CN117305169A - 一株链球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株链球菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明筛选了一株可分解利用母乳低聚糖的链球菌，可以以母乳低聚糖为碳源生长，对2’‑岩藻糖基乳糖、6’‑唾液酸乳糖和乳酰‑N‑四糖的利用率达到95.98％以上，并有助于促进不能利用人乳低聚糖的短双歧杆菌的生长。

Description

一株链球菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株链球菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

目前，人们对身体健康愈发重视，对功能性食品的需求量也与日俱增，其中益生菌类食品及保健品得到了快速发展。链球菌属是人体的共生菌属之一，是婴儿肠道菌群的重要组成部分。分离自健康人体的链球菌已被证实具有安全性和益生特性，使其得到了普遍认可。能够通过自身生理活性促进宿主机体健康的有嗜热链球菌、唾液链球菌和乳链球菌等。

母乳低聚糖(Human milk oligosaccharides,HMO)是一类不能被人体消化吸收的水溶性复合物，主要由半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)、唾液酸(Sia)、岩藻糖(Fuc)五种基本的单糖以各种糖苷键组合形成。母乳低聚糖在母乳中的含量较高，仅次于乳糖和脂类。母乳低聚糖被证实对新生儿的健康发育有益。母乳低聚糖可以通过调节婴儿肠道组织细胞的免疫反应，系统影响免疫系统应答，发挥抗炎、抗病毒和抑菌作用。

肠道微生物对母乳低聚糖的利用是其发挥生理活性的重要方式。母乳低聚糖是母乳喂养婴儿肠道微生物的主要碳源，肠道微生物以不同的方式代谢母乳低聚糖，以乳酸和SCFAs作为代谢产物，促进不同细菌的生长。这些细菌通过协调不同的糖利用系统来利用饮食和宿主衍生的糖聚糖，共享消化的低聚糖、碳水化合物活性酶和可发酵的中间分子，以维持肠道微生物共生和改善自身或其他群落的适应能力。此外，利用HMO产生的代谢产物使肠道环境酸性增加，能够抑制致病菌的生长，保护婴儿免受有害的肠道感染。因此，具有母乳低聚糖利用能力的菌株能够调节婴儿肠道菌群的结构和组成，调节婴儿机体免疫系统应答。筛选可以分解利用母乳低聚糖的链球菌菌株，可用于调节婴儿肠道微生态和机体免疫反应，促进婴幼儿微生态制剂的开发和应用，具有重要意义。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中存在的问题，提供一种能够分解利用母乳低聚糖的链球菌。

本发明提供了一株链球菌(Streptococcus sp.)CCFM1328，所述链球菌CCFM1328保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63647，保藏日期为2023年7月14日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

所述链球菌CCFM1328来源于健康女性的母乳，该菌株经基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤进行种属鉴定，结果显示菌株为链球菌属，命名为链球菌CCFM1328，保存于江南大学食品生物技术菌种保藏中心。

所述链球菌CCFM1328在M17固体培养基上的菌落突起，光滑、圆形、乳白色、半透明、直径为0.45mm。

本发明提供了含有所述链球菌CCFM1328的微生物制剂。

在一种实施方式中，所述微生物制剂中链球菌的活菌数不低于4×10⁸CFU/mL或4×10⁸CFU/g。

本发明提出了一种食品，所述食品含有所述的链球菌CCFM1328。所述链球菌CCFM1328具有分解利用母乳低聚糖的能力，可以以母乳低聚糖为碳源生长，特别是可以以人乳低聚糖为唯一碳源生长。因此，所述食品能够为利用母乳低聚糖的益生菌产品开发提供理论依据和可行性。

在一种实施方式中，所述食品中，链球菌的活菌数为不低于2×10⁹CFU/mL或2×10⁹CFU/g。

在一种实施方式中，所述食品是冻干粉。

在一种实施方式中，所述冻干粉的制备方法为：将所述链球菌CCFM1328接种至培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种到培养基中进行培养，得到培养液；将培养液离心，收集菌泥；将菌泥用生理盐水清洗后重悬，得到重悬液；向重悬液中添加冻干保护剂，得到混合液；将混合液真空冷冻干燥，得到冻干粉。

在一种实施方式中，将种子液按2～4％(v/v)的接种量接种到培养基中进行培养。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分包括脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖和水。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂成分为80～120g/L脱脂乳粉、80～140g/L海藻糖、140-180g/L蔗糖和水。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分包括100g/L脱脂乳粉、100g/L海藻糖、160g/L蔗糖和水。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂在重悬液中的添加量为菌泥总重量的2～4倍。

在一种实施方式中，种子培养基为MRS固体培养基，发酵培养基为MRS液体培养基。

在一种实施方式中，所述MRS液体培养基是加了半胱氨酸盐酸盐的MRS液体培养基。

在一种实施方式中，所述半胱氨酸盐酸盐的添加量为按质量分数0.04～0.1％。

在一种实施方式中，将种子液按2～4％的接种量接种到MRS液体培养基中进行培养的培养条件为：34～38℃厌氧培养24h～36h，7000～12000rpm离心20～30min，收集菌泥，用生理盐水清洗3～4次后重悬。

本发明还提供了所述链球菌CCFM1328在分解人乳低聚糖中的应用。

在一种实施方式中，所述人乳低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、乳酰-N-四糖(LNT)中的一种或多种。

本发明还提供了所述链球菌CCFM1328在促进短双歧杆菌生长方面的应用。

在一种实施方式中，所述应用是在含人乳低聚糖的环境中促进短双歧杆菌生长和/或数量增加。

在一种实施方式中，人乳低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳酰-N-四糖中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述应用是将所述链球菌CCFM1328与短双歧杆菌共培养。

有益效果：

(1)本发明提供的链球菌CCFM1328分离自母乳，该菌株对人体无毒副作用，因此采用本发明提供的链球菌CCFM1328制备的食品，相对于传统食品具有一定的优势，并且该菌株可用于制作益生菌制剂等，具有广阔的市场前景。

(2)本发明所提供的链球菌CCFM1328具有分解母乳低聚糖的能力，可以以母乳低聚糖为碳源生长，特别是可以以人乳低聚糖为唯一碳源生长，所述母乳低聚糖为包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)和乳酰-N-四糖(LNT)中的一种或多种。

(3)本发明所提供的链球菌CCFM1328对母乳低聚糖的利用率较高，可利用其维持自身生长代谢，其中对2’-FL的利用率为99.78％，对6’-SL的利用率为97.65％，对LNT的利用率为95.98％。

(4)本发明所提供的链球菌CCFM1328能分解2’-FL，产生中间产物乳糖和岩藻糖；能分解6’-SL，产生中间产物乳糖和唾液酸；能分解LNT，产生中间产物乳糖。

(5)本发明所提供的链球菌CCFM1328分解2’-FL的终产物为乙酸和乳酸，二者比例1:2.19；分解6’-SL的终产物为乙酸和乳酸，二者比例为1:0.99；降解LNT的产物为乙酸和乳酸，二者比例为1:0.89。

(6)本发明所提供的链球菌CCFM1328在6’-SL-M17培养基中生长时能够喂养不能利用6’-SL的短双歧杆菌SH-SJ-MZM1。

生物材料保藏

一株链球菌(Streptococcus sp.)CCFM1328，分类学命名为Streptococcus sp.，已于2023年7月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63647，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1：链球菌CCFM1328与其近源菌株的ANI和dDDH值。

图2：链球菌CCFM1328以母乳低聚糖为唯一碳源时的生长曲线。

图3：链球菌CCFM1328以母乳低聚糖为唯一碳源时的pH曲线。

图4：链球菌CCFM1328以母乳低聚糖为唯一碳源时的母乳低聚糖残留量。

图5：链球菌CCFM1328以母乳低聚糖为唯一碳源时的中间产物。

图6：链球菌CCFM1328以母乳低聚糖为唯一碳源时的终产物。

图7：链球菌CCFM1328利用母乳低聚糖喂养短双歧杆菌SH-SJ-MZM1。

图8：链球菌CCFM1328与短双歧杆菌在6’-SL上纯培养和共培养的菌数。

图1-8中，“*”、“**”、“***”、“****”均表示与无糖组具有显著性差异，*越多，显著性差异越大。具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中使用的链球菌CCFM1328已于2023年7月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63647。短双歧杆菌SH-SJ-MZM1筛选自母乳。

下述实施例中涉及的培养基如下：

M17液体培养基：胰蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉2.5g/L，七水硫酸镁0.25g/L，抗坏血酸0.5g/L，五水合β-甘油磷酸钠19g/L，碳源(2’-FL/6’-SL/LNT/葡萄糖)5g/L。

M17固体培养基：胰蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉2.5g/L，七水硫酸镁0.25g/L，抗坏血酸0.5g/L，五水合β-甘油磷酸钠19g/L，碳源(2’-FL/6’-SL/LNT/葡萄糖/低聚果糖)5g/L，琼脂粉20g/L。

MRS液体培养基：MRS液体培养基：胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、七水硫酸镁0.5g/L、一水硫酸锰0.25g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、三水磷酸氢二钾2.6g/L、Tween80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。

MRS固体培养基：MRS液体培养基：胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、七水硫酸镁0.5g/L、一水硫酸锰0.25g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、三水磷酸氢二钾2.6g/L、Tween80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，琼脂粉20g/L。分离细菌时，固体培养基中添加15mL/L质量浓度为0.5％的溴甲酚紫溶液做指示剂。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

(1)生长曲线和pH值的测定方法：

以1％的接种量将过夜培养的链球菌CCFM1328培养液接种于2’-FL、6’-SL或LNT为唯一碳源的M17液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养24h。每隔2h用可见光分光光度计测定菌液OD₆₀₀,用pH计测定菌液pH值，在以葡萄糖和低聚果糖(GOS)为碳源的M17液体培养基作为阳性对照，以不加糖的M17培养基为阴性对照。每个样本进行三次生物学平行实验。

(2)母乳低聚糖残留量和中间产物生成量的测定方法：

精确吸取链球菌CCFM1328发酵中期和后期的发酵液，采用Savage法除去蛋白质，加MiliQ水稀释5倍，混匀，4℃下以8000g的速度离心5min，离心后，将滤液通过0.22μm的无菌微孔滤膜过滤。经梯度稀释后的样品利用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)检测发酵液中2’-FL、6’-SL、LNT、GOS、岩藻糖、唾液酸、乳糖、半乳糖和葡萄糖的含量。仪器参数设置如下：采用BEH Amide柱，质谱作为检测器，流动相A和B分别为25mM乙酸铵和乙腈，流速为0.3mL/min，柱温维持在50℃。每个样本进行三次生物学平行实验。

(3)母乳低聚糖代谢终产物生成量的测定方法：

精确吸取链球菌CCFM1328发酵后期的发酵液，采用Savage法除去蛋白质，加MiliQ水稀释5倍，混匀，4℃下以8000g的速度离心5min，离心后，将滤液通过0.22μm的无菌微孔滤膜过滤。经梯度稀释后的样品利用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液中乙酸、乳酸和1,2-丙二醇的含量。仪器参数设置如下：采用Aminex HPX-87H柱(300mm×7.8mm，Bio Rad)，示差折光检测器(RID)作为检测器，5mM H₂SO₄作为流动相，流速为0.5mL/min，柱温维持在50℃。每个样本进行三次生物学平行实验。

(4)以母乳低聚糖为碳源的交叉喂养检测方法：

链球菌CCFM1328在以5g/L 6’-SL为碳源的M17培养基中培养10h。吸取发酵液，用0.22μm的无菌微孔滤膜过滤得到无菌的发酵上清液，与新鲜的无糖MRS培养基(不额外添加糖类碳源)1：1混合，以1％的接种量将短双歧杆菌SH-SJ-MZM1接种于混入发酵液的混合培养基中，37℃恒温培养48h，观察菌液是否浑浊。

实施例1：链球菌CCFM1328的筛选与鉴定

1.样品采集

采集江苏省无锡市母乳样本，样本置于装有30％甘油的样品管中，保存于装有冰袋的保温盒中，带回实验室后迅速置于-80℃冰箱待分离筛选。

2.菌株的分离纯化

(1)稀释涂布：取0.5mL保存于30％甘油的母乳样本在无菌环境下加入装有4.5mL生理盐水的7mL离心管中，得到10^-1稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10^-2、10^-3稀释液；

(2)涂布培养：分别吸取100μL上述10^-1、10^-2、10^-3三个梯度稀释液于以2’-FL为唯一碳源并添加了溴甲酚紫为指示剂的M17固体培养基上，用涂布棒涂布均匀，37℃条件下培养，期间观察并于48h后挑取周围变黄的菌落；

(3)一级纯化培养：取菌落数在30～300区间的稀释涂布平板，每个样本随机挑选10个乳白色或白色，表面光滑，边缘整齐，大小不一的单菌落在含葡萄糖的M17固体培养基上划线，放至37℃条件下培养48h，得到单菌落，命名为CCFM1328；

(4)二级纯化培养：取步骤(3)划线平板上单菌落接种于含葡萄糖的M17液体培养基中，至37℃条件下培养20h，得到二级纯化培养液。

3.菌种保藏与鉴定

(1)菌种保藏

将上述二级纯化培养液混匀，取1mL菌液至2mL干净的菌种保藏管，平行5份。6000rpm离心3min，弃去上清，用0.9％的生理盐水重悬菌体，重复上述操作3次。其中4份再次离心并弃上清，加入1mL 30％甘油重悬，静止30分钟后放入-80℃冰箱保藏；1份用于菌种鉴定。

(2)16S rDNA基因序列的扩增和同源性分析

步骤(1)用于菌种鉴定的菌液作为16S rDNA PCR的体系模板。16S rDNA PCR的程序如下：第一步：94℃，5min；第二步：94℃，30s；第三步：55℃，30s，第四步：72℃，2min；第五步：72℃，10min；其中，第二到四步重复30个循环。体系配置如下：正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3’)0.25μL，反向引物1492R(GGTTAC CTTGTTACGACTT)0.25μL，Taq酶Mixture 12.5μL，模板1μL，双蒸水11μL。PCR产物经核酸电泳分析确认后，送苏州金唯智生物科技有限公司测序；将测序返回序列于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和EzTaxon数据库(https://www.ezbiocloud.net/)比对并进行种属确认。

(3)新种基因组学分析

纯化后的CCFM1328菌株以2％接种量添加至MRS培养基中培养至第三代，收集菌泥并送到上海美吉生物医药科技有限公司进行草图测序。16S rDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，运用在线分析平台ANI Calculator(https://www.ezbiocloud.net/)和Genome-to-Gen ome Distance Calculator(https://ggdc.dsmz.de/home.php)分析菌株CCFM1328与其近源菌株的平均核苷酸相似度(Average Nucleotide Identity，ANI))和DNA-DNA杂交(DNA-DNA hybridization，dDDH)。

基因序列比对结果表明，菌株CCFM1328与Streptococcus infantis、Streptococcus oralis、Streptococcus mitis、、Streptococcus pseudopneumoniae、Streptococcus toyakuensis、Streptococ cus pneumoniae的16S rDNA基因序列相似性分别是99.30％，98.66％，98.59％，98.38％，98.38％，98.10％，菌株CCFM1328初步鉴定为链球菌。由图1可知，链球菌CCFM1328与其近源菌株的ANI值分别为94.91％，82.33％，82.34％，82.40％，82.53％，81.87％，dDDH值分别为59.10％，26.00％，26.20％，26.30％，26.40％，26.00％，远低于细菌种水平鉴定的阈值(ANI>95％，dDDH>70％)，因此菌株CCFM1328为链球菌属的潜在新种。

实施例2：链球菌CCFM1328发酵液的制备

链球菌CCFM1328发酵液的制备方法如下：

(1)从甘油管中蘸取链球菌CCFM1328的菌液在含葡萄糖的M17固体培养基上划线，37℃恒温培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于含葡萄糖的M17液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行活化培养，重复此操作3次，得到活化后的菌液。

(2)将步骤(1)得到的活化后的菌液按照按1％(v/v)的接种量接种至含5g/L对应碳源(2’-FL/6’-SL/LNT/葡萄糖/GOS)或不额外添加糖类碳源的M17液体培养基中，37℃培养24h后得到链球菌CCFM1328的发酵液。

实施例3：链球菌CCFM1328对不同母乳低聚糖的利用能力

菌液的制备方法同实施例1中的步骤(1)，将得到的活化后的菌液按照按1％(v/v)的接种量接种至含5g/L对应碳源(2’-FL/6’-SL/LNT/葡萄糖)或不额外添加糖类碳源的M17液体培养基中，每隔2h用可见光分光光度计测定菌液OD₆₀₀，用pH计测定菌液pH值。

由图2可知，链球菌CCFM1328在以5g/L葡萄糖、GOS或三种母乳低聚糖为唯一碳源的培养基上迅速生长，在24h内达到最大生物量(OD₆₀₀>2.0)。其中，以葡萄糖为唯一碳源时生长速率较高，以GOS、2’-FL、6’-SL或LNT为唯一碳源时相对较缓。可见，链球菌CCFM1328能够利用2’-FL、6’-SL和LNT进行生长繁殖。

由图3可知，以5g/L葡萄糖、GOS或三种母乳低聚糖为唯一碳源时，链球菌CCFM1328的发酵液pH值迅速降低，在24h内达到最低值(pH<5.5)。其中，以葡萄糖为唯一碳源时pH值降低较快，以GOS、2’-FL、6’-SL或LNT为唯一碳源时相对较缓。可见，链球菌CCFM1328能够利用2’-FL、6’-SL和LNT发酵产酸。

实施例4：链球菌CCFM1328对母乳低聚糖的利用效率

发酵液的制备方法参照实施例2，用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)检测链球菌CCFM1328利用不同碳源发酵的发酵液中母乳低聚糖的残留量。

由图4可知，链球菌CCFM1328培养24h后，培养基中的2’-FL、6’-SL和LNT显著减少(P<0.05)。菌株对2’-FL、6’-SL和LNT的利用率分别达到了99.78％、97.65％和95.98％。因此，链球菌CCFM1328能够高效分解利用2’-FL、6’-SL和LNT，其中对2’-FL具有较高的的利用效率。

实施例5：链球菌CCFM1328代谢母乳低聚糖的中间产物

发酵液的制备方法参照实施例2，用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)检测链球菌CCFM1328发酵液中岩藻糖、唾液酸和乳糖的含量。

由图5可知，链球菌CCFM1328培养10h后，以2’-FL或6’-SL为唯一碳源的培养基中分别产生了岩藻糖或唾液酸；培养24h时，岩藻糖含量进一步升高，而唾液酸含量降低(<1ppm)。此外，培养10h时，2’-FL和6’-SL培养基中均出现了少量乳糖(5-25ppm)，而在培养24h时显著降低(<1ppm)。这说明菌株在生长过程中分解母乳低聚糖，产生了各自相应的结构单体，包括岩藻糖、唾液酸和乳糖。其中，乳糖和唾液酸被菌株进一步分解利用以维持生长和代谢活动；岩藻糖未被进一步分解，或仅部分被分解，从而在发酵液中积累。此外，在培养过程中，未在LNT培养基中检测到乳糖的产生，而根据实施例3可知链球菌CCFM1328能够分解利用LNT，因此推测菌株能够分解LNT产生乳糖，但乳糖迅速被菌株进一步代谢分解，从而使发酵液乳糖浓度处于较低水平。综上所述，链球菌CCFM1328能够分解2’-FL产生中间产物岩藻糖和乳糖，分解6’-SL产生唾液酸和乳糖，分解LNT产生乳糖。

实施例6：链球菌CCFM1328代谢母乳低聚糖的终产物

发酵液的制备方法参照实施例2，用高效液相色谱检测链球菌CCFM1328利用不同碳源发酵的发酵液中乳酸、乙酸的含量。

由图6可知，链球菌CCFM1328培养24h后，以2’-FL、6’-SL或LNT为唯一碳源的培养基中均产生了乙酸和乳酸。2’-FL培养基中乙酸和乳酸的质量比为1:2.19，其中乙酸浓度为0.648±0.013mg/mL，乳酸浓度为1.420±0.005mg/mL；6’-SL培养基中乙酸和乳酸的质量比为1:0.99，其中乙酸浓度为1.171±0.003mg/mL，乳酸浓度为1.156±0.045mg/mL；LNT培养基中乙酸和乳酸的质量比为1:0.89，其中乙酸浓度为1.060±0.003mg/mL，乳酸浓度为0.947±0.045mg/mL。因此，链球菌CCFM1328能够分解利用2’-FL、6’-SL和LNT，产生终产物乙酸和乳酸。

实施例7：链球菌CCFM1328利用6’-SL喂养短双歧杆菌SH-SJ-MZM1

含链球菌CCFM1328-6’-SL发酵液的混合培养基制备方法如下：

链球菌CCFM1328发酵液的制备方法同实施例2，区别在于培养时长为10h。发酵液用0.22μm的无菌微孔滤膜过滤，并与新鲜的无糖MRS培养基(不额外添加糖类作碳源)以1：1的体积比混合，以此作为短双歧杆菌SH-SJ-MZM1的培养基。

链球菌-短双歧杆菌共培养体系设计和细菌计数的方法如下：

链球菌CCFM1328和短双歧杆菌SH-SJ-MZM1分别接种到MRS液体培养基中活化三次，将活化好的两种细菌按1％的接种量单独或以链球菌：短双歧杆菌数量比为1：1混合接入含5g/L 6’-SL的MRS液体培养基中，置于37℃厌氧培养箱，培养48h后进行计数。

采用倾注法测定链球菌CCFM1328和短双歧杆菌SH-SJ-MZM1单独或共培养后的细菌数量，具体测定方法为：培养48h后的菌液进行梯度稀释并选择合适的稀释梯度，将单独培养的菌液倾注在正常的MRS固体平板上，共培养的菌液分别倾注在链球菌选择性培养基(以6’-SL为唯一碳源的MRS平板)和短双歧杆菌选择性培养基(以岩藻糖为唯一碳源的MRS平板)中，置于37℃厌氧培养箱中培养48h后计数。选择性培养基的设计以菌株碳源的利用特性为依据，链球菌能利用6’-SL进行生长繁殖，而短双歧杆菌能在以岩藻糖为唯一碳源的培养基中生长。

由图7(A：短双歧杆菌SH-SJ-MZM1以葡萄糖为碳源生长，B：短双歧杆菌SH-SJ-MZM1以6’-SL为碳源生长，C：短双歧杆菌SH-SJ-MZM1以链球菌CCFM1328利用6’-SL后的发酵液为碳源生长)可知，短双歧杆菌SH-SJ-MZM1不能以6’-SL为唯一碳源生长繁殖，培养48h后的OD₆₀₀为0.089；而能以链球菌CCFM1328的6’-SL发酵液中的碳源进行生长繁殖，培养48h后的OD₆₀₀为0.831，活菌数为(4.3±0.6)×10⁸CFU/mL。因此链球菌CCFM1328能通过胞外酶分解6’-唾液酸乳糖，释放乳糖和唾液酸，喂养无6’-唾液酸乳糖利用能力的短双歧杆菌SH-SJ-MZM1。

链球菌与短双歧杆菌在6’-SL培养基中纯培养以及共培养的活菌数量结果如图8所示，其中，黑色柱子表示短双歧杆菌在不同培养方式下的活菌数，灰色柱子表示链球菌在不同培养方式下的活菌数。短双歧杆菌SH-SJ-MZM1在6’-SL培养基中纯培养的活菌数为2.83×10⁵CFU/ml，共培养的活菌数增加至2.2×10⁸CFU/ml左右。链球菌CCFM1328纯培养和共培养的活菌数相似，约为1.9×10⁸CFU/ml。因此，链球菌CCFM1328和短双歧杆菌SH-SJ-MZM1在6’-SL培养基中共培养时存在交叉喂养，短双歧杆菌的活菌数得到显著提升。

实施例8：链球菌CCFM1328冻干制剂的制备

具体步骤如下：

(1)菌株的活化：从甘油管中蘸取链球菌CCFM1328的菌液在MRS固体培养基上划线，37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h进行活化培养，重复此操作3次，得到活化后的菌液。

(2)将步骤(1)得到的菌液按2％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养24h得到发酵液，将得到的发酵液在8000rpm下离心20min后收集菌泥，将菌泥用生理盐水清洗3次后备用，并调整活菌数1×10¹¹CFU/mL。

(3)冻干保护剂的配制：将100g/L脱脂乳粉、100g/L海藻糖、160g/L蔗糖和余量的水混合后得到冻干保护剂。

(4)向步骤(2)中得到的菌泥中添加上述配制好的冻干保护剂，其中冻干保护剂的重量为菌泥重量的3倍，混合均匀后进行真空冷冻干燥，最后将冻干得到的制剂真空包装。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株链球菌(Streptococcus sp.)CCFM1328，所述链球菌CCFM1328保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63647，保藏日期为2023年7月14日。

2.含有权利要求1所述链球菌CCFM1328的微生物制剂。

3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中链球菌CCFM1328的活菌数不低于4×10⁸CFU/mL或4×10⁸CFU/g。

4.含有权利要求1所述链球菌CCFM1328的食品。

5.权利要求1所述的链球菌CCFM1328在分解人乳低聚糖中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述人乳低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳酰-N-四糖中的一种或多种。

7.权利要求1所述的链球菌CCFM1328在促进短双歧杆菌生长方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是在含人乳低聚糖的环境中促进短双歧杆菌生长和/或数量增加。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述人乳低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳酰-N-四糖中的一种或多种。

10.根据权利要求7～9任一所述的应用，其特征在于，所述应用是将所述链球菌CCFM1328与短双歧杆菌共培养。