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CN1176945C - 疟原虫融合抗原及其制法和用途 - Google Patents

疟原虫融合抗原及其制法和用途

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CN1176945C CNB011052929A CN01105292A CN1176945C CN 1176945 C CN1176945 C CN 1176945C CN B011052929 A CNB011052929 A CN B011052929A CN 01105292 A CN01105292 A CN 01105292A CN 1176945 C CN1176945 C CN 1176945C
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Abstract

本发明提供了由疟原虫主要裂殖子表面抗原(MSP1)和裂殖子顶端膜抗原(AMA-1)组成的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在制备抗疟疾疫苗方面的应用。本发明的AMA-1/MSP1融合蛋白具有优异的免疫原性，可在免疫个体中引发有效的抗疟原虫的免疫应答。

Description

疟原虫融合抗原及其制法和用途
本发明涉及DNA重组技术和基因工程疫苗领域。更具体地，本发明涉及一种含疟原虫主要裂殖子表面抗原(MSP1)和裂殖子顶端膜抗原(AMA-1)的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在制备抗疟疾疫苗方面的应用。
疟疾是人类最古老的传染病之一，目前仍严重影响人类的健康。据世界卫生组织(WHO)的最新调查，约世界人口的40％仍处在疟疾威胁之中，分布于一百多个国家。现世界上每年有3至5亿人患疟疾，其中约3百万人因疟疾而死亡。更为严重的是，由于疟原虫及蚊媒抗药性的产生和迅速扩散，疟疾不仅没有得到有效控制，反而有卷土重来之势。因此，开展全球遏制疟疾计划已成为WHO在新世纪两个重点研究领域之一。
人们在疟疾防治中依靠或期望获得突破的主要有三个途径：抗疟药、疟疾疫苗和蚊媒防制。但抗疟药及蚊媒防制面临着巨大的困难和挑战，这是因为疟原虫及蚊虫抗药性的产生和扩散。尽管目前尚未有应用价值的疟疾疫苗问世，但普遍认为发展疟疾疫苗是人类控制乃至消灭疟疾的重要途径。
大量研究表明，疟疾是可以通过研制有效的疫苗而实现预防的。如用灭活子孢子免疫的志愿者能完全保护后来的攻击感染。再如用鼠疟原虫的重组抗原免疫小鼠，亦能完全保护后来同种疟原虫的攻击感染。此外，疟疾流行病学研究也显示，死于疟疾的主要是无疟疾免疫力的人群，如：在疟区的儿童和非疟区人群进入疟区，而在疟区的成人很少因疟疾而死亡。如给这些无免疫力的人群接种有效的疫苗，使其达到与疟区成人同样的免疫力，这样就能实现预防疟疾和降低疟疾死亡率的目标。因此，疟疾疫苗研制已成为当今世界性热点课题。
在疟疾疫苗研究中，有两个候选疫苗的研究曾受到广泛关注，一是抗子孢子疫苗。该疫苗能抑制子孢子入侵肝细胞。但在后来的临床试验中效果不佳。据分析，其主要原因是该疫苗只产生抗子孢子免疫力，这样即使有极个别子孢子逃避该疫苗免疫攻击而幸存下来，就能入侵并在肝细胞生长繁殖，产生足够的裂殖子引起宿主致病。另一个是SPf.66多价合成肽疫苗。该疫苗是一个只有3个10肽表位通过疏水氨基酸相隔连接而成45肽的多聚物[Patarroyo，M.E.，et al，induction ofprotective immunity against experimental infection with malaria suing Syntheticpeptides，Nature，328：629，1987]。该疫苗在夜猴攻击试验中曾取得了较好的免疫保护效果，但后来在非洲、东南亚及南美洲的现场试验中未能取得理想的临床效果，没有应用价值。该疫苗失败的原因可能是SPf.66只有45肽，而在如此短肽序列中，可能不会有足够的T细胞表位能与多数个体MHC分子结合，导致抗原提呈受阻。
尽管以生物技术为基础的疟疾疫苗研究已进行了近20年，但至今尚无有应用价值的疫苗问世。可见疟疾疫苗的突破仍需进一步确定有疟疾保护作用的候选抗原、弄清提供保护作用的免疫学机理及制定并实施新的疟疾疫苗发展策略。
因此，本领域迫切需要开发抗疟疾的有效免疫原和相关疫苗。
本发明的目的是提供一种用基因工程方法生产融合蛋白。该融合蛋白可作为抗疟疾的有效免疫原而引发免疫应答，从而使免疫接种的个体获得抗疟疾的免疫力。
本发明的一个目的就是提供一种新的可用于疟疾疫苗的免疫原，它是含AMA-1和MSP1抗原的融合蛋白(简称为“AMA-1/MSP1融合蛋白”)，以及含该免疫原的疫苗组合物。
本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产所述AMA-1/MSP1融合蛋白的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包含疟原虫裂殖子顶端膜抗原的氨基酸序列、疟原虫主要裂殖子表面抗原的氨基酸序列、以及位于所述裂殖子顶端膜抗原的氨基酸序列和所述主要裂殖子表面抗原氨基酸序列之间的连接肽。
更佳地，所述的融合蛋白包含SEQ ID NO：1、2或3中所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明的上述融合蛋白。
在本发明第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体，以及含所述载体的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种产生本发明的融合蛋白的方法，它包括步骤：
在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和
分离所述的融合蛋白。
在本发明的第五方面，提供了一种疫苗，它含有本发明所述的融合蛋白或编码DNA分子。
在本发明的第六方面，提供了一种抗体，它特异性地结合于本发明的融合蛋白。
在本发明的第七方面，提供了一种构建抗疟疾多价疫苗的方法，它包括步骤：将疟原虫具有构象的多个抗原或其功能域融合为一个融合蛋白分子。具体地，它包括以下步骤：(1)将疟原虫的多个抗原或其功能域(尤其是具有构象的抗原或功能域)融合为一个融合蛋白分子(其中在相邻抗原或功能域之间插入连接肽)，从而得到其氨基酸序列；(2)根据所述的氨基酸序列，设计出其核苷酸编码序列；(3)合成所述的核苷酸编码序列(并可任选地根据密码子偏好等对该编码序列进行改造)；(4)将所述的核苷酸编码序列导入宿主细胞，获得转化的宿主细胞；(5)在适合表达的条件下，培养所述的转化的宿主细胞，以表达该融合蛋白；(6)分离或纯化出所述的融合蛋白，以用作抗疟疾多价疫苗。
在附图中，
图1：PfCP-1(图1A)和PfCP-2(图1B)融合蛋白示意图及其N和C末端序列。AMA-1膜外区可分为三个区域，即I、II、III区。MSP1-19是MSP1 C末端19KD区域。MCS是含有8个单一酶切点的多克隆位点，用于插入其它抗原基因。H是接点序列，由Gly-Pro-Gly重复序列组成，用于防止两个蛋白在构象上的相互影响。
图2是融合抗原基因PfCP-1(图2A)和PfCP-2(图2B)的合成策略示意图。
图2A：PfCP-1基因的合成：1997bp PfCP-1基因分成4个片段分别合成，这四个片段名称及长度分别是：PfCP-1a，512bp；PfCP-1b，629bp；PfCP-1c，575bp；PfCP-1d，395bp。每个片段5′和3′分别加上Xho I和EcoRI位点用于基因片段的克隆。各合成片段克隆在pBluscript载体进行序列分析。各片段通过图示ScaI、Hind IIIT，kpnI位点连接成全长PfCP-1基因。
图2B：PfCP-2基因合成：设计一对引物分别位于PfCP-1 AMA-1(III)的起始处(Pa)和3′末端(Pb)，用PCR方法扩增获得。
图3是全长PfCP-1基因的琼脂糖凝泳图。用XhoI和EcoRI酶切后，电泳显示PfCP-1合成基因及载体条带(泳道1)。
图4是pPIC9k/PfCP-1重组表达质粒示意图。
图5是pPIC9k/PfCP-2重组表达质粒示意图。
图6是免疫印迹法检测PfCP-1的表达的电泳图。其中，泳道2为诱导前的培养上清，泳道1为诱导72小时后的上清。用识别MSP1-19构象表位的单克隆抗体mAb5.2和抗鼠IgG二抗体进行检测。
图7是SDS-PAGE测定PfCP-2的表达。在诱导前Ohr及诱导后24、48、72和96小时取培养上清10μl进行SDS-PAGE分离和拷马斯亮兰染色。在32KD处出现两条目的蛋白。N-末端氨基酸序列分析显示：位于下面的条带其N-末端缺失9个氨基酸残基。
图8显示了一组单抗与PfCP-2的反应。ZP10、IE1、2.2、111.2 12.8T和5.2单抗均为识别构象表位特异性单抗，9.8单抗为阴性对照，PCAB为免抗AMA-1多抗。“-”示样品中无β-巯基乙醇，“+”示样品中加β-巯基乙醇。等量PfCP-2表达上清上样每个泳道并进行电泳分离和转膜，用以上抗体和相应二抗进行反应和显色。
图9是纯化的PfCP-2重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。表达上清分离后，用Ni柱和HPLC凝胶层折两步纯化，经SDS-PAGE和HPLC测定，目的蛋白纯度大于98％。各泳道分别为：泳道1，10μg；泳道2，20μg；泳道3，30μg。
图10显示了用ELISA法测定免疫兔血清PfCP-2特异IgG的水平。各组分别为ISA720佐剂；ISA720佐剂+PfCP-2；ISA720佐剂+变性PfCP-2；福氏佐剂；福氏佐剂+PfCP-2；
图11显示了用IFA法测定免疫兔血清PfCP-2特异IgG的水平。各组分别为：ISA720佐剂；ISA720佐剂+PfCP-2；ISA720佐剂+变性PfCP-2；福氏佐剂；福氏佐剂+PfCP-2。
图12显示了用ELISA法测定免疫兔血清抗AMA-1和MSP1特异IgG的水平。分别用大肠杆菌表达并进行复性的AMA-1和在酵母中表达的MSP1-19为抗原测定各自特异抗体，其中横坐标系不同剂量PfCP-2抗原免疫家兔的免疫血清；纵坐标系Elisa法测定的抗体滴度(效价)。
图13显示了免疫血清抑制疟原虫体外生长效率-1。其中各组分别是：1.福氏佐剂+PfCP-2(15％血清浓度)2，福氏佐剂。
图14显示了免疫血清抑制疟原虫体外生长效率-2。其中各组分别是：1，ISA720佐剂；2，ISA720佐剂+PfCP-2。
图15显示了免疫血清抑制疟原虫体外生长效率-3。其中各组分别是：1，ISA720佐剂+PfCP-2；2，ISA720佐剂+变性PfCP-2。
图16显示了免疫血清抑制疟原虫体外生长效率-4。其中各组分别是：1，ISA720佐剂；2，ISA720佐剂+PfCP-2；3，ISA720佐剂+变性PfCP-2；4，福氏佐剂+PfCP-2；5，福氏佐剂。
研究已表明，疟原虫生活史复杂，抗原有期特异性。另一方面，疟原虫存在严重抗原变异。基于这些特点，一个有效并能持续应用的疟疾疫苗应包含多个疟原虫保护性抗原，由此产生的免疫力能实行多方面攻击。这样，既使有少数疟原虫由于抗原变异等原因而逃避了第一道防线的免疫攻击而幸存下来，这些原虫还会受到以后各道防线的攻击，直至所有原虫被消灭。目前列为疟疾疫苗候选抗原已有20余个蛋白。但有人将其中7个候选抗原混合组成一个多价疫苗，并进行临床试验。在35个自愿者中，经恶性疟攻击感染，只有1个获得保护。经检测免疫个体对每个抗原的抗体滴度相当低。这可能是多个抗原同时免疫会产生各抗原间相互作用，从而影响机体对各抗原的免疫应答反应。
疟疾疫苗另一个实际问题是人体MHC分子多态性。由于人体MHC分子的多态性，使得一些抗原不能与某些机体MHC分子结合，导致抗原递呈受阻，出现免疫个体无反应现象。为确保疫苗在绝大多数个体中得到有效递呈，需在现有疟原虫抗原中鉴定出能识别多数人MHC分子的多反应表位，并掺入疫苗，或将多个抗原掺入组成一个融合抗原以克服单抗原中缺乏足够与MHC分子结合的T细胞表位。
总而言之，一个有效疟疾疫苗需有多个抗原的掺入，而将多个抗原简单的混合则不能产生有效的免疫应答。为此，本发明人经过广泛而深入研究，从另一途径构建多价疫苗抗原，即从现有候选抗原中确定其保护性免疫功能域，然后将这些功能域进行组合成一个融合蛋白，并从DNA水平全合成该蛋白基因及表达该重组蛋白。通过加入间隔序列，使该融合蛋白功能域能维持天然构象。结果发现，含有主要裂殖子表面抗原(MSP1)和裂殖子顶端膜抗原(AMA-1)的融合蛋白可有效地引起免疫应答。在此基础上完成了本发明。
本发明的融合蛋白涉及两个恶性疟原虫抗原，一是主要裂殖子表面抗原(MSP1)，另一个是裂殖子顶端膜抗原(AMA-1)，这两个抗原均是当今重要的疟疾疫苗候选抗原。用从恶性疟原虫提取的MSP1加以免疫的夜猴，能完全保护后来同种疟原虫的攻击感染[Siddiqui，W. A.et al，Merozoite surface coat precursor proteincompletely protects Aotus monkeys against plasmodium falciparum malaria.Proc.NatlAcad.Sci USA，84：3014，1987]。很多实验证据表明，MSP1 19KD C-末端片段(MSP1-19)是该抗原保护性免疫的功能域。MSP1-19免疫血清及单抗均能抑制疟原虫体外生长。该区域含有10个半胱氨酸残基，形成两个表皮生长因子(EGF)样区域。用重组MSP1-19免疫的夜猴亦能保护后来的攻击感染。
AMA-1是分子量约60KD的膜蛋白，该蛋白膜外区(ectodomain)的免疫血清能抑制疟原虫体外生长。用鼠疟原虫AMA-1同类物(analoge)免疫的小鼠亦能保护免受同种疟原虫的攻击感染。AMA-1含有16个保守的半胱氨酸残基，形成3个二硫键连接的区域，其中区域III[AMA-1(III)]在序列上非常保守，推测新入侵的裂殖子仍带有该区域序列，可能参与裂殖子入侵。
研究结果表明，AMA-1和MSP1-19的免疫保护作用均依赖于该抗原二硫键形成的构象。经还原剂加烷化剂处理的抗原均不能产生有效免疫保护作用。因此，将这两个抗原融合为一个分子的关键是维持各抗原的天然构象。
本发明已构建了AMA-1/MSP1-19(定名为PfCP-1)和AMA-1(III)/MSP1-19(定名为PfCP-2)两个融合抗原，并在毕氏酵母中分泌表达该抗原，经分折其构象非常接近天然构象。该抗原具有很强的免疫原性，其Elisa滴度超过400万。该融合抗原的抗体能识别AMA-1和MSP1抗原。该融合抗原的免疫血清经6.7倍稀释后能完全抑制疟原虫生长。
如本文所用，术语“裂殖子顶端膜抗原和主要裂殖子表面抗原的融合蛋白”、“AMA-1/MSP1融合蛋白”等可互换使用，都指由疟原虫主要裂殖子表面抗原的氨基酸序列和疟原虫主要裂殖子表面抗原氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外，裂殖子顶端膜抗原和主要裂殖子表面抗原的融合蛋白包括含有或不含有信号肽，含有或不含有起始甲硫氨酸的融合蛋白。
如本文所用，术语融合蛋白中“疟原虫裂殖子顶端膜抗原(AMA-1)氨基酸序列”指在本发明融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的疟原虫AMA-1及其片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然疟原虫AMA1基本上相同的抗原活性。优选的疟原虫AMA-1氨基酸序列包括(但并不限于)：天然的AMA-1的氨基酸序列，AMA-1的整个外膜区氨基酸序列，AMA-1的区域III的氨基酸序列，AMA-1区域I-III的氨基酸序列，及其消除了糖基化位点的氨基酸序列。
如本文所用，术语融合蛋白中“主要裂殖子表面抗原(MSP1)氨基酸序列”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的疟原虫主要裂殖子表面抗原具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然MSP1基本上相同的免疫刺激活性。优选的疟原虫MSP1氨基酸序列包括(但并不限于)：天然的MSP1的氨基酸序列，MSP1 19KD C-末端的氨基酸序列，及其消除了糖基化位点的氨基酸序列。
AMA-1和MSP1抗原及其类似物的氨基酸序列可以来自人疟原虫(例如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫等)，及动物疟原虫(如小鼠疟原虫、猴疟原虫等)不同疟原虫。
AMA-1氨基酸序列和MSP1氨基酸序列的连接方式及前后次序没有特别限制，例如头尾相连、头头相连、或尾尾相连。
如本文所用，术语“连接肽”(linker)指位于AMA-1氨基酸序列和MSP1氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度没有特别限制。连接肽的长度也可为0，此时AMA-1氨基酸序列和MSP1氨基酸序列直接相连。通常，连接肽不影响或不显著影响AMA-1氨基酸序列和MSP1氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。一些连接肽的例子包括(但并不限于)：
较佳地，所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a)疏水性氨基酸Gly和Pro构成的3-15个氨基酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro：
(b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常为5-20个，较佳地10-20个氨基酸，其例子包括(但并不限于)：TGLQPTRGIDDITSPVD；
(c)除裂殖子顶端膜抗原和主要裂殖子表面抗原之外的疟原虫抗原的氨基酸序列，例如疟原虫环子孢子蛋白，TRAP，175Kd红细胞结合蛋白等；
(d)由(a)、(b)和(c)组合形成的氨基酸序列。一种由(a)和(b)组合成的连接肽是GPGPGTGLQPTRGIDDITSPVDGPGPGP。
此外，在AMA-1/MSP1融合蛋白的N端或C末端还可添加其他不影响AMA-1和MSP1免疫原性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点(Glu-Lys-Arg))，或可促进AMA-1/MSP1融合蛋白的免疫原性(例如细胞因子的序列，如：干扰素，白细胞介素等)。
编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得AMA-1和/或MSP1的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
为了提高宿主细胞的表达量，可以对AMA-1/MSP1融合蛋白编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。在本发明的一个实施例中，就采用酵母偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对AMA-1/MSP1融合蛋白基因进行检测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等。并在该基因核苷酸第494、1085和1621位分别掺入ScaI、HindIII和KpnI单一酶切位点以利于基因的克隆和拼接。
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是酵母细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。
另一方面，本发明还包括对AMA-1/MSP1融合蛋白具有特异性的抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于AMA-1/MSP1融合蛋白或片段。较佳地，指那些能与AMA-1/MSP1融合蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的AMA-1/MSP1融合蛋白结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的AMA-1/MSP1融合蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达AMA1/MSP融合蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
多克隆抗体的生产可用AMA-1/MSP1融合蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于福氏佐剂等。
在本发明的另一方面，提供了含有本发明融合蛋白作为免疫原的疫苗。本发明的疫苗主要是预防性的(即预防感染)。
这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脱氧核糖核酸)，通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)ISA720佐剂；(3)福氏佐剂等。
疫苗组合物(包括抗原，药学上可接受的载体和/或佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。此外，包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物可含有在药学上可接受载体中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或乳化液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。
常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服、栓剂和透皮应用等。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。
一种疫苗方式是DNA疫苗，即含有编码本发明融合蛋白的编码序列的DNA疫苗。
本发明的优点在于：
(1)在AMA-1/MSP1融合蛋白中，AMA-1和MSP1-19融合为一个分子后，其构象非常接近各自的天然构象，至少6个单抗的构象表位与天然蛋白完全一致。
(2)AMA-1/MSP1融合蛋白的表达产物能分泌到胞外，并进入无蛋白培养上清，便于分离纯化，纯度可达98％以上。
(3)AMA-1/MSP1融合蛋白的表达水平高。尤其是PfCP-2的表达水平极高，摇瓶表达量为840mg/L，而15-L罐发酵表达产量可达2,600mg/L。
(4)AMA-1/MSP1融合蛋白具有很高的免疫原性，其Elisa抗体滴度大于400万，且该抗体包含AMA-1和MSP1特异抗体。
(5)AMA-1/MSP1融合蛋白的免疫血清具有很强抑制疟原虫体外生长的作用。该免疫血清经体外6.7倍稀释后能抑制98％以上疟原虫生长。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 PfCP-1和PfCP-2基因的合成
1.融合抗原的设计
本发明融合抗原的序列来自恶性疟原虫3D7株AMA-1膜外区和MSP1-19的氨基酸序列。在两个抗原之间插入：(1)由疏水氨基酸Gly和Pro组成的接点序列，其作用是减少两个抗原间的相互作用，维持各抗原的天然构象；(2)8个单一的限制性酶切位点，以便今后可插入其它抗原基因。此外，在融合抗原的N端增设XhoI克隆位点和酿酒酵母α-因子信号肽切割序列。鉴定出该抗原序列中三个潜在糖基化位点，并通过将氨基酸Asn转为Ala而排除这三个糖基化位点。这样，PfCP-1融合抗原由660个氨基酸组成，而PfCP-2融合抗原由260个氨基酸组成。图1显示两个抗原示意图及N和C序列。
2.融合抗原基因的设计
选用酵母密码子使用频率，将PfCP-1氨基酸序列逆转录成DNA序列，产生PfCP-1合成基因。表1比较了天然和人工合成PfCP-1基因密码使用频率。采用计算机DNA软件对该基因进行检测，并排除在该基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等。在该基因核苷酸第494、1085和1621位分别掺入ScaI、HindIII和KpnI单一酶切位点用于该基因的克隆和拼接(图2)。PfCP-1合成基因的全长为1997bp而PfCP-2为797bp。
3.融合抗原基因的合成
PfCP-1基因的构建：
1997bp PfCP-1基因序列分成4个片段，分别定名为PfCP-1a、PfCP-1b、PfCP-1c和PfCP-1d。前一个片段的3′端与后一个片段的5′端有部分序列重叠，并含有一个单一酶切位点(图2，A中箭头所指处)用于两片段的连接。这样在该基因核苷酸第494、1085、和1621位分别设有Scal、HindIII和KpnI三个单一酶切位点(图2，A)
512bp PfCP-1a片段由8条寡核苷酸链拼接而成。相邻两条链设有18～20bp的重叠区。用PCR方法将8条链拼接成双链DNA分子。PCR扩增条件为：95℃10秒(变性)、55℃30秒(退火)和72℃1分30秒(延伸)，每次25个循环。PCR产物用1％琼脂糖胶分离，并用Qiagen DNA回收试剂盒分离目的基因。用XhoI和EcoRI双酶切目的基因片段，酶切条件为：在20μl反应体系中含有2μg目的基因片段，1×酶切缓冲液，XhoI及EcoRI酶各5单位，37℃反应1小时。酶切片段与经同样酶切的pBluscript载体连接，并转化感受态DH5α大肠杆菌。抽提氨卞青霉素抗性菌落的质粒DNA，经双酶切鉴定为正确插入后进行DNA序列分析。在所测3个克隆中，有一个克隆的序列无任何错误碱基。用类似方法获得序列正确的PfCP-1b、PfCP-1c和PfCP-1d。用XhoI/ScaI，ScaI/HindIII、HindIII/KpnI和KpnI/EcoRI内切酶分别出pfcp-1a、pfcp-1b、pfcp-1c和pfcp-1片段，回收上述4个片段，并与经与XhoI/EcoRI切开的载体连接，产生1997bp全长PfCP-1合成基因，它编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的融合蛋白。
将含该基因的质粒转入大肠杆菌DH5α，经反复接种培养后，回收该质粒并进行序列分析，结果在PfCP-1基因中无发现碱基突变。表明该合成基因能稳定存在大肠杆菌中。
为使PfCP-1基因能在毕氏酵母中分泌表达，将该基因5′端进行修饰，即加上编码Iys和Arg两个氨基酸的DNA序列，这两个氨基酸是α-因子信号肽切割位点的序列。此外，该基因的3′端含或不含编码6×His的DNA序列，产生两种类型PfCP-1，即PfCP-1-his和PfCP-1+his。在PfCP-1基因的5′及3′端分别含有XhoI及EcoRI位点用于该基因克隆入表达载体。
                    表1  PfCP1密码子使用频率比较
         密码子使用频率(％)                    密码子使用频率(％)
氮基   密码  Pfcp-1  PfcP-1   YSC        氨基    密码    Pfcp-1  Pfcp-1    YSC
酸      子    天然   合成   编码序列     酸       子      天然    合成   编码序列
Ala     GCA    43     21       24        Leu      CTC       0       3       5
        GCC    8      2        24                 CTG       0       3       10
        GCG    0      0        1                  CTT       16      0       11
        GCT    49     77       43                 TTA       73      39      27
                                                  TTG       10      55      34
Arg     AGA    79     82       53
        AGG    8      5        18        Lys      AAA       90      61      53
        CGA    4      0        5                  AAG       10      39      47
        CGC    0      0        0
        CGG    0      0        0         Met      ATG       100     100     100
        CGT    8      14       16
                                         Phe      TTC       21      60      45
Asn     AAC    21     28       44                 TTT       79      40      55
        AAT    79     72       56
                                        Pro      CCA       64      73      47
Asp     GAC    12     13       37                 CCC       8       0       13
        GAT    88     87       63                 CCG       3       2       10
                                                  CCT       26      24      29
Cys     TGC    14     7        32
        TGT    86     93       68        Ser      AGC       11      0       10
                                                  AGT       27      3       15
Gln     CAA    87     74       72                 TCA       47      22      20
        CAG    13     26       28                 TCC       4       5       18
                                                  TCG       2       2       9
Glu     GAA    95     84       73                 TCT       9       68      30
        GAG    5      16       27
                                         Thr      ACA       52      21      28
Gly     GGA    42     11       17                 ACC       3       3       23
        GGC    10     5        16                 ACG       7       3       12
        GGG    0      3        10                 ACT       38      72      37
        GGT    48     82       57
                                         Trp      TGG       100     100     100
His     CAC    22     21       39
        CAT    78     79       61        Tyr      TAC       10      30      48
                                                  TAT       90      70      52
Ile     ATA    30     6        23
        ATC    14     27       29        Val      GTA       54      7       17
        ATT    57     68       49                 GTC       11      19      24
                                                  GTG       4       0       17
Leu     CTA    0      0        13                 GTT       32      74      42
PfCP-2基因的构建：
合成一对引物，5′引物序列为5′-ccg ctc gag aaa aga caa caa tca tct tac att g-3′，位于PfCP-1基因核苷酸第1234位；3′引物序列为5′-cg gaa ttc cta tta atg atg atg atg atgatg att aga gga aga gca gaa g-3′，位于PfCP-1基因3′端。以PfCP-1基因为模板，用以上引物进行PCR反应，获得797bp PfCP-2基因，该基因编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的融合蛋白(带有6个His尾部序列以便纯化)。将该基因克隆入pBluscript载体进行序列分析。证实无错误序列的PfCP-2基因用于表达研究。
此外，还用相同方法构建了不带6个His尾部的PfCP-2基因，该基因编码SEQID NO：3所示氨基酸序列的融合蛋白。其中所用的3′端引物是5′-cg gaa ttc cta tta attaga gga aga gca gaa g-3′，而5’端引物同上。
实施例2.PfCP基因在毕氏酵母中分泌表达
2.1：表达载体的构建
PfCP-1或PfCP-2基因通过XhoI和EcoRI位点插入到pPIC9酵母表达质粒(购于lnvitrogen公司)。这样，PfCP的N端与该载体上酿酒酵母α-因子信号肽C末端融合。由于PfCP分子N端含有该信号肽切点三个特异氨基酸Glu-Iys-Arg序列。故分泌表达释放的目的蛋白不含信号肽序列。
pPIC9K载体的基本元件与pPIC9相同，但它带有卡那霉素抗性基因，可用G418进行高拷贝插入子的筛选。这样，用BamHI和SalI将含PfCP-1片段切出并插入在pPIC9K表达质粒的相应位点中，构建成pPIC9K/PfCP-1(图4)。用类似方法还构建pPIC9K/PfCP-2重组表达质粒(图5)。
2.2：转化毕氏酵母SMD1168
用SalI将pPIC9K/PfCP-1及pPIC9K/PfCP-2质粒线性化，10μg线性化表达质粒电转化SMD1168毕氏酵母。转化菌先用组氨酸缺陷平板筛选His+转化子，然后用不同浓度G418平板筛选多拷贝插入的转化子。抽提不同转化子的基因组DNA，用一对目的基因内部引物PCR加以鉴定，表明表达质粒插入酵母染色体。经鉴定有插入的转化子进行以下表达研究。
将获得的毕氏酵母工程菌(Pichia sp.PfCP-1)于2000年11月22日保藏中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为CCTCC NO：M200026。
2.3：表达
转化子先接种在以甘油为碳源的培养基中，生长24小后，转接到以甲醇为碳源的培养基中。进行诱导表达。每24小时取样、检测表达产物上清和细胞沉淀。SDS-PAGE和拷马斯亮兰检测结果显示：在32kD处有明显的PfCP-2表达条带，该表达带只在甲醇诱导后出现，并随表达时间延长，其表达产物明显增加(图7)。用特异性单抗mAb5.2检测表达产物，结果为：除32kD目的蛋白外，还出现PfCP-2二聚体及四聚体的反应条带(图7，B)。此外，目的蛋白含有两条带，经N-末端氨基酸序列分析显示低分子量条带的N-末端缺失9个氨基酸残基。免疫印迹法检测PfCP-1分泌表达，在72kD处可见明显的目的蛋白反应条带(图6)，但在考马斯亮兰染色的凝胶上只见很浅条带。
实施例3 AMA-1/MSP1融合蛋白表达产物与一组单抗反应性
AMA1和MSP1-19含有丰富半胱氨酸，可形成多对二硫键。此外，这两个抗原的免疫保护作用需要正确的，二硫键依赖的构象。因此，将这两个抗原融合为一个分子后是否会改变各自构象已成为本发明的关键。对此，在该实施例中，用一组单克隆抗体与PfCP-1和PfCP-2进行反应，以验证AMA-1/MSP1融合蛋白的抗原性。
共有13个单抗与PfCP-1反应，其中10个单抗识别构象表位。表达产物先用非还原条件SDS-PAGE分离，并转移至硝酸纤维膜，分别与13个单抗反应，再与碱磷酶标记的二抗反应，毕后与底物进行显色反应。结果显示，所有13个单抗均能与表达产物反应(表2)。
                      表2  一组单克隆抗体与PfCP-1的反应性
                  PfCP特异性抗体 Western印迹
  抗原    特异性   单克隆抗体编号   表位类型   相互作用区域   毕氏酵母
  MSP-1    保守        5.2   构象型     MSP1-19       +
       12.8   构象型     MSP1-42       +
       12.10   构象型     MSP1-19       +
       2.2   构象型     MSP1-19       +
       6.1   构象型     MSP1-42       +
       1E1   构象型     MSP1-19       +
       2F10   构象型     MSP1-19       +
       8A12   构象型     MSP1-19       +
       111.4   构象型     MSP1-19       +
       111.2   构象型     MSP1-19       +
  AMA-1     3D7        1F9     AMA-1       +
    3D7        2C5     AMA-1       +
    3D7        5G8     AMA-1       +
在还原和非还原两种条件下测定PfCP-2与6个识别空间构象表位单抗的反应性。还原条件是在样品中加入6％β-巯基乙醇。同样量样品上样每个泳道，并按上述方法检测反应。结果为所有6个单抗在非还原条件下能与PfCP-2反应，而在还原条件下失去反应性(图8)。
结论：AMA-1和MSP1-19融合为一个分子后，其构象非常接近各自的天然构象，至少以上单抗的表位与天然蛋白完全一致。
实施例4 AMA-1/MSP1融合蛋白发酵与纯化
经对表达条件的优化研究，摇瓶表达水平可达840mg/L。用15-L罐进行发酵表达，在整个发酵周期中，前期的细胞呈指数生长上升，细胞密度达OD600＝112.5。到甘油添加生长期，细胞生长呈直线上升，细胞密度达到OD600＝660。但到了甲醇诱导表达阶段，细胞总密度基本保持不变，而目的蛋白表达是在甲醇加入后3-7hr开始，并随时间延长，表达产率迅速提高，并不断分泌到发酵液中。在诱导后53hr，其表达量可达2,600mg/L。
PfCP-2表达产物的纯化分两步进行：第一步是用Ni-NTA柱纯化。由于PfCP-2C末端含有6×His序列，故表达产物可结合到Ni-NTA亲和柱上，并用250mM咪唑洗脱目的蛋白。第二步是用凝胶过滤液相法纯化。经两步纯化的蛋白纯度可达98％(图9)。
实施例5 PfCP-2免疫家兔
在该实施例中，用纯化的PfCP-2为抗原，用福氏和ISA720为免疫佐剂免疫家兔，实验分为5组，第一组为ISA720佐剂对照；第二组为ISA720+PfCP-2；第三组为ISA720+变性的PfCP-2；第四组为福氏佐剂+PfCP-2和第五组为福氏佐剂对照。免疫分4次进行，每次免疫分别在第0、12、28、和42天进行。每次免疫前及免疫结束后第7天取血测定特异抗体水平。具体方法如下：
PfCP-2抗原与福氏完全佐剂按1∶1(V/V)混合，并乳化。该抗原与ISA720佐剂按3∶7混合，用注射器抽吸乳化至均匀。PfCP-2抗原变性处理按以下方法进行：抗原溶液与固体尿素混合，使终浓度为8M，置50℃水浴60min，加入DTT使其终浓度为20mM，置50℃水浴6hr；再加入碘乙酸钠使其终浓度为60mM，置室温60min，毕后用0.1M pH7.5硼酸缓冲液(100mM硼酸、137mM NaCl，调pH至7.5)透析过夜。免疫剂量，初次免疫为800μg，第二及第三次加强免疫的剂量为400μg，最后一次用200μg免疫。采用皮下多点注射。四次免疫注射时间分别在D0、D12、D28和D42。在首次免疫后D10、D26、D39和D47取血测定抗体ELISA及IFA滴度(图10，11)。
ELISA按以下程序进行：采用表达PfCP-2或恶性疟原虫全虫蛋白为抗原，每孔包被量为0.1μg，加入不同稀释度的抗血清100μl，每份稀度血清样本重复三孔，经37℃反应1hr和洗涤后，加入酶标二抗，用TMD底物显色，并读取450mMOD值。用免疫前血清确定阳性阈值，大于该值的稀释度为抗血清阳性最终滴度。
Elisa结果显示，两种佐剂对照组没有产生特异抗体，其余3组均产生明显的特异抗体(图10)。用培养的恶性疟原虫为抗原进行间接荧光抗体试验，第二和四组兔子有明显的特异抗体水平，抗体滴度分别为1∶10240和1∶2560，而第三组抗体水平较低(1∶640)，其余两个对照组为阴性(1∶＜40)(图11)。用ELISA法测定PfCP-2免疫兔血清抗AMA-1和MSP1-19特异IgG的水平，其中分别用大肠杆菌表达并进行复性的AMA-1和在酵母中表达的MSP1-19为抗原测定各自特异抗体。结果表明，该兔免疫血清可特异性地与AMA-1和MSP1-19结合(图12)。
实施例6 对疟原虫的体外抑制试验
用于本实验的恶性疟原虫FCC1/HN株取自海南省。培养按国际上通用的Trager氏蜡烛缸法进行，并按以下公式计算抑制原虫生长率(抑制率)
Figure C0110529200191
具体方法如下：恶性疟原虫FCCl/HN株按Trager和Jansen氏方法进行体外培养，每天更换培养液，每四天添加红细胞。用于抑制试验的原虫需经过同步处理，即在实验前24小时，含有各期的疟原虫与5％山梨醇混合，置室温30min。经此处理的原虫只含环状体时期的原虫。再继续培养24小时，绝大部分已发育到裂殖体。将此时的原虫配制成2％细胞压积和0.5％的原虫感染率。按实验需要加入不同量抗血清，配制成不同抗血清浓度的起始培养物。以每孔200μl将该培养物置96孔平板中，培养24hr或72小时后，制作薄血膜、吉氏染色，用显微镜计数原虫率。
抗血清制备：用灭菌注射器从免疫家兔心脏取血，置灭菌离心管中，待血液凝固，血凝块逐渐缩小溢出血清后，离心回收血清，分离的血清经56℃ 30min灭活及过滤除菌后用于上述抑制试验。
除去IgG抗血清的制备：用蛋白A吸附法除去抗血清中的抗体。装填一支蛋白A-Agarose层折柱，按厂家说明书对该柱进行预处理。加抗血清于柱上，收集滤过液，反复过柱直至在SDS-PAGE拷马期亮兰染胶上未能见到IgG条带。同时洗脱结合在柱上的IgG。体外抑制试验结果(见图13-16。福氏佐剂或ISA720佐剂与PfCP-2抗原的免疫血清经6.7倍稀释后能抑制98％以上原虫的生长，且这种作用是依赖于PfCP-2正确的空间构象和特异性抗体。
结果如下：
(1)用福氏佐剂+PfCP-2免疫的血清能抑制96.63％原虫生长，而只用福氏佐剂组无明显抑制作用(IR：6.41％)。(图13)
(2)ISA720+PfCP-2免疫血清抑制疟原虫生长效率为98.32％，有鉴于只用ISA720佐剂对照组无明显抑制作用(IR：0.69％)。(图14)
(3)用8M尿素和DTT变性PfCP-2蛋白，再用烷化剂进行烷化处理。经此变性处理的PfCP-2与ISA720免疫产生的抗血清完全失去抑制疟原虫生长作用(IR：0％)。(图15)
(4)用蛋白A柱除去各免疫血清中IgG，并测定这种无IgG的免疫血清的抑制恶性疟原虫体外生长作用。结果显示：ISA720+PfCP-2和福氏佐剂PfCP-2组的免疫血清，在去除IgG后失去原有的抑制作用，其抑制率从原来的98.32％和96.63％分别降为0％和12.7％(图16)。
以上抑制试验结果表明：(1)PfCP-2产生的免疫血清经6.7倍(15％血清含量)稀释后能完全抑制疟原虫体外生长(＞98％的抑制率)，且这种抑制作用是抗体介导的，因为去除抗体的免疫血清失去原有的抑制作用；(2)福氏佐剂是作用很强的免疫佐剂，但只能用于动物的免疫试验。ISA720佐剂是由法国赛比克公司研制的新型佐剂，现已批准人体应用。本结果显示，ISA720和PfCP-2联合免疫产生的抗体水平至少不低于福氏佐剂和PfCP-2抗体水平。这为PfCP-2疫苗的人体试剂寻找到合适的佐剂；(3)PfCP-2的免疫保护作用是依赖于该抗原正确的构象，经变性处理的抗原不能诱导保护性抗体。这样，有效的PfCP-2重组疫苗需要产生具有天然构象的表达产物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
                                         序列表
(1)一般信息：
  (ii)发明名称：疟原虫融合抗原及其制法和用途
  (iii)序列数目：3
(2)SEQ ID NO：1的信息：
    (i)序列特征：
    (A)长度：654个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：多肽
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
LEKREAEAQN YWEHPYQNSD VYRPINEHRE HPKEYEYPLH QEHTYQQEDS  50
GEDENTLQHA YPIDHEGAEP APQEQNLFSS IEIVERSNYM GNPWTEYMAK  100
YDIEEVHGSG IRVDLGEDAE VAGTQYRLPS GKCPVFGKGI IIENSQTTFL  150
TPVATGNQYL KDGGFAFPPT EPLMSPMTLD EMRHFYKDNK YVKNLDELTL  200
CSRHAGNMIP DNDKNSNYKY PAVYDDKDKK CHILYIAAQE NNGPRYCNKD  250
ESKRNSMFCF RPAKDISFQQ YTYLSKNVVD NWEKVCPRKN LQNAKFGLWV  300
DGNCEDIPHV NEFPAIDLFE CNKLVFELSA SDQPKQYEQH LTDYEKIKEG  350
FKNKQASMIK SAFLPTGAFK ADRYKSHGKG YNWGNYNTET QKCEIFNVKP  400
TCLIQQSSYI ATTALSHPIE VENNFPCSLY KDEIMKEIER ESKRIKLNDN  450
DDEGNKKIIA PRIFISDDKD SLKCPCDPEM VSQSTCRFFV CKCVERRAEV  500
TSNNEVVVKE EYKDEYADIP EHKPTYDKMG PGPGTGLQPT RGIDDITSPV  550
DGPGPGPLQI SQHQCVKKQC PQNSGCFRHL DEREECKCLL NYKQEGDKCV  600
ENPQPTCNEN NGGCDADAKC TEEDSGSNGK KITCECTKPD SYPLFDGIFC  650
SSSN                                                    654
(2)SEQ ID NO：2的信息：
  (i)序列特征：
  (A)长度：260个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
 (ii)分子类型：多肽
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
LEKRQQSSYI ATTALSHPIE VENNFPCSLY KDEIMKEIER ESKRIKLNDN  50
DDEGNKKIIA PRIFISDDKD SLKCPCDPEM VSQSTCRFFV CKCVERRAEV  100
TSNNEVVVKE EYKDEYADIP EHKPTYDKMG PGPGTGLQPT RGIDDITSPV  150
DGPGPGPLQI SQHQCVKKQC PQNSGCFRHL DEREECKCLL NYKQEGDKCV  200
ENPQPTCNEN NGGCDADAKC TEEDSGSNGK KITCECTKPD SYPLFDGIFC  250
SSSNHHHHHH                                              260
(2)SEQ ID NO：3的信息：
  (i)序列特征：
  (A)长度：254个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
 (ii)分子类型：多肽
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
LEKRQQSSYI ATTALSHPIE VENNFPCSLY KDEIMKEIER ESKRIKLNDN  50
DDEGNKKIIA PRIFISDDKD SLKCPCDPEM VSQSTCRFFV CKCVERRAEV  100
TSNNEVVVKE EYKDEYADIP EHKPTYDKMG PGPGTGLQPT RGIDDITSPV  150
DGPGPGPLQI SQHQCVKKQC PQNSGCFRHL DEREECKCLL NYKQEGDKCV  200
ENPQPTCNEN NGGCDADAKC TEEDSGSNGK KITCECTKPD SYPLFDGIFC  250
SSSN                                                    254

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，它包含疟原虫裂殖子顶端膜抗原AMA-1的氨基酸序列、疟原虫主要裂殖子表面抗原MSP1的氨基酸序列、以及位于所述裂殖子顶端膜抗原的氨基酸序列和所述主要裂殖子表面抗原氨基酸序列之间的连接肽，
其中所述的疟原虫AMA-1氨基酸序列选自下组：天然的AMA-1的氨基酸序列，AMA-1的整个外膜区氨基酸序列，AMA-1的区域III的氨基酸序列，AMA-1区域I-III的氨基酸序列，及其消除了糖基化位点的氨基酸序列；
疟原虫MSP1氨基酸序列选自下组：天然的MSP1的氨基酸序列，MSP1 19KD C-末端的氨基酸序列，及其消除了糖基化位点的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a)疏水性氨基酸Gly和Pro构成6个氨基酸序列；
(b)多克隆位点所编码的氨基酸序列；
(c)除裂殖子顶端膜抗原和主要裂殖子表面抗原之外的疟原虫抗原的氨基酸序列；
(d)由(a)、(b)和(c)组合形成的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO：1、2或3中所示的氨基酸序列。
4.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的融合蛋白。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的DNA分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，它是毕赤酵母(Pichia sp.)，保藏号为CCTCC NO：M200026。
8.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞从而表达出所述的融合蛋白；分离所述的融合蛋白。
9.一种抗疟疾疫苗，其特征在于，它含有权利要求1所述的融合蛋白或权利要求4所述的DNA分子。
10.一种抗体，其特征在于，它特异性地结合于权利要求1所述的融合蛋白。
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