CN117529562A - 子宫内膜异位症的诊断中的新型生物标记物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可以被用于子宫内膜异位症的诊断中的新型生物标记物的组合。本发明的目的是检测在子宫内膜异位症的诊断中，在从子宫内膜活组织检查样品中分离的eMSC中与健康eMSC相比差异表达的生物标记物。

Description

子宫内膜异位症的诊断中的新型生物标记物

技术领域

本发明涉及可以被用于子宫内膜异位症的诊断中的新型生物标记物的组合。

背景技术

子宫内膜异位症是定义为子宫内膜组织离开子宫植入到身体的其它部位的疾病，所述子宫内膜组织衬里于育龄女性的子宫内层，并且自青春期起每个月在月经期间于增厚后丧失[1]、[2]。考虑到子宫内膜异位症的患病率，它在10-15％的育龄女性和9-50％的不孕人群中可见，尽管在患有慢性盆腔疼痛和痛经主诉的青少年中，这些值可能增加直到大约50％[3]。临床症状例如头痛[4]、关节痛、肌痛[5]、过敏、甲状腺功能减退、纤维肌痛、慢性疲劳综合征[6]和阴道酵母菌感染易感性[7]在子宫内膜异位症病症中是常见的。与疾病相关的这些症状严重影响女性的日常生活活动，并且降低她们的生活质量[8]，并且此外，这种疾病甚至可能导致女性中的不孕，使她们感到力不从心。在此时，应用用于子宫内膜异位症诊断和治疗的新方法来改善患者的日常生活质量且使患者在心理上缓解是必要的。

文献中的先前研究和由美国生殖医学会(American Society for ReproductiveMedicine)发表的报告已显示了，“腹腔镜检查”，即手术介入，已成为子宫内膜异位症的诊断中的“黄金标准”[9]，但也带来了很多风险。例如，除每一次手术介入的风险之外，还可以列出诸如对腹内器官例如膀胱、肠、输尿管的损害以及后续内出血，降低的卵巢储备伴随对卵巢的损伤以及降低的生育概率的风险作为子宫内膜异位症患者中的风险[10]、[11]。特别地，手术介入在其优先考虑是克服由子宫内膜异位症引起的不孕因素的患者中造成了高风险[11]。尽管作为血清标记物之一的CA125糖蛋白的单克隆抗体被用于子宫内膜异位症的诊断中，但通过研究已证实了该标记物的结果是成问题的并且它的灵敏度很低，尤其是在已扩散到腹膜区域的子宫内膜异位症类型中[12]。

文献中累积的证据提示了，需要替代性诊断方法来代替低灵敏度的目前诊断技术，所述技术具有高成本，并且导致患者在手术后可能经历的并发症，并且妨碍患者在短时间内重返社会生活。按照这些信息，在作为专利申请的主题的研究中，所旨在的是确立对于开发用于子宫内膜异位症的新型诊断技术所必需的生物标记物，所述技术在成本上有效益、无痛且不会因诸如“手术”等概念让患者在心理上疲惫不堪。

子宫内膜异位症疾病以“子宫内膜”命名，并且尽管子宫内膜异位症在1860年得到描述[1]，但其病因和发病机制至今仍不清楚[13]、[14]。在子宫内膜异位症的发病机制中已建立了不同的鉴定表和理论。这些是逆行性月经/移植[2]、[15]，体腔化生[16]，细胞免疫变化[17]、[18]、[19]、[20]，转移[21]，遗传因素[22]、[23]，环境因素[24]以及特定基因与环境的相互作用[25]。二十世纪二十年代提出的最受重视的理论陈述了该疾病由子宫内膜组织通过逆行性月经扩散到腹膜腔内而发展[2]、[18]。呈腹膜下植入物的形式的子宫内膜组织的存在指示了病理状况。这导致回流的子宫内膜组织碎片附着到腹膜表面，随后为侵入的开始和疾病的发展。根据Sampson，在经血中存在仍然存活的活细胞，其必须随着每个月的月经周期被弃去。他提出这些活细胞不是被从体内弃去，而是可以迁移到不同的区域，粘附到它们已迁移的区域和其它邻近器官并增殖[2]。Sampson在他的研究中提到的，并且也是后来文献中进行的研究的主题的人子宫内膜结构，具有由许多不同细胞类型组成的嵌合细胞群体[26]。在这种嵌合结构中，在子宫内膜壁周围存在基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、淋巴样细胞以及平滑肌细胞和间充质干细胞。已假设在发展子宫内膜异位症的女性中，子宫内膜干细胞连同其生态位细胞(niche cell)一起通过逆行性月经脱落到腹膜腔内[27]、[28]、[29]、[30]，并且发现这支持了Sampson的理论。在动物实验研究中，已显示了从取自具有持续月经周期的狒狒的经血中分离的间充质干细胞可以诱导子宫内膜异位症发展的实验环境[31]。粘附和迁移性质在子宫内膜间充质细胞(eMSC)中较高的事实已导致以下观点：组织转谷氨酰胺酶(TG2)丧失其交联性质并且在这些细胞中作为特异性细胞粘附分子高度合成[32]、[33]、[34]、[35]、[36]，并且因此假设应该定位于子宫内膜中的细胞具有迁移到其它位置以产生子宫内膜异位症的能力。根据这一信息，检查并确定了在健康和子宫内膜异位症患者之间eMSC的表面标记物中的差异，所述eMSC在子宫内膜的嵌合结构中是丰富的，并且具有高迁移潜力。

发明内容

本发明的目的是列出与健康eMSC相比，在子宫内膜异位症的诊断中从子宫内膜活组织检查样品中分离的eMSC中差异表达的可能的生物标记物。从其表达在5个患者的eMSC样品中观察到变化的标记物列表中选择的生物标记物也在诊断有子宫内膜异位症的17个患者的子宫内膜异位症病灶组织中进行病理学评估，然后被鉴定为生物标记物。

本发明的另一个目的是开发一种诊断试剂盒，其中单独或组合使用在子宫内膜异位症eMSC中差异表达的组织转谷氨酰胺酶(TG2)、分化簇146(CD146)、血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)、整联蛋白β1和含有Sushi结构域的蛋白质2(SUSD2，或被同义地称为W5C5)标记物的基因或蛋白质表达。

以这种方式，用活组织检查样品做出诊断，来代替目前明确诊断患者中的子宫内膜异位症所需的手术诊断将是可能的。

具体实施方式

为实现上文提到的目的而开发的标题为“子宫内膜异位症的诊断中的新型生物标记物”的本发明在附图中进行说明，其中：

图1.通过流式细胞术对来自取自没有子宫内膜异位症诊断的个体的子宫内膜组织的健康对照子宫内膜间充质干细胞(heMSC)的表征由黑色实心曲线表示，并且±值表示5种不同heMSC的标准差。将与同种型IgG抗体一起温育的细胞用作阴性对照(NC)，并且由空心灰色曲线表示。

图2.通过流式细胞术对来自取自具有子宫内膜异位症诊断的5个不同患者的子宫内膜组织的患者子宫内膜间充质干细胞(peMSC)的表征由黑色实心曲线表示，并且±值表示5种不同peMSC的标准差。将与同种型IgG抗体一起温育的细胞用作阴性对照(NC)，并且由空心灰色曲线表示。

图3.所有分离的eMSC中的TG2蛋白水平。(a).通过蛋白质印迹技术显现五个不同组中的TG2蛋白条带。(b).从五个不同组的不同对照(heMSC)和患者(peMSC)间充质干细胞中分离的TG2蛋白的分析。(c).从五个不同组的不同heMSC和peMSC中分离的TG2蛋白的平均值和统计分析。使用的所有细胞都处于第3代，并且通过非酶促程序分离。P<0.0001的值由****符号表示。

图4.蛋白质印迹结果显示了在所有分离的eMSC中通过shRNA技术沉默的TG2的蛋白质水平。(a).应用于五个不同组中的对照和患者样品的SCR结果和shRNA结果的膜图像。(b).应用于五个不同组中的每个对照和患者样品的SCR和shRNA分析。(c).应用于五个不同组中的对照和患者样品SCR和shRNA分析的平均均值。作为统计分析的结果，统计学不显著的p值由“ns”表示，而显著的p<0.00001值由*****表示。

图5.所有组中的对照(heMSC)和用杂乱shRNA处理的对照(heMSC+SCR)的流式细胞术的平均(±)值和标准差。五个不同的heMSC样品由图中的黑色实心曲线表示，而heMSC+SCR样品由空心灰色曲线表示。

图6.所有组的用含有杂乱的对照慢病毒颗粒处理的peMSC+

shRNA和靶向TG2的shRNA处理的peMSC+shRNA样品的流式细胞术的平均(±)值和标准差。五个不同的heMSC样品由图中的黑色实心曲线表示，而heMSC+SCR样品由空心灰色曲线表示。

图7.tTG2用shRNA的主动(voluntary)和受控沉默对五个不同组中的eMSC样品的平均细胞生长的作用。“ns”被用于统计分析结果的非显著p值，并且*p<0.05、****p<0.00001分别被用于显著值。

图8.用对取自子宫内膜异位症病灶的组织切片的子宫内膜有特异性的表面标记物的免疫组织化学染色的代表性图像。图像显示了CD146(A)、整联蛋白β-1(B)、PDGFR(C)和TG2(D)标记物。比例尺：50μm。

本发明的主题是组织转谷氨酰胺酶(TG2)作为生物标记物用于分离的子宫内膜间充质干细胞中的子宫内膜异位症诊断的用途，所述间充质干细胞衍生自来自子宫内膜异位症患者的子宫内膜活组织检查和/或月经血。与当今子宫内膜异位症的诊断中使用的“腹腔镜检查”方法相比，这种方法是一种非侵入性方法。除此之外，连同组织转谷氨酰胺酶(TG2)一起，选自“分化簇146”(CD146)、“含有Sushi结构域的蛋白质2”(SUSD2，也被同义地称为W5C5)、“整联蛋白β1(ITGB1)”和“血小板衍生的生长因子受体”(PDGFR)标记物的至少一种标记物及其组合，被用作用于分离的子宫内膜间充质干细胞中的子宫内膜异位症诊断的生物标记物，所述间充质干细胞衍生自来自子宫内膜异位症患者的子宫内膜活组织检查和/或月经血。此外，在本发明的范围内开发了子宫内膜异位症诊断试剂盒，其包含与单独或彼此组合的CD146、SUSD2(W5C5)、ITGB1和PDGFR中的一种或多种组合的TG2或本发明的标记物，并且其被用于测量“从子宫内膜活组织检查样品和/或月经血中分离的子宫内膜间充质细胞(eMSC)”中的基因和/或其蛋白质水平。除这些之外，在从月经血中分离的间充质细胞中的本发明的标记物(所述标记物是TG2或其与CD146、SUSD2(W5C5)、ITGB1和PDGFR中的一种或多种的组合)的基因和蛋白质表达水平还可以被用于检测在治疗和治疗过程中使用的药物的成功。鉴于子宫内膜异位症占不孕病例的9％-50％，确定年轻女性由于子宫内膜异位症的不孕风险具有重大意义。考虑到当子宫内膜异位囊肿达到大的尺寸时执行的手术显著降低卵巢储备，在年轻时通过卵母细胞冷冻保存方法保留患者的生育力将由于将在本发明的框架内开发的子宫内膜异位症的早期和容易诊断而变得适用。

子宫内膜异位症以“子宫内膜”命名，其意指衬里于育龄女性的子宫内层，并且每个月在月经期间于增厚后丧失的层。在子宫内膜异位症中，通常应该存在于子宫内层中的类似子宫内膜的组织，在子宫外生长并植入身体的其它部位[37]。由于异位植入的组织含有活的子宫内膜细胞，因此在每一个月经期，它们以与子宫中的细胞相同的方式发挥功能[37]。这些细胞的高粘附和迁移性质可以通过它们在细胞表面上表达的粘附和迁移诱导性表面蛋白质来解释。在文献中，已显示了与从其它器官中分离的间充质干细胞不同，eMS细胞表达CD146、PDGFR、W5C5标记物[38]。我们最近在会议摘要中发表了，除这些标记物之外，组织转谷氨酰胺酶(TG2)蛋白也在eMS细胞中表达[39]。在我们的会议摘要中，分析了TG2酶活性和mRNA水平连同粘结蛋白聚糖(syndecan)-4和整联蛋白β1的水平，并且在从健康个体和患者中分离的eMS细胞中确定了TG2对基质金属蛋白酶(metaproteinase enzyme)活性的作用。在我们作为我们的会议摘要的延续进行且是本专利申请的主题的实验室研究中，已显示了增加的TG2不仅控制CD146、SUSD2(W5C5)、ITGB1和PDGFR的蛋白质表达，而且还促进来自五个子宫内膜异位症患者的eMSC中的eMSC增殖。另外，在从子宫内膜异位症组织中获得的17个活组织检查样品中，TG2连同CD146、ITGB1和PDGFR的上调也是显而易见的。如同该家族的其它成员，人组织转谷氨酰胺酶(TG2，转谷氨酰胺酶家族的一个成员)催化Ca⁺²依赖性蛋白质脱酰胺、转酰胺和交联[40]、[41]。TG2的转酰胺酶活性在基质稳定中发挥细胞外作用，所述基质稳定在伤口愈合、血管生成和骨修复中是必需的，并且一般在细胞凋亡期间的蛋白质交联中发挥细胞内作用[40]。自从在1957年发现TG2以后，它的众多酶促底物已在细胞内区室(包括胞质溶胶、核和线粒体)以及细胞内和细胞外基质(ECM)内的细胞外区室中得到鉴定[42]、[43]、[44]。除Ca²⁺依赖性蛋白质翻译后修饰之外，该酶(也被称为TG2、胞质溶胶II型或肝转谷氨酰胺酶)可以结合并水解GTP，并且像G蛋白那样起作用[41]、[45]。因此，就催化活性而言，由于其催化Ca²⁺依赖性蛋白质交联活性和Ca²⁺不依赖性GTP水解的能力，TG2可以被称为双功能酶[41]、[46]、[47]、[45]、[48]。

在TG2的Ca⁺²依赖性转酰胺基反应中，形成分子间异肽ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸键，并且这导致单体蛋白质单元的内部交联[49]。这些键对化学和物理降解是抗性的；因此，已知它们具有生物学重要性，特别是在细胞外基质(ECM)的稳定方面[50]、[51]。研究已显示了，当在转酰胺基反应中依赖于Ca⁺²水平的TG2在低Ca⁺²量下丧失其交联活性时[36]、[50]、[52]，TG2转变成如G蛋白那样在细胞粘附和迁移中发挥积极作用的蛋白质[41]、[45]。TG2在粘附功能中发挥功能的能力取决于其与两种跨膜蛋白——整联蛋白(β1/β3/β5)和粘结蛋白聚糖的协作，以及作为这种协作的结果的ECM蛋白与粘附受体的非共价结合[50]、[53]。这些受体和TG2本身都与纤连蛋白相互作用[34]、[36]、[50]。在最近的研究中，已提示了TG2通过在细胞外与纤连蛋白(FN)基质蛋白结合而丧失其“交联”酶活性，并且充当作为整联蛋白和粘结蛋白聚糖-4受体的共受体起作用的新型细胞粘附蛋白[32]、[33]、[34]、[35]、[36]。另外，与FN基质蛋白复合的TG2具有预防其整联蛋白受体被阻断且无法与表面结合的细胞经历细胞凋亡的作用[54]，因此在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和胰腺癌中观察到TG2的上调，并且证明了TG2对癌细胞赋予药物抗性和转移性质[55]、[56]、[57]、[58]、[59]、[60]、[61]、[62]。

根据子宫内膜异位症患者中的逆行性月经周期，CD146、PDGFR、W5C5表面标记物是在作为在月经期间子宫内膜细胞的逆流的结果的子宫内膜细胞向腹膜和腹腔中器官的迁移中起作用的其它分子。在我们的专利申请的框架内进行的实验室研究中，比较了从患有子宫内膜异位症的个体中分离的eMSC和从健康个体中分离的eMSC，并且检测到CD146、PDGFR、W5C5表面标记物在子宫内膜异位症eMSC中以比在健康eMSC中更高的比率表达。这些标记物在eMSC中的表达增加显示受TG2控制，其中TG2表达通过shRNA技术得到沉默。

尽管在文献中的许多研究中，展示出免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员CD146(其充当细胞粘附分子(CAM))的表达增加的细胞显示了细胞迁移和侵入潜力的增加[63]、[64]，但除了健康eMSC之外，这种标记物先前尚未在子宫内膜异位症患者中进行研究。除CD146之外，当与健康的子宫内膜间充质干细胞(heMSC)相比时，发现另一种子宫内膜间充质细胞标记物PDFGR在子宫内膜异位症间充质干细胞(peMSC)中过表达，提示了这种标记物在我们的假设中被视为另一个潜在参数。研究已显示了，PDFGR在卵巢癌[65]、[66]、[67]、[68]和子宫癌[69]中是高度表达的，所述癌症在未治疗的晚期子宫内膜异位症病例中发展。在文献中的研究中还陈述了，PDGFR在各种子宫内膜疾病的发展和发病机制期间的各种细胞过程例如细胞增殖、迁移、转化和存活中是必需的[70]、[71]、[72]。然而，尽管已阐明了PDFGR在许多不同的妇科病症的发展中发挥作用，但尚未执行具有/没有子宫内膜异位症的先前诊断的个体的eMSC的比较研究。文献中的这个缺陷覆盖我们发明的另一项原创研究。如按照这一信息所预计的以及通过本发明的结果所显示的，子宫内膜异位症细胞含有比健康细胞更高的PDGFR。除这些标记物之外，另一种标记物是被称为W5C5的抗体，其识别显示对于从健康个体中分离的子宫内膜间充质细胞有特异性的SUSD2蛋白。正如CD146和PDGFR，这种标记物也已知在子宫内膜间充质干细胞中以基础水平表达[38]。Garget等人在他们的研究中显示了，W5C5在子宫内膜异位症患者中的血管周围移植病灶中是高度表达的[73]、[74]。在文献中的另一项研究中，还发现与从健康个体中分离的成纤维细胞相比，W5C5水平在从被诊断有子宫内膜异位症的个体中分离的成纤维细胞中更高[75]。在本发明的范围内进行的从健康和子宫内膜异位症患者中分离的eMS细胞中的W5C5水平的检测从未在文献中进行研究。

在我们发明的框架内，通过我们对子宫内膜异位症和健康eMSC进行的研究已证实了以下：

1.CD146、PDGFR和W5C5的表达在TG2控制下在子宫内膜异位症eMSC中是增加的；和

2.TG2是驱动这些细胞增殖的主要因素。

除我们用子宫内膜MSC中的CD146、整联蛋白β-1、PDGFR、TG2和W5C5标记物的研究之外，还通过免疫组织化学染色方法，在取自处于不同阶段的17个患者的不同区域的子宫内膜异位症病灶中调查了这些标记物的表达水平。个别地评估了组织中的腺体和基质的染色，并且已检测到如我们已在eMSC中显示的，CD146、PDGFR和TG2标记物在所有子宫内膜异位症病灶组织的腺体中表达超过50％，为强烈(++)或非常强烈(+++)(表5)。已检测到在子宫内膜异位症病灶组织中，基质中的CD146、PDGFR和TG2表达低于腺体中。

实验研究

待在实验中使用的细胞组的确定

在我们实验中使用的所有分离的细胞都从诊断有子宫内膜异位症的患者和健康志愿者的组织样品中进行分离。我们研究的伦理委员会申请向叶迪特佩大学人类伦理委员会(Yeditepe University Human Ethics Committee)提出，并且从委员会成员获得决定编号No:63/509的批准。在于我们发明的框架内进行的实验中，研究了取自五个不同的健康人(对照组)和诊断有子宫内膜异位症的五个不同患者的组织样品。在研究中使用的健康组织样品得自49岁以下有生育力的女性，其没有子宫中的子宫内膜息肉、子宫内膜增生症、子宫内膜癌或粘膜下肌瘤，并且并未诊断有子宫内膜异位症。来自健康患者的子宫内膜活组织检查样品在非妇科手术期间从有生育力的个体中收集，所述个体并未患有在盆腔腹膜和器官中的子宫内膜异位症。

患者样品从49岁以下的女性中进行自愿收集，所述女性根据美国生殖医学会(ASRM)分类系统确诊为中度或重度子宫内膜异位症。所有患者都经历对腹腔检查的腹腔镜检查干预和子宫内膜异位症组织全切除术。在研究中并不包括患有可能影响研究的结果的除子宫内膜异位症外的病理性疾病的女性。

细胞分离和培养

在将收集的子宫内膜组织在血清生理盐水中转移到我们的实验室后，将它们用含有3％(v/v)青霉素链霉素的磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗3次以去除组织中的血液和灭菌。在将样品用无血清生长培养基MEM洗涤2次后，然后借助于手术刀将组织小片切碎成1-2mm³的小片。在此过程之后，将切碎的组织小片在10ml含有0.05％胰蛋白酶的无血清MEM中在37℃下以70rpm搅拌2小时。在搅拌过程之后，将细胞以1500rpm离心5分钟，并然后弃去上清液，将剩余的团块部分转移到6孔细胞培养皿中，并且在其上放置盖玻片，并且让细胞在含有20％(v/v)胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的低葡萄糖(1g/L)DMEM培养基中，在37℃和5％ CO2增湿环境中生长5天。在温育期结束时，将覆盖6孔板表面的细胞转移到它们在其中生长的T-25然后为T-75组织培养皿中，然后它们经受CD标记物分析以表征干细胞性质。

eMSC的表征

将流式细胞术分析应用于表征对照和患者eMS细胞。细胞用4％(v/v)多聚甲醛溶液进行固定，并然后用PBS洗涤3次，且用作为eMSC的表面标记物的CD146、PDGFR、W5C5、CD44、CD29、CD73、整联蛋白β-1、CD90和CD105抗体在4℃下标记16小时，且使用流式细胞术进行分析。同时，分离的细胞还与作为造血干细胞表面标记物的CD31、CD34、CD45抗体(充当阴性对照)一起温育。将细胞以300xg进行沉淀，并然后用PBS洗涤一次且悬浮于1ml PBS中，且使用流式细胞仪上的FL1(绿色)、FL2(红色)通道进行分析。

蛋白质印迹

通过蛋白质印迹方法检测heMSC、peMSC和用shRNA处理以下调TG2的细胞中的TG2蛋白水平。使用β肌动蛋白作为对照抗体，以显示每个样品的蛋白量同等地上样。为此目的，将eMSC以300.000个细胞/孔的密度接种到6孔板内4小时。在24小时的温育期之后，将30μlRIPA缓冲液(1mM PMSF、0.5％ Non-idet、0.1％ SDS、1mMNaF、1mM Na3VO4和蛋白酶抑制剂混合物)添加到细胞上，并且使细胞膜形成碎片，并且获得细胞裂解物并通过Lowry法确定蛋白量。在密度范围为8％至12％的凝胶中，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术，分离细胞匀浆中的蛋白质(50μg/孔)。将蛋白质通过湿转法在200mA电流下转移到硝酸纤维素膜上1小时，并然后将膜在含有5％奶粉的Tris-Tween(100mM Tris-HCl、0.9％(w/v)NaCl和0.05％(w/v)中，pH 7.4)溶液中保持1小时，并且与适当的抗体一起在4℃下温育16小时。将蛋白质印迹中使用的抗体在含有5％奶粉的Tris-Tween溶液中以根据购买者推荐所指示的浓度进行制备。在16小时的温育期之后，将膜用Tris-Tween溶液洗涤3次5分钟，并且用在含有5％奶粉的Tris-Tween溶液中1:5000或1:1000稀释的HRP标记的抗小鼠抗体在室温下标记2小时。在2小时结束时，将各自用Tris-Tween溶液洗涤3次5分钟的膜保留在ECL-HRP底物溶液中，并然后用ChemiDoc XRS+(BioRad)装置进行拍照。

通过shRNA技术的TG2表达降低

在接种到24孔板(20.000/孔)之后24小时后，将eMSC在含有4％(v/v)FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素(转导培养基)和8μg/ml聚凝胺的培养基中保持12小时。将peMSC用在转导培养基中稀释到感染复数(MOI)为4的含有shTG2的慢病毒颗粒和对照shRNA慢病毒颗粒进行感染，而将heMSC仅使用MOI为2的对照shRNA进行转导。病毒颗粒由Santa Cruz(USA)公司生产，并且shTG2病毒颗粒包含长度为19-25个核苷酸(+发夹)的靶特异性shRNA，其在至少3个不同位置与TG2 mRNA结合。对照shRNA包含在慢病毒颗粒内并不导致任何细胞信息的任何特定破坏的杂乱shRNA序列，并且被用于确定转导过程是否对eMSC具有任何作用。在处理后，将细胞用PBS洗涤一次，并然后在含有12％(v/v)FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2.5μg/ml嘌呤霉素的培养基中保持6至9天。由于嘌呤霉素抗性基因也在含有shRNA的质粒中编码，因此用shRNA质粒转导的细胞预计发展嘌呤霉素抗性。在嘌呤霉素选择结束时，将细胞培养并储存在液氮中在含有10％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)的FBS中。

通过WST-1测定的细胞增殖能力确定

2-[4-碘苯基]-3-[4-硝基苯基]-5-[2,4-二磺苯基]-2H四唑鎓单钠盐水溶性四唑鎓(WST-1)测定是用于测试分别在24、48、72和96小时的时间段TG2-驱动的eMS细胞增殖的比色测量，其对用/不用shRNA的所有分离的eMS细胞执行[76]。在WST-1细胞增殖测定的工作原理中，测量细胞的线粒体活性。首先，使细胞与作为比色底物的WST-1试剂一起温育[77]。该技术基于由线粒体酶系统催化的四唑鎓盐的还原。首先，在清晨，将所有分离的eMSC以2000个细胞/孔、5000个细胞/孔、10000个细胞/孔、15000个细胞/孔和20000个细胞/孔接种到96孔板内以构建标准曲线。在此过程后，将所有分离的eMSC以2000个细胞/孔接种到96孔板内，并且在指定时间点将细胞与含有5μL WST-1试剂和45μL生长培养基的混合物一起温育1小时。在温育期结束时，通过测量细胞在420-480nm(λ最大450nm)波长处的吸光度来确定细胞的增殖能力。

选择取自子宫内膜异位症病灶的组织切片

由病理学家扫描诊断有子宫内膜异位症的患者样品的报告，并且选择处于不同阶段的17个患者样品。来自不同阶段的样品的要求被规定为选择标准的条件。在从患者中收集组织样品后，将它们以石蜡包埋的方式进行贮存。

组织切片的免疫组织化学染色

允许石蜡包埋的组织样品在-20℃下冷却，以获取薄切片。使用切片机装置从样品中获取5μm厚度的切片，将其漂浮在热水上并且放置在带正电的载玻片上。使载玻片干燥并且将具有石蜡的组织切片粘附到载玻片的表面。在用抗体染色之前，将所有载玻片都在70℃下保持一小时，以从组织中去除石蜡。然后，如由制造商的说明书所推荐的，将它们制备并且用CD146、整联蛋白β1、PDGFR、W5C5和TG2子宫内膜间充质干细胞表面标记物抗体进行处理。免疫组织化学染色的所有过程都用Leica Bond Max免疫组织化学染色机(上海，中国)装置执行。在样品在装置中完全干燥后，添加封固剂并用盖玻片覆盖。对于每个样品的每种抗体染色，使用具有40x物镜的Zeiss荧光显微镜的光模块从不同区域获取各五张图像。

免疫组织化学染色图像的定量和评估

通过使用ImageJ程序对于腺体和基质分开地分析每种标记物的染色强度，并且将染色强度以百分比指示。然后，选择最弱和最强的染色，并且在excel程序中计算中值。将最弱染色与中值数目之间的染色值分成两部分并评估为“0”和“+”。类似地，将最高染色与中值数目之间的值分成两部分并评估为“++”和“+++”。数值评估表如下(表1)。将该过程对于来自17个患者的子宫内膜异位症病灶执行。由于在用W5C5抗体执行的任何研究中都不存在染色，因此并未将它包括在评估中。

表1：免疫组织化学染色的评估

统计分析

对于所有数据分析准备的图表在GraphPath程序中进行准备，并且在确定数据是具有参数分布还是非参数分布后，将显示参数分布的数据通过学生t检验与对照相比进行分析。将方差分析和曼怀二氏检验用于非参数数据。每个实验重复至少5次。p＜0.05公认为显著的。(*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001)。

实验结果

作为本发明主题的我们的调查在叶迪特佩大学遗传与生物工程系(Departmentof Genetics and Bioengineering)的分子细胞生物学研究实验室中进行。在将健康的子宫内膜间充质干细胞(heMSC)和子宫内膜异位症间充质干细胞(peMSC)用作细胞模型，所述细胞在细胞培养基中从诊断有子宫内膜异位症(患者组)和并未诊断有子宫内膜异位症(对照组)的个体中收集的子宫内膜组织中分离。本发明的实验通过用从五个不同患者组和五个不同健康组中收集的样品来进行，并且所有实验对于每个组织样品应用一次，并且因此创建了五组重复实验。将流式细胞术分析应用于eMS细胞的表征。通过遵循eMSC表征中解释的方案；将CD146、PDGFR、W5C5、CD44、CD29、CD73、整联蛋白β-1、CD90和CD105抗体用作间充质标记物，并将CD31、CD34、CD45抗体用作造血(充当阴性对照)标记物。在图1中，给出了来自每组的n＝5个细胞的CD标记物的平均结合亲和力与标准差。

在heMSC中，作为表面标记物分别检测到对于CD146为42.74％，对于W5C5为44.60％，对于PDGFR为43.38％，对于CD44为92.03％，对于CD29为93.93％，对于整联蛋白β-1为92.20％，对于CD73为91.86％，对于CD90为89.90％，以及对于CD105为90.91％的蛋白质表达。另一方面，通过流式细胞术实验发现了用作阴性对照的造血干细胞表面标记物分别表达2.64％CD14、1.44％CD31、2.87％CD34和1.58％CD45。

在图2中，将流式细胞术应用于peMSC样品的表征测试，并且给出了来自每组的n＝5个细胞的CD标记物的平均结合亲和力与标准差。

当对peMSC中的CD表面标记物的分析求平均值时，分别确定了对于CD146为75.52％，对于W5C5为73.99％，对于PDGFR为73.99％，对于CD44为94.08％，对于CD29为95.65％，对于整联蛋白β-1为97.93％，对于CD73为96.70％，对于CD90为97.74％，以及对于CD105为87.43％的蛋白质表达。另一方面，流式细胞术结果的分析显示了用作阴性对照的造血干细胞表面标记物的表达分别对于CD14为1.40％，对于CD31为1.20％，对于CD34为1.60％且对于CD45为0.96％。

表2中给出了关于从取自五个健康志愿者和子宫内膜异位症患者的子宫内膜样品中分离的eMSC的标记物的平均值、标准差和“p显著性”值(****p≤0.0001)。

表2：五种不同heMSC和peMSC中的干细胞标记物的平均百分比，并且将p≤0.0001的值表示为****

当考虑到表2中给出的五种不同heMSC和peMSC的平均值时，作为我们已进行的流式细胞术实验的结果，发现了与heMSC样品相比，表面标记物CD 146、W5C5和PDGFR的表达在从诊断有子宫内膜异位症的患者中分离的peMSC样品中显著(****，p<0.0001)更高。与heMSC相比，在peMSC中，CD 146的表达是1.77倍，W5C5的表达是1.65倍，并且PDGFR的表达是1.71倍。在此背景下，我们的实验已显示了CD146、W5C5和PDFGR在患者细胞样品中比健康细胞中合成更多，并且当个别地或以组合使用时，这些生物标记物将为用于诊断子宫内膜异位症的生物标记物。

在我们的发明的范围内，使用蛋白质印迹方法来确定从对照(健康)和患者MSC中分离的总蛋白中的TG2量。为此，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术，并且在通过蛋白质印迹技术转移到硝酸纤维素膜之后，分离从五个不同的对照样品和五个不同的患者样品中分离的蛋白质。在图3中，TG2蛋白表达水平使用识别TG2的抗体进行确定，而β-肌动蛋白抗体被用于整个蛋白质印迹技术中以确保等量的蛋白质上样。

在图3中，观察到从五个不同患者中分离的peMSC裂解物中的TG2水平高于从健康个体中分离的heMSC裂解物中的TG2水平。当在组间分别比较从健康个体和患者中分离的细胞中的TG2蛋白水平时，观察到组-1中的患者细胞中的TG2水平是健康细胞的7.4倍。检测到组2中的患者具有的TG2蛋白水平是健康个体的6.1倍。在组3、组4和组5中的患者细胞的蛋白质样品中观察到了类似的结果，并且通过Image J分析检测到，当与健康样品相比时，子宫内膜异位症患者分别具有6.5倍、6.3倍和5.8倍的更多的TG2蛋白。在图3.c中，呈现了所有组的TG2蛋白水平的平均值，并且GraphPad Prism 6中用单因素方差检验评估了图中的统计结果。作为统计分析的结果，获得p<0.0001值，并且将结果用****描绘。在显示了所有组的TG2蛋白水平的平均值的图3.c中，确定了peMSC样品的平均TG2蛋白水平是heMSC样品的4.7倍高。

为了证明我们的假设，即peMSC样品中增加的CD146、PDGFR和W5C5可能是TG2驱动的(这增加了我们发明的原创性)，我们在我们的这部分研究中通过使用shRNA技术执行了主动/受控的TG2沉默。实验样品由以下组成：未处理的heMSC，杂乱shRNA处理的heMSC(heMSC+SCR)和peMSC(peMSC+SCR)，以及最后靶向TG2的shRNA处理的peMSC(peMSC+shRNA)。首先，为了证明通过使用shRNA技术以主动和受控的方式的TG2沉默成功地进行，将蛋白质印迹(图4)和RT-PCR方法应用于heMSC、heMSC+SCR、peMSC、peMSC+SCR和peMSC+shRNA样品。

在图4.a.中，在靶向TG2的shRNA应用后，细胞中的TG2蛋白水平的变化通过在蛋白质印迹技术后测量膜上的条带强度来确定。通过使用Image J软件程序检测这些条带强度的定量结果，并且将其呈现于图4.b的图表中。根据这些结果，heMSC的所有组(n＝5)中的SCR shRNA转导并不引起TG2表达的任何变化(图4.c.)，而peMSC用携带靶向TG2的shRNA的病毒颗粒的转导在组1中引起减少到1/1.62，该值对于组2确定为1/1.62，对于组3为1/3.1，对于组4为1/3且对于组5为1/2.37。发现作为peMSC中用shRNA(peMSC+shRNA)的TG2表达降低的结果测量的TG2蛋白表达当与heMSC和heMSC+SCR相比时是类似的(图4.c)。统计分析显示了在它们之间不存在显著差异，并且它在图表中被表示为“ns”。在同一图表上在heMSC样品和peMSC样品之间进行了类似的比较，作为结果，观察到peMSC合成的TG2是peMSC+shRNA的2.6倍，并且显著性p<0.00001值由*****指示。

在用shRNA成功沉默TG2后，再次执行流式细胞术实验，以检测五种不同的健康和子宫内膜异位症eMSC中的CD146、PDGFR和W5C5表面标记物，并且在图5中给出了我们比较heMSC和heMSC+SCR样品的结果，并且在图6给出了我们比较peMSC+SCR和peMSC+shRNA SCR样品的结果。

在流式细胞术结果中，观察到用杂乱病毒颗粒处理的对照样品(heMSC+SCR)具有与heMSC样品相比相似的值。heMSC和heMSC+SCR样品的平均值的统计分析结果呈现于表3中。

表3：五个不同的heMSC和heMSC+SCR样品中的干细胞标记物的平均百分比以及通过“ns”显示的无统计差异的p值

根据表3中的结果，已通过我们在我们发明的框架内进行的实验证明了我们用作载体的慢病毒对细胞没有作用。

在我们的这部分结果中，为了显示peMSC样品中增加的CD146、PDGFR和W5C5可能是TG2驱动的，将流式细胞术方法应用于用杂乱的对照慢病毒颗粒处理的peMSC+SCR样品和用靶向tTG的shRNA处理的peMSC+shRNA样品，并且将结果在图6中给出。

流式细胞术结果阐述了peMSC+SCR细胞表面标记物与peMSC细胞相似。在靶向TG2的shRNA处理的peMSC+shRNA细胞中，在peMSC中高度含有的CD146、W5C5和PDGFR表面标记物的表达响应于TG2沉默而减少到健康eMSC中可见的水平。将peMSC+SCR和peMSC+shRNA样品的平均值的统计分析结果呈现于表4中。

表4：五个不同的peMSC和peMSC+shRNA样品中的干细胞标记物的平均百分比以及通过“***”显示的具有统计差异的p值(p<0.0001)

考虑到表4中的结果，当将peMSC+SCR样品与peMSC+shRNA样品进行比较时，在用靶向TG2的shRNA处理的peMSC+shRNA样品中，在统计上，分别观察到对于CD146到1/2.1的表达降低，对于W5C5到1/1.82的表达降低且对于PDGFR到1/2.26的表达降低(****，p<0.0001)。这些结果在文献中首次构成了以下的证明：在子宫内膜异位症的发展中可见的peMSC样品中的CD146、PDGFR和W5C5表达水平的增加是TG2驱动的。

对于peMSC中TG2驱动的细胞增殖的比较检测，将WST-1测定应用于在24、48、72和96小时的不同时间点的heMSC、heMSC+SCR、peMSC、peMSC+SCR和peMSC+shRNA样品，并且在图7中给出结果。

根据图7中的结果，阐述了在24、48、72和96小时结束时，heMSC和heMSC+SCR细胞比peMSC和peMSC+SCR细胞增殖更缓慢。在24小时和48小时结束时，观察到与heMSC相比，具有高TG2表达的peMSC和peMSC+SCR样品具有平均2.1倍和2.3倍的更多的细胞，并且在72小时和96小时结束时，这一比率分别为3.2倍和3.0倍高。在其中TG2表达被沉默的peMSC+shRNA细胞样品中，检测到平均细胞数目与heMSC和heMSC+SCR细胞相似(p>0.05)。

在用TG2、CD146、PGDGR、SUSD2(W5C5)和整联蛋白β-1抗体对取自子宫内膜异位症病灶的组织执行免疫组织化学染色后，将组织样品关于每种抗体分开地进行探测，并且使用Zeiss荧光显微镜的光模块用40x镜头从不同区域获取各五张图像。每种抗体的代表性图像在图8中示出。在所有样品中，检测到整联蛋白β-1、TG2、CD146和PGDGR标记物在子宫内膜异位症病灶的腺体中比基质中表达更强烈。在任何子宫内膜异位症病灶组织样品中均未观察到关于SUSD2(W5C5)抗体的染色。

表5.所研究的子宫内膜异位症病灶组织的基质和腺体中的CD146、ITGβ-1、PDGFR和TG2标记物的表达水平以百分比给出。

检测到在所有研究的子宫内膜异位症病灶组织的腺体中，CD146、PDGFR和TG2标记物的表达超过50％，为强烈(++)或非常强烈(+++)(表5)。

发明的结果和应用

如先前的研究中提到的，子宫内膜异位症是这样的状况，其中应该在子宫中的子宫内膜组织也存在于子宫外，最常见在腹腔的表面上、在卵巢中或在远得多的区域例如脑中[78]。当总体上检查在女性中的患病率时，它被确定为6％-10％[79]、[80]、[81]。然而，已显示了子宫内膜异位症疾病的检出率在患有盆腔疼痛或不孕的女性中为35-50％[79]、[80]、[81]。关于子宫内膜异位症诊断的美国费用报告结果为每年6940万美元[82]。“腹腔镜检查”构成了这种昂贵诊断的很大一部分[82]。虽然腹腔镜检查是用于诊断子宫内膜异位症的重要诊断方法，但它包括手术风险例如在操作过程中可能出现的手术问题、肠道和膀胱损伤、卵巢损伤、大血管损伤和出血，以及高成本和长期患者休息过程[6]、[82]、[83]。具有快速结果的非侵入性、易于应用、可靠的诊断测试的缺乏导致关于患有子宫内膜异位症的女性的诊断平均7-11年的延迟[84]、[85]。

按照文献中的这一信息，在其中我们已开始致力于高灵敏度诊断测试的我们的发明中，我们已发现了可以是用于子宫内膜异位症诊断的新型生物标记物，并且既在成本有效益又提供了无需手术介入而在短时间内“应用/结果”的可能性的TG2，可以通过驱动子宫内膜MSC特异性CD146、W5C5和PDFGR表达而被用于子宫内膜异位症的诊断中。在此背景下，TG2在子宫内膜异位症的诊断和发展中的重要性通过我们在我们发明的范围内进行的实验首次在文献中得到证实。

在流式细胞术检查中，证明了从健康(图1)个体和患者(图2)的子宫内膜中分离的细胞具有间充质干细胞特征，其与文献中的eMSC表征信息一致[86]、[87]、[88]、[89]。另一方面，这些结果指示了子宫内膜是间充质干细胞的丰富来源，并且定位于子宫内膜中的间充质干细胞助于月经周期的重复、子宫内膜的修复并确保其动态结构[90]、[91]。通过流式细胞术在相同的细胞组中确定了，与健康细胞相比，对于子宫内膜间充质干细胞特异性的CD146、W5C5和PDFGR[92]标记物在患者细胞样品中表达更多。在患者子宫内膜异位症细胞中，对于子宫内膜衍生的间充质干细胞有特异性的CD146、W5C5和PDFGR[92]的表达增加可能已对peMSC样品赋予了细胞迁移、粘附和侵入潜力。由于已知在细胞迁移、粘附和侵入中发挥作用的CD146、PDGFR和W5C5的量在患者细胞中为高的，并且PDGFR直接与TG2协作，因此认为peMSC样品中的CD146、PDGFR和W5C5增加可能是TG2驱动的。在由Zemskov等人的先前研究中，已显示了在不同的细胞样品中，细胞表面TG2与PDGFR相互作用，并且触发与整联蛋白的TG2驱动的PDGFR依赖性细胞粘附[93]、[94]。另一方面，在用中枢神经系统细胞进行的最近研究中，已显示了CD146在PDGFR-β介导的信号转导中发挥重要作用，并且通过作为CD146二聚化的结果的PDGFR-β磷酸化来触发细胞迁移和粘附[95]。尽管在本研究中解释了CD146和PDGFR之间的关系，但它们与TG2的关系以及在子宫内膜异位症中的作用尚未阐明。按照流式细胞术结果，在heMSC和peMSC样品中调查了TG2的存在，以确定TG2在peMSC样品中的CD146、PDGFR和W5C5表达增加中的作用。通过在此背景下进行的蛋白质印迹(图3)和RT-PCR实验，在heMSC和peMSC样品中调查了TG2的蛋白质含量和基因表达，并且检测到与对照相比，TG2的蛋白质和基因表达两者在患者样品中均更高。

如用迄今为止呈现的证明我们假设的数据所显示的，为了理解peMSC中增加的CD146、PDGFR和W5C5表面标记物是否处于TG2表达的控制下，通过将shRNA技术应用于eMSC，以主动和受控的方式沉默TG2表达(图4)。虽然观察到TG2蛋白的水平(图4)在将shRNA应用于peMSC后降低，但将含有(杂乱)shRNA的对照慢病毒颗粒应用于peMSC和heMSC并未降低TG2蛋白水平。还如文献中公开的，shRNA抑制作为靶基因的产物的蛋白质，而包含杂乱的对照慢病毒颗粒包含人基因组中的约19-25个核苷酸序列，其并不对应于任何细胞信息，预计在用杂乱处理的细胞中没有变化[96]，并且这一信息与我们的结果类似。随着shRNA在以高水平合成且表达TG2的peMSC样品中的成功应用，我们通过检测CD146、PDGFR和W5C5表面标记物的变化，细胞的增殖潜力，它们迁移到子宫外的区域的能力，以及它们侵入它们已迁移到其中的新部位的能力，在分子上阐明了TG2在子宫内膜异位症中的作用。

如已知的，除其Ca⁺²依赖性交叉酶活性[41]、[46]、[97]、[98]、[99]之外，TG2还可以丧失其不依赖于Ca⁺²的交联活性，并且结合并水解GTP，并且如G蛋白那样在细胞粘附和迁移中发挥积极作用[41]、[45]、[36]、[50]、[52]。按照文献中的这一信息以及作为我们在我们发明的范围内呈现的实验的结果，已调查了peMSC是否已借助于它们含有的高水平的TG2表达而获得迁移到子宫外的区域并且粘附且侵入所述区域的能力。

根据我们在图4中呈现的结果，在TG2用shRNA的受控和主动沉默之后，peMSC+shRNA细胞中的CD146、W5C5和PDGFR表面标记物降低到在heMSC、heMSC+SCR细胞中观察到的水平(图6，表3和表4)。这些结果向我们显示了在peMSC细胞中高度表达的CD146、W5C5和PDFGR的表面标记物处于TG2基因表达的控制下。

在第24、48、72和96小时执行的用于确定TG2表达对eMSC细胞增殖的作用的WST-1测定(图7)显示了，当与heMSC样品相比时，peMSC细胞的增殖速度为1.3倍快。通过TG2沉默，peMSC+shRNA细胞的增殖能力降低到健康heMSC的水平。这些结果构成了子宫内膜异位症中的细胞增殖在TG2的控制下执行的证明。

除我们在子宫内膜MSC中用CD146、整联蛋白β-1、PDGFR、TG2和W5C5标记物的研究之外，还通过免疫组织生物化学染色方法检查了取自处于子宫内膜异位症的不同阶段的17个患者的不同区域的子宫内膜异位症病灶中的表达水平。分开地评估了组织中的腺体和基质中的染色。结果显示了，如我们已在所有子宫内膜异位症病灶组织的腺体中的eMSC中所示的，CD146、PDGFR和TG2标记物的表达超过50％，为强烈(++)或非常强烈(+++)(表5)。检测到在子宫内膜异位症病灶组织中，基质中的CD146、PDGFR和TG2表达低于腺体中(图8)。虽然并未显示在eMSC中增加的整联蛋白β-1表达在子宫内膜异位症病灶组织中表达，但在从健康个体和患者中分离的eMSC中并未检测到表达的变化。这提示了整联蛋白β-1表达在eMSC子宫内膜异位症病灶形成过程中增加。我们在本专利申请的框架内用W5C5进行的免疫组织化学研究首次在文献中证实了，与Gargett等人相反，W5C5的表达在子宫内膜异位症病灶组织中受到遏制，而该标记物在从子宫内膜异位症患者子宫内膜中分离的eMS细胞中增加。

在根据本申请进行的研究的框架内，要求为单独或组合的TG2、CD146、PGDGR、SUSD2(W5C5)和整联蛋白β-1标记物作为子宫内膜异位症的诊断中生物标记物的用途授予专利权。

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Claims (4)

1.组织转谷氨酰胺酶，其被用作用于在分离的子宫内膜间充质干细胞中的子宫内膜异位症的诊断的生物标记物，所述间充质干细胞衍生自来自子宫内膜异位症患者的子宫内膜活组织检查和/或月经血。

2.根据权利要求1的组织转谷氨酰胺酶，其连同选自分化簇146、含有Sushi结构域的蛋白质2、整联蛋白β1和血小板衍生的生长因子受体标记物的至少一种标记物及其组合一起被用作用于在分离的子宫内膜间充质干细胞中的子宫内膜异位症的诊断的生物标记物，所述间充质干细胞衍生自来自子宫内膜异位症患者的子宫内膜活组织检查和/或月经血。

3.子宫内膜异位症诊断试剂盒，其包含单独或彼此组合的权利要求1和2中所述的生物标记物，并且其被用于测量“从子宫内膜活组织检查样品和/或月经血中分离的子宫内膜间充质细胞”中的基因和/或其蛋白质水平。

4.根据权利要求1或2的生物标记物，其在从月经血中分离的间充质细胞中的基因和蛋白质表达水平被用于检测在治疗中使用的药物的成功。