CN117298078A - 姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物制备技术领域，具体公开了姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用。本发明提供的姜黄素干预能够缓解低氧暴露导致的学习记忆障碍，改善低氧导致的海马神经元树突棘密度下降和突触损伤，上调PSD‑95和NMDAR1表达，抑制低氧诱导的神经炎症反应及氧化应激，有制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物的潜力。

Description

姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的 应用

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用。

背景技术

我国高原面积分布辽阔，平均海拔高度在4000m以上，高原自然环境具有低压低氧、紫外线强、寒冷等特点，其特殊的气候条件及地理环境影响高原居住人群的身心健康，由于高原环境的氧含量低于平原地区，当人体长时间暴露于低压低氧环境中会出现不同程度的缺氧症状引发疾病，主要表现为高原肺水肿、高原脑水肿等，同时中枢神经系统对低压低氧环境极其敏感，长期暴露于低氧环境诱发记忆力、注意力及认知功能的异常，因此，改善高原低氧环境影响认知能力及防护药物的研究逐渐成为研究者广泛关注的问题。

海马区作为对高原低氧环境最敏感的脑组织结构，是与中枢神经系统及空间认知功能密切相关的脑部区域。海马组织在学习与记忆功能中具有十分重要的作用，极易受到低压低氧的损害。

姜黄素是一种天然化合物，具有良好的抗炎和抗癌特性，姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种二酮类化合物，化学式为C₂₁H₂₀O₆。其中，姜黄中约含姜黄素3％～6％，是植物界很稀少的具有二酮结构的色素。姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦，不溶于水，在食品生产中主要用于肠类制品、罐头、酱卤制品等产品的着色。姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆等作用。但是并未有关于姜黄素干涉低氧暴露致学习记忆障碍中的相关记载。预防和治疗低氧暴露致学习记忆障碍的药物也十分罕见。

发明内容

为寻找一种预防和治疗低氧暴露致学习记忆障碍药物原料，本发明提供了姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，本发明提供的姜黄素干预能够缓解低氧暴露导致的学习记忆障碍，改善低氧导致的海马神经元树突棘密度下降和突触损伤，上调PSD-95和NMDAR1表达，抑制低氧诱导的神经炎症反应及氧化应激，有制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物的潜力。

本发明提供了姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用。

进一步地，所述姜黄素对于C57BL/6雄性小鼠的给药剂量为200-400mg/kg体重/天。

进一步地，所述姜黄素对于C57BL/6雄性小鼠的给药剂量为400mg/kg体重/天。

进一步地，所述姜黄素能够用于制备低氧暴露原代培养的海马神经元树突棘的保护剂。

进一步地，所述姜黄素能够用于制备低氧暴露小鼠海马神经元突触结构的保护剂。

进一步地，所述姜黄素能够用于制备突触发育相关的分子表达促进剂。

进一步地，所述突触发育相关的分子为PSD-95和NMDAR1。

进一步地，所述姜黄素能够用于制备炎症因子表达抑制剂。

进一步地，所述炎症因子包括IL-1β、IL-6和TNF-α。

进一步地，所述药物还含有其他活性成分和辅料。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供了姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，所述姜黄素干预能够缓解低氧暴露导致的学习记忆障碍，改善低氧导致的海马神经元树突棘密度下降和突触损伤，上调PSD-95和NMDAR1表达，抑制低氧诱导的神经炎症反应及氧化应激，其机制可能与纠正了低氧导致的海马组织内胆汁酸、苯丙氨酸等代谢异常有关，有制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物的潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为姜黄素干预对低氧暴露小鼠长时程空间记忆的改变(n＝12；**：P＜0.01；*：P＜0.05)；

其中，图A为姜黄素干预下低氧暴露小鼠的定位航行轨迹图；

图B为姜黄素干预下低氧暴露小鼠到达平台潜伏期；

图C为姜黄素干预下低氧暴露小鼠平台周边探索距离；

图D为姜黄素干预下低氧暴露小鼠目标象限探索距离；

图E为姜黄素干预下低氧暴露小鼠穿越平台时间；

图F为姜黄素干预下低氧暴露小鼠目标象限停留时间。

图2为姜黄素干预对低氧暴露小鼠恐惧记忆的改变(n＝12，**：P＜0.01；*：P＜0.05)。

图3为姜黄素干预对低氧暴露小鼠短期工作记忆的影响；

其中，图A为姜黄素干预对低氧暴露小鼠运动轨迹图；

图B为姜黄素干预对低氧暴露小鼠新臂探索次数百分比(％)；

图C为姜黄素干预对低氧暴露小鼠新臂停留时间百分比(％)。

图4为姜黄素干预对低氧暴露小鼠海马神经元树突棘密度的改变(n＝3；**：P＜0.01)；

其中，图A为姜黄素干预下低氧暴露小鼠海马高尔基染色，bar＝100μm；

图B为姜黄素干预下低氧暴露小鼠代表性树突棘形态，bar＝5μm；

图C为姜黄素干预下低氧暴露小鼠树突棘密度的定量。

图5为姜黄素干预对低氧暴露小鼠原代海马神经元树突棘形态的改变(n＝3，**：P<0.01；*：P＜0.05)；

其中，图A为姜黄素干预下低氧暴露小鼠低倍镜下树突棘形态图，bar＝10μm；

图B为姜黄素干预下低氧暴露小鼠高倍镜下树突棘形态图，bar＝5μm；

图C为姜黄素干预下低氧暴露小鼠树突棘密度统计图。

图6为姜黄素干预低氧暴露小鼠海马神经元突触结构的改变(n＝3；**：P＜0.01)；

其中，图A为姜黄素干预下低氧暴露小鼠海马神经元突触超微结构，bar＝500nm，红色箭头指示超微结构变化；

图B为姜黄素干预下低氧暴露小鼠突触数量统计图。

图7为姜黄素干预对低氧暴露小鼠海马组织NMDAR1及PSD-95表达水平的改变(n＝3；**：P＜0.01；*：P＜0.05)；

其中，图A为姜黄素干预对低氧暴露小鼠海马组织NMDAR1及PSD-95蛋白电泳图；

图B为姜黄素干预对低氧暴露小鼠海马组织PSD-95蛋白相对表达量；

图C为姜黄素干预对低氧暴露小鼠海马组织NMDAR1蛋白相对表达量。

图8为姜黄素干预对低氧暴露HT22细胞NMDAR1、PSD-95表达水平的变化(n＝3；**：P＜0.01；*：P＜0.05)；

其中，图A为姜黄素干预对低氧暴露HT22细胞NMDAR1、PSD-95蛋白电泳图；

图B为姜黄素干预对低氧暴露HT22细胞NMDAR1、PSD-95蛋白相对表达量。

图9为姜黄素对低氧暴露小鼠海马CA1区PSD-95表达水平的变化(n＝3；**：P＜0.01)；

其中，图A为姜黄素对低氧暴露小鼠海马CA1区PSD-95免疫荧光染色图；

图B为姜黄素对低氧暴露小鼠海马CA1区PSD-95荧光强度统计图。

图10为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织炎症细胞因子表达水平的影响(n＝3；***：P＜0.001；**：P＜0.01；*：P＜0.05)；

其中，图A为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织IL-1β含量的影响；

图B为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织IL-6含量的影响；

图C为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织TNF-α含量的影响。

图11为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织炎症细胞因子mRNA表达的变化(n＝3；**：P＜0.01；*：P＜0.05)；

其中，图A为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织炎症细胞因子IL-1βmRNA表达水平的影响；

图B为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织炎症细胞因子IL-6mRNA表达水平的影响；

图C为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织炎症细胞因子TNF-αmRNA表达水平的影响。

图12为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织氧化应激水平影响(n＝3；***：P＜0.001；**：P＜0.01；*：P＜0.05)；

其中，图A为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织GSH含量的影响；

图B为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织GSH-PX酶活性的影响

图C为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织MDA含量的影响；

图D为姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织SOD酶活性的影响。

图13为代谢组学分析小鼠海马代谢物表达的改变；

其中，图A为代谢物筛选韦恩图；

图B为代谢物筛选聚类热图；

图C为代谢物筛选韦恩图；

图D为代谢物筛选聚类热图。

图14代谢组学分析小鼠海马代谢物表达的KEGG富集通路图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用。

一、实验材料与试剂耗材

1、实验动物

48只3周龄C57BL/6雄性小鼠，体重8-10g，空军军医大学实验动物中心提供(许可证号：SYXK-2019-001)。饲养于洁净级动物房，温度控制维持(22-24℃)，期间室内环境安静，自由进食及饮水，保持正常昼夜节律。

2、实验仪器

冰冻切片机(CM1900)，德国Leica公司；

激光共聚焦显微镜(尼康A1)，日本Nikon公司；

反转录基因扩增仪，美国ABI公司；

PCR基因扩增仪(7500)，美国ABI公司；

共聚焦活细胞皿，美国Thermo公司。

3、实验试剂

姜黄素，美国Sigma公司；Neurobasal培养基，美国Gibco公司；Trizol，美国Invitrogen公司；SYBR Green PCR试剂盒，日本Takare公司；逆转录试剂盒，日本Takare公司；DEPC水，美国Sigma公司；B-27添加剂，美国Gibco公司；L-Glutamine谷氨酰胺，美国Thermo公司；多聚赖氨酸，美国Sigma公司；原代胰酶，美国Gibco公司；链霉素，美国MP公司；青霉素，美国MP公司；过氧化氢(H₂O₂)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；丙二醛(MDA)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子a(TNF-a)ELISA检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；白细胞介素1β(IL-1β)ELISA检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；白细胞介素6(L-6)ELISA检测试剂盒，南京建成生物工程研究所。

二、实验方法

(一)建立体内外低氧暴露模型

1、小鼠低氧暴露模型：

小鼠随机分为对照组、低氧组、低氧+姜黄素200mg/kg组及低氧+姜黄素400mg/kg组，每组12只。低氧组、低氧+姜黄素200mg/kg组及低氧+姜黄素400mg/kg小鼠均置于高原环境模拟舱低氧暴露2周，海拔高度设为6000m，海拔上升速率设为5-8m/s，期间持续给药及每5d降低舱内海拔更换垫料，补充水和食物。对照组小鼠饲养于洁净级动物房。

2、姜黄素给药干预

(1)动物模型干预：将姜黄素粉末加入小鼠饲料中经口给药，浓度分为低浓度剂量组及高浓度剂量组(浓度为1.33mg/g及2.67mg/g)，测量摄入量后计算给药剂量为200mg/kg体重/天与400mg/kg体重/天。低氧+姜黄素干预组小鼠连续药物干预4周，第3周开始低氧暴露2周。

(2)细胞模型干预：根据分子量按10mmol/L的母液浓度后将姜黄素粉溶于DMSO中，给药时将母液稀释至5μM及10μM备用。

3、建立原代海马神经元低氧暴露模型

清洁级胎龄14d的C57BL/6孕鼠，空军军医大学实验动物中心提供。孕鼠胚胎取出，体视显微镜下剥弃脑膜，同时剪碎过滤海马组织，培养周期大概为12-14d。使用Neurobasal培养基(B-27、L-Glutamine、青霉素)，培养期间每3d半换液，14d后神经元状态良好，低氧组换低氧培养液，姜黄素干预组加入姜黄素溶液，随后将原代神经元放置低氧工作站进行低氧暴露，氧浓度设置为1％。

4、细胞低氧暴露模型

HT22小鼠海马神经元作为细胞系，用DMEM-High Glucose培养液加10％胎牛血清进行细胞培养。细胞进行16h贴壁，密度至70％，低氧组换低氧培养液，脱落酸干预组加脱落酸溶剂，将细胞置于低氧工作站进行低氧暴露，氧浓度为1％，细胞培养液预先置于低氧工作站9小时以平衡氧浓度，低氧暴露24h、48h结束进行后续实验。

(二)细胞培养

1、培养原代小鼠海马神经元

准备条件：超净台、精细手术剪、镊子、滴管、移液器、Φ10cm细胞培养皿、Φ6cm细胞培养皿、活细胞成像培养皿紫外照射，准备冰盆。

(1)提前配制溶液：

a.多聚赖氨酸：用高压灭菌后的无菌水将25M的多聚赖氨酸稀释为1M浓度，随后将1％多聚赖氨酸浓度稀释为0.1％，提前一天包被活细胞成像培养皿。第二天用高压灭菌ddH₂O洗两遍备用。

b.配制培养液：Neurobasal培养基50ml加B-27 1ml，谷氨酰胺500μl，双抗30μl。

(2)取胚胎：提前准备冰盆，Φ10cm细胞培养皿、Φ6cm细胞培养皿放PBS于冰盆上，孕鼠脱颈，快速剖开腹部将胚胎取出，皿中放入头部，使用体视超清显微镜取出大脑，将海马组织剥离，脑膜及出血点弃去，放入灭菌的PBS中，实验过程中，从外入内的过程中每步更换新的手术镊与剪刀，全程在冰上进行，无菌操作。

(3)清洗：PBS清洗海马组织。

(4)消化：加入2ml原代胰酶，于37℃孵箱进行消化，每隔5分钟用滴管进行吹打，全程手法轻微，保证消化充分。

(5)制作悬液：消化结束后，加入Neurobasal混合培养基制单细胞悬液，混匀后静止60s，取上清液到新的10mL无菌EP管中。

(6)离心：900rpm，5min。

(7)细胞培养：上清液弃去，制单细胞悬液，过滤。细胞计数后接种于培养皿中，37℃孵箱培养。

(8)换液：每隔三天进行半换液。培养期间观察细胞状态，培养至14d加入药物干预进行后续实验。

2、HT22小鼠海马神经元培养

(1)细胞复苏：在10mL的离心管中加DMEM-High Glucose培养液(含10％胎牛血清，100μg/mL链霉素，100U/mL青霉素)5mL。用镊子从液氮中迅速取出装有HT22细胞的冻存管，立即放入37℃水浴锅中，轻轻震荡加速其融化，约100s，待细胞融化完全，消毒后迅速放入超净台。用1mL的移液枪将细胞转移至已经准备的装有10％完全培养液的10mL离心管中，1000r/min离心10min。离心完成后将上层培养液弃去，加入新配的完全培养液2mL，用移液枪将细胞吹打均匀，转移到新的培养瓶中，将培养液加至5mL。在显微镜下观察细胞状态，放入恒温培养箱中。48h换一次培养液。

(2)细胞传代：当细胞处于对数生长期，且长满瓶底的80％左右时，将培养瓶中旧的培养液弃掉，加入1mL PBS平衡盐溶液润洗2次，弃掉后，加入2mL含有EDTA的胰酶，放入恒温箱中约6min，在光学显微镜下观察细胞突起缩回，细胞间隙增大，近乎缩成圆形时，加10％的完全培养液2mL终止消化，用移液移液枪吹打细胞至呈单细胞状态，转移至10mL离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，加入新的完全培养液，用移液枪吹打使细胞成悬浮状态，将细胞分装至3～5个培养瓶中，进行传代培养。

(三)行为学实验

1、Morris水迷宫实验

①实验准备：实验前，将小鼠放入行为学实验室提前适应环境3d，进行实验室水迷宫水池内卫生清洁，室内温度维持22-24℃，放入清水，水温约为23℃左右，将平台放入目标象限中。

②实验共分成两个阶段，首先为训练期，为期5天。将小鼠从任选象限放入水中找平台，时间计为90s，如小鼠未能在指定时间找到平台，用引导杆助小鼠找到平台位置，停留20s，假如小鼠找到平台后，系统软件设置小鼠在平台停留时间10s后结束实验，换下一只小鼠。四个象限按照顺时针方向分别入水找寻平台。实验全程保持安静，操作步骤一致。

2、Y迷宫实验

①实验准备：将行为学实验室打扫干净，Y迷宫装置酒精擦拭干净，将装置放置摄像头中间位置，准备挡板阻断新臂。

②实验分为训练及测试2个部分。训练时将新臂入口进行阻断，小鼠自起始臂放入，观察记录小鼠在迷宫内探索轨迹，时间5min。1小时后开始测试，打开新臂入口，从自起始臂将小鼠放入，时间设5min，记录小鼠进入新臂的次数和时间以及进入3个臂的总次数。

③实验过程中步骤保持一致，全程安静。

3、条件恐惧实验

①实验准备：将行为学实验室打扫干净，条件恐惧箱装置使用酒精擦拭，测试软件装置电击与声音是否正常。

②实验分为3日，第1日，小鼠在无外界刺激的情况下，将其置于条件恐惧箱中5min；第2日，将小鼠置于条件恐惧箱中，60s后进行单频率的声刺激(声强80db，时间30s)，在声刺激结束后2s，进行电刺激(电流强度0.5mA，频率5000赫兹)，连续3次，间隔60s，共360s；第3日，在不施加任何条件性刺激情况下，观察2min的僵直情况。

(五)高尔基染色实验

腹腔注射1％戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉开胸，脑组织于高尔基液(A:B＝1:1)中浸泡，在常温条件下避光放置14d。用刀片修剪脑组织，502胶水黏住底部轻放入槽内，用振动切片机进行脑组织切片，厚度设为100μm，振动幅度5档，切片速度3档。双蒸水漂洗2次，每次4分钟，高尔基液(D:E:双蒸水＝1:1:2)染色10min。染色结束后双蒸水漂洗2次，50％、75％、95％、无水乙醇依次脱水，最后在二甲苯中透化，在干净的黏附载玻片上用树脂封片剂封片，避光晾干后显微镜观察。

(五)慢病毒感染原代海马神经元实验

①实验准备：将慢病毒保存于-80℃冰箱，可提前按需求进行分装保存以避免反复冻存造成的影响，全程避光处理，首先进行感染预实验选择合适的MOI值。按照实验安排准备共聚焦活细胞皿及3.5cm皿提前一天进行多聚赖氨酸包被处理，紫外照射一晚后，PBS洗三遍备用。

②筛选MOI值：按上述培养原代海马神经元步骤，以5×10⁴密度接种于3.5cm皿中，MOI值为0、2.5、5、10、20、50，根据公式计算每孔应加入的病毒量。原代海马神经元培养3d后将病毒加入皿中，14h后换液，3d后荧光显微镜下观察细胞荧光强度，选择适宜的强度进行后续实验的MOI值。

③正式实验：培养3d后的神经元半换液，期间持续观察细胞状态，培养至第5d病毒量按筛选好的MOI＝10的计算量直接加入皿中。14h后换液，持续培养3d后加入姜黄素溶剂，继续培养3d进行一次半换液，加入病毒后全程避光，期间观察细胞状态，72h后观察病毒荧光强度。

④低氧模型建立：原代海马神经元持续培养14d-21d后观察树突棘形态变化，低氧暴露时间为24h/48h。

(六)透射电镜实验

小鼠麻醉后取脑，冰上剥离海马组织，放电镜固定液中4℃避光固定2～4h。切为1mm×1mm×1mm组织块，0.1mol/LPB缓冲液漂洗6次，每次5min，1％锇酸的PB溶液固定1h，无水乙醇进行梯度脱水，包埋。待包埋剂聚合后修块，超薄切片机切片，厚度60～80nm，铀铅双染色。

(七)蛋白提取、制作样品

1、小鼠海马组织标本采集和蛋白提取制样

①组织裂解：按10mg组织：100μl蛋白裂解液比例加入组织中。电动匀浆器充分研磨后在冰上裂解10min，之后超声裂解3s×10次，冰上静止裂解5min。

②离心：4℃，12500rpm，15min。蛋白定量：BCA试剂盒AB液按比例(A:B＝50:1)混合，每孔加200μl混合液和蛋白样品2μl，混匀。调零孔内只添加AB混合液。混合样品后的96孔板放置37℃恒温金属加热器中孵育30min。用酶标仪进行浓度检测。

③制样：计算体积，加入5×loading buffer，100℃5min。

2、细胞样品采集和蛋白提取制样

①弃去培养基，加入2ml PBS，洗3遍。

②加裂解液，冰上裂解5min。

③将裂解后的细胞碎片轻轻刮下收于新的1.5ml EP管内。

④于冰上超声破碎仪裂解细胞，3s×10次，静止裂解10min。

⑤后续操作同上述步骤。

(八)Western blot实验

(1)备胶：

a.实验准备：将玻璃板提前洗净烘干，放入板夹夹紧。准备50mlEP管，异丙醇，10孔板。

b.制胶：根据凝胶配方进行配制，快速混匀后倒入对齐放置配胶架中的玻璃板内，同时加200μl异丙醇进行压胶，大约1h凝固。凝固后，将异丙醇倒出同时用滤纸小心吸干上层胶上剩余液体，加入下层胶溶液混匀后加入板内，从边缘小心插入梳子，过程中避免气泡，约1h凝固。

c.保存：将配置好的胶放入盛ddH2O的盒子内，于4℃保存。

(2)电泳：

a.配置电泳液：根据需要配置适量1x的电泳液。

b.上样：向电泳槽中倒入适量电泳缓冲液，过程中观察漏液情况，轻拔梳子，加入Marker，之后根据蛋白定量后计算的上样量从加样孔内依照分组情况加入样品，上样过程保持匀速。连接电泳装置，设电压幅值80V，时间初设30min。当电泳到分离胶界面的时候，更改电压幅值120V，根据目标蛋白分子量设置电泳时间。

(3)电转：

a.电泳过程中提前配置1x电转缓冲液，4℃预冷。

b.准备PVDF膜，转膜前用甲醇泡2min，准备好冰盆。电泳结束后，将玻璃板从板夹中取出，使用转膜板将短胶板分开，划掉浓缩胶，将分离胶通过水流从左边缓慢脱离玻璃板，顺序为黑海绵、白海棉、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、白海棉、黑海绵依次置电转夹中，过程中避免气泡，设置电流为250mA，根据分子量大小调整时间。

c.封闭及一抗、二抗孵育：室温于BSA中封闭2h。PVDF膜移至相应一抗中(兔抗PSD-95 1:1000；鼠抗NDR1/2 1:1000；兔抗NMDAR1 1:1000；兔抗NMDAR2A 1:1000；β-actin 1:1000)，摇床4℃过夜。第二天TBST洗膜3次，10min/次，之后进行对应二抗(山羊抗小鼠lgG1:1000；山羊抗兔lgG 1:1000)。室温2h摇床孵育。

d.发光：二抗孵育结束后，将PVDF膜用TBST洗10min，共3次。全能凝胶成像系统进行观察，按照(A:B＝1:1)比例将发光液配置均匀，从左至右均匀滴入后开始检测。使用Image J对条带开始灰度分析。

(九)免疫荧光染色实验

(1)取脑组织：小鼠麻醉后，0.9％生理盐水和4％多聚甲醛对小鼠心脏灌流，将脑组织放4％多聚甲醛固定16h后，将脑组织放入20％-30％蔗糖溶液(PB配)10mLEP管中，4℃保存，进行3d脱水。

(2)切片：箱体温度设为-23℃，设置样本夹温度-25℃。将箱内整理干净，设置切片厚度18um，安装刀片，拿出冻台，冻台缺口朝上，将包埋剂平整地涂在冻台上进行速冻。将脑组织倒掉蔗糖溶液，取出组织，垂直切掉小脑，使用滴管将脑组织周围裹上包埋剂，将脑组织垂直立在原先冻住的包埋剂平面上，放回箱内进行冷冻12h以上。切片后，将片子放置-20℃保存。后续染片时，需将片子提前室温至少晾2h。

(3)用画圈笔在脑片周围画圈，PBS洗1遍，3min，200ul的5％BSA(含0.3％Triton)滴加在组织上室温摇床封闭1h。

(4)PBS洗1次，3min，加一抗(兔抗PSD95 1:1000；鼠抗NDR1/2 1:1000)在脑片上，4℃过夜。

(5)PBS洗3次，10min，加二抗(HRP山羊抗小鼠lgG 1:1000；HRP山羊抗兔lgG 1:1000)，室温避光孵育1h。

(6)封片。二抗孵育结束后，用PBS洗3遍，10min，使用适量的封片液(内含DAPI)滴加在组织上，盖玻片小心盖住，过程避免气泡。

(十)qRT-PCR

1、小鼠海马组织RNA提取

将每个装有小鼠海马组织的EP管中加入1mlTRIzol，电动匀浆器研磨后冰上充分裂解15min；加200μl三氯甲烷，剧烈晃动于冰上静置10min；离心4℃，12000rpm，15min；将上清(400-500μl)吸到新的1.5mlEP管中，加与上清体积相同的异丙醇，于冰上静置10min；离心，12000rpm，15min；弃上清，加入75％无水乙醇；离心，12000rpm，5min；弃上清，等待RNA沉淀变干燥；加20μl DEPC水，检测浓度。

2、RNA定量及反转录

(1)仪器调零，按分组进行定量并记录数值。

(2)采用Takara公司反转录试剂盒将RNA转为cDNA。

3、qRT-PCR检测

(1)根据荧光定量PCR检测试剂盒TBPremix Ex TaqTMⅡ，体系设为20μL：SYBRMPrimex Ex Taq II 10μL，Forward Primer 0.8μL，Reverse Primer 0.8μL，cDNA 2μL，ROX Reference Dye II 0.4μL，RNase Free dH₂O 6μL。

(2)引物序列：

表1qRT-PCR检测引物序列

(3)实验步骤

a.根据体系及试剂盒说明按分组加入对应的试剂在96孔板中，每个样品设置3个复孔，添加过程中全程使用无酶枪头。

b.反应条件：分为三个阶段。检测结束后进行数据保存并整理，根据2^-ΔΔCT值判断RNA的表达水平。

(十一)Elisa实验

1、样品制备：小鼠海马组织剥出，液氮迅速冷冻保存。根据重量体积比1g:9mL的比例加入9倍体积的PBS(PH7.4)。电动匀浆机粉碎组织，离心2000-3000转/分，20min，收上清。

2、试剂准备：

(1)试剂盒使用前室温静置30min。

(2)按试剂盒说明将试剂按要求制备稀释、混匀备用。

(3)说明书操作实验步骤。

(十二)氧化应激指标检测

1、制备组织匀浆：小鼠海马组织加0.86％冷生理盐水，电动匀浆机制成10％的组织匀浆，2000r/min离心15min，根据后续实验按说明剂量添加。

2、具体测定方法参考试剂盒说明书。

(十三)代谢样本提取及代谢标志物的筛查与鉴定

1、代谢物提取(小鼠海马组织样本)：

(1)将被液态氮碾碎的100mg组织样品放入EP管中，加500μL 80％甲醇；

(2)振荡，冰浴5min，15000g，4℃离心20min；

(3)质谱溶液稀释上清液，使其含有53％的甲醇；

(4)15000g，4℃离心20min，收上清，LC-MS分析。

2、仪器参数

(1)色谱条件

色谱柱：HypesilGoldcolumn(C18)

柱温：40℃

流速：0.2mL/min

正模式：流动相A：0.1％甲酸流动相B：甲醇

负模式：流动相A：5mM醋酸铵，pH9.0流动相B：甲醇

色谱梯度洗脱程序见表2：

表2色谱梯度洗脱程序

(2)质谱条件

扫描范围选择m/z 100-1500；ESI源的设置如下:Spray Voltage:3.2kV；Sheathgas flow rate:40arb；Aux Gas flow rate:10arb；Capillary Temp:320℃.Polarity:positive；negative；MS/MS二级扫描为data-dependent scans.

(3)代谢物鉴定

将下机数据(.raw)文件导入CD搜库软件中，进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后对不同样品根据保留时间偏差0.2min和质量偏差5ppm进行峰对齐，使鉴定更准确，随后根据设置的质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度100000、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和Masslist数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到数据的鉴定和定量结果。

(十四)统计学分析和作图

使用Graphpad Prism 8.0软件对实验数据进行处理，多组数据比较分析采用单因素方差分析，组间比较采用Tukey校正的t检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

三、实验结果

1、姜黄素对低氧暴露小鼠学习记忆功能的影响

(1)水迷宫实验检测姜黄素对低氧暴露小鼠长时程空间记忆的影响

通过水迷宫实验验证低氧暴露损害小鼠空间记忆功能及姜黄素干预后的改善作用，实验结果表明：与对照组相比，低氧组小鼠目标象限停留时间及探索距离缩短(P＜0.05，如图1所示)，但是平台周边探索距离、穿越平台时间较对照组无明显差异(P＞0.05)，低氧+姜黄素200mg/kg组目标象限停留时间、探索距离及平台周边探索距离、穿越平台时间呈增加趋势(P＜0.05)，低氧+姜黄素400mg/kg组干预后目标象限探索距离、目标象限停留时间显著提高(P＜0.001)，提示姜黄素干预能够改善高原低氧暴露导致的长时程空间记忆能力下降。

(2)条件恐惧实验检测姜黄素对低氧暴露小鼠恐惧记忆的影响

通过条件恐惧实验进一步验证低氧暴露对小鼠恐惧记忆的影响及姜黄素干预的改善作用，实验结果显示：低氧组僵直时间明显低于对照组(P＜0.05，如图2所示)，与低氧组相比，低氧+姜黄素200mg/kg组及400mg/kg组僵直时间显著增加(P＜0.05)，提示姜黄素可改善高原低氧暴露导致的恐惧记忆改变。

(3)Y迷宫实验检测姜黄素对低氧暴露小鼠短期工作记忆的影响

Y迷宫实验观察姜黄素对低氧暴露小鼠短期工作记忆的影响，根据运动路线轨迹图和数据分析统计图显示:与对照组相比，高原低氧暴露2周后小鼠进入新臂探索次数及停留时间比呈下降趋势(P＜0.05，如图3所示)，而低氧+姜黄素200mg/kg组及400mg/kg组小鼠新臂探索次数和停留时间比与低氧组相比升高，但统计学分析结果显示无显著差异，提示姜黄素干预对低氧暴露导致的小鼠短期工作记忆改变的影响不明显。

2、姜黄素对低氧暴露小鼠海马神经元树突棘密度的影响

高尔基染色方法检测姜黄素对小鼠神经元树突棘密度影响，结果表明：与低氧后小鼠海马神经元树突棘密度较对照组明显降低(P＜0.01，图4)，低氧+姜黄素200mg/kg组神经元树突棘密度较低氧组增高，但统计学分析表示差异不显著(P＞0.05)，低氧+姜黄素400mg/kg组干预后树突棘密度明显升高(P＜0.01)，提示姜黄素干预能够保护高原低氧暴露诱发的海马神经元树突棘发育异常。

3、姜黄素对低氧暴露小鼠原代海马神经元树突棘形态的影响

通过对小鼠原代海马神经元感染pEGFP绿色荧光慢病毒验证姜黄素对低氧暴露原代海马神经元树突棘形态的改变，结果表明，低氧组原代海马神经元树突棘密度较对照组降低(P＜0.01，如图5所示)，低氧+姜黄素10μM干预后树突棘密度升高(P＜0.05)，进一步说明低氧暴露可损伤原代培养的海马神经元树突棘密度，姜黄素具有保护效果。

4、姜黄素对低氧暴露小鼠海马神经元突触结构的影响

通过透射电镜验证姜黄素对低氧暴露小鼠海马神经元突触结构的影响，实验结果显示：低氧暴露后，海马神经元突触数量减少(P＜0.01)，突触结构的致密性降低，边缘模糊(图6)，低氧+姜黄素200mg/kg组神经元突触致密性增高，边缘较为清晰，突触数量有增加趋势，但差异不显著(P＞0.05).低氧+姜黄素400mg/kg组干预后保护效果更为明显，神经元突触致密性明显增高，边缘清晰，基本恢复正常，突触数量恢复(P＜0.01)，说明姜黄素干预可缓解低氧暴露导致的突触损伤。

5、姜黄素对低氧暴露下突触发育相关分子表达的影响

(1)姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织突触发育相关分子表达的影响

Western blot实验结果表明，低氧组小鼠海马组织中与突触发育相关的分子PSD-95，NMDAR1表达较对照组下降(P＜0.05，图7)，低氧+姜黄素200mg/kg组干预后PSD-95表达较低氧组上升(P＜0.01)，低氧+姜黄素400mg/kg组干预后NMDAR1表达水平较低氧组增加(P＜0.05)，提示低氧暴露造成突触发育相关分子表达降低，药物干预可促进其表达。

(2)姜黄素对低氧暴露HT22细胞中突触发育分子表达影响

结果显示，与对照组相比，48h低氧暴露后树突发育相关的分子PSD-95、NMDAR1表达水平下降(P＜0.05，图8)，低氧+姜黄素5μM组及10μM组干预后PSD-95、NMDAR1表达均有上升趋势(P＜0.05)。

6、姜黄素对低氧暴露小鼠海马CA1区突触发育分子表达影响

通过对小鼠脑组织切片进行免疫荧光染色，结果显示，低氧暴露后PSD-95表达水平较对照组有下降趋势，低氧+姜黄素400mg/kg组干预后表达上升(P＜0.01，图9)。

7、姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织炎症细胞因子表达水平的影响

(1)姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织炎症细胞因子表达

ELISA试剂盒检测小鼠海马组织中炎症因子的表达水平，结果显示，低氧组小鼠海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α含量较对照组呈上升趋势(P＜0.01，图10)，低氧+姜黄素200mg/kg组干预后IL-6表达含量上升(P＜0.05)，低氧+姜黄素400mg/kg组干预后较低氧组相比IL-1β、IL-6、TNF-α表达下降(P＜0.05)，进一步验证了低氧暴露环境诱导炎症因子的表达水平改变，姜黄素干预后具有良性调控作用。

(2)姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织炎症细胞因子mRNA表达的影响

通过RT-PCR实验检测姜黄素干预后低氧暴露对小鼠海马组织中炎症因子的mRNA表达变化，结果说明，低氧组小鼠海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平较对照组提高(P＜0.05，图11)，低氧+姜黄素200mg/kg及低氧+姜黄素400mg/kg干预后IL-1β表达下降(P＜0.05)，低氧+姜黄素400mg/kg干预后可以提升IL-6、TNF-α表达下降(P＜0.05)，进一步验证了低氧暴露环境诱导炎症因子的mRNA表达水平改变，姜黄素干预后得到改善。

8、姜黄素对低氧暴露小鼠海马组织氧化应激指标变化的影响

试剂盒检测氧化应激，发现低氧组小鼠海马组织中GSH、GSH-PX及SOD含量较对照组降低(P＜0.05，图12)，MDA含量提高(P＜0.05)，低氧+姜黄素400mg/kg干预后GSH、GSH-PX及SOD含量呈上升趋势(P＜0.05)，MDA含量降低(P＜0.05)，进一步说明低氧暴露对氧化应激水平造成影响，姜黄素干预后得到正向调控作用。

9、姜黄素干预低氧暴露小鼠学习记忆功能的海马代谢组学研究

首先通过韦恩图的形式分析不同干预组小鼠海马组织差异表达的代谢物。如图13的图A所示，低氧组表达上调而低氧+姜黄素200mg/kg组表达下调的代谢物有77种，低氧组表达下调而低氧+姜黄素200mg/kg组表达下调的代谢物有25种；低氧组表达上调而低氧+姜黄素400mg/kg组表达下调的代谢物有21种，低氧组表达下调而低氧+姜黄素400mg/kg组表达下调的代谢物有8种。Hierarchical Pearson聚类热图分析可视化显示了姜黄素干预低氧暴露小鼠海马组织中显著性变化的代谢物(图13的图B和图C)。

对以上共同变化代谢物取交集后发现，在低氧表达组下调，而在两个剂量组表达均上调的代谢物有15种；在低氧表达组上调，而在两个剂量组表达均上调的代谢物有5种(图13的图C)，说明姜黄素干预可以比较集中地影响低氧暴露小鼠海马中某些代谢通路。Hierarchical Pearson聚类热图分析可视化显示了共同变化的代谢物，包括磷脂酰乙醇胺(36:4)、苯乙酰-L-谷氨酰胺、D-甘露醇-1-磷酸酯、异丁酰-L-肉碱等代谢中间产物。

如图14所示，富集图说明，姜黄素干预低氧暴露小鼠后海马组织差异代谢物涉及的代谢通路包含初级胆汁酸生物合成、次级胆汁酸生物合成、果糖苯、丙氨酸代谢及甘露糖代谢、丙酸酯代谢、胆汁分泌、三磷酸腺苷结合盒转运体、不同环境下微生物代谢和代谢途径等9条代谢通路。以上结果表明，低氧暴露可影响小鼠海马组织内生理代谢过程，一些差异表达代谢物及其代谢通路与学习记忆能力密切相关；姜黄素干预可改善海马组织的代谢紊乱，从而发挥对低氧致学习记忆障碍的保护作用。

综上所述，实验结果说明姜黄素干预可以改善低氧暴露造成的认知功能下降，树突棘密度降低、突触结构受损及缓解突触发育相关分子表达水平降低的问题，同时对炎症细胞因子的表达水平及氧化应激水平也有正向调节作用，因此我们更进一步进行代谢标志物的筛选为后续研究其分子通路奠定基础。姜黄素具备制备治疗和预防低氧暴露致学习记忆障碍药物的潜力。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，其特征在于，所述姜黄素对于C57BL/6雄性小鼠的给药剂量为200-400mg/kg体重/天。

3.根据权利要求2所述的姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，其特征在于，所述姜黄素对于C57BL/6雄性小鼠的给药剂量为400mg/kg体重/天。

4.根据权利要求1所述的姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，其特征在于，所述姜黄素能够用于制备低氧暴露原代培养的海马神经元树突棘的保护剂。

5.根据权利要求1所述的姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，其特征在于，所述姜黄素能够用于制备低氧暴露小鼠海马神经元突触结构的保护剂。

6.根据权利要求1所述的姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，其特征在于，所述姜黄素能够用于制备突触发育相关的分子表达促进剂。

7.根据权利要求6所述的姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，其特征在于，所述突触发育相关的分子为PSD-95和NMDAR1。

8.根据权利要求1所述的姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，其特征在于，所述姜黄素能够用于制备炎症因子表达抑制剂。

9.根据权利要求8所述的姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，其特征在于，所述炎症因子包括IL-1β、IL-6和TNF-α。

10.根据权利要求1所述的姜黄素在制备治疗或预防低氧暴露致学习记忆障碍药物中的应用，其特征在于，所述药物还含有其他活性成分和辅料。