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CN117343166A - 一种抗呼吸道合胞病毒抗体、检测呼吸道合胞病毒的试剂和试剂盒 - Google Patents

一种抗呼吸道合胞病毒抗体、检测呼吸道合胞病毒的试剂和试剂盒 Download PDF

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CN117343166A
CN117343166A CN202310679065.2A CN202310679065A CN117343166A CN 117343166 A CN117343166 A CN 117343166A CN 202310679065 A CN202310679065 A CN 202310679065A CN 117343166 A CN117343166 A CN 117343166A
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Abstract

本发明公开了一种抗呼吸道合胞病毒抗体、检测呼吸道合胞病毒的试剂和试剂盒，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗呼吸道合胞病毒抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区。该抗体为呼吸道合胞病毒的检测提供了重要的原料来源，且具有改善的活性。

Description

一种抗呼吸道合胞病毒抗体、检测呼吸道合胞病毒的试剂和 试剂盒
相关申请的交叉引用
本公开要求于2022年07月05日提交中国专利局的申请号为202210781885.8、名称为“一种抗呼吸道合胞病毒抗体、检测呼吸道合胞病毒的试剂和试剂盒”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗呼吸道合胞病毒抗体、检测呼吸道合胞病毒的试剂和试剂盒。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)简称合胞病毒，属于副粘病毒科肺病毒属，是一种具被膜的非节段单链RNA(负链)病毒，病毒颗粒呈不规则的表面粗糙的球形或丝状。病毒主要在鼻咽上皮细胞中增殖。RSV是5岁以内儿童病毒性肺炎的最主要病原体，也是婴儿猝死的病因之一。儿童对RSV普遍易感，且再感染率很高。成人急性感染也很常见，老年人可引起严重肺炎，并发展为成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。RSV感染症状主要包括咳嗽、鼻塞、流涕、咽喉不适等呼吸道局部症状和发热、乏力、头痛、肌肉酸痛等全身症状。婴幼儿常伴发热，气急。X线胸片常显示明显的支气管肺炎和/或毛细支气管炎表现。在成人和年长儿，感染可能不明显或仅表现为无热性上呼吸道感染(普通感冒)。多种病毒性肺炎之间依靠临床症状几乎无法区别。在发达国家，有0.5-1.5％的住院婴幼儿死于RSV感染。RSV在老人聚居地易发生暴发性流行，患病率和死亡率极高。
免疫学检测方法是基于抗体和抗原的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、荧光、胶体金属、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测微生物、蛋白质、激素等微量生物活性物质。目前，RSV检测常用的免疫学方法主要有胶体金免疫层析法。类似的免疫学检测方法还有生化免疫比浊法、放射免疫法及化学发光法等。上述任一免疫学检测方法用于RSV检测时都需要针对于RSV的抗体。
现在市场上针对RSV的抗体来源少，且活性、灵敏度或特异性等性能存有缺陷，本领域对于有效结合RSV并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本申请提供一种活性改善的抗呼吸道合胞病毒抗体，以改善呼吸道合胞病毒的检测，为呼吸道合胞病毒的检测提供重要的原料来源。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:20、21、22、23任一重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:24、25任一轻链可变区的三个互补决定区。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:15所示的HCDR2、SEQ ID NO:3所示的HCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4至SEQ IDNO:6所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种抗呼吸道合胞病毒抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为上述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种抗呼吸道合胞病毒的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:20、21、22、23任一所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:24、25任一所示。
为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种抗呼吸道合胞病毒抗体，包括重链和/或轻链，所述重链包括上述的重链可变区，所述轻链包括上述的轻链可变区。
为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，一种抗呼吸道合胞病毒的抗体，包括重链和/或轻链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26、27、28、29任一所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:30、31任一所示。
为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其功能性片段。
为了实现上述目的，根据本发明的第八个方面，提供了一种检测呼吸道合胞病毒的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物。
为了实现上述目的，根据本发明的第九个方面，本发明还提供了一种核酸，所述核酸编码上述的抗体或其功能性片段。
为了实现上述目的，根据本发明的第十个方面，本发明还提供了一种载体、一种细胞及一种制备上述抗体或其功能性片段的方法。
为了实现上述目的，根据本发明的第十一个方面，提供了一种检测呼吸道合胞病毒的方法，所述方法包括将上述抗体或其功能性片段与待检测样品中呼吸道合胞病毒接触形成免疫复合物。
为了实现上述目的，根据本发明的第十二个方面，提供了上述的抗体或其功能性片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒在检测或制备检测呼吸道合胞病毒产品中的用途。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Anti-RSV-3B14mut1至Anti-RSV-3B14mut5的还原性SDS-PAGE的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含具有氨基酸序列
SEQ ID NO:20、21、22、23任一重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:24、25任一轻链可变区的三个互补决定区。
需要说明的是，HCDR1、HCDR2和HCDR3为与第一方面所述的抗体或其功能性片段中所限定的同一条重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3一致的氨基酸序列，LCDR1、LCDR2和LCDR3为与第一方面所述的抗体或其功能性片段中所限定的同一条轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3一致的氨基酸序列。
例如所述HCDR1、HCDR2、HCDR3为与SEQ ID NO:21所示重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3一致的氨基酸序列；所述LCDR1、LCDR2、LCDR3为与SEQ ID NO:24所示轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3一致的氨基酸序列。
在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。
在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。
CDR的定义方法是本领域公知的，CDR定义方法包括：Kabat定义、Chothia定义、IMGT定义、Contact定义和AbM定义。如本文所述，“Kabat定义”是指Kabat等，U.S.Dept.ofHealth and Human Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所述的定义系统。“Chothia定义”参见Chothia等，J Mol Biol 196：901-917(1987)。还有其他CDR定义方法可能不严格遵循上述方案之一，但仍会与Kabat定义的CDR区的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组的预测或实验结果可能会缩短或延长它们。示例性的定义的CDR列于下表1中,不同文献中的标注略有不同。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。需要说明的是，不限于表1中的其他方法定义的CDR也属于本公开的保护范围。
表1：CDR定义1
CDR Kabat AbM2 IMGT Chothia
HCDR1 H31～H353 H26～H353 H26～H33..55 H26～H32..344
HCDR2 H50～H65 H50～H58 H51～H57 H52～H56
HCDR3 H95～H102 H95～H102 H93～H102 H95～H102
LCDR1 L24～L34 L24～L34 L27～L32 L24～L34
LCDR2 L50～L56 L50～L56 L50～L51 L50～L56
LCDR3 L89～L97 L89～L97 L89～L97 L89～L97
1表1中所有CDR定义的编号是依据Kabat编号系统(参见下文)，重链上的氨基酸编号用“H+数字”表示，轻链上的氨基酸编号用“L+数字”表示。本领域普通技术人员可以明确地将该Kabat编号系统对应到任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所述，“Kabat编号”是指Kabat等，U.S.Dept.of Health and HumanServices，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所述的编号系统。
2如表1中使用的“AbM”具有小写“b”，是指通过Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
3如果H35A和H35B都不存在时，那么CDR-H1结束在35位；如果只有H35A存在时，那么CDR-H1结束在35A位；如果H35A和H35B同时存在，那么CDR-H1结束在35B位。
4如果H35A和H35B都不存在时，那么CDR-H1结束在32位；如果只有H35A存在时，那么CDR-H1结束在33位；如果H35A和H35B同时存在，那么CDR-H1结束在34位。
5如果H35A和H35B都不存在时，那么CDR-H1结束在33位；如果只有H35A存在时，那么CDR-H1结束在34位；如果H35A和H35B都存在时，那么CDR-H1结束在35位。
根据本发明的实施例，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2或LCDR3由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact任意一种系统或多种系统组合定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Kabat系统定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Chothia系统定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由IMGT系统定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由AbM系统定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Contact系统定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact系统组合定义。
根据本发明的实施例，所述Kabat、Chothia、AbM或IMGT系统定义的HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2或LCDR3的氨基酸序列对应的Kabat编号位置如下：
CDR Kabat AbM IMGT Chothia
HCDR1 H31～H35A H26～H35A H26～H34 H26～H33
HCDR2 H50～H65 H50～H58 H51～H57 H52～H56
HCDR3 H95～H102 H95～H102 H93～H102 H95～H102
LCDR1 L24～L34 L24～L34 L27～L32 L24～L34
LCDR2 L50～L56 L50～L56 L50～L51 L50～L56
LCDR3 L89～L97 L89～L97 L89～L97 L89～L97
根据本发明的实施例，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3依次包括或为Kabat编号的重链可变区的31～35A位、50～65位、95～99位氨基酸序列；所述LCDR1、LCDR2和LCDR3依次包括或为Kabat编号的轻链可变区的24～34位、50～56位、89～95位氨基酸序列。
第二方面，本发明实施例提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:15所示的HCDR2、SEQ ID NO:3所示的HCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。上述抗体具有改善的活性。
在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。
在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段还具有HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的至少之一；
所述HFR1包括SEQ ID NO:7或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述HFR2包括SEQ ID NO:8或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述HFR3包括SEQ ID NO:9或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述HFR4包括SEQ ID NO:10或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述LFR1包括SEQ ID NO:11或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述LFR2包括SEQ ID NO:12或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述LFR3包括SEQ ID NO:13或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述LFR4包括SEQ ID NO:14或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段还包括氨基酸序列如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:10所示的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4和氨基酸序列如SEQ ID NO:11至SEQ IDNO:14所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。
需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各框架区氨基酸序列可以与上述对应框架区(SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13或14)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的HFR1如SEQ ID NO:16所示。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的HFR3如SEQ ID NO:17所示。
第三方面，本发明实施例提供一种抗呼吸道合胞病毒的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为上述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列为上述的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:20至23任一所示。
在可选的实施方式中，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:24至25所示。
在可选的实施方式中，上述第一方面、第二方面、第三方面所述抗体或其功能性片段包括下列任一组合的重链可变区和轻链可变区：
组合 重链可变区 轻链可变区
1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:24
2 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:24
3 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24
4 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:25
5 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:25
在可选的实施方式中，所述抗体还包含恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为鼠。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为大鼠或小鼠。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列(CH)如SEQ ID NO:18所示，所述轻链恒定区(CL)序列如SEQ ID NO:19所示。
需要说明的是，在其他的实施例中，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ IDNO:18或19)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
第四方面，本发明实施例提供一种抗呼吸道合胞病毒的抗体，包括重链和/或轻链，所述重链包括上述的重链可变区和上述的重链恒定区；所述轻链包括上述的轻链可变区和上述的轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26至29任一所示。
在可选的实施方式中，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:30至31任一所示。
在可选的实施方式中，上述第一方面、第二方面、第三方面、第四方面所述的抗体，包括下列任一组合的重链和轻链：
组合 重链 轻链
1 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:30
2 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:30
3 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30
4 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:31
5 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:31
第五方面，本发明实施例提供一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其功能性片段。
在可选的实施方式中，上述抗体偶联物中所述抗体或其功能性片段标记有标记物。
在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中，所述标记物包括但不限于荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
在可选的实施方式中，上述抗体偶联物中所述抗体或其功能性片段包被至固相。
在可选的实施方式中，所述固相选自微球、板和膜。
在可选的实施方式中，所述固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
在可选的实施方式中，所述固相为硝酸纤维素膜。
第六方面，本发明实施例提供一种检测呼吸道合胞病毒的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物。
第七方面，本发明实施例提供上述抗体或其功能性片段、抗体偶联物或上述的试剂或试剂盒在呼吸道合胞病毒检测中的用途。
第八方面，本发明实施例提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。
第九方面，本发明实施例提供含有上述核酸分子的载体。
第十方面，本发明实施例提供含有上述载体的细胞。
第十一方面，本发明实施例提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如上所述的细胞。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
第十二方面，本发明实施例还提供一种检测呼吸道合胞病毒的方法，其包括：使上述抗体或其功能性片段与待检测样品中呼吸道合胞病毒接触形成免疫复合物；
在可选的实施方式中，上述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合；
在可选的实施方式中，上述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与呼吸道合胞病毒结合。
第十三方面，本发实施例明还提供了上述的抗体或其功能性片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒在检测或制备检测呼吸道合胞病毒产品中的用途。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1Anti-RSV-3B14单克隆抗体的制备
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTMRACE cDNAAmplification Kit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。
1重组质粒的构建
(1)抗体基因制备
从分泌抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆，各4个克隆送基因测序公司进行测序。
(2)Anti-RSV-3B14抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在Kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为321bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为351bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
(3)重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.73kb的Light Chain基因片段和1.44kb的Heavy Chain基因片段。
Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
2重组抗体的样品制备
提前复苏HEK293细胞，传代培养到200ml体系，使细胞密度达到3～5×106cells/ml，细胞活力>95％；离心清洗细胞，用培养基复溶，同时将细胞密度调整到2.9×106cells/ml，作为细胞稀释液。用培养基分别配制质粒DNA和转染试剂稀释液。将转染试剂稀释液加入到质粒DNA稀释液中，混匀后室温静置放置15min；将该混合物在1min内缓慢加入细胞稀释液中，混匀后取样计数，记录并观察细胞转染后的活力，并将其放置于35℃恒温培养箱中培养，转速120rmp，CO2含量8％，13天后离心收样。将离心上清用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。
实施例2活性优化
实施例1得到的Anti-RSV-3B14单克隆抗体虽然具备结合呼吸道合胞病毒的能力，但抗体活性不够理想，因而申请人通过对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行定向突变。即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计，根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应，将PCR产物克隆至载体，再按照实施例1所述的方法进行突变抗体的制备。经筛选，得到抗体活性显著提升的单克隆抗体，并命名为：Anti-RSV-3B14mut1至Anti-RSV-3B14 mut 5。各单克隆抗体的氨基酸序列如下表所示：
表2抗体序列
样品名称 重链序号 轻链序号
Anti-RSV-3B14mut1 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:30
Anti-RSV-3B14mut2 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:30
Anti-RSV-3B14mut3 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30
Anti-RSV-3B14mut4 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:31
Anti-RSV-3B14mut5 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:31
实施例3抗体的性能检测
1.活性鉴定
包被液(主要成分NaHCO3)稀释羊抗鼠IgG(购自菲鹏生物)至1ug/ml，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的上述单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min-60min；洗涤液清洗5次，拍干；加入稀释的RSV抗原(北京科兴中维)，每孔100uL，37℃,40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记HRP的抗RSV抗体，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液(PBS)清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔，含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L柠檬酸、0.07g/L乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲)，加入显色液B液(50μl/孔，含1.05g/L柠檬酸、0.186g/LEDTA·2Na、0.45g/L TMB和0.2ml/L浓HCl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/EDTA·2Na和10.2ml/L浓H2SO4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果见下表。
表3活性数据
样品浓度(ng/ml) 15.63 7.81 3.91 1.95 0.98 0.00
对照 1.531 1.231 0.811 0.629 0.406 0.045
Anti-RSV-3B14mut1 1.866 1.527 1.093 0.782 0.526 0.061
Anti-RSV-3B14mut2 1.845 1.507 1.012 0.764 0.507 0.054
Anti-RSV-3B14mut3 1.844 1.501 1.011 0.766 0.512 0.055
Anti-RSV-3B14mut4 1.856 1.512 1.024 0.758 0.511 0.059
Anti-RSV-3B14mut5 2.01 1.702 1.321 0.811 0.592 0.054
2.稳定性考核
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表4为抗体考核21天的酶免活性检测OD结果。
表4稳定性数据
样品浓度(ng/ml) 7.81 3.91 0
4℃，21天样品 1.501 1.011 0.012
-80℃，21天样品 1.508 1.012 0.012
37℃，21天样品 1.507 1.009 0.011
3.抗体在胶体金检测上的应用
3.1胶体金检测试纸的制备
3.1.1硝酸纤维素膜的制备
硝酸纤维素膜的制备：用包被缓冲液将呼吸道合胞病毒抗体RSV1(购自菲鹏生物)稀释到1～5mg/mL，调整机器，划线为T线，即为检测线，T线靠近金标垫端；用包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到1～5mg/mL，调整机器，划线为C线，即为控制线，C线靠近吸收垫。两线距离5～8mm，均匀。37℃烘干，封装备用。
3.1.2胶体金、金标记单克隆抗体的制备
用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100mL 0.01％氯金酸加入2mL1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，分别加入上述抗体Anti-RSV-3B14mut1～Anti-RSV-3B14mut5和对照，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1％静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤液将沉淀重悬，将制备好的胶体金标记抗体Anti-RSV-3B14mut1～Anti-RSV-3B14mut5置4℃备用。
3.1.3金标垫的制备
将金标垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。
3.1.4检测试纸的组装
将吸收垫(购自Millipore公司)、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫设置在不吸水的支撑薄片上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装，得到所述检测试纸。
3.2抗体在胶体金检测中的应用
利用上述组装好的检测试纸条检测被检材料中是否含有呼吸道合胞病毒抗原，从而确定抗体Anti-RSV-3B14mut1～Anti-RSV-3B14mut5对呼吸道合胞病毒抗原检测的作用性。
利用双抗体夹心法来检测被检材料中的是否含有呼吸道合胞病毒抗原。检测时，呼吸道合胞病毒抗原先和胶体金标记的抗体结合形成呼吸道合胞病毒抗原-胶体金标记抗体复合物，由于毛细管作用，呼吸道合胞病毒抗原-胶体金标记抗体复合物沿硝酸纤维素膜向前泳动，到达检测线时，呼吸道合胞病毒抗原-胶体金标记抗体复合物会与上述实施例步骤3.1.1制备得到的呼吸道合胞病毒抗体RSV1结合，形成RSV1抗体-呼吸道合胞病毒-胶体金标记抗体的复合物，从而富集在检测线上，形成红色沉淀线。未结合检测线上的呼吸道合胞病毒抗体的呼吸道合胞病毒抗原-胶体金标记抗体复合物则通过检测线，被羊抗鼠IgG抗体捕获，富集在质控线上，形成红色沉淀线。当检测线与质控线同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有呼吸道合胞病毒病毒抗原，未结合呼吸道合胞病毒抗原的胶体金标记的抗体到达检测线时，不会形成呼吸道合胞病毒抗体-呼吸道合胞病毒抗原-胶体金标记抗体的复合物，未结合呼吸道合胞病毒抗原的胶体金标记的抗体复合物通过检测线，仅富集在质控线上形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。
备注：“B”代表阴性，“C”代表阳性，C1>C1+>C2>C2+>C3>C3+，以此类推，数字越小颜色越浅，活性越高
RSV：表示阳性样品HRSV：表示RSV抗原
表5性能评估数据
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本申请涉及的部分氨基酸序列如下所示：

Claims (18)

1.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含具有氨基酸序列SEQ IDNO:20、21、22、23任一重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:24、25任一轻链可变区的三个互补决定区。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述互补决定区由Kabat、Chothia、IMGT、Lesk、AbM或Contact系统定义；
可选地，所述CDRs由Kabat、Chothia、IMGT或Lesk系统定义。
3.一种抗呼吸道合胞病毒抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:15所示的HCDR2、SEQ ID NO:3所示的HCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还具有HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的至少之一；
所述HFR1包括SEQ ID NO:7或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述HFR2包括SEQ ID NO:8或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述HFR3包括SEQ ID NO:9或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述HFR4包括SEQ ID NO:10或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述LFR1包括SEQ ID NO:11或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述LFR2包括SEQ ID NO:12或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述LFR3包括SEQ ID NO:13或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述LFR4包括SEQ ID NO:14或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
可选地，所述抗体或其功能性片段还具有氨基酸序列如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:10所示的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4和氨基酸序列如SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:14所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，或与所述各序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；
可选地，所述抗体或其功能性片段的HFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
可选地，所述抗体或其功能性片段的HFR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
5.一种抗呼吸道合胞病毒抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为权利要求1-3所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列为权利要求4所述的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列；
可选地，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:20至23任一所示；
可选地，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:24至25任一所示。
6.一种抗呼吸道合胞病毒的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:20、21、22、23任一所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:24、25任一所示。
7.根据权利要求1至6任一所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区；
可选地，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；
可选地，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；
可选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；
可选地，所述恒定区的种属来源为鼠；
可选地，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:18所示或与其具有至少80％同一性；
可选地，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:19所示或与其具有至少80％同一性。
8.根据权利要求1至7任一所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
9.一种抗呼吸道合胞病毒抗体，包括重链和/或轻链，其特征在于，所述重链包括权利要求5或6所述的重链可变区和权利要求7所述的重链恒定区；所述轻链包括权利要求5或6所述的轻链可变区和权利要求7所述的轻链恒定区；
可选地，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26至29任一所示；
可选地，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:30至31任一所示。
10.一种抗呼吸道合胞病毒的抗体，包括重链和/或轻链，其特征在于，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26、27、28、29任一所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:30、31任一所示。
11.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包括权利要求1至10任一项所述的抗体或其功能性片段；
可选地，所述抗体或其功能性片段标记有标记物；
可选地，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物；
可选地，所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物；
可选地，所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶；
可选地，所述放射性同位素选自212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F；
可选地，所述化学发光试剂选自鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物；
可选地，所述纳米颗粒类标记物选自纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒；
可选地，所述胶体选自胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；
可选地，所述胶体金属选自胶体金、胶体银和胶体硒；
可选地，所述抗体或其功能性片段包被至固相；
可选地，所述固相选自微球、板和膜；
可选地，所述固相选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
12.一种检测呼吸道合胞病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1至10任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求11所述的抗体偶联物。
13.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求1至10任一项所述的抗体或其功能性片段。
14.一种载体，其特征在于，其含有权利要求13所述的核酸。
15.一种细胞，其特征在于，其含有权利要求13所述的核酸或权利要求14所述的载体。
16.一种制备权利要求1至10任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求15所述的细胞。
17.一种检测呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于，包括：
使权利要求1至10任一项所述抗体或其功能性片段与待检测样品中呼吸道合胞病毒接触形成免疫复合物；
优选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合；
优选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与呼吸道合胞病毒结合。
18.权利要求1-8任一项所述的抗体或其功能性片段、权利要求9-10任一项所述的抗体、权利要求11所述的抗体偶联物，或者权利要求12所述的试剂或试剂盒在检测或制备检测呼吸道合胞病毒产品中的用途。
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