CN117305201A

CN117305201A - 一种利用二碳化合物合成手性乳酸的基因工程菌株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN117305201A
Application number: CN202311047737.4A
Authority: CN
Inventors: 李�灿; 王旺银; 王迎晨
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2023-08-18
Filing date: 2023-08-18
Publication date: 2023-12-29

Abstract

本申请公开了一种利用二碳化合物合成手性乳酸的基因工程菌株及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的基因工程菌株包括出发菌株、初始表达载体、启动子和外源性基因；所述出发菌株包括大肠杆菌；所述外源性基因包括乙醇脱氢酶基因、乙醛脱氢酶基因和乳酸脱氢酶基因。本发明提供的基因工程菌株能够利用二碳化合物生长并发酵得到手性乳酸，克服了现有技术中微生物不能利用二碳化合物进行发酵的缺陷。采用本发明方法构建的基因工程菌株，结合多种二碳化合物混合培养的方式，可以有效提高手性乳酸的产量和积累时间。

Description

一种利用二碳化合物合成手性乳酸的基因工程菌株及其构建方法和应用

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，尤其涉及一种利用二碳化合物合成手性乳酸的基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

当前的发酵工业严重依赖碳水化物，如葡萄糖，蔗糖。随着社会的进步，发展除了糖之外的碳源成为解决粮食危机和能源危机的重要手段之一。基于二氧化碳的低碳化合物，如C1化合物(CO，CH₄，甲酸，甲醇)和C2化合物(乙醇，乙酸)，其来源绿色，生产成本低以及自然资源丰富，并且与碳水化合物相比，做到了“不与人争粮”。对于低碳化合物为碳源，一部分自养微生物天然具有相应的代谢途径能够同化并将它们转化为生物质，如具有固定CO₂能力的蓝藻，但是自养微生物的生长速度往往较慢，这不利于发酵工程中单位时间产率的提高。相比于自养微生物，异样微生物的生产通常依赖于葡萄糖这类碳水化物，其分裂速度快，然而它们一般天生不具备利用低碳化合物的能力。合成生物学的发展，赋予了我们对微生物进行改造的能力，使它们更好地适应低碳化合物为碳源的生长条件。

乳酸作为一种重要的化学品，在食品、医药、化妆品等领域都有广泛的应用。同时它也是聚乳酸的基本单体。聚乳酸是一种新型生物降解材料，目前已经应用于一次性用品行业和医药行业。但聚乳酸的特性受乳酸单体的光学纯度影响非常大，使用光学纯的乳酸(纯的L-乳酸或纯的D-乳酸)才能得到结晶性非常好的聚乳酸材料，而聚乳酸的精化程度影响着材料的稳定性。目前，光学纯的乳酸主要是通过生物发酵的方式获得。因为相比于化学手段，基于酶本身的特性，生物催化得到的产物天然就是纯的D-乳酸或纯的L-乳酸，避免了复杂且高昂的手性分离过程。但是，当前生物催化产乳酸依旧是发酵葡萄糖为主的碳水化合物。基于全球粮食短缺的现状以及快速增加的粮食需求，寻找和开发更加绿色可持续的化合物为碳源来生产乳酸是十分有必要的。

从生物工程的角度分析，乙醇和乙酸在水溶液中的溶解度好，传质快，有利于发酵工程的开展。同时，随着催化化学和化学工程的发展，乙醇和乙酸已经能够由CO₂通过电催化等绿色化学的手段转化而来，保证了发酵原料的低污染，可再生特点。乙醇和乙酸这类C2化合物的能量高，在同化过程中，等浓度的C2化合物能够为微生物提供充足的还原力和能量，减少了用于为生存供能而将碳源转化为CO₂进行呼吸作用的不必要消耗。同化后的乙酸或乙醇将直接以乙酰辅酶A的形式参与微生物的代谢，乙酰辅酶A是一种重要的中间代谢物，其本身属于精细化学品，同时也是聚羟基丁酸酯(PHB)和脂肪酸这类生物基大分子化合物的重要前体。目前，有关于如何利用乙醇和乙酸通路进行手性乳酸的合成还鲜有报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用二碳化合物合成手性乳酸的基因工程菌株及其构建方法和应用，所述基因工程菌株通过引入外源性的乙醇脱氢酶基因、乙醛脱氢酶基因和乳酸脱氢酶基因，能够利用二碳化合物生长并发酵得到手性乳酸。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种利用二碳化合物合成手性乳酸的基因工程菌株，所述基因工程菌株包括出发菌株、初始表达载体、启动子和外源性基因；

所述出发菌株包括大肠杆菌；

所述外源性基因包括乙醇脱氢酶基因、乙醛脱氢酶基因和乳酸脱氢酶基因。

可选地，所述初始表达载体包括pRSFduet-1和/或pACYC184。

可选地，当所述初始表达载体为pRSFduet-1时，所述启动子包括Ptrc-tho，所述Ptrc-tho的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

当所述初始表达载体为pACYC184时，所述启动子包括ParaBAD，所述ParaBAD的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

可选地，所述乙醇脱氢酶基因的NCBI的登录号为GenBank:WP_012885841；

所述乙醛脱氢酶基因的NCBI的登录号为GenBank:NP_014032；

所述乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

第二方面，本发明提供了上述基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

步骤1)将所述外源性基因与初始表达载体、启动子连接，得重组过表达载体；

步骤2)将所述重组过表达载体转入出发菌株中，得所述基因工程菌株。

可选地，步骤2)将所述重组过表达载体转入出发菌株的感受态细胞中。

可选地，步骤2)将所述重组过表达载体转入出发菌株中后，还包括用抗生素进行筛选的步骤。

第三方面，本发明提供了上述基因工程菌株在利用二碳化合物合成手性乳酸及其衍生物中的应用。

第四方面，本发明提供了一种利用二碳化合物合成手性乳酸的方法，包括如下步骤：

将上述的基因工程菌株接种至培养基中进行生物发酵，得所述手性乳酸。

可选地，所述基因工程菌株的接种量为0.2～30OD₆₀₀。

优选地，所述基因工程菌株的接种量为2～30OD₆₀₀。

可选地，所述基因工程菌株的接种量独立地选自0.2OD₆₀₀、1OD₆₀₀、2OD₆₀₀、5OD₆₀₀、10OD₆₀₀、15OD₆₀₀、20OD₆₀₀、25OD₆₀₀、30OD₆₀₀中的任意值或任意两者之间的范围值。

可选地，所述培养基中包括二碳化合物；

所述二碳化合物的初始加入量为5～20g/L。

优选地，所述二碳化合物的初始加入量为8～12g/L。

可选地，所述二碳化合物的初始加入量独立地选自5g/L、8g/L、10g/L、12g/L、14g/L、16g/L、18g/L、20g/L中的任意值或任意两者之间的范围值。

可选地，所述二碳化合物选自乙醇、乙酸、乙醇盐和乙酸盐中的一种或多种。

可选地，所述二碳化合物为乙醇和乙酸的混合物，所述混合物中乙醇和乙酸的浓度比为1～2:1。

可选地，所述培养基中还包括磷酸盐、钠盐、无机含氮化合物、镁盐、螯合剂和微量元素中的一种或多种。

可选地，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二铵中的一种或多种。

可选地，所述钠盐包括氯化钠。

可选地，所述无机含氮化合物选自氯化铵、硫酸铵、磷酸铵和碳酸氢铵中的一种或多种。

可选地，所述镁盐包括硫酸镁。

可选地，所述螯合剂包括EDTA。

可选地，所述微量元素选自可溶性的钴盐、锰盐、铜盐、钼盐、锌盐、铁盐和硼酸中的一种或多种。

可选地，所述生物发酵在有氧条件下进行。

可选地，所述生物发酵的温度为27～45℃。

优选地，所述生物发酵的温度为30～37℃。

可选地，所述生物发酵的时间不小于24h。

可选地，所述生物发酵过程中控制培养基的pH为6～7.5。

可选地，所述手性乳酸包括D-乳酸和/或L-乳酸。

与现有技术相比，本发明包括以下有益效果：

(1)本发明提供的基因工程菌株以大肠杆菌为出发菌株，并引入了外源性的乙醇脱氢酶基因、乙醛脱氢酶基因和乳酸脱氢酶基因，能够利用二碳化合物生长并发酵得到手性乳酸，克服了现有技术中微生物不能利用二碳化合物进行发酵的缺陷。

(2)采用本发明方法构建的基因工程菌株，结合多种二碳化合物混合培养的方式，可以有效提高手性乳酸的产量和积累时间。尤其当用等浓度的乙醇和乙酸作为共同底物进行发酵时，手性乳酸的产量最高。

附图说明

图1为本发明利用乙醇通路时初始表达载体和重组过表达载体的质粒信息；

图2为本发明以乙醇为唯一碳源时菌株的生长情况示意图；

图3为本发明以乙醇为唯一碳源时乙醇的消耗示意图；

图4为本发明生产手性乳酸时初始表达载体和重组过表达载体的质粒信息；

图5为本发明以乙醇为唯一碳源时不同菌株发酵产乳酸的情况示意图；

图6为本发明以乙醇为唯一碳源时不同菌株对乙醇的消耗示意图；

图7为本发明以乙醇为唯一碳源时调节培养基C/N比对乳酸产量的影响示意图；

图8为本发明以乙醇为唯一碳源时调节培养基C/N比对菌株生长的影响示意图；

图9为本发明以乙酸和乙醇混养时，调节乙酸乙醇的比例对乳酸产量的影响示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。以下所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如下，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买，不经任何特殊处理直接使用。

如无特别说明，实施例中的分析方法均采用仪器或设备的常规设置和常规分析方法。

以下实施例中所用菌株大肠杆菌BW25113的来源为：https://www.mingzhoubio.com/goods-109218.html，购买自宁波明州生物，编号为BMZ066594。

实施例1

重组菌利用乙醇的通路的构建：

在大肠杆菌BW25113中构建乙醇利用模块，表达异源乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶。通过全基因合成的方式合成外源性的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶。将来自酿酒酵母基因组的编码乙醇脱氢酶的ada基因(NCBI的登录号为GenBank:WP_012885841)和来自水稻基腐病菌基因组的编码乙醛脱氢酶的adh基因(NCBI的登录号为GenBank:NP_014032)克隆到pRSFduet-1表达载体上，受Ptrc-tho启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)控制，得重组过表达载体。初始表达载体和重组过表达载体的质粒信息如图1所示。将所述重组过表达载体转入野生型大肠杆菌BW25113感受态中，用抗生素筛选正确的基因工程菌，得到BW-e菌株。乙醇进入大肠杆菌后被催化转化为乙酰辅酶A，以乙酰辅酶A的形式参与微生物的代谢过程。将大肠杆菌种子液接入以200mM乙醇为唯一碳源的种子培养基中(种子培养基：200mM乙醇，13.3g/L KH₂PO₄，4g/L(NH₄)₂HPO₄，1.2g/L MgSO₄，0.0084g/L EDTA，0.0025g/L CoCl₂，0.015g/L MnCl₂，0.0015g/L CuCl₂，0.003g/L H₃BO₃，0.0025g/L Na₂MoO₄，0.008g/L Zn(CH₃COO)₂，0.06g/L Fe(III)citrate)，保证初始接种量为0.05OD₆₀₀，在200rpm，30℃条件下进行有氧培养。其中，BW-e菌株的生长情况如图2所示，乙醇的消耗情况如图3所示。由图2可知，BW-e菌株能够利用乙醇为唯一碳源进行生长，实现了菌量从0.05OD₆₀₀到16OD₆₀₀的变化。同时由图3可知，BW-e利用乙醇的能力也十分可观，在108h内消耗了250mM的底物乙醇。

实施例2

重组菌生产手性乳酸的通路的构建：

通过全基因合成的方式合成外源性的乳酸脱氢酶。将来自乳酸杆菌基因组的编码乳酸脱氢酶的ldh基因(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)克隆到pACYC184质粒上，并且选择L-阿拉伯糖诱导型启动子ParaBAD也即araBAD启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)控制该基因的表达，得重组过表达载体。初始表达载体和重组过表达载体的质粒信息如图4所示。将所述重组过表达载体转入实施例1中的BW-e菌株中，得到BW-el菌株。基于引入乙醇利用模块的大肠杆菌，异源表达D-乳酸脱氢酶，能够将丙酮酸转化为D-乳酸。而没有引入乳酸脱氢酶的菌株BW-L和野生型大肠杆菌WT均无法利用乙醇产乳酸。以初始OD₆₀₀为0.3，分别将不同菌株的菌液接种到含有100mL卡那霉素含量为10μg/mL的种子培养基中(种子培养基：10μg/mL卡那霉素，13.3g/L KH₂PO₄，4g/L(NH₄)₂HPO₄，1.2g/L MgSO₄，0.0084g/L EDTA，0.0025g/L CoCl₂，0.015g/L MnCl₂，0.0015g/L CuCl₂，0.003g/L H₃BO₃，0.0025g/LNa₂MoO₄，0.008g/L Zn(CH₃COO)₂，0.06g/L Fe(III)citrate)，200rpm，30℃进行培养过夜。培养后的菌体通过离心加以采收，然后将菌重新分散于100mL发酵培养基中(发酵培养基：6.8g/L Na₂HPO₄，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，0.25g/L NH₄Cl，1.2g/L MgSO₄，0.0084g/LEDTA，0.0025g/L CoCl₂，0.015g/L MnCl₂，0.0015g/L CuCl₂，0.003g/L H₃BO₃，0.0025g/LNa₂MoO₄，0.008g/L Zn(CH₃COO)₂，0.06g/L Fe(III)citrate)，保证OD₆₀₀为2.2。加入卡那霉素和诱导剂阿拉伯糖，同时加入200mM乙醇为唯一碳源，在30℃条件下进行有氧发酵。其中，不同菌株发酵产D-乳酸的情况如图5所示，不同菌株对乙醇的消耗情况如图6所示。由图5可知，野生型大肠杆菌BW-25113(BW)并不具有产乳酸的能力，同时图6也表明BW无法有效的利用培养基中的乙醇。与BW-el菌株相比，BW-L菌株是在BW中引入了生产手性乳酸的通路(外源性乳酸脱氢酶)，但是BW-L没有构建利用乙醇的通路。由图5可见，尽管BW-L引入了乳酸脱氢酶，依旧无法生产手性乳酸；同时，因为没有构建乙醇利用通路，BW-L与BW一样无法有效利用培养基中的乙醇。与BW-L相比，BW-el引入了乙醇利用通路，可以高效利用乙醇，图5的结果也表明BW-el能够以乙醇为唯一碳源生产手性乳酸。由此可见，为了获得以乙醇为底物发酵产乳酸的目的菌株，乙醇利用通路和乳酸生产通路的构建都很关键。

实施例3

应用大肠杆菌基因工程菌BW-el发酵生产D-乳酸：

(1)研究无机盐培养基的含氮量对乳酸产量的影响：

种子培养基：13.3g/L KH₂PO₄，4g/L(NH₄)₂HPO₄，1.2g/L MgSO₄，微量元素：0.0084g/L EDTA，0.0025g/L CoCl₂，0.015g/L MnCl₂，0.0015g/L CuCl₂，0.003g/L H₃BO₃，0.0025g/LNa₂MoO₄，0.008g/L Zn(CH₃COO)₂，0.06g/L Fe(III)citrate；

发酵培养基：6.8g/L Na₂HPO₄，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，NH₄Cl浓度见表1，1.2g/LMgSO₄，微量元素：0.0084g/L EDTA，0.0025g/L CoCl₂，0.015g/L MnCl₂，0.0015g/L CuCl₂，0.003g/L H₃BO₃，0.0025g/L Na₂MoO₄，0.008g/L Zn(CH₃COO)₂，0.06g/L Fe(III)citrate；

培养方法：以初始OD₆₀₀为0.3，将菌液接种种子培养基中，200rpm，30℃进行培养过夜。培养后的菌体通过离心加以采收。对发酵培养基中的含氮量，即铵根含量，进行调整，调整情况和培养基对应的C/N比如表1所示。

表1发酵培养基中的含氮量及对应的C/N比

C/N比	NH₄Cl浓度(g/L)
		20:1	1
40:1	0.5
		80:1	0.25
400:0	0

将菌重新分散于不同含氮量的100mL发酵培养基，保证OD₆₀₀为2.2。同时加入200mM乙醇为唯一碳源，在30℃条件下进行有氧发酵。不同氮含量的培养条件下，D-乳酸的发酵情况如图7所示，微生物的生长情况如图8所示。

由图7可知，发酵结束后，当NH₄Cl的含量为0g/L或0.25g/L时，基因工程菌BW-el合成D-乳酸的产量最高。与1g/L的NH₄Cl相比，当培养基中含有0.25g/L NH₄Cl时，乳酸的产量从8mM提高为15mM。

(2)研究二碳化合物的种类和配比对乳酸产量的影响：

发酵培养基：6.8g/L Na₂HPO₄，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，0.25g/L NH₄Cl，1.2g/LMgSO₄，微量元素：0.0084g/L EDTA，0.0025g/L CoCl₂，0.015g/L MnCl₂，0.0015g/L CuCl₂，0.003g/L H₃BO₃，0.0025g/L Na₂MoO₄，0.008g/L Zn(CH₃COO)₂，0.06g/L Fe(III)citrate；

培养方法：以初始OD₆₀₀为0.3，将菌液接种种子培养基中，200rpm，30℃进行培养过夜。培养后的菌体通过离心加以采收。然后将菌沉淀重新分散于100mL发酵培养基，保证OD₆₀₀为2.2。同时加入乙醇和乙酸所谓发酵的底物，其中乙醇和乙酸混合物的比例调整如表2所示。

表2发酵培养基中乙醇和乙酸混合物的比例调整

乙醇/乙酸	乙醇加入量(g/L)	乙酸加入量(g/L)
			1:0	10	0
1:1	5	5
			0:1	0	10

在上述不同比例的乙醇和乙酸混合物为碳源的培养条件下，D-乳酸的发酵情况如图9所示。

由图9可知，发酵结束后，当二碳化合物的比例为乙醇:乙酸＝1:1时，基因工程菌BW-el合成D-乳酸的产量最高。与只用乙醇进行发酵相比，当用等浓度的乙醇和乙酸作为共同底物进行发酵时，乳酸的产量从15mM提高为53mM；而与只用乙酸进行发酵相比，当用等浓度的乙醇和乙酸作为共同底物进行发酵时，乳酸的产量从4mM提高到了53mM。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims

1.一种利用二碳化合物合成手性乳酸的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株包括出发菌株、初始表达载体、启动子和外源性基因；

所述出发菌株包括大肠杆菌；

2.根据权利要求1所述的一种利用二碳化合物合成手性乳酸的基因工程菌株，其特征在于，所述初始表达载体包括pRSFduet-1和/或pACYC184。

3.根据权利要求2所述的一种利用二碳化合物合成手性乳酸的基因工程菌株，其特征在于，当所述初始表达载体为pRSFduet-1时，所述启动子包括Ptrc-tho，所述Ptrc-tho的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

4.根据权利要求1所述的一种利用二碳化合物合成手性乳酸的基因工程菌株，其特征在于，所述乙醇脱氢酶基因的NCBI的登录号为GenBank:WP_012885841；

所述乙醛脱氢酶基因的NCBI的登录号为GenBank:NP_014032；

所述乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.权利要求1～4任意一项所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤2)将所述重组过表达载体转入出发菌株的感受态细胞中；

优选地，步骤2)将所述重组过表达载体转入出发菌株中后，还包括用抗生素进行筛选的步骤。

7.权利要求1～4任意一项所述的基因工程菌株在利用二碳化合物合成手性乳酸及其衍生物中的应用。

8.一种利用二碳化合物合成手性乳酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1～4任意一项所述的基因工程菌株接种至培养基中进行生物发酵，得所述手性乳酸。

9.根据权利要求8所述的一种利用二碳化合物合成手性乳酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌株的接种量为0.2～30OD₆₀₀；

优选地，所述基因工程菌株的接种量为2～30OD₆₀₀。

10.根据权利要求8所述的一种利用二碳化合物合成手性乳酸的方法，其特征在于，所述培养基中包括二碳化合物；

所述二碳化合物的初始加入量为5～20g/L；

优选地，所述二碳化合物的初始加入量为8～12g/L；

优选地，所述二碳化合物选自乙醇、乙酸、乙醇盐和乙酸盐中的一种或多种；

优选地，所述二碳化合物为乙醇和乙酸的混合物，所述混合物中乙醇和乙酸的浓度比为1～2:1；

优选地，所述生物发酵在有氧条件下进行；

优选地，所述生物发酵的温度为27～45℃；

优选地，所述生物发酵的温度为30～37℃；

优选地，所述生物发酵的时间不小于24h；

优选地，所述生物发酵过程中控制培养基的pH为6～7.5；

优选地，所述手性乳酸包括D-乳酸和/或L-乳酸。