAs[Golombek等人,2018]相比，裸mRNA/srRNA同样有效地产生抗原。

(3)第三个挑战是皮内疫苗的先例数量有限。只有BCG疫苗是常规皮内施用的，并且当前可用的COVID-19疫苗都是肌内施用的。我们降低采用皮内注射的障碍的一种方式是使用专门的装置，如MicronJet600(NanoPass)和Immucise(Terumo)，它们现在可以实现简单、一致的皮内注射。这些装置也是大规模生产和部署的良好候选物。然而，由于这些特殊装置的成本相对较高，使用标准针头和注射筒通过Mantoux技术的皮内注射也是一种选择。

合适抗原的设计

以细胞免疫为重点的方法允许重新考虑病毒基因组上编码的所有蛋白质作为抗原候选物，因为体液免疫(即中和抗体的诱导)不是主要考虑因素。

当选择将提供针对SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV及其变种的更广泛保护的抗原时，确定核蛋白(N)是最合适的，因为(1)N是最丰富的蛋白质，其次是病毒颗粒中的膜(M)和刺突(S)[Finkel等人,2021]，(2)N总体上是上述β冠状病毒中最保守的蛋白质[Grifoni等人,2020]，以及(3)B和T细胞的表位在S和N中是最丰富的[Grifoni等人,2020]。这与先前的建议(N是疫苗的最佳抗原)一致[Dutta等人,2020]。值得注意的是，最近的报道清楚地表明，使用单独的N作为抗原的疫苗可以在仓鼠和小鼠两者中都提供S非依赖性保护性免疫[Matchett等人,2021]。尽管先前观察到N疫苗以及S疫苗的疾病增强[Lambert等人,2020]，但是这些数据是通过使用具有不利的Th2>Th1特征的不同载体获得的。

示例性疫苗候选物srRNA1ts2-G5005被设计为表达SARS-CoV-2的N蛋白(SARS2-N)。然而，MERS-N形成不同的组并且仅显示48％同一性[Tilocca等人,2020]。考虑到这一点，另一种示例性疫苗候选物srRNA1ts2-G5006被设计为表达SARS2-N和MERS-N的融合蛋白。G5005和G5006抗原示意性地示于图2中。srRNA1ts2-G5005适合用于诱导针对SARS-CoV-1、SARS-CoV-2及其变种的免疫应答。相比之下，srRNA1ts2-G5006适合用于诱导泛型冠状病毒免疫应答(例如，针对SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV及其变种)。

为了应对SARS-CoV-2病毒的变种(突变)形式的出现，产生编码SARS-CoV-2奥密克戎变种(G5003o)的RBD的c-srRNA，并且将其皮内施用于C57BL/6小鼠(实施例8和图15)。在疫苗接种后14天评估细胞免疫。结果清楚地表明，当c-srRNA中包含奥密克戎变种的受体结合结构域(RBD)的开放阅读框时，c-srRNA可以诱导奥密克戎变种特异性细胞免疫。重要的是，发现编码G5003o抗原的c-srRNA诱导偏向于Th1的应答，如图16A-图16B所示[Th1(INF-γ)>Th2(IL-4)]，这对于疫苗是有利的。

纳入初免加强免疫方案

皮内施用的c-srRNA疫苗的独特特征之一是其诱导细胞免疫但不明显诱导体液免疫(即抗体)的能力。如在本公开文本的开发期间确定的，c-srRNA疫苗能够引发针对随后遇到的蛋白质抗原的体液免疫应答。简言之，首先将小鼠用编码抗原(即，SARS-CoV-2原始毒株的RBD)的c-srRNA处理，随后用佐剂化变种RBD蛋白(即，SARS-CoV-2δ变种的RBD)处理，如实施例9所述和图17A所示。

在初次疫苗接种(初免)后第14天已经诱导了细胞免疫(通过测量抗原特异性IFN-γ分泌T细胞的存在来评估)，如图17B所示。此时未检测到抗原特异性抗体。在用佐剂化蛋白抗原处理后，早在第二次疫苗接种(加强)后第7天诱导抗体，如图17C所示。这种抗体的早期诱导与二次免疫应答一致，表明c-srRNA已经引发体液免疫。重要的是，由蛋白质抗原加强诱导的抗体能够中和病毒变种，所述病毒变种具有与由c-srRNA疫苗编码的RBD抗原不同的RBD序列。这一出乎意料的发现表明c-srRNA疫苗可以诱导针对这样的病原体的保护性免疫应答，所述病原体具有与由c-srRNA疫苗编码的抗原序列不同的抗原序列。因此，预期c-srRNA疫苗诱导广泛反应性免疫应答，这对于提供针对变种病原体的保护是至关重要的。

针对病原体的亚单位疫苗通常不提供持久的体液免疫(即，病原体特异性抗体)，因此需要一种或多种加强疫苗。如在本公开文本的开发期间所确定的，当佐剂化蛋白作为初免疫苗施用时，c-srRNA疫苗适合用作加强疫苗。简言之，将小鼠首先用佐剂化蛋白(即SARS-CoV-2原始毒株的RBD)处理，随后用安慰剂(PBO：仅缓冲液)、编码G5003抗原的c-srRNA(原始RBD)、编码G5003o抗原的c-srRNA(奥密克戎RBD)、或佐剂化蛋白质抗原(原始RBD)处理，如实施例10所述和图18A。

如图17C所示，单独的c-srRNA疫苗不诱导中和抗体应答形式的体液免疫(参见，PBO第7天)。然而，当由佐剂化蛋白(作为初次疫苗接种的模型)引发体液免疫时，c-srRNA加强疫苗能够诱导抗原特异性细胞因子应答(图18B-图18C)和抗原特异性抗体应答(图19)两者。值得注意的是，在当前的实验条件下，单剂佐剂化蛋白不会诱导RBD特异性抗体。显然，由c-srRNA诱导的细胞免疫能够刺激针对较早遇到的蛋白质抗原的抗体产生。这一观察结果表明细胞免疫应答与体液免疫应答之间发生了重要的相互作用。

体内抗原表达细胞的消除

c-srRNA疫苗能够诱导强的细胞免疫应答(即抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+辅助T淋巴细胞)。抗原特异性CD8+CTL使表达抗原的细胞裂解。CD8+CTL的抗原识别是基于MHC I类分子对短肽片段(T细胞表位)的呈递，因此抗原不必在靶细胞表面上表达。对于针对病原体的疫苗，预期疫苗使被病原体感染的细胞裂解。对于针对癌症的疫苗，预期疫苗使癌细胞裂解。

产生了编码SARS-CoV-2核蛋白和MERS-CoV核蛋白(称为SMN蛋白或G5006)的融合蛋白作为抗原的c-srRNA疫苗。为了对被病毒感染的细胞进行建模，选择了4T1乳腺癌细胞系，该细胞系源自BALB/c小鼠并且已知作为用于三阴性IV期人类乳腺癌的模型。当注射到BALB/c小鼠中时，4T1细胞快速生长并且形成肿瘤。使用这种同系小鼠模型来模拟受感染的细胞的快速增加。通过转染在CMV启动子下编码SMN蛋白的质粒载体来建立表达SMN蛋白的4T1细胞(命名为4T1-SMN)，使得该蛋白在4T1细胞中组成型表达。该融合蛋白与G5006相同，不同之处是从4T1细胞中表达的SMN蛋白的N末端去除CD5信号肽。

将BALB/c小鼠用c-srRNA-G5006进行疫苗接种，并且通过对SARS-CoV-2核蛋白(图20A-图20B)和MERS-CoV核蛋白(图20C-图20D)两者均应答的T细胞的存在来证明细胞免疫的诱导。随后，在第24天(疫苗接种后24天)，将4T1-SMN细胞注射到用c-srRNA-G5006进行疫苗接种的BALB/c小鼠中。如所预期，4T1-SMN细胞在接受安慰剂(无疫苗组)的小鼠中快速生长。相比之下，在c-srRNA-G5006疫苗接种的小鼠中，4T1-SMN肿瘤的生长受到抑制。在接受25μg c-srRNA-G5006疫苗的两只小鼠中，即使肿瘤最初生长，但是小鼠最终变得无肿瘤并且在安慰剂的接受者死亡后存活了很长时间。此外，即使在疫苗接种后第143天第二轮注射4T1-SMN肿瘤后，也没有肿瘤生长，并且小鼠在研究的持续时间保持存活和无肿瘤(图21)。此结果表明，编码G5006抗原(即，SMN蛋白)的c-srRNA疫苗可以通过消除被SARS-CoV-2或MERS-CoV感染的细胞来诱导保护性免疫应答。

泛型冠状病毒加强疫苗

对于感染性疾病，如COVID-19，世界卫生组织(World Health Organization)指南要求许可的能够诱导中和抗体(nAb)的疫苗。这种要求是有意义的，因为nAb可以防止细胞被感染，并且因此nAb可以有效地控制感染的传播。然而，nAb水平通常迅速下降，因此在初次疫苗接种系列(第1次和第2次疫苗接种)完成后需要定期(例如，一年一次或两次)加强疫苗以维持足够的nAb水平。SARS-CoV-2的高突变率(特别是在作为nAb的靶标的刺突蛋白的RBD内)是与使用通常靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的第一代COVID-19疫苗相关的主要问题。

为了解决这些问题，开发了新的加强疫苗，c-srRNA-G5006d，其编码包含以下的融合蛋白：CD5信号肽、SARS-CoV-2的刺突-RBD、SARS-CoV-2的核蛋白、MERS-CoV的核蛋白、和MERS-CoV的刺突-RBD(实施例12和图22)。泛型冠状病毒抗原(G5006d)的氨基酸序列如SEQID NO:27所示，并且其开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。可以改变融合蛋白的每个序列区段(SARS-CoV-2的RBD；SARS-CoV-2的核蛋白；MERS-CoV的核蛋白；MERS-CoV的RBD)的顺序，并且每个区段的氨基酸序列不必与本文提供的示例性序列100％相同。

在接受了针对刺突抗原或其片段(RBD)的初次疫苗系列(第1次疫苗接种或者第1次和第2次疫苗接种)后，c-srRNA-G5006d疫苗旨在被用作加强疫苗。然而，c-srRNA-G5006d疫苗也可以用作初次疫苗系列的一部分。

c-srRNA-G5006d疫苗加强nAb水平，并且提供针对感染人类的β冠状病毒的细胞免疫。细胞免疫对于提供针对严重疾病、住院治疗和死亡的长期保护是重要的。

如实施例10中所述，当将编码刺突-RBD的c-srRNA疫苗用作加强疫苗时，在施用可以引发或诱导体液免疫的疫苗后，所述c-srRNA疫苗可以增加针对刺突-RBD的抗体或nAb的水平。

c-srRNA-G5006d编码SARS-CoV-2的刺突-RBD蛋白和MERS-CoV的刺突-RBD蛋白两者。因此，c-srRNA-G5006d可以用作SARS-CoV-2和MERS-CoV两者的加强疫苗。

SARS-CoV-2和SARS-CoV的刺突蛋白是类似的(约76％同一性)(Grifoni等人,2020)。因此，c-srRNA-G5006d作为针对SARS-CoV-2、SARS-CoV及其变种的加强剂是有效的。在另一方面，SARS-CoV-2和MERS-CoV的刺突蛋白是不同的(约35％同一性)(Grifoni等人,2020)。然而，c-srRNA-G5006d也编码MERS-CoV的刺突-RBD。因此，c-srRNA-G5006d作为针对MERS-CoV及其变种的加强剂是有效的。总之，c-srRNA-G5006d作为针对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV及其变种的加强剂是有效的。

c-srRNA-G5006d也编码SARS-CoV-2和MERS-CoV的核蛋白。因此，c-srRNA-G5006d能够诱导针对SARS-CoV-2和MERS-CoV的强的细胞免疫。SARS-CoV-2和SARS-CoV的核蛋白彼此非常类似(约90％同一性)(Grifoni等人,2020)。因此，c-srRNA-G5006d提供了针对SARS-CoV-2、SARS-CoV及其变种的强的细胞免疫。相比之下，SARS-CoV-2和MERS-CoV的核蛋白是不同的(约48％同一性)(Grifoni等人,2020)。然而，c-srRNA-G5006d也编码MERS-CoV的核蛋白。因此，预期c-srRNA-G5006d提供针对MERS-CoV及其变种的强的细胞免疫。总之，c-srRNA-G5006诱导针对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV及其变种的有效免疫应答。

如实施例9和实施例10所述，c-srRNA疫苗具有显著的作用模式。也就是说，编码的抗原似乎不直接刺激B细胞，并且因此不需要考虑编码的抗原的三维结构。这不同于被设计成直接刺激B细胞以产生针对构象表位(抗原的三维结构)的抗体的传统疫苗。这就是为什么将融合蛋白用于c-srRNA疫苗是合适的，而将融合蛋白用于传统亚单位疫苗是复杂的，因为当表达为融合蛋白时，每种抗原的天然三维结构可能被破坏。c-srRNA加强疫苗通过CD4+辅助T细胞的激活来刺激抗体产生，并且因此它依赖于短肽表位(约15聚体)。因此，可以简单地将两种或更多种不同的抗原放在一起形成针对由c-srRNA疫苗编码的抗原的单一融合蛋白，而这种机制对于亚单位疫苗的设计可能是有问题的。

c-srRNA依赖于用于诱导细胞和体液免疫应答的短肽表位的事实也为引发针对变种病原体的保护的更广泛反应性的疫苗提供了优势。许多T细胞表位存在于单个蛋白质中，并且因此任何单个突变不太可能引起免疫原性的丧失。在另一方面，传统的亚单位疫苗依赖于蛋白质抗原的三维结构，并且因此即使单个突变也可能改变蛋白质的构象，这可能导致免疫原性的丧失。

如图23A-图23B所示，c-srRNA-G5006d可以刺激针对由此疫苗编码的以下所有蛋白质的细胞免疫：SARS-CoV-2的刺突-RBD、SARS-CoV-2的核蛋白、MERS-CoV的核蛋白和MERS-CoV的刺突-RBD。

泛型流感加强疫苗

如在本公开文本开发期间所确定的(参见，实施例6)，当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达包含来自代表性甲型流感和乙型流感毒株的核蛋白的融合蛋白时，所述融合蛋白能够诱导强的抗原特异性细胞免疫应答。保护通常被认为主要由针对血凝素(HA)(流感病毒的表面蛋白之一)的中和抗体介导。因此，FDA批准的流感疫苗包括单独或与其他流感抗原组合的HA作为抗原。由于基于c-srRNA的加强疫苗仅需要HA蛋白上的CD4+T细胞表位来增强Ab产生，因此不需要考虑HA蛋白的三维结构。已知只有H1N1流感病毒的HA蛋白的一些部分可以充当CD4+T细胞表位(Knowlden等人,Pathogens.8(4):220,2019)。已经鉴定了甲型流感和乙型流感两者中的B细胞表位和CD4+T细胞表位(Terajima等人Virol J,10:244,2013)。对代表性H1N1流感病毒的HA蛋白的序列进行比对(Darricarrère等人,JVirol,92(22):e01349-18,2018)，并且鉴定具有良好保守的序列的区域。基于这些考虑，选择甲型流感病毒(A/New Caledonia/20/1999(H1N1))[GenBank登录号EU103824]的HA蛋白片段(残基316-456)和乙型流感病毒(B/Florida/4/2006)[GenBank登录号CY033876]的HA蛋白片段(残基332-474)。还包括来自甲型流感和乙型流感的核蛋白，其已经在实施例6中描述并且表示为G5010抗原。

图24示出了泛型流感加强疫苗的设计。c-srRNA-G5012编码融合蛋白(G5012)，所述融合蛋白包含CD5的信号肽(残基1-24)、甲型流感的血凝素(HA)的一部分、甲型流感的核蛋白、乙型流感的核蛋白、和乙型流感的血凝素(HA)的一部分。泛型流感病毒抗原(G5012)的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，并且其开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。可以改变融合蛋白的每个序列区段(甲型流感的HA的一部分；甲型流感的核蛋白；乙型流感的核蛋白；乙型流感的HA的一部分)的顺序，并且每个区段的氨基酸序列不必与本文提供的示例性序列100％相同。

这种c-srRNA-G5012流感疫苗通过增强HA特异性CD4+辅助T细胞来加强nAb水平。它还通过进化保守的核蛋白提供针对基本上所有流感病毒的细胞免疫。已知细胞免疫提供针对严重疾病、住院治疗和死亡的长期保护。

体内基因表达的壳聚糖增强

RNA酶抑制剂(从人类胎盘纯化的蛋白质)略微增强针对c-srRNA上编码的抗原的免疫原性，最可能的是通过当皮内注射到小鼠中时增强来自c-srRNA的抗原在体内的表达(参见例如，WO 2021/138447 A1的图25C)。RNA酶抑制剂可以保护c-srRNA免受RNA酶介导的体内降解。然而，期望找到可以增强目的基因(GOI)在体内表达以用于治疗目的的替代药剂，因为难以在可注射产品中使用基于蛋白质的RNA酶抑制剂作为赋形剂。

显示低分子量壳聚糖(分子量约6kDa)抑制RNA酶的活性，抑制常数范围为30-220nM(Yakovlev等人,Biochem Biophys Res Commun,357(3):584-8,2007)。尽管这仅在体外得到证明，并且对于人工制备的多核苷酸如聚(A)/聚(U)也得到证明，但是在小鼠中需要通过皮内注射c-srRNA来在体内测试壳聚糖寡糖是否可以增强来自c-srRNA的GOI的表达。如实施例14所示，测试了以下两种不同的壳聚糖寡聚物：壳聚糖寡聚物(分子量≤5kDa，≥75％脱乙酰化：Heppe Medical Chitosan GmbH：产品编号44009)和壳聚糖寡糖乳酸(分子量约5kDa，>90％脱乙酰化：Sigma-Aldrich：产品编号523682)。出乎意料地是，发现即使非常低水平的壳聚糖寡聚物，低至0.001μg/mL(约0.2nM：为Yakovlev等人,同上,2007发现的抑制常数的约1/100)也能够将c-srRNA上编码的萤光素酶的表达增强约10倍(图25)。通过高达0.5μg/mL的壳聚糖寡聚物和0.1μg/mL的壳聚糖寡糖乳酸实现了类似的GOI表达增强。

已经将壳聚糖用作核苷酸(DNA和RNA)递送载体，因为它可以形成复合物或纳米颗粒(综述于Buschmann等人,Adv Drug Deliv Rev,65(9):1234-70,2013；和Cao等人,Drugs,17:381,2019)。然而，值得注意的是，壳聚糖寡聚物对GOI表达的增强不太可能是由c-srRNA和壳聚糖寡聚物的纳米颗粒或复合物形成介导的。首先，这种低浓度的壳聚糖寡聚物不允许与RNA形成复合物。其次，紧接在皮内注射之前将壳聚糖寡聚物添加到c-srRNA中，因此没有足够的时间形成复合物。

由于壳聚糖寡聚物在与在体外作为RNA酶抑制剂的有效浓度相比低得多的浓度下增强GOI的体内表达(Yakovlev等人,同上,2007)，可以想象这种通过壳聚糖寡聚物的增强的GOI表达可能不是由其RNA酶抑制机制介导的。例如，壳聚糖寡聚物可以促进c-srRNA掺入细胞中，从而可以增强来自c-srRNA的GOI的表达。尽管如此，这一出乎意料的发现应提供可增强c-srRNA上编码的GOI的体内治疗性表达的有效手段。

列举的实施方案

1.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对冠状病毒的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和含有编码融合蛋白的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)，其中所述ORF从5’至3’包含：

(i)编码哺乳动物信号肽的核苷酸序列；和

(ii)编码冠状病毒核衣壳蛋白的核苷酸序列。

2.根据实施方案1所述的组合物，其中所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地其中所述β冠状病毒是人类β冠状病毒。

3.根据实施方案2所述的组合物，其中所述β冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(SARS-CoV-1)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)或其组合。

4.根据实施方案3所述的组合物，其中所述β冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)。

5.根据实施方案4所述的组合物，其中所述冠状病毒核衣壳蛋白包含第一核衣壳蛋白和第二核衣壳蛋白，其中所述第一核衣壳蛋白是来自第一进化枝的第一变种的SARS-CoV-2核衣壳蛋白，并且所述第二核衣壳蛋白是来自第二进化枝的第二变种的SARS-CoV-2核衣壳蛋白，并且其中所述第一进化枝和所述第二进化枝是由世界卫生组织、Pango、GISAID和Nextstrain中的一个或多个定义的不同进化枝。

6.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对冠状病毒的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和含有编码融合蛋白的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)，其中所述ORF从5’至3’包含：

(i)编码哺乳动物信号肽的核苷酸序列；和

(ii)编码两种或更多种冠状病毒核衣壳蛋白的核苷酸序列。

7.根据实施方案6所述的组合物，其中所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地其中所述β冠状病毒是人类β冠状病毒。

8.根据实施方案7所述的组合物，其中所述β冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(SARS-CoV-1)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)或其组合。

9.根据实施方案8所述的组合物，其中所述β冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)。

10.根据实施方案9所述的组合物，其中所述两种或更多种冠状病毒核衣壳蛋白包括SARS-CoV-2核衣壳蛋白和MERS核衣壳蛋白。

11.根据实施方案9所述的组合物，其中所述两种或更多种冠状病毒核衣壳蛋白包括SARS-CoV-2核衣壳蛋白、SARS-CoV-1核衣壳蛋白和MERS核衣壳蛋白。

12.根据实施方案6-11中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种冠状病毒核衣壳蛋白被长度为一至十个残基的接头分开。

13.根据实施方案1-12中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物信号肽是在哺乳动物抗原呈递细胞中表达的表面蛋白的信号肽。

14.根据实施方案13所述的组合物，其中所述哺乳动物信号肽是CD5信号肽，并且所述CD5信号肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8至少90％或95％相同的氨基酸序列。

15.根据实施方案1-14中任一项所述的组合物，其中所述核衣壳蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的残基2-419或与SEQ ID NO:5的残基2-419至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

16.根据实施方案1-14中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

17.根据实施方案6-14中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

18.根据实施方案16所述的组合物，其中所述开放阅读框包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

19.根据实施方案17所述的组合物，其中所述开放阅读框包含SEQ ID NO:3或SEQID NO:4的核苷酸序列。

20.根据实施方案1-14中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9的残基2-413或与SEQ ID NO:9的残基2-413至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

21.根据实施方案1-14中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的残基2-422或与SEQ ID NO:10的残基2-422至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

22.根据实施方案1-21中任一项所述的组合物，其中所述组合物不包含脂质体或脂质纳米颗粒。

23.根据实施方案1-22中任一项所述的组合物，其中所述mRNA是自我复制mRNA。

24.根据实施方案23所述的组合物，其中所述自我复制RNA包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒属复制子。

25.根据实施方案24所述的组合物，其中所述甲病毒属选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。

26.根据实施方案25所述的组合物，其中所述甲病毒属是委内瑞拉马脑炎病毒。

27.根据实施方案23-26中任一项所述的组合物，其中所述甲病毒属复制子包含非结构蛋白编码区，其中插入12-18个核苷酸，导致在非结构蛋白2(nsP2)的β折叠4与β折叠6之间包含4至6个另外的氨基酸的nsP2的表达。

28.根据实施方案1-27中任一项所述的组合物，其中所述自我复制mRNA是温度敏感型药剂(ts药剂)，其能够在许可温度下表达所述融合物，而在非许可温度下不表达所述融合物。

29.根据实施方案28所述的组合物，其中所述许可温度是31℃至35℃并且所述非许可温度是至少37℃±0.5℃。

30.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对冠状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用根据实施方案1-29中任一项所述的组合物，以在所述哺乳动物受试者中刺激针对所述冠状病毒核衣壳蛋白的免疫应答。

31.根据实施方案30所述的方法，其中将所述组合物皮内施用。

32.根据实施方案30或实施方案31所述的方法，其中所述免疫应答包括冠状病毒反应性细胞免疫应答。

33.根据实施方案32所述的方法，其中所述免疫应答进一步包括冠状病毒反应性体液免疫应答。

34.根据实施方案30-33中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。

35.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

根据实施方案1-29中任一项或实施方案37-62中任一项所述的组合物；和

用于将所述组合物皮内递送至哺乳动物受试者的装置。

36.根据实施方案35所述的试剂盒，其中所述装置包括注射筒和针头。

37.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对两种或更多种病毒的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和含有编码融合蛋白的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)，其中所述ORF从5’至3’包含：

(i)编码哺乳动物信号肽的核苷酸序列；和

(ii)编码第一病毒的第一核衣壳蛋白和第二病毒的第二核衣壳蛋白的核苷酸序列。

38.根据实施方案37所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒能够在感染人类受试者后引起疾病。

39.根据实施方案38所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒是相同物种的不同变种、亚型或谱系。

40.根据实施方案38所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒是相同属的不同物种。

41.根据实施方案40所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒两者都是β冠状病毒属的成员。

42.根据实施方案41所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)。

43.根据实施方案38所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒是相同界的不同科、目、纲或门的成员。

44.根据实施方案43所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒两者都是正粘病毒科的成员。

45.根据实施方案44所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒包括甲型流感病毒和乙型流感病毒。

46.根据实施方案45所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ IDNO:16或与SEQ ID NO:16至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

47.根据实施方案38所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒两者都是正核糖核酸病毒界的成员，任选地其中所述第一病毒和所述第二病毒包括：(a)严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(SARS-CoV-1)或中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)；和(b)甲型流感病毒或乙型流感病毒。

48.根据实施方案40所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒两者都是埃博拉病毒属的成员，任选地其中所述第一病毒和所述第二病毒选自扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、本迪布焦型埃博拉病毒和塔伊森林型埃博拉病毒。

49.根据实施方案48所述的组合物，其中所述核苷酸序列进一步编码第三病毒的第三核衣壳蛋白和第四病毒的第四核衣壳蛋白，并且所述第一病毒、所述第二病毒、所述第三病毒和所述第四病毒是扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、本迪布焦型埃博拉病毒和塔伊森林型埃博拉病毒。

50.根据实施方案49所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ IDNO:22或与SEQ ID NO:22至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

51.根据实施方案49所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)编码所述第一病毒的第一核衣壳蛋白的用于刺激针对全部所述第一病毒、所述第二病毒、所述第三病毒和所述第四病毒的免疫应答的共享部分。

52.根据实施方案51所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)编码所述第一核衣壳蛋白、所述第二核衣壳蛋白、所述第三核衣壳蛋白和所述第四核衣壳蛋白各自用于刺激针对全部所述第一病毒、所述第二病毒、所述第三病毒和所述第四病毒的免疫应答的单独部分。

53.根据实施方案52所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)编码所述第二病毒的第二核衣壳蛋白的用于刺激针对所述第二病毒和所述第三病毒的免疫应答的单独部分的片段。

54.根据实施方案37所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)编码所述第一病毒的第一核衣壳蛋白的用于刺激针对所述第一病毒和所述第二病毒两者的免疫应答的共享部分。

55.根据实施方案54所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)编码所述第一核衣壳蛋白和所述第二核衣壳蛋白各自用于刺激针对所述第一病毒和所述第二病毒两者的免疫应答的单独部分。

56.根据实施方案37-48中任一项所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)进一步编码至少一种其他病毒的至少一种其他核衣壳蛋白，并且其中所述至少一种其他病毒不同于所述第一病毒和所述第二病毒。

57.根据实施方案37-56中任一项所述的组合物，其中所述第一核衣壳蛋白和所述第二核衣壳蛋白，或者所述第一核衣壳蛋白、所述第二核衣壳蛋白和所述其他核衣壳蛋白被长度为一至十个残基的接头分开。

58.根据实施方案37-57中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物信号肽是在哺乳动物抗原呈递细胞中表达的表面蛋白的信号肽。

59.根据实施方案37-58中任一项所述的组合物，其中所述mRNA是自我复制mRNA。

60.根据实施方案59所述的组合物，其中所述自我复制mRNA是温度敏感型药剂(ts药剂)，其能够在许可温度下表达所述融合蛋白，而在非许可温度下不表达所述融合蛋白。

61.根据实施方案60所述的组合物，其中所述许可温度是31℃至35℃并且所述非许可温度是至少37℃±0.5℃。

62.根据实施方案1-29中任一项或实施方案37-61中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含壳聚糖。

63.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对两种或更多种病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用根据实施方案37-62中任一项所述的组合物，以在所述哺乳动物受试者中刺激针对所述两种或更多种病毒的核衣壳蛋白的免疫应答。

64.根据实施方案63所述的方法，其中将所述组合物皮内施用。

65.根据实施方案63或实施方案64所述的方法，其中所述免疫应答包括对所述两种或更多种病毒具有反应性的细胞免疫应答。

66.根据实施方案65所述的方法，其中所述细胞免疫应答包括核衣壳蛋白特异性辅助T淋巴细胞(Th)应答，所述核衣壳蛋白特异性辅助T淋巴细胞应答包括核衣壳蛋白特异性细胞因子分泌。

67.根据实施方案66所述的方法，其中核衣壳蛋白特异性细胞因子分泌包括干扰素-γ和白介素-4中之一或两者的分泌。

68.根据实施方案65所述的方法，其中所述细胞免疫应答包括核衣壳蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。

69.根据实施方案65-68中任一项所述的方法，其中所述免疫应答进一步包括对所述两种或更多种病毒具有反应性的体液免疫应答。

70.根据实施方案63-69中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。

71.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对病毒的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和含有编码融合蛋白的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)，其中所述ORF从5’至3’包含：

(i)编码哺乳动物信号肽的核苷酸序列；

(ii)编码第一病毒的第一病毒抗原或其片段的核苷酸序列；和

(iii)编码所述第一病毒或第二病毒的第二病毒抗原或其片段的核苷酸序列，其中所述第一病毒抗原是核衣壳蛋白并且所述第二病毒抗原是表面蛋白，或者所述第一病毒抗原是表面蛋白并且所述第二病毒抗原是核衣壳蛋白。

72.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对两种或更多种病毒的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和含有编码融合蛋白的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)，其中所述ORF从5’至3’包含：

(i)编码哺乳动物信号肽的核苷酸序列；

(ii)编码第一病毒的第一病毒抗原或其片段的核苷酸序列；

(iii)编码所述第一病毒的第二病毒抗原或其片段的核苷酸序列；

(iv)编码第二病毒的第三病毒抗原或其片段的核苷酸序列；

(iii)编码所述第二病毒的第四病毒抗原或其片段的核苷酸序列，

其中所述第一病毒抗原是第一核衣壳蛋白并且所述第二病毒抗原是第一表面蛋白，或者所述第一病毒抗原是第一表面蛋白并且所述第二病毒抗原是第一核衣壳蛋白，并且其中所述第三病毒抗原是第二核衣壳蛋白并且所述第四病毒抗原是第二表面蛋白，或者所述第三病毒抗原是第二表面蛋白并且所述第四病毒抗原是第二核衣壳蛋白。

73.根据实施方案71或实施方案72所述的组合物，其中所述mRNA是自我复制mRNA。

74.根据实施方案73所述的组合物，其中所述自我复制RNA包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒属复制子。

75.根据实施方案74所述的组合物，其中所述甲病毒属选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。

76.根据实施方案74所述的组合物，其中所述甲病毒属是委内瑞拉马脑炎病毒。

77.根据实施方案73-76中任一项所述的组合物，其中所述自我复制mRNA是温度敏感型药剂(ts药剂)，其能够在许可温度下表达所述融合蛋白，而在非许可温度下不表达所述融合蛋白。

78.根据实施方案77所述的组合物，其中所述许可温度是31℃至35℃并且所述非许可温度是至少37℃±0.5℃。

79.根据实施方案74-78中任一项所述的组合物，其中所述甲病毒属复制子包含非结构蛋白编码区，其中插入12-18个核苷酸，导致在非结构蛋白2(nsP2)的β折叠4与β折叠6之间包含4至6个另外的氨基酸的nsP2的表达。

80.根据实施方案71-79中任一项所述的组合物，其中所述第一病毒和/或所述第二病毒是冠状病毒，任选地其中所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地其中所述β冠状病毒是人类β冠状病毒。

81.根据实施方案80所述的组合物，其中所述第一病毒和/或所述第二病毒是独立地选自以下的β冠状病毒：严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(SARS-CoV-1)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)。

82.根据实施方案80所述的组合物，其中所述第一病毒是SARS-CoV-2，并且所述第二病毒是MERS-CoV。

83.根据实施方案80-82中任一项所述的组合物，其中所述表面蛋白、所述第一表面蛋白和/或所述第二表面蛋白各自包含冠状病毒刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)。

84.根据实施方案83所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ IDNO:27或与SEQ ID NO:27至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

85.根据实施方案71-79中任一项所述的组合物，其中所述第一病毒和/或所述第二病毒是正粘病毒科的成员。

86.根据实施方案85所述的组合物，其中所述第一病毒和/或所述第二病毒独立地选自甲型流感病毒(IAV)和乙型流感病毒(IBV)。

87.根据实施方案86所述的组合物，其中所述第一病毒是IAV并且所述第二病毒是IBV。

88.根据实施方案85-87中任一项所述的组合物，其中所述表面蛋白、所述第一表面蛋白和/或所述第二表面蛋白各自包含流感血凝素的一部分。

89.根据实施方案88所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ IDNO:29或与SEQ ID NO:29至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

90.根据实施方案71-89中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含壳聚糖。

91.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)根据实施方案71-90中任一项所述的组合物；和

(ii)用于将所述组合物皮内递送至哺乳动物受试者的装置。

92.根据实施方案91所述的试剂盒，其中所述装置包括注射筒和针头。

93.根据实施方案91或实施方案92所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含使用所述装置向哺乳动物受试者施用所述组合物以刺激针对所述第一病毒抗原、所述第二病毒抗原、所述第三病毒抗原和所述第四病毒抗原中的一种或多种的免疫应答的说明书。

94.一种在哺乳动物受试者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用根据实施方案71-90中任一项所述的组合物，以在所述哺乳动物受试者中刺激针对所述第一病毒抗原、所述第二病毒抗原、所述第三病毒抗原和所述第四病毒抗原中的一种或多种的免疫应答。

95.根据实施方案94所述的方法，其中将所述组合物皮内施用。

96.根据实施方案95所述的方法，其中所述免疫应答包括针对所述第一病毒抗原、所述第二病毒抗原、所述第三病毒抗原和所述第四病毒抗原中的一种或多种具有反应性的细胞免疫应答。

97.根据实施方案96所述的方法，其中所述免疫应答进一步包括针对所述第一病毒抗原、所述第二病毒抗原、所述第三病毒抗原和所述第四病毒抗原中的一种或多种具有反应性的体液免疫应答。

98.根据实施方案94-97中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。

99.一种用于针对至少一种病毒的主动加强免疫的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者皮内施用根据实施方案1-29中任一项、实施方案37-62中任一项或实施方案71-90中任一项所述的组合物，以刺激针对所述病毒的二次免疫应答，其中所述哺乳动物受试者已经经历了针对所述病毒的初次免疫方案。

100.根据实施方案99所述的方法，其中所述初次免疫方案包括施用至少一剂针对所述病毒的不同疫苗。

101.根据实施方案100所述的方法，其中所述不同疫苗包含所述至少一种病毒的蛋白质抗原或灭活病毒，任选地其中所述蛋白质抗原是重组蛋白或其片段。

102.一种用于针对至少一种病毒的主动加强免疫的方法，所述方法包括：

(i)向有需要的哺乳动物受试者皮内施用根据实施方案1-29中任一项、实施方案37-62中任一项或实施方案71-90中任一项所述的组合物，以刺激针对所述病毒的初次免疫应答；以及

(ii)向所述哺乳动物受试者施用至少一剂针对所述病毒的不同疫苗，以刺激针对所述病毒的二次免疫应答。

103.根据实施方案102所述的方法，其中所述不同疫苗包含所述至少一种病毒的蛋白质抗原或灭活病毒，任选地其中所述蛋白质抗原是重组蛋白或其片段。

104.一种用于针对至少一种病毒的主动初次免疫的方法，所述方法包括：

(i)向有需要的哺乳动物受试者皮内施用根据实施方案1-29中任一项、实施方案37-62中任一项或实施方案71-90中任一项所述的组合物，以刺激针对所述病毒的初次免疫应答，其中所述哺乳动物受试者没有经历过针对所述病毒的初次免疫方案。

105.根据实施方案104所述的方法，所述方法进一步包括：

(ii)向所述哺乳动物受试者施用至少一剂针对所述病毒的不同疫苗，以刺激针对所述病毒的二次免疫应答。

106.根据实施方案105所述的方法，其中所述不同疫苗包含所述至少一种病毒的蛋白质抗原或灭活病毒，任选地其中所述蛋白质抗原是重组蛋白或其片段。

107.根据实施方案94-106中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。108.一种表达载体，所述表达载体包含与启动子可操作组合的前述权利要求中任一项所述的mRNA。

109.根据实施方案108所述的表达载体，其中所述启动子是T7启动子或SP6启动子。

110.根据实施方案108所述的表达载体，其中所述载体是质粒。

111.根据实施方案108-110中任一项所述的表达载体，所述表达载体进一步包含选择标记。

实施例

缩写：Ab(抗体)；APC(抗原呈递细胞)；CoV(冠状病毒)；c-srRNA(温度可控型自我复制RNA)；CTL(细胞毒性T淋巴细胞)；FluA或IAV(甲型流感病毒)；FluB或IBV(乙型流感病毒)；IL-4(白介素-4)；INF-γ(干扰素γ)；GOI(目的基因)；HA(血凝素)；MERS(中东呼吸综合征相关)；nAb(中和抗体)；N或NP(核衣壳或核蛋白)；nsP(非结构蛋白)；ORF(开放阅读框)；PBO(安慰剂)；RBD(受体结合结构域)；S(刺突)；PRNT(蚀斑降低中和测试)；SARS(严重急性呼吸综合征)；SFC(斑点形成细胞)；SFU(斑点形成单位)；srRNAts(温度敏感型自我复制RNA)；Th(辅助T淋巴细胞)；和Tx(处理)。术语c-srRNA和srRNAts在整个公开文本中可互换使用，其中srRNA1ts2(描述于WO 2021/138447 A1中)是示例性实施方案。

实施例1.由srRNA1ts2-G5004诱导的细胞免疫

此实施例描述了这样的发现：当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达单独的SARS-CoV-2核蛋白(G5004抗原，不含信号肽)时，所述蛋白质不诱导有效的细胞免疫应答。

材料与方法。

CD-1远交雌性小鼠。

通过编码G5004抗原的温度可控型自我复制RNA载体(如PCT/US2020/067506中所述的srRNA1ts2)的体外转录产生srRNA1ts2-G5004 mRNA(图2)。

从通过SARS-CoV-2的核蛋白(UniProt:P0DTC9)[JPT peptide产品代码：PM-WCPV-NCAP]的肽扫描得到的102种肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

结果

最近，已经显示用单独的核蛋白(N)疫苗接种在小鼠和仓鼠中引发细胞免疫和不依赖于刺突的SARS-CoV-2保护性免疫(Machett等人,bioRxiv.2021.04.26.441518.2021)。疫苗接种涉及静脉内施用表达源自USA-WA1/2021毒株的N序列的人类腺病毒血清型5(Ad5)载体(Ad5-N)。

为了测试单独的核蛋白(N)(不含信号肽)是否可以诱导细胞免疫，在通过单次皮内注射5μg或25μg srRNA1ts2-G5004(图2)或安慰剂(PBO：仅缓冲液)对CD-1远交小鼠进行疫苗接种后14天，进行ELISpot测定。仅观察到干扰素-γ(INF-γ)分泌T细胞(图4A)和IL-4分泌T细胞(图4B)的弱诱导。有趣的是，没有观察到INF-γ应答是剂量依赖性的(5μg相比于25μg)。

得出结论，单独的核蛋白(N)在由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达时不诱导有效的细胞免疫应答。

实施例2.由srRNA1ts2-G5005诱导的细胞免疫

此实施例描述了以下发现：向SARS-CoV-2核蛋白添加CD5信号肽在由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达时在CD-1小鼠中诱导有效的细胞免疫应答。

材料与方法

CD-1远交雌性小鼠。

通过编码G5005抗原的温度可控型自我复制RNA载体(如PCT/US2020/067506中所公开的srRNA1ts2)的体外转录产生srRNA1ts2-G5005 mRNA(图2)。

从通过SARS-CoV-2的核蛋白(UniProt:P0DTC9)[JPT peptide产品代码：PM-WCPV-NCAP]的肽扫描得到的102种肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

结果

野生型核蛋白不含信号肽或跨膜结构域，因此预期不针对哺乳动物宿主细胞的分泌途径。本发明人推断，缺乏信号肽可能是野生型核蛋白(由实施例1的srRNA1ts2-G5004表达)不诱导有效的细胞免疫应答的原因。考虑到这一点，将来自人类CD5基因的信号肽序列的编码区添加到核蛋白编码区以代替srRNA1ts2-G5005中的核蛋白的起始密码子(ATG)(图2)。CD5信号肽的氨基酸序列是MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG(如SEQ ID NO:8所示)。

在通过单次皮内注射5μg或25μg srRNA1ts2-G5005(图2)或安慰剂(PBO：仅缓冲液)对CD-1远交小鼠进行疫苗接种后14天，通过ELISpot测定评估细胞免疫。

如图5A所示，以剂量依赖性方式强烈诱导抗原特异性INF-γ分泌T细胞(5μg相比于25μg)。相比之下，几乎没有诱导抗原特异性IL-4分泌T细胞(图5B)。Th1细胞分泌INF-γ，而Th2细胞分泌IL-4。通常认为Th1>Th2免疫应答是疫苗的有利特征。

总之，向核蛋白(N)的N末端添加源自人类CD5的信号肽导致当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达所述蛋白质时诱导强的抗原特异性细胞免疫应答。srRNA1ts2-G5005疫苗也显示出良好的Th1偏斜(Th1>Th2)免疫应答。

实施例3.由srRNA1ts2-G5005诱导的细胞免疫

此实施例描述了以下发现：向SARS-CoV-2核蛋白添加CD5信号肽在由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达时在BALB/c小鼠中诱导有效的细胞免疫应答。

材料与方法

BALB/c雌性小鼠。

通过编码G5005抗原的温度可控型自我复制RNA载体(如PCT/US2020/067506中所述的srRNA1ts2)的体外转录产生srRNA1ts2-G5005 mRNA(图2)。

从通过SARS-CoV-2的核蛋白(UniProt:P0DTC9)[JPT peptide产品代码：PM-WCPV-NCAP]的肽扫描得到的102种肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

结果

为了测试srRNA1ts2-G5005是否可以在另一种小鼠品系中诱导强的细胞免疫应答，还在BALB/c小鼠中进行了免疫原性研究。在通过单次皮内注射5μg或25μgsrRNA1ts2-G5005(图2)或安慰剂(PBO：仅缓冲液)对BALB/c小鼠进行疫苗接种后30天，通过ELISpot测定评估细胞免疫。

如图6A所示，以剂量依赖性方式强烈诱导抗原特异性INF-γ分泌T细胞(5μg相比于25μg)。相比之下，未诱导抗原特异性IL-4分泌T细胞(图6B)。因此，在BALB/c小鼠中也观察到有利的Th1>Th2细胞应答。

总之，向核蛋白(N)的N末端添加源自人类CD5的信号肽显著增强当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达所述蛋白质时的抗原特异性细胞免疫应答。与在CD-1小鼠中一样，srRNA1ts2-G5005疫苗在BALB/c小鼠中显示出有利的Th1偏斜(Th1>Th2)免疫应答。

实施例4.由srRNA1ts2-G5005诱导的体液免疫

此实施例描述了以下发现：当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达SARS-CoV-2核蛋白时，所述SARS-CoV-2核蛋白在与人类CD5信号肽连接的情况下诱导有效的体液免疫应答。

材料与方法

BALB/c雌性小鼠。

通过编码G5005抗原的温度可控型自我复制RNA载体(如PCT/US20/67506中所述的srRNA1ts2)的体外转录产生srRNA1ts2-G5005 mRNA(图2)。

SARS-CoV-2核衣壳IgG ELISA试剂盒(ENZO：ENZ-KIT193-0001)。

结果

为了测试srRNA1ts2-G5005是否可以诱导体液免疫，在通过单次皮内注射5μg或25μg srRNA1ts2-G5005(图2)或安慰剂(PBO：仅缓冲液)对BALB/c小鼠进行疫苗接种30天后，通过ELISA测量血清中的核蛋白特异性IgG水平。在ELISA中IgG水平由OD450表示。在疫苗接种(第0天)之前(第-1天)和之后(第30天)测量IgG水平。

如图7所示，以剂量依赖性方式强烈诱导核蛋白特异性血清IgG(5μg相比于25μg)。

总之，向核蛋白(N)的N末端添加源自人类CD5的信号肽诱导当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达所述蛋白质时的抗原特异性体液免疫应答。

实施例5.由srRNA1ts2-G5006诱导的细胞免疫

此实施例描述了以下发现：当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达包含SARS-CoV-2核蛋白和MERS-CoV核蛋白的融合蛋白时，所述融合蛋白可以诱导针对SARS-CoV-2和MERS-CoV的强的细胞免疫。

材料与方法

BALB/c雌性小鼠。

通过编码G5006抗原的温度可控型自我复制RNA载体(如PCT/US2020/067506中所述的srRNA1ts2)的体外转录产生srRNA1ts2-G5006 mRNA(图2C)。

从通过SARS-CoV-2的核蛋白(UniProt:P0DTC9)[JPT peptide产品代码：PM-WCPV-NCAP]的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。

从通过MERS-CoV的核蛋白的肽扫描(具有11个氨基酸重叠的15聚体)得到的肽池。

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

结果

T细胞表位存在于短线性肽(对于MHC I类，通常在范围为8-11个残基的大小内，对于MHC II类，通常在范围为10-30个残基的大小内)中。与许多B细胞表位不同，T细胞表位的3-D构象对于免疫细胞受体的识别并不重要。因此，本发明人推断，来自不同β冠状病毒株的核蛋白可以在不存在长接头(长度大于10个氨基酸)的情况下融合在一起，用作疫苗抗原以引发针对不同β冠状病毒(例如，SARS-CoV-1及其变种、SARS-CoV-2及其变种、以及MERS-CoV及其变种)的免疫应答。

为了测试此概念，设计了包含人类CD5信号肽、SARS-CoV-2核蛋白和MERS-CoV核蛋白的融合蛋白(参见图2C中的G5006)。通过皮内注射将小鼠用srRNA1ts2-G5006进行疫苗接种，并且通过ELISpot测定测量抗原特异性细胞免疫应答。如所预期的，srRNA1ts2-G5006疫苗诱导了针对SARS-CoV-2核蛋白(图8)和MERS-CoV核蛋白两者的强的INF-γ分泌T细胞应答。此外，预期细胞免疫应答具有Th1>Th2平衡。

总之，当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达包含来自不同β冠状病毒的核蛋白的融合蛋白时，所述融合蛋白诱导强的抗原特异性细胞免疫应答。

实施例6.由srRNA1ts2-G5010(泛型流感疫苗)诱导的细胞免疫

此实施例描述了对当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达包含甲型流感病毒(FluA)核蛋白和乙型流感病毒(FluB)核蛋白的融合蛋白时由所述融合蛋白诱导的免疫应答的评估。

材料与方法

BALB/c雌性小鼠。

通过编码G5010抗原的温度可控型自我复制RNA载体(srRNA1ts2[PCT/US20/67506])的体外转录产生srRNA1ts2-G5010 mRNA(图9)。G5010融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:16所示。编码G5010融合蛋白的核酸序列被密码子优化以在人类细胞中表达，并且如SEQ ID NO:15所示。

从通过流感A(H2N2)的核蛋白(NP)(Swiss-Prot ID P21433)[JPT peptide产品代码：PM-INFA-NPH2N2]的肽扫描得到的122种重叠肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。H2N2核蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:17中。

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

结果

甲型流感和乙型流感可以感染人类并且引起季节性流行或大流行(参见来自CDC网站www.cdc.gov/flu/about/viruses/types.htm的“流感病毒类型(Types of InfluenzaViruses)”)。与常规包含在流感疫苗中的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原相比，核蛋白抗原在不同的流感病毒株中更保守。例如，代表性甲型流感毒株(H1N1、H3N2、H5N8、H7N7、H7N9、H9N2、H10N8)的核蛋白的氨基酸序列非常类似。同样，代表性乙型流感毒株(Yamagata、Victoria)的核蛋白的氨基酸序列非常类似。相比之下，甲型流感的核蛋白的氨基酸序列与乙型流感的核蛋白的氨基酸序列显著不同。

T细胞表位存在于短线性肽(对于MHC I类，通常在范围为8-11个残基的大小内，对于MHC II类，通常在范围为10-30个残基的大小内)中。与许多B细胞表位不同，T细胞表位的构象或3D结构对于免疫细胞受体的识别并不重要。因此，预期来自甲型流感的一种代表性核蛋白包括许多甲型流感病毒株共有的许多T细胞表位。同样，预期来自乙型流感的一种代表性核蛋白包括许多乙型流感病毒株共有的许多T细胞表位。因此，本发明人推断来自不同流感毒株的核蛋白可以在不存在长接头(长度大于10个氨基酸)的情况下融合在一起，用作疫苗抗原以引发针对不同流感病毒(例如，甲型流感的不同毒株和乙型流感的不同毒株)的免疫应答。

发现代表性甲型流感毒株(H1N1、H3N2、H5N8、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8)的核蛋白的氨基酸序列彼此类似。选择流感毒株H5N8的核蛋白，因为它与其他毒株(H1N1、H3N2、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8)的核蛋白差异最少。选择乙型流感毒株(B/Florida/4/2006；GenBank CY033879.1)的核蛋白作为代表性的乙型流感病毒核蛋白。设计了包含人类CD5信号肽、一个FluA核蛋白和一个FluB核蛋白的融合蛋白(参见图9中的G5010)，并且将融合蛋白的编码区克隆到srRNA1ts2的亚基因组启动子的下游。随后通过体外转录产生mRNA。FluA核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:13(甲型流感，H5N8亚型[A/breeder duck/Korea/Gochang1/2014]，GenBank号KJ413835.1，ProteinID号AHL21420.1)所示，并且FluB核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:14(乙型流感[B/Florida/4/2006]，GenBank号CY033879.1，ProteinID号ACF54251.1)所示。

通过皮内注射将小鼠用srRNA1ts2-G5010进行疫苗接种，并且通过ELISpot测定测量抗原特异性细胞免疫应答。为了回忆起核蛋白反应性T细胞免疫，使用从如SEQ ID NO:17所示的甲型流感核蛋白序列的肽扫描得到的122种重叠肽池对从疫苗接种后14天的小鼠收获的脾细胞进行再刺激。尽管G5010的甲型流感核蛋白序列与肽池的甲型流感核蛋白序列之间存在差异(图10)，但是srRNA1ts2-G5010疫苗诱导了针对FluA核蛋白的强的INF-γ分泌T细胞应答(图11)。重要的是，几乎没有诱导针对FluA核蛋白的IL-4分泌T细胞。这些结果表明srRNA1ts2-G5010疫苗诱导Th1(INF-γ)显性应答(Th1>Th2平衡)，这是针对病毒性疾病的疫苗的有利特征。

总之，当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达包含来自代表性甲型流感和乙型流感毒株的核蛋白的融合蛋白时，所述融合蛋白诱导强的抗原特异性细胞免疫应答。

实施例7.由srRNA1ts2-泛型埃博拉(泛型埃博拉疫苗)诱导的细胞免疫

此实施例描述了以下发现：当将包含来自四种埃博拉病毒物种(扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、本迪布焦型埃博拉病毒、塔伊森林型埃博拉病毒)的核蛋白片段的融合蛋白用作疫苗抗原时，所述融合蛋白可以诱导针对埃博拉病毒的强的细胞免疫。此实施例使用温度可控型自我复制RNA作为表达载体。

材料与方法

BALB/c雌性小鼠。

通过编码泛型埃博拉抗原的温度可控型自我复制RNA载体(srRNA1ts2[PCT/US20/67506])的体外转录产生srRNA1ts2-泛型埃博拉mRNA(图12)。

从通过埃博拉病毒-塔伊森林型埃博拉病毒的核蛋白(Swiss-Prot ID:B8XCN6)[JPT peptide；PepMix塔伊森林型埃博拉病毒(NP)；JPT产品代码：PM-TEBOV-NP]的肽扫描得到的182种肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

结果

埃博拉病毒引起高度致命的出血性发热。已知有四种埃博拉病毒物种会引起人类中的疾病：埃博拉病毒(扎伊尔型埃博拉病毒)、苏丹病毒(苏丹型埃博拉病毒)、本迪布焦病毒(本迪布焦型埃博拉病毒)和塔伊森林病毒(塔伊森林型埃博拉病毒，以前称为科特迪瓦型埃博拉病毒)。

目前，只有一种许可的疫苗(rVSV-ZEBOV)可用于埃博拉病毒。这种疫苗是减毒的重组水疱性口炎病毒(VSV)，其表达来自扎伊尔型埃博拉病毒的主要糖蛋白(GP)。尽管疫苗可以诱导针对埃博拉病毒的中和抗体，但是GP的蛋白质序列在感染人类的四种埃博拉病毒物种中高度不同。因此，rVSV-ZEBOV疫苗仅针对扎伊尔型埃博拉病毒有效。希望有一种泛型埃博拉病毒疫苗，其可以提供针对所有四种埃博拉病毒物种的保护。

与GP相比，核蛋白(NP)序列在四种埃博拉病毒物种中更保守。然而，与GP不同，NP不是表面蛋白，因此针对NP诱导的抗体不是中和抗体。重要的是，已经表明，疫苗接种扎伊尔型埃博拉病毒NP的小鼠可以被保护免于扎伊尔型埃博拉病毒激发，这是由细胞免疫而不是体液免疫介导的(Wilson和Hart,J Virol,75:2660-2664,2001)。还显示保护是由MHC I类限制性CD8+杀伤T细胞(细胞毒性T淋巴细胞)介导的，而不是由MHC II类限制性CD4+辅助T细胞介导的(Wilson和Hart,同上,2001)。

使用所有四种埃博拉病毒物种的NP的融合蛋白作为疫苗抗原，提供了针对所有四种埃博拉病毒物种的保护。然而，每个NP的长度为约740个氨基酸。因此，将四个完整的NP融合在一起将产生约3,000个氨基酸的相对大的蛋白质。较小尺寸的抗原对于许多疫苗平台是期望的。

使用NCBI BlastP(扎伊尔型埃博拉病毒NP(GenBank ID:AF272001)、苏丹型埃博拉病毒NP(GenBank ID:AF173836)，本迪布焦型埃博拉病毒NP(GenBank ID:FJ217161)和塔伊森林型埃博拉病毒NP(GenBank ID:FJ217162))比较了四种埃博拉病毒的核蛋白的氨基酸序列。发现NP的N末端一半(称为区域A)的序列彼此类似(88％-92％同一性)，而发现NP的C末端一半的序列(称为区域B)是多种多样的(42％-54％)(表7-1)。因此，选择扎伊尔(A)作为扎伊尔型(A)、苏丹型(A)、本迪布焦型(A)和塔伊森林型(A)的代表。对于区域B，发现本迪布焦型(B)和塔伊森林型(B)彼此类似(80％和86％同一性)，不同之处在中间部分(40％同一性)(称为区域C)。因此，选择了扎伊尔型(B)、苏丹型(B)、本迪布焦型(B)和塔伊森林型(C)纳入泛型埃博拉疫苗。在将四种核蛋白组装到单个融合蛋白中之前，将另外的8个氨基酸序列添加到两侧，使得核蛋白片段末端的可能的T细胞表位不会被破坏。泛型埃博拉抗原的融合蛋白的示意图示于图12中，并且包含扎伊尔型(A)、扎伊尔型(B)、苏丹型(B)、本迪布焦型(B)和塔伊森林型(C)的NP片段，以及人类CD5信号肽。示出埃博拉病毒NP序列的同一性百分比的图示于图13中。泛型埃博拉抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，而编码泛型埃博拉抗原的核酸序列如SEQ ID NO:23所示。

表7-1.埃博拉病毒NP结构域序列之间的同一性百分比

病毒	扎伊尔型(A)	扎伊尔型(B)
			苏丹型	88％	42％
本迪布焦型	92％	53％
			塔伊森林型	92％

通过克隆srRNA1ts2的亚基因组启动子下游的泛型埃博拉融合蛋白来产生srRNA1ts2-泛型埃博拉疫苗。通过体外转录产生mRNA，并且将其用于皮内对BALB/c小鼠进行体内疫苗接种。通过ELISpot测定测量抗原特异性细胞免疫应答。为了回忆起核蛋白反应性T细胞免疫，使用从核蛋白(埃博拉病毒-塔伊森林型埃博拉病毒的核蛋白(Swiss-ProtID:B8XCN6))的肽扫描得到的182种肽池对从疫苗接种后14天的小鼠收获的脾细胞进行再刺激。srRNA1ts2-泛型埃博拉疫苗诱导了针对塔伊森林型核蛋白的强的INF-γ分泌T细胞应答(图14A)。令人惊讶的是，mRNA疫苗中仅包含一小部分(169aa)的塔伊森林型核蛋白，而用于再刺激的肽池覆盖了全部塔伊森林型核蛋白序列。重要的是，几乎没有诱导针对塔伊森林型核蛋白的IL-4分泌T细胞(图14B)。这些结果表明srRNA1ts2-泛型埃博拉疫苗诱导Th1(INF-γ)显性应答(Th1>Th2平衡)，这是针对病毒性疾病的疫苗的有利特征。

总之，当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA中表达包含来自四种埃博拉病毒物种的核蛋白片段的融合蛋白时，所述融合蛋白诱导强的抗原特异性细胞免疫应答。实施例表明，可以通过去除构成疫苗的一种或多种核蛋白的更良好保守的部分来减小用作泛型埃博拉疫苗的融合蛋白的大小。泛型埃博拉抗原也适合用于其他疫苗平台(例如，腺病毒、腺相关病毒、重组蛋白等)。

实施例8.由srRNA1ts2-G5003o(奥密克戎疫苗)诱导的细胞免疫

此实施例描述了以下发现：编码SARS-CoV-2(奥密克戎毒株B.1.1.529)的RBD的c-srRNA的皮内递送可以在小鼠中诱导强的细胞免疫。

材料与方法

C57BL/6雌性小鼠。

通过编码G5003o抗原的温度可控型自我复制RNA载体(srRNA1ts2[WO 2021/138447A1])的体外转录产生srRNA1ts2-G5003o(mRNA)(图15)。

从通过SARS-CoV-2奥密克戎变种的RBD(S-RBD B.1.1.529)[JPT Peptides：PM-SARS2-RBDMUT08-1]的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

结果

在此实施例中，产生了编码SARS-CoV-2奥密克戎变种(G5003o)的RBD的c-srRNA(图15)。将RNA皮内施用于C57BL/6小鼠，并且14天后收集脾细胞以检查针对SARS-CoV-2RBD(奥密克戎变种)的细胞免疫。在c-srRNA-G5003o受体中明确观察到了INF-γ分泌T细胞的诱导(图16A)，而在c-srRNA-G5003o受体中未观察到IL-4分泌T细胞的诱导(图16B)。

结论

通过使用奥密克戎变种特异性RBD作为抗原，我们已经证明，当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达蛋白质时，可以诱导奥密克戎变种特异性细胞免疫应答。还观察到有利的Th1(INF-γ)>Th2(IL-4)应答。

实施例9.c-srRNA初免蛋白质加强免疫方案的功效

此实施例描述了以下发现：施用编码原始病毒的蛋白质抗原的c-srRNA疫苗能够引发针对变种病毒的蛋白抗原的体液免疫应答。

材料与方法

BALB/c雌性小鼠。

通过编码G5003抗原的温度可控型自我复制RNA载体(srRNA1ts2[WO 2021/138447A1])的体外转录产生srRNA1ts2-G5003(mRNA)(图15)。

重组SARS-CoV-2B.1.617.2刺突GCN4-IZ蛋白(R&D Systems，目录号10878-CV)。

基于AddaVax^TM角鲨烯的水包油佐剂是从InvivoGen获得的。

从通过SARS-CoV-2(原始毒株)的RBD[JPT Peptides：PepMix SARS-CoV-2(S-RBD)PM-WCPV-S-RBD-2]的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

用于蚀斑降低中和测定(PRNT)的Vero76细胞。

用于PRNT测定的SARS-CoV-2δ变种活病毒

对于PRNT测定，首先将Vero76细胞用连续稀释的小鼠血清处理，然后用SARS-CoV-2的活病毒(δ变种毒株)感染。在此测定中，受感染的细胞死亡并且在固定并用结晶紫染色后形成蚀斑。如果血清含有中和抗体，则病毒感染被抑制，导致蚀斑数量减少。结果显示为显示蚀斑数减少50％的血清稀释滴度(PRNT₅₀)。

结果

将包含编码G5003抗原(SARS-CoV-2原始毒株的RBD)的c-srRNA的组合物作为裸mRNA皮内施用于BALB/c小鼠的皮肤中(图17A)。即，srRNA1ts2-G5003组合物不含有任何纳米颗粒或转染试剂。随后，皮内施用包含与佐剂混合的SARS-CoV-2(δ变种B.1.617.2)的刺突蛋白的组合物(图17A)。

在单次皮内注射c-srRNA-G5003组合物后14天，在小鼠脾细胞中检测到针对SARS-CoV-2RBD蛋白的细胞免疫(图17B)。早在蛋白质抗原暴露后第7天，免疫小鼠随后暴露于不同SARS-CoV-2毒株(δ变种B.1.617.2)的刺突蛋白诱导针对SARS-CoV-2的δ变种的中和抗体(通过PRNT测定检测)(图17C)。相比之下，未接受编码SARS-CoV-2(原始毒株)的RBD的c-srRNA-G5003的小鼠未产生针对SARS-CoV-2的δ变种的中和抗体应答。中和抗体的早期诱导是二次免疫应答的特征，表明c-srRNA在暴露于佐剂化RBD蛋白之前引发了体液免疫应答。

结论

结果表明，c-srRNA免疫原可以诱导有效的免疫应答，该免疫应答对由c-srRNA编码的抗原和不同的变种抗原两者都具有广泛的反应性。因此，c-srRNA SARS-CoV-2RBD免疫原适合用于针对广谱SARS-CoV-2毒株的免疫方案。

实施例10.蛋白质初免c-srRNA加强免疫方案的功效

此实施例描述了以下发现：当用作其他疫苗的加强疫苗时，c-srRNA疫苗可以增强抗体滴度。

材料与方法

C57BL/6雌性小鼠。

RBD蛋白(Sino Biological SARS-CoV-2[2019-nCoV]刺突RBD-His重组蛋白，目录号40592-V08B)

基于AddaVax^TM角鲨烯的水包油佐剂是从InvivoGen获得的。

通过编码G5003抗原的温度可控型自我复制RNA载体(srRNA1ts2[WO 2021/138447A1])的体外转录产生srRNA1ts2-G5003(mRNA)(图15)。

通过编码G5003o抗原的温度可控型自我复制RNA载体(srRNA1ts2[WO 2021/138447A1])的体外转录产生srRNA1ts2-G5003o(mRNA)(图15)。

从通过SARS-CoV-2(原始毒株)的RBD[JPT Peptides：PepMix SARS-CoV-2(S-RBD)PM-WCPV-S-RBD-2]的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

ELISA测定板(ENZO SARS-CoV-2IgG ELISA试剂盒[目录号ENZ-KIT170-0001，将板用SARS-CoV-2(原始毒株)S1抗原RBD蛋白包被])。

结果

为了测试c-srRNA疫苗可以用作加强疫苗的可能性，首先将小鼠用佐剂化蛋白(在这种情况下，SARS-CoV-2[原始毒株]的RBD)进行疫苗接种。十四天后(第14天)，将小鼠用皮内注射安慰剂(PBO：仅缓冲液)、编码G5003抗原的c-srRNA、编码G5003o抗原的c-srRNA、或佐剂化RBD蛋白进一步处理(图18A)。

在第28天，通过ELISpot测定评估细胞免疫。如所预期，RBD(第1次)+PBO(第2次)组不能诱导细胞免疫，而RBD(第1次)+RBD(第2次)组诱导细胞免疫(图18B，图18C)。有趣的是，RBD(第1次)+c-srRNA-G5003和c-srRNA-G5003o组也诱导细胞免疫(图18B，图18C)。这是所预期的，因为单独的c-srRNA疫苗可以诱导细胞免疫。

在第28天，通过ELISA测定评估针对SARS-CoV-2病毒(原始毒株)的RBD的血清抗体水平(图19)。用单独的佐剂化RBD蛋白进行的第一次疫苗接种可以微弱地诱导抗体。在另一方面，c-srRNA疫苗能够以与第二次疫苗接种佐剂化蛋白类似的水平诱导抗体。

结论

结果表明，c-srRNA疫苗可以作为细胞免疫和体液免疫两者的加强疫苗起作用。

实施例11.由srRNA1ts2-G5006诱导的有效细胞免疫应答

此实施例描述了以下发现：当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达包含SARS-CoV-2核蛋白和MERS-CoV核蛋白的融合蛋白时，所述融合蛋白可以诱导针对SARS-CoV-2和MERS-CoV的强的细胞免疫。疫苗接种的小鼠可以消除植入的表达包含SARS-CoV-2核蛋白和MERS-CoV核蛋白的融合蛋白的肿瘤细胞。

材料与方法

BALB/c雌性小鼠。

通过编码G5006抗原的温度可控型自我复制RNA载体(如WO 2021/138447 A1中所述的srRNA1ts2)的体外转录产生srRNA1ts2-G5006 mRNA(图2)。

从通过SARS-CoV-2的核蛋白(UniProt:P0DTC9)[JPT peptide产品代码：PM-WCPV-NCAP]的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。

从通过MERS-CoV(YP_009047211.1)的核蛋白的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。肽是由JPT Peptides定制的。

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

源自BALB/c小鼠并且已知作为用于三阴性IV期人类乳腺癌的模型的4T1乳腺癌细胞系(目录号CRL-2539)购自ATCC。

将在CMV启动子下编码SARS-CoV-2和MERS-CoV的核蛋白的融合蛋白(G5006的非分泌形式，即不含CD5信号肽)和在SV40早期启动子下的潮霉素抗性基因的质粒DNA转染到4T1细胞中。通过在存在200μg/mL潮霉素B的情况下培养细胞来分离表达SARS-CoV-2和MERS-CoV的核蛋白的融合蛋白的细胞(称为4T1-SMN)。

结果

为了对被病毒感染的细胞进行建模，我们使用了4T1乳腺癌细胞系，该细胞系源自BALB/c小鼠并且已知作为用于三阴性IV期人类乳腺癌的模型。当注射到BALB/c小鼠中时，4T1细胞快速生长并且形成肿瘤。使用这种同系小鼠模型来模拟受感染的细胞的快速增加。为此，我们首先制备了在CMV启动子下编码SARS-CoV-2和MERS-CoV的核蛋白的融合蛋白(命名为SMN蛋白)的质粒载体，从而使该蛋白组成型表达。此融合蛋白与G5006相同，但是从所述蛋白的N末端去除CD5信号肽。天然地，核蛋白不具有信号肽并且停留在细胞的细胞质内。在潮霉素选择后建立表达SMN蛋白的4T1细胞(命名为4T1-SMN)，因为质粒载体也携带潮霉素抗性基因。

将BALB/c小鼠用c-srRNA-G5006进行疫苗接种，并且通过对SARS-CoV-2核蛋白(图20A)和MERS-CoV核蛋白(图20B)两者均应答的T细胞的存在来证明细胞免疫的诱导。

在第24天(疫苗接种后24天)，将4T1-SMN细胞注射到用c-srRNA-G5006进行疫苗接种的BALB/c小鼠中(图21)。如所预期，4T1-SMN细胞在接受安慰剂(无疫苗接种组)4T1-SMN细胞的小鼠中快速生长。在另一方面，在c-srRNA-G5006疫苗接种的小鼠中，4T1-SMN肿瘤的生长受到抑制。接受25μg c-srRNA-G5006疫苗的两只小鼠(尽管肿瘤最初生长)变得无肿瘤并且存活。此外，即使在疫苗接种后第143天第二轮注射4T1-SMN肿瘤后，也没有肿瘤生长，并且小鼠无肿瘤且继续存活(图21)。

结论

c-srRNA疫苗可以诱导较强的细胞免疫，这种细胞免疫可以杀伤并消除表达该抗原的细胞。此结果表明c-srRNA通过消除受感染的细胞而起到疫苗的作用。

实施例12.由srRNA1ts2-泛型冠状病毒疫苗诱导的细胞免疫

此实施例描述了以下发现：当由皮内注射的温度可控型自我复制RNA表达包含CD5信号肽、SARS-CoV-2的刺突-RBD、SARS-CoV-2的核蛋白、MERS-CoV的核蛋白和MERS-CoV的刺突-RBD的融合蛋白时，所述融合蛋白可以诱导针对所有这些抗原的强的细胞免疫。

材料与方法

C57BL/6雌性小鼠。

通过编码G5006抗原的温度可控型自我复制RNA载体(如WO 2021/138447 A1中所述的srRNA1ts2)的体外转录产生srRNA1ts2-G5006 mRNA(图2)。

通过编码G5006d抗原的温度可控型自我复制RNA载体(如WO 2021/138447 A1中所述的srRNA1ts2)的体外转录产生srRNA1ts2-G5006d mRNA(图22)。

从通过SARS-CoV-2(原始毒株)的RBD[JPT Peptides：PepMix SARS-CoV-2(S-RBD)PM-WCPV-S-RBD-2]的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池

从通过SARS-CoV-2的核蛋白(UniProt:P0DTC9)[JPT peptide产品代码：PM-WCPV-NCAP]的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。

从通过MERS-CoV(YP_009047211.1)的核蛋白的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。肽是由JPT Peptides定制的。

从通过MERS-CoV(中东呼吸综合征相关冠状病毒)的刺突糖蛋白(Swiss-Prot ID:K9N5Q8)[JPT肽产品代码：PM-MERS-CoV-S-1]的肽扫描得到的336种(168+168)肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

结果

在此我们设计了一种新的加强疫苗，这是一种编码包含CD5信号肽、SARS-CoV-2的刺突-RBD、SARS-CoV-2的核蛋白、MERS-CoV的核蛋白、和MERS-CoV的刺突-RBD的融合蛋白的c-srRNA疫苗(称为c-srRNA-G5006d)(图22)。

将小鼠皮内注射安慰剂(PBO：仅缓冲液)、编码G5006抗原的c-srRNA和编码G5006d抗原的c-srRNA进行疫苗接种。在疫苗接种后第14天，通过ELISpot测定评估细胞免疫。

如图23A所示，c-srRNA-G5006d可以刺激针对此疫苗上编码的以下所有蛋白质的细胞免疫：SARS-CoV-2的刺突-RBD、SARS-CoV-2的核蛋白、MERS-CoV的核蛋白和MERS-CoV的刺突-RBD。

结论

结果表明，c-srRNA疫苗可以作为细胞免疫和体液免疫两者的加强疫苗起作用。

实施例13.srRNA1ts2-泛型流感病毒疫苗

此实施例描述了基于c-srRNA疫苗平台的独特特征的泛型流感加强疫苗的设计。c-srRNA上编码的抗原(G5012)是CD5信号肽(残基1-24)、甲型流感的血凝素(HA)的一部分、甲型流感的核蛋白、乙型流感的核蛋白、和乙型流感的血凝素(HA)的一部分的融合蛋白。

材料与方法

C57BL/6雌性小鼠。

通过编码G5012抗原的温度可控型自我复制RNA载体(如WO 2021/138447 A1中所述的srRNA1ts2)的体外转录产生c-srRNA-G5012 mRNA(图24)。

从通过甲型流感的血凝素(HA)的一部分、甲型流感的核蛋白、乙型流感的核蛋白、和乙型流感的血凝素(HA)的一部分的肽扫描得到的肽(具有11个氨基酸重叠的15聚体)池。

用于干扰素γ(INF-γ)和白介素-4(IL-4)的ELISpot测定板和试剂(CellularTechnology Limited，美国俄亥俄州)。

Immunospot S6 Entry Analyzer(Cellular Technology Limited，美国俄亥俄州)。

结果

将小鼠用皮内注射的安慰剂(PBO：仅缓冲液)和编码G5012抗原的c-srRNA进行疫苗接种。在疫苗接种后第14天，通过ELISpot测定评估细胞免疫。

c-srRNA-G5012刺激了针对此该疫苗上编码的以下所有抗原的细胞免疫：甲型流感的血凝素(HA)、甲型流感的核蛋白、乙型流感的核蛋白、和乙型流感的血凝素(HA)。

结论

结果表明，c-srRNA疫苗可以作为细胞免疫和体液免疫两者的加强疫苗起作用。

实施例14.壳聚糖增强由srRNA1ts2-LUC2的萤光素酶表达

此实施例描述了以下发现：壳聚糖寡聚物能够增强由c-srRNA构建体编码的目的基因(GOI)的体内表达。

材料与方法

C57BL/6雌性小鼠。

通过编码萤光素酶基因的温度可控型自我复制RNA载体(如WO 2021/138447 A1中所述的srRNA1ts2)的体外转录产生srRNA1ts2-LUC2(mRNA)。

壳聚糖寡聚物(分子量≤5kDa，≥75.0％脱乙酰化：Heppe Medical ChitosanGmbH：产品编号44009)。

壳聚糖寡糖乳酸(分子量约5kDa，>90％脱乙酰化：Sigma-Aldrich：产品编号523682)。

生物发光成像系统，AMI HTX(Spectral Instruments Imaging，亚利桑那州图森)。

结果

为了测试壳聚糖寡聚物是否可以增强在体内c-srRNA上编码的GOI的表达，将5μg编码作为GOI的萤光素酶基因的c-srRNA(也称为srRNA1ts2)与壳聚糖混合，并且皮内施用于每只C57BL/6小鼠(图25)。在乳酸盐林格氏溶液中，在不存在脂质纳米颗粒或任何其他转染试剂的情况下，将c-srRNA配制为裸RNA。通过使用生物发光成像系统AMI HTX(SpectralInstruments Imaging，亚利桑那州图森)使萤光素酶活性可视化并对其定量。

在以下组中测试各五只小鼠：1，对照-仅c-srRNA；2，与壳聚糖寡糖(0.001μg/mL)混合的c-srRNA；3，与壳聚糖寡糖(0.01μg/mL)混合的c-srRNA；4，与壳聚糖寡糖(0.5μg/mL)混合的c-srRNA；5，与壳聚糖寡糖乳酸(0.1μg/mL)混合的c-srRNA。

如图27所示，与对照条件(即仅c-srRNA：无壳聚糖)相比，具有浓度为0.001μg/mL、0.01μg/mL和0.5μg/mL的壳聚糖寡聚物的所有条件以及具有浓度为0.1μg/mL的壳聚糖寡糖乳酸的条件均显示出高约10倍的萤光素酶活性水平。

结论

当在将c-srRNA皮内注射到小鼠皮肤中之前与c-srRNA混合时，低分子量壳聚糖(如壳聚糖寡聚物和壳聚糖寡糖乳酸)可以增强c-srRNA上编码的GOI的表达。壳聚糖寡聚物即使在非常低的浓度(0.001μg/mL或约0.2nM)下也能提供约10倍的基因表达增强。这一令人惊讶的发现提供了一种可增强在c-srRNA上编码的GOI的体内治疗性表达的有效手段。

序列

SEQ ID NO:1

>G5004(SARS-COV-2_N，mRNA)

SEQ ID NO:2

>G5005(CD5-SP_SARS-COV-2_N，合成mRNA)

SEQ ID NO:3

>G5006A(CD5-SP_SARS2-N_MERS-N，合成mRNA)

SEQ ID NO:4

>G5006B(CD5-SP_SARS2-N_MERS-N：CODON-OPTIMIZED，合成mRNA)

SEQ ID NO:5

>G5004(SARS-COV-2_N，蛋白质)

SEQ ID NO:6

>G5005(CD5-SP_SARS-CoV-2_N，合成蛋白质)

SEQ ID NO:7

>G5006a(CD5-SP_SARS2-N_MERS-N，合成蛋白质)

SEQ ID NO:8

>人类CD5信号肽(智人(Homo sapiens)，蛋白质)

MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG

SEQ ID NO:9

>MERS-N蛋白

SEQ ID NO:10

>SARS-COV-1-N蛋白

SEQ ID NO:11

>克隆位点(合成DNA)

GGCGCGCCattggccaccGCGGCCGC

将目的基因(例如，β冠状病毒核蛋白开放阅读框)插入SEQ ID NO:11的核苷酸18与19之间。GGCGCGCC是AscI限制性位点并且GCGGCCGC是NotI限制性位点。

SEQ ID NO:12

>人工

Attggccacc(合成DNA)

将此核苷酸序列添加到β冠状病毒核蛋白编码区的5’末端以提供用于启动mRNA翻译的Kozak共有序列。

SEQ ID NO:13

>甲型流感病毒(H5N8)核衣壳蛋白

>

SEQ ID NO:14

>乙型流感病毒核衣壳蛋白

SEQ ID NO:15

>G5010(合成mRNA)[针对泛型流感抗原的密码子优化序列]

SEQ ID NO:16

>G5010(合成蛋白质)[泛型流感抗原]

SEQ ID NO:17

>甲型流感病毒(H2N2)的核蛋白(Swiss-Protein ID P21433)[JPT peptide产品代码：PM-INFA-NPH2N2]

ASQGTKRSYEQMETDGERQNANEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYKRVDGKWMRELVLYDKEEIRRIWRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDTTYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRNAYERMCNILKGKFQTAAQRAMMDQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEKEGYSLVGIDPFKLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACNSAAFEDLRVSSFIRGTKVIPRGKLSTRGVQIASNENMDTMGSSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLPFDKPTIMAAFTGNAEGRTSDMRAEIIRMMEGAKPEEVSFQGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN

SEQ ID NO:18

>扎伊尔型埃博拉病毒的核蛋白片段

SEQ ID NO:19

>苏丹型埃博拉病毒的核蛋白片段

SEQ ID NO:20

>本迪布焦型埃博拉病毒的核蛋白片段

SEQ ID NO:21

>塔伊森林型埃博拉病毒的核蛋白片段

SEQ ID NO:22

>泛型埃博拉抗原(合成蛋白质)

SEQ ID NO:23

>泛型埃博拉抗原(合成mRNA)

SEQ ID NO:24

>G5003o(合成mRNA)[CD5sp+RBD2(奥密克戎)]

SEQ ID NO:25

>G5003o(合成蛋白质)[CD5sp+RBD2(奥密克戎)]

SEQ ID NO:26

>G5006d(合成mRNA)

SEQ ID NO:27

>G5006d(合成蛋白质)

SEQ ID NO:28

>G50012(合成mRNA)

SEQ ID NO:29

>G50012(合成蛋白质)

序列表

<110> 伊利克斯根治疗公司

<120> 用于病毒性疾病的温度可控型自我复制RNA

疫苗

<130> 69944-20014.40

<140> 尚未分配

<141> 同时随同提交

<150> US 63/275,398

<151> 2021-11-03

<150> US 63/240,278

<151> 2021-09-02

<150> US 63/211,974

<151> 2021-06-17

<160> 29

<170>用于Windows的FastSEQ 4.0版

<210> 1

<211> 1260

<212> DNA

<213> SARS-COV-2

<400> 1

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

<210> 2

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct 60

tcctgcctcg gatctgataa tggaccccaa aatcagcgaa atgcaccccg cattacgttt 120

ggtggaccct cagattcaac tggcagtaac cagaatggag aacgcagtgg ggcgcgatca 180

aaacaacgtc ggccccaagg tttacccaat aatactgcgt cttggttcac cgctctcact 240

caacatggca aggaagacct taaattccct cgaggacaag gcgttccaat taacaccaat 300

agcagtccag atgaccaaat tggctactac cgaagagcta ccagacgaat tcgtggtggt 360

gacggtaaaa tgaaagatct cagtccaaga tggtatttct actacctagg aactgggcca 420

gaagctggac ttccctatgg tgctaacaaa gacggcatca tatgggttgc aactgaggga 480

gccttgaata caccaaaaga tcacattggc acccgcaatc ctgctaacaa tgctgcaatc 540

gtgctacaac ttcctcaagg aacaacattg ccaaaaggct tctacgcaga agggagcaga 600

ggcggcagtc aagcctcttc tcgttcctca tcacgtagtc gcaacagttc aagaaattca 660

actccaggca gcagtagggg aacttctcct gctagaatgg ctggcaatgg cggtgatgct 720

gctcttgctt tgctgctgct tgacagattg aaccagcttg agagcaaaat gtctggtaaa 780

ggccaacaac aacaaggcca aactgtcact aagaaatctg ctgctgaggc ttctaagaag 840

cctcggcaaa aacgtactgc cactaaagca tacaatgtaa cacaagcttt cggcagacgt 900

ggtccagaac aaacccaagg aaattttggg gaccaggaac taatcagaca aggaactgat 960

tacaaacatt ggccgcaaat tgcacaattt gcccccagcg cttcagcgtt cttcggaatg 1020

tcgcgcattg gcatggaagt cacaccttcg ggaacgtggt tgacctacac aggtgccatc 1080

aaattggatg acaaagatcc aaatttcaaa gatcaagtca ttttgctgaa taagcatatt 1140

gacgcataca aaacattccc accaacagag cctaaaaagg acaaaaagaa gaaggctgat 1200

gaaactcaag ccttaccgca gagacagaag aaacagcaaa ctgtgactct tcttcctgct 1260

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<211> 2568

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<220>

<223> 合成构建体

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<210> 4

<211> 2568

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

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<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

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<213> 甲型流感病毒

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<213> 乙型流感病毒

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ggcatggatc ctcggatgtg tagcctgatg cagggcagca cactgccaag acggagtggg 600

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ctgtctacaa gaggtgtgca gatcgccagc aacgagaaca tggagaccat ggatagcagc 1200

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agcgatatga gaacagaaat tatccgtatg atggagtccg caaaacctga ggacgtgtcc 1440

ttccaaggca gaggcgtgtt cgagctgagc gacgagaagg ccaccaaccc tatcgtgcct 1500

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aacatgtcta atatggatat cgacggcatt aacaccggca ccatcgacaa aacccctgag 1620

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gacgacaaga ccatctactt cagccctatc cggataacat tcctgaaaga agaagtgaag 2100

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<220>

<223> 合成构建体

<400> 16

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Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr

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<213> 甲型流感病毒

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Asn

<210> 18

<211> 738

<212> PRT

<213> 扎伊尔型埃博拉病毒

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Tyr Leu Glu Gly His Gly Phe Arg Phe Glu Val Lys Lys Arg Asp Gly

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Val Lys Arg Leu Glu Glu Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Gly Lys Asn

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Asn Ala Gly Gln Phe Leu Ser Phe Ala Ser Leu Phe Leu Pro Lys Leu

145 150 155 160

Val Val Gly Glu Lys Ala Cys Leu Glu Lys Val Gln Arg Gln Ile Gln

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Val His Ala Glu Gln Gly Leu Ile Gln Tyr Pro Thr Ala Trp Gln Ser

180 185 190

Val Gly His Met Met Val Ile Phe Arg Leu Met Arg Thr Asn Phe Leu

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Ile Lys Phe Leu Leu Ile His Gln Gly Met His Met Val Ala Gly His

210 215 220

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385 390 395 400

Leu Ala Lys Leu Thr Glu Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Pro Lys Thr

405 410 415

Ser Gly His Tyr Asp Asp Asp Asp Asp Ile Pro Phe Pro Gly Pro Ile

420 425 430

Asn Asp Asp Asp Asn Pro Gly His Gln Asp Asp Asp Pro Thr Asp Ser

435 440 445

Gln Asp Thr Thr Ile Pro Asp Val Val Val Asp Pro Asp Asp Gly Ser

450 455 460

Tyr Gly Glu Tyr Gln Ser Tyr Ser Glu Asn Gly Met Asn Ala Pro Asp

465 470 475 480

Asp Leu Val Leu Phe Asp Leu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Thr Lys Pro

485 490 495

Val Pro Asn Arg Ser Thr Lys Gly Gly Gln Gln Lys Asn Ser Gln Lys

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Gly Gln His Ile Glu Gly Arg Gln Thr Gln Phe Arg Pro Ile Gln Asn

515 520 525

Val Pro Gly Pro His Arg Thr Ile His His Ala Ser Ala Pro Leu Thr

530 535 540

Asp Asn Asp Arg Arg Asn Glu Pro Ser Gly Ser Thr Ser Pro Arg Met

545 550 555 560

Leu Thr Pro Ile Asn Glu Glu Ala Asp Pro Leu Asp Asp Ala Asp Asp

565 570 575

Glu Thr Ser Ser Leu Pro Pro Leu Glu Ser Asp Asp Glu Glu Gln Asp

580 585 590

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725 730 735

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<212> PRT

<213> 苏丹型埃博拉病毒

<400> 19

Ala Lys Leu Thr Glu Ala Ile Thr Thr Ala Ser Lys Ile Lys Val Gly

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275 280 285

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290 295 300

Glu Lys Glu Asn Arg Tyr Leu Val Ile Asp Gly Gln Gln Phe Leu Trp

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Pro Val Met Ser Leu Arg Asp Lys Phe Leu Ala Val Leu Gln His Asp

325 330 335

<210> 20

<211> 337

<212> PRT

<213> 本迪布焦型埃博拉病毒

<400> 20

Ala Lys Leu Thr Glu Ala Ile Thr Ser Thr Ser Ile Leu Lys Thr Gly

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Asp Asp Asp Asn Asp Ile Pro Phe Pro Gly Pro Ile Asn

20 25 30

Asp Asn Glu Asn Ser Gly Gln Asn Asp Asp Asp Pro Thr Asp Ser Gln

35 40 45

Asp Thr Thr Ile Pro Asp Val Ile Ile Asp Pro Asn Asp Gly Gly Tyr

50 55 60

Asn Asn Tyr Ser Asp Tyr Ala Asn Asp Ala Ala Ser Ala Pro Asp Asp

65 70 75 80

Leu Val Leu Phe Asp Leu Glu Asp Glu Asp Asp Ala Asp Asn Pro Ala

85 90 95

Gln Asn Thr Pro Glu Lys Asn Asp Arg Pro Ala Thr Thr Lys Leu Arg

100 105 110

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115 120 125

Val Ala Pro Asn Gln Tyr Arg Asp Lys Pro Met Pro Gln Val Gln Asp

130 135 140

Arg Ser Glu Asn His Asp Gln Thr Leu Gln Thr Gln Ser Arg Val Leu

145 150 155 160

Thr Pro Ile Ser Glu Glu Ala Asp Pro Ser Asp His Asn Asp Gly Asp

165 170 175

Asn Glu Ser Ile Pro Pro Leu Glu Ser Asp Asp Glu Gly Ser Thr Asp

180 185 190

Thr Thr Ala Ala Glu Thr Lys Pro Ala Thr Ala Pro Pro Ala Pro Val

195 200 205

Tyr Arg Ser Ile Ser Val Asp Asp Ser Val Pro Ser Glu Asn Ile Pro

210 215 220

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225 230 235 240

Gln Ser Glu Gln Ser Ile Ala Glu Met Tyr Gln His Ile Leu Lys Thr

245 250 255

Gln Gly Pro Phe Asp Ala Ile Leu Tyr Tyr His Met Met Lys Glu Glu

260 265 270

Pro Ile Ile Phe Ser Thr Ser Asp Gly Lys Glu Tyr Thr Tyr Pro Asp

275 280 285

Ser Leu Glu Asp Glu Tyr Pro Pro Trp Leu Ser Glu Lys Glu Ala Met

290 295 300

Asn Glu Asp Asn Arg Phe Ile Thr Met Asp Gly Gln Gln Phe Tyr Trp

305 310 315 320

Pro Val Met Asn His Arg Asn Lys Phe Met Ala Ile Leu Gln His His

325 330 335

Arg

<210> 21

<211> 169

<212> PRT

<213> 塔伊森林型埃博拉病毒

<400> 21

Leu Val Leu Phe Asp Leu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Asp His Arg Pro

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Glu Asn Asn Asn Lys His Ser Leu Thr Gly Thr Asp

20 25 30

Ser Asn Lys Thr Ser Asn Trp Asn Arg Asn Pro Thr Asn Met Pro Lys

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130 135 140

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165

<210> 22

<211> 1604

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 22

Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly

1 5 10 15

Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Asp Ser Arg Pro Gln Lys Ile Trp

20 25 30

Met Ala Pro Ser Leu Thr Glu Ser Asp Met Asp Tyr His Lys Ile Leu

35 40 45

Thr Ala Gly Leu Ser Val Gln Gln Gly Ile Val Arg Gln Arg Val Ile

50 55 60

Pro Val Tyr Gln Val Asn Asn Leu Glu Glu Ile Cys Gln Leu Ile Ile

65 70 75 80

Gln Ala Phe Glu Ala Gly Val Asp Phe Gln Glu Ser Ala Asp Ser Phe

85 90 95

Leu Leu Met Leu Cys Leu His His Ala Tyr Gln Gly Asp Tyr Lys Leu

100 105 110

Phe Leu Glu Ser Gly Ala Val Lys Tyr Leu Glu Gly His Gly Phe Arg

115 120 125

Phe Glu Val Lys Lys Arg Asp Gly Val Lys Arg Leu Glu Glu Leu Leu

130 135 140

Pro Ala Val Ser Ser Gly Lys Asn Ile Lys Arg Thr Leu Ala Ala Met

145 150 155 160

Pro Glu Glu Glu Thr Thr Glu Ala Asn Ala Gly Gln Phe Leu Ser Phe

165 170 175

Ala Ser Leu Phe Leu Pro Lys Leu Val Val Gly Glu Lys Ala Cys Leu

180 185 190

Glu Lys Val Gln Arg Gln Ile Gln Val His Ala Glu Gln Gly Leu Ile

195 200 205

Gln Tyr Pro Thr Ala Trp Gln Ser Val Gly His Met Met Val Ile Phe

210 215 220

Arg Leu Met Arg Thr Asn Phe Leu Ile Lys Phe Leu Leu Ile His Gln

225 230 235 240

Gly Met His Met Val Ala Gly His Asp Ala Asn Asp Ala Val Ile Ser

245 250 255

Asn Ser Val Ala Gln Ala Arg Phe Ser Gly Leu Leu Ile Val Lys Thr

260 265 270

Val Leu Asp His Ile Leu Gln Lys Thr Glu Arg Gly Val Arg Leu His

275 280 285

Pro Leu Ala Arg Thr Ala Lys Val Lys Asn Glu Val Asn Ser Phe Lys

290 295 300

Ala Ala Leu Ser Ser Leu Ala Lys His Gly Glu Tyr Ala Pro Phe Ala

305 310 315 320

Arg Leu Leu Asn Leu Ser Gly Val Asn Asn Leu Glu His Gly Leu Phe

325 330 335

Pro Gln Leu Ser Ala Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala His Gly Ser

340 345 350

Thr Leu Ala Gly Val Asn Val Gly Glu Gln Tyr Gln Gln Leu Arg Glu

355 360 365

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370 375 380

Glu Leu Asp His Leu Gly Leu Asp Asp Gln Glu Lys Lys Ile Leu Met

385 390 395 400

Asn Phe His Gln Lys Lys Asn Glu Ile Ser Phe Gln Gln Thr Asn Ala

405 410 415

Met Val Thr Leu Arg Lys Glu Arg Leu Ala Lys Leu Thr Glu Ala Ile

420 425 430

Thr Ala Ala Ser Leu Pro Lys Thr Ser Gly His Tyr Asp Asp Asp Asp

435 440 445

Asp Ile Pro Phe Pro Gly Pro Ile Asn Asp Asp Asp Asn Pro Gly His

450 455 460

Gln Asp Asp Asp Pro Thr Asp Ser Gln Asp Thr Thr Ile Pro Asp Val

465 470 475 480

Val Val Asp Pro Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Glu Tyr Gln Ser Tyr Ser

485 490 495

Glu Asn Gly Met Asn Ala Pro Asp Asp Leu Val Leu Phe Asp Leu Asp

500 505 510

Glu Asp Asp Glu Asp Thr Lys Pro Val Pro Asn Arg Ser Thr Lys Gly

515 520 525

Gly Gln Gln Lys Asn Ser Gln Lys Gly Gln His Ile Glu Gly Arg Gln

530 535 540

Thr Gln Phe Arg Pro Ile Gln Asn Val Pro Gly Pro His Arg Thr Ile

545 550 555 560

His His Ala Ser Ala Pro Leu Thr Asp Asn Asp Arg Arg Asn Glu Pro

565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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675 680 685

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690 695 700

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755 760 765

Ile Thr Thr Ala Ser Lys Ile Lys Val Gly Asp Arg Tyr Pro Asp Asp

770 775 780

Asn Asp Ile Pro Phe Pro Gly Pro Ile Tyr Asp Asp Thr His Pro Asn

785 790 795 800

Pro Ser Asp Asp Asn Pro Asp Asp Ser Arg Asp Thr Thr Ile Pro Gly

805 810 815

Gly Val Val Asp Pro Tyr Asp Asp Glu Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Tyr

820 825 830

Glu Asp Ser Ala Glu Gly Thr Thr Gly Asp Leu Asp Leu Phe Asn Leu

835 840 845

Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Arg Pro Gly Pro Pro Asp Arg Gly Gln

850 855 860

Asn Lys Glu Arg Ala Ala Arg Thr Tyr Gly Leu Gln Asp Pro Thr Leu

865 870 875 880

Asp Gly Ala Lys Lys Val Pro Glu Leu Thr Pro Gly Ser His Gln Pro

885 890 895

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Asn Asp Ile Pro Phe Pro Gly Pro Ile Asn Asp Asn Glu Asn Ser Gly

1125 1130 1135

Gln Asn Asp Asp Asp Pro Thr Asp Ser Gln Asp Thr Thr Ile Pro Asp

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Val Ile Ile Asp Pro Asn Asp Gly Gly Tyr Asn Asn Tyr Ser Asp Tyr

1155 1160 1165

Ala Asn Asp Ala Ala Ser Ala Pro Asp Asp Leu Val Leu Phe Asp Leu

1170 1175 1180

Glu Asp Glu Asp Asp Ala Asp Asn Pro Ala Gln Asn Thr Pro Glu Lys

1185 1190 1195 1200

Asn Asp Arg Pro Ala Thr Thr Lys Leu Arg Asn Gly Gln Asp Gln Asp

1205 1210 1215

Gly Asn Gln Gly Glu Thr Ala Ser Pro Arg Val Ala Pro Asn Gln Tyr

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Arg Asp Lys Pro Met Pro Gln Val Gln Asp Arg Ser Glu Asn His Asp

1235 1240 1245

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Ala Asp Pro Ser Asp His Asn Asp Gly Asp Asn Glu Ser Ile Pro Pro

1265 1270 1275 1280

Leu Glu Ser Asp Asp Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ala Ala Glu Thr

1285 1290 1295

Lys Pro Ala Thr Ala Pro Pro Ala Pro Val Tyr Arg Ser Ile Ser Val

1300 1305 1310

Asp Asp Ser Val Pro Ser Glu Asn Ile Pro Ala Gln Ser Asn Gln Thr

1315 1320 1325

Asn Asn Glu Asp Asn Val Arg Asn Asn Ala Gln Ser Glu Gln Ser Ile

1330 1335 1340

Ala Glu Met Tyr Gln His Ile Leu Lys Thr Gln Gly Pro Phe Asp Ala

1345 1350 1355 1360

Ile Leu Tyr Tyr His Met Met Lys Glu Glu Pro Ile Ile Phe Ser Thr

1365 1370 1375

Ser Asp Gly Lys Glu Tyr Thr Tyr Pro Asp Ser Leu Glu Asp Glu Tyr

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Pro Pro Trp Leu Ser Glu Lys Glu Ala Met Asn Glu Asp Asn Arg Phe

1395 1400 1405

Ile Thr Met Asp Gly Gln Gln Phe Tyr Trp Pro Val Met Asn His Arg

1410 1415 1420

Asn Lys Phe Met Ala Ile Leu Gln His His Arg Leu Val Leu Phe Asp

1425 1430 1435 1440

Leu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Asp His Arg Pro Ser Ser Ser Ser Glu

1445 1450 1455

Asn Asn Asn Lys His Ser Leu Thr Gly Thr Asp Ser Asn Lys Thr Ser

1460 1465 1470

Asn Trp Asn Arg Asn Pro Thr Asn Met Pro Lys Lys Asp Ser Thr Gln

1475 1480 1485

Asn Asn Asp Asn Pro Ala Gln Arg Ala Gln Glu Tyr Ala Arg Asp Asn

1490 1495 1500

Ile Gln Asp Thr Pro Thr Pro His Arg Ala Leu Thr Pro Ile Ser Glu

1505 1510 1515 1520

Glu Thr Gly Ser Asn Gly His Asn Glu Asp Asp Ile Asp Ser Ile Pro

1525 1530 1535

Pro Leu Glu Ser Asp Glu Glu Asn Asn Thr Glu Thr Thr Ile Thr Thr

1540 1545 1550

Thr Lys Asn Thr Thr Ala Pro Pro Ala Pro Val Tyr Arg Ser Asn Ser

1555 1560 1565

Glu Lys Glu Pro Leu Pro Gln Glu Lys Ser Gln Lys Gln Pro Asn Gln

1570 1575 1580

Val Ser Gly Ser Glu Asn Thr Asp Asn Lys Pro His Ser Glu Gln Ser

1585 1590 1595 1600

Val Glu Glu Met

<210> 23

<211> 4815

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 23

atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct 60

tcctgcctcg gagattctcg tcctcagaaa atctggatgg cgccgagtct cactgaatct 120

gacatggatt accacaagat cttgacagca ggtctgtccg ttcaacaggg gattgttcgg 180

caaagagtca tcccagtgta tcaagtaaac aatcttgaag aaatttgcca acttatcata 240

caggcctttg aagcaggtgt tgattttcaa gagagtgcgg acagtttcct tctcatgctt 300

tgtcttcatc atgcgtacca gggagattac aaacttttct tggaaagtgg cgcagtcaag 360

tatttggaag ggcacgggtt ccgttttgaa gtcaagaagc gtgatggagt gaagcgcctt 420

gaggaattgc tgccagcagt atctagtgga aaaaacatta agagaacact tgctgccatg 480

ccggaagagg agacaactga agctaatgcc ggtcagtttc tctcctttgc aagtctattc 540

cttccgaaat tggtagtagg agaaaaggct tgccttgaga aggttcaaag gcaaattcaa 600

gtacatgcag agcaaggact gatacaatat ccaacagctt ggcaatcagt aggacacatg 660

atggtgattt tccgtttgat gcgaacaaat tttctgatca aatttctcct aatacaccaa 720

gggatgcaca tggttgccgg gcatgatgcc aacgatgctg tgatttcaaa ttcagtggct 780

caagctcgtt tttcaggctt attgattgtc aaaacagtac ttgatcatat cctacaaaag 840

acagaacgag gagttcgtct ccatcctctt gcaaggaccg ccaaggtaaa aaatgaggtg 900

aactccttta aggctgcact cagctccctg gccaagcatg gagagtatgc tcctttcgcc 960

cgacttttga acctttctgg agtaaataat cttgagcatg gtcttttccc tcaactatcg 1020

gcaattgcac tcggagtcgc cacagcacac gggagtaccc tcgcaggagt aaatgttgga 1080

gaacagtatc aacaactcag agaggctgcc actgaggctg agaagcaact ccaacaatat 1140

gcagagtctc gcgaacttga ccatcttgga cttgatgatc aggaaaagaa aattcttatg 1200

aacttccatc agaaaaagaa cgaaatcagc ttccagcaaa caaacgctat ggtaactcta 1260

agaaaagagc gcctggccaa gctgacagaa gctatcactg ctgcgtcact gcccaaaaca 1320

agtggacatt acgatgatga tgacgacatt ccctttccag gacccatcaa tgatgacgac 1380

aatcctggcc atcaagatga tgatccgact gactcacagg atacgaccat tcccgatgtg 1440

gtggttgatc ctgatgatgg aagctacggc gaataccaga gttactcgga aaacggcatg 1500

aatgcaccag atgacttggt cctattcgat ctagacgagg acgacgagga cactaagcca 1560

gtgcctaata gatcgaccaa gggtggacaa cagaagaaca gtcaaaaggg ccagcatata 1620

gagggcagac agacacaatt caggccaatt caaaatgtcc caggccctca cagaacaatc 1680

caccacgcca gtgcgccact cacggacaat gacagaagaa atgaaccctc cggctcaacc 1740

agccctcgca tgctgacacc aattaacgaa gaggcagacc cactggacga tgccgacgac 1800

gagacgtcta gccttccgcc cttggagtca gatgatgaag agcaggacag ggacggaact 1860

tccaaccgca cacccactgt cgccccaccg gctcccgtat acagagatca ctctgaaaag 1920

aaagaactcc cgcaagacga gcaacaagat caggaccaca ctcaagaggc caggaaccag 1980

gacagtgaca acacccagtc agaacactcc cttgaggaga tgtatcgcca cattctaaga 2040

tcacaggggc catttgatgc tgttttgtat tatcatatga tgaaggatga gcctgtagtt 2100

ttcagtacca gtgatggcaa agagtacacg tatccagact cccttgaaga ggaatatcca 2160

ccatggctca ctgaaaaaga ggctatgaat gaagagaata gatttgttac attggatggt 2220

caacaatttt attggccggt gatgaatcac aagaataaat tcatggcaat cctgcaacat 2280

catcaggcta aattgaccga agccatcacg actgcatcga agatcaaggt tggagaccgt 2340

tatcctgatg acaatgatat tccatttccc gggccgatct atgatgacac tcaccccaat 2400

ccctctgatg acaatcctga tgattcacgt gatacaacta ttccaggtgg tgttgttgac 2460

ccgtatgatg atgagagtaa taattatcct gactacgagg attcggctga aggcaccaca 2520

ggagatcttg atctcttcaa tttggacgac gacgatgatg acagccgacc aggaccacca 2580

gacagggggc agaacaagga gagggcggcc cggacatatg gcctccaaga tccgaccttg 2640

gacggagcga aaaaggtgcc ggagttgacc ccaggttccc atcaaccagg caacctccac 2700

atcaccaagt cgggttcaaa caccaaccaa ccacaaggca atatgtcatc tactctccat 2760

agtatgaccc ctatacagga agaatcagag cccgatgatc aaaaagataa tgatgacgag 2820

agtctcacat cccttgactc tgaaggtgac gaagatggtg agagcatctc tgaggagaac 2880

accccaactg tagctccacc agcaccagtc tacaaagaca ctggagtaga cactaatcag 2940

cagaatggac caagcagtac tgtagatagt caaggttctg aaagtgaagc tctcccaatc 3000

aactctaaaa agagttccgc actagaagaa acatattatc atctcctaaa aacacagggt 3060

ccatttgagg caatcaatta ttatcaccta atgagtgatg aacccattgc ttttagcact 3120

gaaagtggca aggaatatat ctttccagac tcccttgaag aagcctaccc gccgtggttg 3180

agtgagaagg aggccttaga gaaggaaaat cgttatctgg tcattgatgg ccagcaattc 3240

ctctggccgg taatgagcct acgggacaag ttccttgccg ttcttcaaca tgacgccaaa 3300

ttgaccgaag ctattacttc cacctctatc ctcaaaacag gaaggcggta tgatgatgac 3360

aatgacatac cctttccagg gccaatcaat gataacgaga actctggtca gaacgatgac 3420

gatccaacag actcccagga taccacaatc ccggatgtaa taatcgatcc aaacgatggt 3480

gggtataata attacagcga ttatgcaaat gatgctgcaa gtgctcctga tgacctagtt 3540

ctttttgacc ttgaggacga ggatgatgct gataacccgg ctcaaaacac gccagaaaaa 3600

aatgatagac cagcaacaac aaagctgaga aatggacagg accaggatgg aaaccaaggc 3660

gaaactgcat ccccacgggt agcccccaac caatacagag acaagccaat gccacaagta 3720

caggacagat ccgaaaatca tgaccaaacc cttcaaacac agtccagggt tttgactcct 3780

atcagcgagg aagcagaccc cagcgaccac aacgatggtg acaatgaaag cattcctccc 3840

ctggaatcag acgacgaggg tagcactgat actactgcag cagaaacaaa gcctgccact 3900

gcacctcccg ctcccgtcta ccgaagtatc tccgtagatg attctgtccc ctcagagaac 3960

attcccgcac agtccaatca aacgaacaat gaggacaatg tcaggaacaa tgctcagtcg 4020

gagcaatcca ttgcagaaat gtatcaacat atcttgaaaa cacaaggacc ttttgatgcc 4080

atcctttact accatatgat gaaagaagag cccatcattt tcagcactag tgatgggaag 4140

gagtatacat atccagactc tcttgaagat gagtatccac cctggctcag cgagaaggaa 4200

gccatgaacg aagacaatag attcataacc atggatggtc agcagtttta ctggcctgtg 4260

atgaatcata gaaataaatt catggcaatc ctccagcatc acaggcttgt tctttttgac 4320

cttgaagatg gtgacgagga tgatcaccga ccgtcaagtt catcagagaa caacaacaaa 4380

cacagtctta caggaactga cagtaacaaa acaagtaact ggaatcgaaa cccgactaat 4440

atgccaaaga aagactccac acaaaacaat gacaatcctg cacagcgggc tcaagaatac 4500

gccagggata acatccagga tacaccaaca ccccatcgag ctctaactcc catcagcgaa 4560

gaaaccggct ccaatggtca caatgaagat gacattgata gcatccctcc tttggaatca 4620

gacgaagaaa acaacactga gacaaccatt accaccacaa aaaataccac tgctccacca 4680

gcacctgttt atcggagtaa ttcagaaaag gagcccctcc cgcaagaaaa atcccagaag 4740

caaccaaacc aagtgagtgg tagtgagaat accgacaata aacctcactc agagcaatca 4800

gtggaagaaa tgtaa 4815

<210> 24

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 24

atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct 60

tcctgcctcg gaagagtcca accaacagaa tctattgtta gatttcctaa tattacaaac 120

ttgtgccctt ttgatgaagt ttttaacgcc accagatttg catctgttta tgcttggaac 180

aggaagagaa tcagcaactg tgttgctgat tattctgtcc tatataatct cgcaccattt 240

ttcactttta agtgttatgg agtgtctcct actaaattaa atgatctctg ctttactaat 300

gtctatgcag attcatttgt aattagaggt gatgaagtca gacaaatcgc tccagggcaa 360

actggaaaca ttgctgatta taattataaa ttaccagatg attttacagg ctgcgttata 420

gcttggaatt ctaacaagct tgattctaag gttagtggta attataatta cctgtataga 480

ttgtttagga agtctaatct caaacctttt gagagagata tttcaactga aatctatcag 540

gccggtaaca aaccttgtaa tggtgttgca ggttttaatt gttactttcc tttacgatca 600

tatagtttcc gacccactta tggtgttggt caccaaccat acagagtagt agtactttct 660

tttgaacttc tacatgcacc agcaactgtt tgtggaccta aaaagtctac taatttggtt 720

aaaaacaaat gtgtcaattt ctaa 744

<210> 25

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 25

Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly

1 5 10 15

Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile

20 25 30

Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Asp Glu Val Phe

35 40 45

Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile

50 55 60

Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Leu Ala Pro Phe

65 70 75 80

Phe Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu

100 105 110

Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn

115 120 125

Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser

130 135 140

Asn Lys Leu Asp Ser Lys Val Ser Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg

145 150 155 160

Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr

165 170 175

Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Asn Lys Pro Cys Asn Gly Val Ala Gly Phe

180 185 190

Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Tyr Ser Phe Arg Pro Thr Tyr Gly

195 200 205

Val Gly His Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu

210 215 220

His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val

225 230 235 240

Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

245

<210> 26

<211> 4056

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 26

atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct 60

tcctgcctcg gaagagtcca accaacagaa tctattgtta gatttcctaa tattacaaac 120

ttgtgccctt ttggtgaagt ttttaacgcc accagatttg catctgttta tgcttggaac 180

aggaagagaa tcagcaactg tgttgctgat tattctgtcc tatataattc cgcatcattt 240

tccactttta agtgttatgg agtgtctcct actaaattaa atgatctctg ctttactaat 300

gtctatgcag attcatttgt aattagaggt gatgaagtca gacaaatcgc tccagggcaa 360

actggaaaga ttgctgatta taattataaa ttaccagatg attttacagg ctgcgttata 420

gcttggaatt ctaacaatct tgattctaag gttggtggta attataatta ccggtataga 480

ttgtttagga agtctaatct caaacctttt gagagagata tttcaactga aatctatcag 540

gccggtagca aaccttgtaa tggtgttgaa ggttttaatt gttactttcc tttacaatca 600

tatggtttcc aacccactaa tggtgttggt taccaaccat acagagtagt agtactttct 660

tttgaacttc tacatgcacc agcaactgtt tgtggaccta aaaagtctac taatttggtt 720

aaaaacaaat gtgtcaattt ctcaggtggt ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 780

ggcggatcga tgtctgataa tggaccccaa aatcagcgaa atgcaccccg cattacgttt 840

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actccaggca gcagtatggg aacttctcct gctagaatgg ctggcaatgg ctgtgatgct 1440

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cctcggcaaa aacgtactgc cactaaagca tacaatgtaa cacaagcttt cggcagacgt 1620

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gcagatttgg atgatttctc caaacaattg caacaatcca tgagcagtgc tgactcaact 2040

caggccatgg catcccctgc tgcacctcgt gctgtttcct ttgccgataa caatgatata 2100

acaaatacaa acctatctcg aggtagagga cgtaatccaa aaccacgagc tgcaccaaat 2160

aacactgtct cttggtacac tgggcttacc caacacggga aagtccctct tacctttcca 2220

cctgggcagg gtgtacctct taatgccaat tctacccctg cgcaaaatgc tgggtattgg 2280

cggagacagg acagaaaaat taataccggg aatggaatta agcaactggc tcccaggtgg 2340

tacttctact acactggaac tggacccgaa gcagcactcc cattccgggc tgttaaggat 2400

ggcatcgttt gggtccatga agatggcgcc actgatgctc cttcaacttt tgggacgcgg 2460

aaccctaaca atgattcagc tattgttaca caattcgcgc ccggtactaa gcttcctaaa 2520

aacttccaca ttgaggggac tggaggcaat agtcaatcat cttcaagagc ctctagctta 2580

agcagaaact cttccagatc tagttcacaa ggttcaagat caggaaactc tacccgcggc 2640

acttctccag gtccatctgg aatcggagca gtaggaggtg atctacttta ccttgatctt 2700

ctgaacagac tacaagccct tgagtctggc aaagtaaagc aatcgcagcc aaaagtaatc 2760

actaagaaag atgctgctgc tgctaaaaat aagatgcgcc acaagcgcac ttccaccaaa 2820

agtttcaaca tggtgcaagc ttttggtctt cgcggaccag gagacctcca gggaaacttt 2880

ggtgatcttc aattgaataa actcggcact gaggacccac gttggcccca aattgctgag 2940

cttgctccta cagccagtgc ttttatgggt atgtcgcaat ttaaacttac ccatcagaac 3000

aatgatgatc atggcaaccc tgtgtacttc cttcggtaca gtggagccat taaacttgac 3060

ccaaagaatc ccaactacaa taagtggttg gagcttcttg agcaaaatat tgatgcctac 3120

aaaaccttcc ctaagaagga aaagaaacaa aaggcaccaa aagaagaatc aacagaccaa 3180

atgtctgaac ctccaaagga gcagcgtgtg caaggtagca tcactcagcg cactcgcacc 3240

cgtccaagtg ttcagcctgg tccaatgatt gatgttaaca ctgattctgg tggcggtggc 3300

tcgggcggag gtgggtcggg tggcggcgga tcagaagcaa aaccttctgg ctcagttgtg 3360

gaacaggctg aaggtgttga atgtgatttt tcacctcttc tgtctggcac acctcctcag 3420

gtttataatt tcaagcgttt ggtttttacc aattgcaatt ataatcttac caaattgctt 3480

tcactttttt ctgtgaatga ttttacttgt agtcaaatat ctccagcagc aattgctagc 3540

aactgttatt cttcactgat tttggattac ttttcatacc cacttagtat gaaatccgat 3600

ctcagtgtta gttctgctgg tccaatatcc cagtttaatt ataaacagtc cttttctaat 3660

cccacatgtt tgattttagc gactgttcct cataacctta ctactattac taagcctctt 3720

aagtacagct atattaacaa gtgctctcgt cttctttctg atgatcgtac tgaagtacct 3780

cagttagtga acgctaatca atactcaccc tgtgtatcca ttgtcccatc cactgtgtgg 3840

gaagacggtg attattatag gaaacaacta tctccacttg aaggtggtgg ctggcttgtt 3900

gctagtggct caactgttgc catgactgag caattacaga tgggctttgg tattacagtt 3960

caatatggta cagacaccaa tagtgtttgc cccaagcttg aatttgctaa tgacacaaaa 4020

attgcctctc aattaggcaa ttgcgtggaa tattag 4056

<210> 27

<211> 1351

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 27

Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly

1 5 10 15

Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile

20 25 30

Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe

35 40 45

Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile

50 55 60

Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe

65 70 75 80

Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu

100 105 110

Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn

115 120 125

Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser

130 135 140

Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg

145 150 155 160

Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr

165 170 175

Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Lys Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe

180 185 190

Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly

195 200 205

Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu

210 215 220

His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val

225 230 235 240

Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln

260 265 270

Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly

275 280 285

Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg

290 295 300

Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr

305 310 315 320

Gln His Gly Lys Glu Gly Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro

325 330 335

Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg

340 345 350

Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser

355 360 365

Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu

370 375 380

Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly

385 390 395 400

Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn

405 410 415

Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys

420 425 430

Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg

435 440 445

Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser

450 455 460

Ser Met Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Cys Asp Ala

465 470 475 480

Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys

485 490 495

Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys

500 505 510

Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr

515 520 525

Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln

530 535 540

Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp

545 550 555 560

Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala

565 570 575

Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr

580 585 590

Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn

595 600 605

Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys

610 615 620

Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Tyr

625 630 635 640

Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr

645 650 655

Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln

660 665 670

Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala Met Ala Ser Pro Ala Ala

675 680 685

Pro Arg Ala Val Ser Phe Ala Asp Asn Asn Asp Ile Thr Asn Thr Asn

690 695 700

Leu Ser Arg Gly Arg Gly Arg Asn Pro Lys Pro Arg Ala Ala Pro Asn

705 710 715 720

Asn Thr Val Ser Trp Tyr Thr Gly Leu Thr Gln His Gly Lys Val Pro

725 730 735

Leu Thr Phe Pro Pro Gly Gln Gly Val Pro Leu Asn Ala Asn Ser Thr

740 745 750

Pro Ala Gln Asn Ala Gly Tyr Trp Arg Arg Gln Asp Arg Lys Ile Asn

755 760 765

Thr Gly Asn Gly Ile Lys Gln Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

770 775 780

Thr Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ala Leu Pro Phe Arg Ala Val Lys Asp

785 790 795 800

Gly Ile Val Trp Val His Glu Asp Gly Ala Thr Asp Ala Pro Ser Thr

805 810 815

Phe Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asp Ser Ala Ile Val Thr Gln Phe

820 825 830

Ala Pro Gly Thr Lys Leu Pro Lys Asn Phe His Ile Glu Gly Thr Gly

835 840 845

Gly Asn Ser Gln Ser Ser Ser Arg Ala Ser Ser Leu Ser Arg Asn Ser

850 855 860

Ser Arg Ser Ser Ser Gln Gly Ser Arg Ser Gly Asn Ser Thr Arg Gly

865 870 875 880

Thr Ser Pro Gly Pro Ser Gly Ile Gly Ala Val Gly Gly Asp Leu Leu

885 890 895

Tyr Leu Asp Leu Leu Asn Arg Leu Gln Ala Leu Glu Ser Gly Lys Val

900 905 910

Lys Gln Ser Gln Pro Lys Val Ile Thr Lys Lys Asp Ala Ala Ala Ala

915 920 925

Lys Asn Lys Met Arg His Lys Arg Thr Ser Thr Lys Ser Phe Asn Met

930 935 940

Val Gln Ala Phe Gly Leu Arg Gly Pro Gly Asp Leu Gln Gly Asn Phe

945 950 955 960

Gly Asp Leu Gln Leu Asn Lys Leu Gly Thr Glu Asp Pro Arg Trp Pro

965 970 975

Gln Ile Ala Glu Leu Ala Pro Thr Ala Ser Ala Phe Met Gly Met Ser

980 985 990

Gln Phe Lys Leu Thr His Gln Asn Asn Asp Asp His Gly Asn Pro Val

995 1000 1005

Tyr Phe Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Ile Lys Leu Asp Pro Lys Asn Pro

1010 1015 1020

Asn Tyr Asn Lys Trp Leu Glu Leu Leu Glu Gln Asn Ile Asp Ala Tyr

1025 1030 1035 1040

Lys Thr Phe Pro Lys Lys Glu Lys Lys Gln Lys Ala Pro Lys Glu Glu

1045 1050 1055

Ser Thr Asp Gln Met Ser Glu Pro Pro Lys Glu Gln Arg Val Gln Gly

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Ser Ile Thr Gln Arg Thr Arg Thr Arg Pro Ser Val Gln Pro Gly Pro

1075 1080 1085

Met Ile Asp Val Asn Thr Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1090 1095 1100

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Lys Pro Ser Gly Ser Val Val

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Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly

1125 1130 1135

Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys

1140 1145 1150

Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe

1155 1160 1165

Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser

1170 1175 1180

Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp

1185 1190 1195 1200

Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln

1205 1210 1215

Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile Leu Ala Thr Val Pro His Asn

1220 1225 1230

Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys

1235 1240 1245

Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr Glu Val Pro Gln Leu Val Asn

1250 1255 1260

Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser Ile Val Pro Ser Thr Val Trp

1265 1270 1275 1280

Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly

1285 1290 1295

Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr Val Ala Met Thr Glu Gln Leu

1300 1305 1310

Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser

1315 1320 1325

Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn Asp Thr Lys Ile Ala Ser Gln

1330 1335 1340

Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr

1345 1350

<210> 28

<211> 4098

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 28

atgcctatgg gcagcctgca gccactggct acactgtacc tgctgggcat gctggtggcc 60

tcttgtctgg gcataggaga gtgtccaaag tatgtcagga gtgcaaaatt aaggatggtt 120

acaggactaa ggaacatccc atccattcaa tccagaggtt tgtttggagc cattgccggt 180

ttcattgaag gggggtggac tggaatggta gatgggtggt atggttatca tcatcagaat 240

gagcaaggat ctggctatgc tgcagatcaa aaaagtacac aaaatgccat taacgggatt 300

acaaacaagg tgaattctgt aattgagaaa atgaacactc aattcacagc tgtgggcaaa 360

gaattcaaca aattggaaag aaggatggaa aacttaaata aaaaagttga tgatgggttt 420

ctagacattt ggacatataa tgcagaattg ttggttctac tggaaaatga aaggactttg 480

gatttccatg actccgccag ccaaggcact aagagaagct acgagcagat ggaaaccgga 540

ggcgaacggc agaacgccac agagatcaga gcctctgtgg gccgtatggt cggcggcatc 600

ggcagattct acatccagat gtgcaccgaa ctgaagctga gcgactacga gggccgcctg 660

atccagaaca gcatcacaat cgagagaatg gtgctgtccg cctttgacga gcggagaaac 720

aaatacctgg aagagcaccc tagcgccgga aaagatccta agaaaaccgg cggacctatc 780

tacagaagaa gagatggtaa gtgggtgaga gagctgattc tgtacgataa ggaagagatt 840

cgaagaatct ggagacaggc caacaacggc gaggatgcca ccgcaggcct gacacacctg 900

atgatctggc acagcaacct gaacgatgcg acctaccagc gcacgcgggc cctggtcaga 960

accggcatgg atcctcggat gtgtagcctg atgcagggca gcacactgcc aagacggagt 1020

ggggccgccg gcgctgcagt gaagggcgtc ggaaccatgg tgatggagct gatccggatg 1080

ataaagcggg gcatcaacga cagaaacttc tggcgaggcg agaacggccg aagaacccgg 1140

atcgcctacg agagaatgtg caacatcctg aaaggaaaat tccagaccgc cgcccagcgg 1200

gccatgatgg accaggtgcg cgagagcaga aaccccggca atgccgagat cgaggacctg 1260

atcttcctgg ccagaagcgc cctcattctt agaggctctg tggcccacaa gagctgtctg 1320

cctgcctgtg tgtacggcct ggcagtggcc tcaggctacg acttcgagcg ggaaggatac 1380

agtctggtgg gcatcgaccc tttcagactc ctgcagaata gccaggtgtt tagcctgatc 1440

agaccaaacg aaaaccccgc ccataagagc cagctggtgt ggatggcctg ccacagcgcc 1500

gcctttgagg atctgagagt gagctctttt atcagaggca cccgggtggt tccacgaggt 1560

caactgtcta caagaggtgt gcagatcgcc agcaacgaga acatggagac catggatagc 1620

agcaccctgg aactgagatc cagatactgg gccatcagga cacggagcgg cggcaccacc 1680

aatcagcagc gcgccagcgc cggccagatc tctgtccagc ctacgtttag cgtgcagcgg 1740

aatttgccct tcgaacgcgc cacaatcatg gctgctttca ccggcaatac agagggcaga 1800

accagcgata tgagaacaga aattatccgt atgatggagt ccgcaaaacc tgaggacgtg 1860

tccttccaag gcagaggcgt gttcgagctg agcgacgaga aggccaccaa ccctatcgtg 1920

cctagcttcg atatgtctaa tgagggcagc tactttttcg gagataacgc cgaagagtac 1980

gacaacatgt ctaatatgga tatcgacggc attaacaccg gcaccatcga caaaacccct 2040

gaggagatca cccctggcac cagcggcaca acccggccca tcatccgccc cgctacactg 2100

gctccaccta gcaacaagcg gaccagaaat ccctcgccag aaagagccac aacctccagc 2160

gaggacgacg tgggacggaa gacacaaaag aagcagaccc ctacagagat caagaagtct 2220

gtttacaaca tggtggtgaa actgggcgag ttctacaacc agatgatggt gaaggccggc 2280

ctgaacgacg atatggaaag aaatctgatc cagaacgccc acgccgtgga gcggattctg 2340

ctggccgcca ccgatgataa gaagaccgaa ttccagaaaa agaaaaacgc cagagacgtg 2400

aaggaaggca aggaagagat cgaccacaac aagacaggcg gcacattcta caagatggtc 2460

cgggacgaca agaccatcta cttcagccct atccggataa cattcctgaa agaagaagtg 2520

aagaccatgt acaaaaccac aatgggctct gacggcttca gcggcctgaa tcacatcatg 2580

atcggccact ctcaaatgaa cgatgtgtgc ttccagagaa gcaaggctct gaagcgcgtg 2640

ggcctggatc ctagcctgat ctctaccttc gccggcagca ccatccccag aagatcgggc 2700

gctaccggcg tggctatcaa gggaggaggc acactggtgg ctgaagccat cagattcatc 2760

ggaagagcca tggccgacag aggactcctg agagatatca aagccaaaac cgcctacgaa 2820

aaaatcctgc tgaacctgaa gaacaagtgc agcgcgcctc aacagaaggc cctggtggac 2880

caggttatcg gctctagaaa ccctggaatc gccgatatcg aggacctgac actgctggcc 2940

agatctatgg tggtggtgag accctccgtg gccagcaagg tggtgctgcc tatcagcatc 3000

tacgccaaga tccctcagct gggatttaac gtggaagaat acagcatggt tggttatgag 3060

gccatggccc tgtacaacat ggccacacct gtgtccatcc tgagaatggg cgacgatgcc 3120

aaagacaaga gccagctgtt cttcatgagc tgcttcggcg ctgcctatga ggacctgaga 3180

gtgctgtccg ctcttacagg aacagagttc aagcctagga gcgcactgaa gtgcaagggc 3240

ttccacgtgc ccgccaagga acaggtggaa ggcatgggag ctgctctgat gtccatcaag 3300

ctgcaatttt gggctcctat gacccggagc ggcggaaatg aggtgggtgg cgacggaggc 3360

agcggacaga tttcttgcag ccccgtattt gccgtggaga gaccaatcgc cctgtccaag 3420

caggccgtga gaagaatgct gagcatgaac atcgagggcc gggacgccga cgtgaagggc 3480

aacctgttga agatgatgaa cgacagcatg gccaagaaga ccagtggcaa tgccttcatc 3540

ggcaagaaga tgttccagat ctccgacaag aacaagacca accccgtgga aatccccatc 3600

aagcagacaa tccctaactt cttcttcggc agagacaccg ccgaagacta tgacgacctg 3660

gactacatag gaaattgccc aatatgggtg aaaacacctt tgaagcttgc caatggaacc 3720

aaatatagac ctcctgcaaa actattaaag gaaaggggtt tcttcggagc tattgctggt 3780

ttcctagaag gaggatggga aggaatgatt gcaggctggc acggatacac atctcacgga 3840

gcacatggag tggcagtggc ggcggacctt aagagtacgc aagaagctat aaacaagata 3900

acaaaaaatc tcaattcttt gagtgagcta gaagtaaaga atcttcaaag actaagtggt 3960

gccatggatg aactccacaa cgaaatactc gagctggatg agaaagtgga tgatctcaga 4020

gctgacacta taagctcgca aatagaactt gcagtcttgc tttccaacga aggaataata 4080

aacagtgaag atgagtga 4098

<210> 29

<211> 1365

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 29

Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly

1 5 10 15

Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val

20 25 30

Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser

35 40 45

Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly

50 55 60

Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn

65 70 75 80

Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala

85 90 95

Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn

100 105 110

Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Arg Arg

115 120 125

Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp

130 135 140

Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu

145 150 155 160

Asp Phe His Asp Ser Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln

165 170 175

Met Glu Thr Gly Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser

180 185 190

Val Gly Arg Met Val Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys

195 200 205

Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser

210 215 220

Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn

225 230 235 240

Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr

245 250 255

Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu

260 265 270

Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn

275 280 285

Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile Trp His

290 295 300

Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg

305 310 315 320

Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu

325 330 335

Pro Arg Arg Ser Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr

340 345 350

Met Val Met Glu Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg

355 360 365

Asn Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu

370 375 380

Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg

385 390 395 400

Ala Met Met Asp Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu

405 410 415

Ile Glu Asp Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly

420 425 430

Ser Val Ala His Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala

435 440 445

Val Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly

450 455 460

Ile Asp Pro Phe Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile

465 470 475 480

Arg Pro Asn Glu Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala

485 490 495

Cys His Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg

500 505 510

Gly Thr Arg Val Val Pro Arg Gly Gln Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln

515 520 525

Ile Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met Asp Ser Ser Thr Leu Glu

530 535 540

Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Thr Thr

545 550 555 560

Asn Gln Gln Arg Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe

565 570 575

Ser Val Gln Arg Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala

580 585 590

Phe Thr Gly Asn Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile

595 600 605

Ile Arg Met Met Glu Ser Ala Lys Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly

610 615 620

Arg Gly Val Phe Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val

625 630 635 640

Pro Ser Phe Asp Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn

645 650 655

Ala Glu Glu Tyr Asp Asn Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Ile Asn

660 665 670

Thr Gly Thr Ile Asp Lys Thr Pro Glu Glu Ile Thr Pro Gly Thr Ser

675 680 685

Gly Thr Thr Arg Pro Ile Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser

690 695 700

Asn Lys Arg Thr Arg Asn Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser

705 710 715 720

Glu Asp Asp Val Gly Arg Lys Thr Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu

725 730 735

Ile Lys Lys Ser Val Tyr Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr

740 745 750

Asn Gln Met Met Val Lys Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn

755 760 765

Leu Ile Gln Asn Ala His Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr

770 775 780

Asp Asp Lys Lys Thr Glu Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val

785 790 795 800

Lys Glu Gly Lys Glu Glu Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe

805 810 815

Tyr Lys Met Val Arg Asp Asp Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg

820 825 830

Ile Thr Phe Leu Lys Glu Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met

835 840 845

Gly Ser Asp Gly Phe Ser Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser

850 855 860

Gln Met Asn Asp Val Cys Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val

865 870 875 880

Gly Leu Asp Pro Ser Leu Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Ile Pro

885 890 895

Arg Arg Ser Gly Ala Thr Gly Val Ala Ile Lys Gly Gly Gly Thr Leu

900 905 910

Val Ala Glu Ala Ile Arg Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly

915 920 925

Leu Leu Arg Asp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu

930 935 940

Asn Leu Lys Asn Lys Cys Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp

945 950 955 960

Gln Val Ile Gly Ser Arg Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu

965 970 975

Thr Leu Leu Ala Arg Ser Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser

980 985 990

Lys Val Val Leu Pro Ile Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly

995 1000 1005

Phe Asn Val Glu Glu Tyr Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu

1010 1015 1020

Tyr Asn Met Ala Thr Pro Val Ser Ile Leu Arg Met Gly Asp Asp Ala

1025 1030 1035 1040

Lys Asp Lys Ser Gln Leu Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr

1045 1050 1055

Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro

1060 1065 1070

Arg Ser Ala Leu Lys Cys Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln

1075 1080 1085

Val Glu Gly Met Gly Ala Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp

1090 1095 1100

Ala Pro Met Thr Arg Ser Gly Gly Asn Glu Val Gly Gly Asp Gly Gly

1105 1110 1115 1120

Ser Gly Gln Ile Ser Cys Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile

1125 1130 1135

Ala Leu Ser Lys Gln Ala Val Arg Arg Met Leu Ser Met Asn Ile Glu

1140 1145 1150

Gly Arg Asp Ala Asp Val Lys Gly Asn Leu Leu Lys Met Met Asn Asp

1155 1160 1165

Ser Met Ala Lys Lys Thr Ser Gly Asn Ala Phe Ile Gly Lys Lys Met

1170 1175 1180

Phe Gln Ile Ser Asp Lys Asn Lys Thr Asn Pro Val Glu Ile Pro Ile

1185 1190 1195 1200

Lys Gln Thr Ile Pro Asn Phe Phe Phe Gly Arg Asp Thr Ala Glu Asp

1205 1210 1215

Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr

1220 1225 1230

Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu

1235 1240 1245

Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly

1250 1255 1260

Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly

1265 1270 1275 1280

Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala

1285 1290 1295

Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val

1300 1305 1310

Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu

1315 1320 1325

Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile

1330 1335 1340

Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile

1345 1350 1355 1360

Asn Ser Glu Asp Glu

1365

Claims (107)

1.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对冠状病毒的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和含有编码融合蛋白的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)，其中所述ORF从5’至3’包含：

(i)编码哺乳动物信号肽的核苷酸序列；和

(ii)编码冠状病毒核衣壳蛋白的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地其中所述β冠状病毒是人类β冠状病毒。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述β冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(SARS-CoV-1)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)或其组合。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述β冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述冠状病毒核衣壳蛋白包含第一核衣壳蛋白和第二核衣壳蛋白，其中所述第一核衣壳蛋白是来自第一进化枝的第一变种的SARS-CoV-2核衣壳蛋白，并且所述第二核衣壳蛋白是来自第二进化枝的第二变种的SARS-CoV-2核衣壳蛋白，并且其中所述第一进化枝和所述第二进化枝是由世界卫生组织、Pango、GISAID和Nextstrain中的一个或多个定义的不同进化枝。

6.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对冠状病毒的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和含有编码融合蛋白的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)，其中所述ORF从5’至3’包含：

(i)编码哺乳动物信号肽的核苷酸序列；和

(ii)编码两种或更多种冠状病毒核衣壳蛋白的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地其中所述β冠状病毒是人类β冠状病毒。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述β冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(SARS-CoV-1)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)或其组合。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述β冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述两种或更多种冠状病毒核衣壳蛋白包括SARS-CoV-2核衣壳蛋白和MERS核衣壳蛋白。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述两种或更多种冠状病毒核衣壳蛋白包括SARS-CoV-2核衣壳蛋白、SARS-CoV-1核衣壳蛋白和MERS核衣壳蛋白。

12.根据权利要求6-11中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种冠状病毒核衣壳蛋白被长度为一至十个残基的接头分开。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物信号肽是在哺乳动物抗原呈递细胞中表达的表面蛋白的信号肽。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述哺乳动物信号肽是CD5信号肽，并且所述CD5信号肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8至少90％或95％相同的氨基酸序列。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述核衣壳蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的残基2-419或与SEQ ID NO:5的残基2-419至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

16.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

17.根据权利要求6-14中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述开放阅读框包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

19.根据权利要求17所述的组合物，其中所述开放阅读框包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的核苷酸序列。

20.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9的残基2-413或与SEQ ID NO:9的残基2-413至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

21.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的残基2-422或与SEQ ID NO:10的残基2-422至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中所述组合物不包含脂质体或脂质纳米颗粒。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中所述mRNA是自我复制mRNA。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述自我复制RNA包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒属复制子。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述甲病毒属选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述甲病毒属是委内瑞拉马脑炎病毒。

27.根据权利要求23-26中任一项所述的组合物，其中所述甲病毒属复制子包含非结构蛋白编码区，其中插入12-18个核苷酸，导致在非结构蛋白2(nsP2)的β折叠4与β折叠6之间包含4至6个另外的氨基酸的nsP2的表达。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的组合物，其中所述自我复制mRNA是温度敏感型药剂(ts药剂)，其能够在许可温度下表达所述融合物，而在非许可温度下不表达所述融合物。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述许可温度是31℃至35℃并且所述非许可温度是至少37℃±0.5℃。

30.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对冠状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用根据权利要求1-29中任一项所述的组合物，以在所述哺乳动物受试者中刺激针对所述冠状病毒核衣壳蛋白的免疫应答。

31.根据权利要求30所述的方法，其中将所述组合物皮内施用。

32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述免疫应答包括冠状病毒反应性细胞免疫应答。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述免疫应答进一步包括冠状病毒反应性体液免疫应答。

34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。

35.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

根据权利要求1-29中任一项或权利要求37-62中任一项所述的组合物；和

用于将所述组合物皮内递送至哺乳动物受试者的装置。

36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述装置包括注射筒和针头。

37.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对两种或更多种病毒的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和含有编码融合蛋白的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)，其中所述ORF从5’至3’包含：

(i)编码哺乳动物信号肽的核苷酸序列；和

(ii)编码第一病毒的第一核衣壳蛋白和第二病毒的第二核衣壳蛋白的核苷酸序列。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒能够在感染人类受试者后引起疾病。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒是相同物种的不同变种、亚型或谱系。

40.根据权利要求38所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒是相同属的不同物种。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒两者都是β冠状病毒属的成员。

42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)。

43.根据权利要求38所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒是相同界的不同科、目、纲或门的成员。

44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒两者都是正粘病毒科的成员。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒包括甲型流感病毒和乙型流感病毒。

46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:16至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

47.根据权利要求38所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒两者都是正核糖核酸病毒界的成员，任选地其中所述第一病毒和所述第二病毒包括：(a)严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(SARS-CoV-1)或中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)；和(b)甲型流感病毒或乙型流感病毒。

48.根据权利要求40所述的组合物，其中所述第一病毒和所述第二病毒两者都是埃博拉病毒属的成员，任选地其中所述第一病毒和所述第二病毒选自扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、本迪布焦型埃博拉病毒和塔伊森林型埃博拉病毒。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述核苷酸序列进一步编码第三病毒的第三核衣壳蛋白和第四病毒的第四核衣壳蛋白，并且所述第一病毒、所述第二病毒、所述第三病毒和所述第四病毒是扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、本迪布焦型埃博拉病毒和塔伊森林型埃博拉病毒。

50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:22或与SEQ ID NO:22至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

51.根据权利要求49所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)编码所述第一病毒的第一核衣壳蛋白的用于刺激针对全部所述第一病毒、所述第二病毒、所述第三病毒和所述第四病毒的免疫应答的共享部分。

52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)编码所述第一核衣壳蛋白、所述第二核衣壳蛋白、所述第三核衣壳蛋白和所述第四核衣壳蛋白各自用于刺激针对全部所述第一病毒、所述第二病毒、所述第三病毒和所述第四病毒的免疫应答的单独部分。

53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)编码所述第二病毒的第二核衣壳蛋白的用于刺激针对所述第二病毒和所述第三病毒的免疫应答的单独部分的片段。

54.根据权利要求37所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)编码所述第一病毒的第一核衣壳蛋白的用于刺激针对所述第一病毒和所述第二病毒两者的免疫应答的共享部分。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)编码所述第一核衣壳蛋白和所述第二核衣壳蛋白各自用于刺激针对所述第一病毒和所述第二病毒两者的免疫应答的单独部分。

56.根据权利要求37-48中任一项所述的组合物，其中所述核苷酸序列(ii)进一步编码至少一种其他病毒的至少一种其他核衣壳蛋白，并且其中所述至少一种其他病毒不同于所述第一病毒和所述第二病毒。

57.根据权利要求37-56中任一项所述的组合物，其中所述第一核衣壳蛋白和所述第二核衣壳蛋白，或者所述第一核衣壳蛋白、所述第二核衣壳蛋白和所述其他核衣壳蛋白被长度为一至十个残基的接头分开。

58.根据权利要求37-57中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物信号肽是在哺乳动物抗原呈递细胞中表达的表面蛋白的信号肽。

59.根据权利要求37-58中任一项所述的组合物，其中所述mRNA是自我复制mRNA。

60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述自我复制mRNA是温度敏感型药剂(ts药剂)，其能够在许可温度下表达所述融合蛋白，而在非许可温度下不表达所述融合蛋白。

61.根据权利要求60所述的组合物，其中所述许可温度是31℃至35℃并且所述非许可温度是至少37℃±0.5℃。

62.根据权利要求1-29中任一项或权利要求37-61中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含壳聚糖。

63.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对两种或更多种病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用根据权利要求37-62中任一项所述的组合物，以在所述哺乳动物受试者中刺激针对所述两种或更多种病毒的核衣壳蛋白的免疫应答。

64.根据权利要求63所述的方法，其中将所述组合物皮内施用。

65.根据权利要求63或权利要求64所述的方法，其中所述免疫应答包括对所述两种或更多种病毒具有反应性的细胞免疫应答。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述细胞免疫应答包括核衣壳蛋白特异性辅助T淋巴细胞(Th)应答，所述核衣壳蛋白特异性辅助T淋巴细胞应答包括核衣壳蛋白特异性细胞因子分泌。

67.根据权利要求66所述的方法，其中核衣壳蛋白特异性细胞因子分泌包括干扰素-γ和白介素-4中之一或两者的分泌。

68.根据权利要求65所述的方法，其中所述细胞免疫应答包括核衣壳蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。

69.根据权利要求65-68中任一项所述的方法，其中所述免疫应答进一步包括对所述两种或更多种病毒具有反应性的体液免疫应答。

70.根据权利要求63-69中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。

71.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对病毒的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和含有编码融合蛋白的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)，其中所述ORF从5’至3’包含：

(i)编码哺乳动物信号肽的核苷酸序列；

(ii)编码第一病毒的第一病毒抗原或其片段的核苷酸序列；和

(iii)编码所述第一病毒或第二病毒的第二病毒抗原或其片段的核苷酸序列，

其中所述第一病毒抗原是核衣壳蛋白并且所述第二病毒抗原是表面蛋白，或者所述第一病毒抗原是表面蛋白并且所述第二病毒抗原是核衣壳蛋白。

72.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对两种或更多种病毒的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和含有编码融合蛋白的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)，其中所述ORF从5’至3’包含：

(i)编码哺乳动物信号肽的核苷酸序列；

(ii)编码第一病毒的第一病毒抗原或其片段的核苷酸序列；

(iii)编码所述第一病毒的第二病毒抗原或其片段的核苷酸序列；

(iv)编码第二病毒的第三病毒抗原或其片段的核苷酸序列；

(iii)编码所述第二病毒的第四病毒抗原或其片段的核苷酸序列，

其中所述第一病毒抗原是第一核衣壳蛋白并且所述第二病毒抗原是第一表面蛋白，或者所述第一病毒抗原是第一表面蛋白并且所述第二病毒抗原是第一核衣壳蛋白，并且

其中所述第三病毒抗原是第二核衣壳蛋白并且所述第四病毒抗原是第二表面蛋白，或者所述第三病毒抗原是第二表面蛋白并且所述第四病毒抗原是第二核衣壳蛋白。

73.根据权利要求71或权利要求72所述的组合物，其中所述mRNA是自我复制mRNA。

74.根据权利要求73所述的组合物，其中所述自我复制RNA包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒属复制子。

75.根据权利要求74所述的组合物，其中所述甲病毒属选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。

76.根据权利要求74所述的组合物，其中所述甲病毒属是委内瑞拉马脑炎病毒。

77.根据权利要求73-76中任一项所述的组合物，其中所述自我复制mRNA是温度敏感型药剂(ts药剂)，其能够在许可温度下表达所述融合蛋白，而在非许可温度下不表达所述融合蛋白。

78.根据权利要求77所述的组合物，其中所述许可温度是31℃至35℃并且所述非许可温度是至少37℃±0.5℃。

79.根据权利要求74-78中任一项所述的组合物，其中所述甲病毒属复制子包含非结构蛋白编码区，其中插入12-18个核苷酸，导致在非结构蛋白2(nsP2)的β折叠4与β折叠6之间包含4至6个另外的氨基酸的nsP2的表达。

80.根据权利要求71-79中任一项所述的组合物，其中所述第一病毒和/或所述第二病毒是冠状病毒，任选地其中所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地其中所述β冠状病毒是人类β冠状病毒。

81.根据权利要求80所述的组合物，其中所述第一病毒和/或所述第二病毒是独立地选自以下的β冠状病毒：严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(SARS-CoV-1)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)。

82.根据权利要求80所述的组合物，其中所述第一病毒是SARS-CoV-2，并且所述第二病毒是MERS-CoV。

83.根据权利要求80-82中任一项所述的组合物，其中所述表面蛋白、所述第一表面蛋白和/或所述第二表面蛋白各自包含冠状病毒刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)。

84.根据权利要求83所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:27至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

85.根据权利要求71-79中任一项所述的组合物，其中所述第一病毒和/或所述第二病毒是正粘病毒科的成员。

86.根据权利要求85所述的组合物，其中所述第一病毒和/或所述第二病毒独立地选自甲型流感病毒(IAV)和乙型流感病毒(IBV)。

87.根据权利要求86所述的组合物，其中所述第一病毒是IAV并且所述第二病毒是IBV。

88.根据权利要求85-87中任一项所述的组合物，其中所述表面蛋白、所述第一表面蛋白和/或所述第二表面蛋白各自包含流感血凝素的一部分。

89.根据权利要求88所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:29或与SEQ ID NO:29至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

90.根据权利要求71-89中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含壳聚糖。

91.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)根据权利要求71-90中任一项所述的组合物；和

(ii)用于将所述组合物皮内递送至哺乳动物受试者的装置。

92.根据权利要求91所述的试剂盒，其中所述装置包括注射筒和针头。

93.根据权利要求91或权利要求92所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含使用所述装置向哺乳动物受试者施用所述组合物以刺激针对所述第一病毒抗原、所述第二病毒抗原、所述第三病毒抗原和所述第四病毒抗原中的一种或多种的免疫应答的说明书。

94.一种在哺乳动物受试者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用根据权利要求71-90中任一项所述的组合物，以在所述哺乳动物受试者中刺激针对所述第一病毒抗原、所述第二病毒抗原、所述第三病毒抗原和所述第四病毒抗原中的一种或多种的免疫应答。

95.根据权利要求94所述的方法，其中将所述组合物皮内施用。

96.根据权利要求95所述的方法，其中所述免疫应答包括针对所述第一病毒抗原、所述第二病毒抗原、所述第三病毒抗原和所述第四病毒抗原中的一种或多种具有反应性的细胞免疫应答。

97.根据权利要求96所述的方法，其中所述免疫应答进一步包括针对所述第一病毒抗原、所述第二病毒抗原、所述第三病毒抗原和所述第四病毒抗原中的一种或多种具有反应性的体液免疫应答。

98.根据权利要求94-97中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。

99.一种用于针对至少一种病毒的主动加强免疫的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者皮内施用根据权利要求1-29中任一项、权利要求37-62中任一项或权利要求71-90中任一项所述的组合物以刺激针对所述病毒的二次免疫应答，其中所述哺乳动物受试者已经经历了针对所述病毒的初次免疫方案。

100.根据权利要求99所述的方法，其中所述初次免疫方案包括施用至少一剂针对所述病毒的不同疫苗。

101.根据权利要求100所述的方法，其中所述不同疫苗包含所述至少一种病毒的蛋白质抗原或灭活病毒，任选地其中所述蛋白质抗原是重组蛋白或其片段。

102.一种用于针对至少一种病毒的主动加强免疫的方法，所述方法包括：

(i)向有需要的哺乳动物受试者皮内施用根据权利要求1-29中任一项、权利要求37-62中任一项或权利要求71-90中任一项所述的组合物，以刺激针对所述病毒的初次免疫应答；以及

(ii)向所述哺乳动物受试者施用至少一剂针对所述病毒的不同疫苗，以刺激针对所述病毒的二次免疫应答。

103.根据权利要求102所述的方法，其中所述不同疫苗包含所述至少一种病毒的蛋白质抗原或灭活病毒，任选地其中所述蛋白质抗原是重组蛋白或其片段。

104.一种用于针对至少一种病毒的主动初次免疫的方法，所述方法包括：

(i)向有需要的哺乳动物受试者皮内施用根据权利要求1-29中任一项、权利要求37-62中任一项或权利要求71-90中任一项所述的组合物，以刺激针对所述病毒的初次免疫应答；其中所述哺乳动物受试者没有经历过针对所述病毒的初次免疫方案。

105.根据权利要求104所述的方法，所述方法进一步包括：

(ii)向所述哺乳动物受试者施用至少一剂针对所述病毒的不同疫苗，以刺激针对所述病毒的二次免疫应答。

106.根据权利要求105所述的方法，其中所述不同疫苗包含所述至少一种病毒的蛋白质抗原或灭活病毒，任选地其中所述蛋白质抗原是重组蛋白或其片段。

107.根据权利要求94-106中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。