CN117229936A - 一种丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建方法及应用，主要包括如下步骤：(1)微生物的培养：利用TGY培养基于37℃下对丁酸梭菌进行培养，获得新鲜的丁酸梭菌菌液；(2)丁酸梭菌/CdS复合体系的构建：向菌液体中加入L‑半胱氨酸盐酸盐和Cd2+金属离子原位形成纳米粒子CdS同时自组装于丁酸梭菌细胞表面；在光照射下，检测丁酸梭菌/CdS体系中的NADH的浓度，评估该体系的光催化性能。本发明从目前的能源短缺问题出发，利用自然界可再生的太阳能源，构建的光合生物杂化系统综合了半导体的捕光能力和微生物代谢催化能力的优点，可应用于微生物高效生产高附加值产品如丁酸、H2、乙醇、1,3‑丙二醇等。
Description
技术领域
本发明涉及光催化剂领域，具体涉及一种丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建方法及应用。
背景技术
以石油、煤炭、天然气为代表的化石燃料是目前世界上主要的能源形式。但随着全球工业化进程的推进，各生产部门和人们日常生活对能源的巨大需求造成了化石燃料的快速消耗。此外，化石燃料的广泛使用引起了二氧化碳的过度排放，这导致了持续的全球气候变化、极端天气和冰川融化。因此，基于传统化石燃料的不可再生性和环境消耗特性，开发可再生的绿色能源实现对化石燃料的有序替代已成为未来发展的必然趋势。太阳能是地球上最丰富的可再生能源，但目前的工业微生物并不能直接利用太阳能。
光催化材料能够模仿天然生物吸光色素，如类胡萝卜素和叶绿素。光催化材料对太阳光谱的吸收更广、对太阳光谱的分段互补吸收、更容易电荷分离，因此捕光效率更高。CdS作为最具发展前景的可见光驱动制氢光催化剂之一，因其带隙窄(Eg≈2.4eV)、带边位置合适、产生高效光激子等优点而受到广泛关注。特别是一维CdS纳米结构，由于其内部载流子分离的优异表现，在光催化制氢方面显示出巨大的应用潜力。丁酸梭菌是一种严格厌氧、革兰氏阳性细菌。丁酸梭菌的底物谱较为丰富，可利用大量的糖类，包括复杂的混合物，如糖蜜、马铃薯淀粉、乳清、大多数双糖和甘油，不仅可以生产丁酸，还生产乙酸、H2、乙醇和1,3-丙二醇等大宗化学品。因其本身具有较高的稳定性和可操作性，已被用于生产高附加值产品的主要微生物。目前，通过代谢工程改造及发酵工艺优化等手段提高丁酸梭菌合成化学品的能力已被研究，但同时出现的局限性如易突变、操作繁琐等极大地限制了丁酸梭菌工业化进程。本发明提出一种丁酸梭菌/CdS杂化体系构建方法，有望利用CdS的捕光优势高效地强化丁酸梭菌的生产力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建方法及应用。以现代生物技术为手段，通过丁酸梭菌原位合成光催化剂CdS并自组装于丁酸梭菌的表面构建丁酸梭菌/CdS复合体系，在一定的光照强度下可提高丁酸梭菌胞内NADH的再生，进一步促进胞内产物的代谢通量；构建的丁酸梭菌/CdS复合体系将丰富而廉价的太阳能通过微生物细胞工厂转化为工业化产品，将是解决能源短缺和环境恶化双重危机的有效途径。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建方法，包括如下步骤：
(1)微生物的培养：将丁酸梭菌接种于10-20mL的TGY液体培养基中于37℃下静置培养12-18h，按5-8％(v/v)的比例将菌液加入新鲜的TGY培养基中继续培养10-16h，取50-80mL菌液于4℃，4000rpm下离心10min，去上清液；
(2)丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建：在50mL的TGY液体培养基中加入0.1-0.4g/L的Cd(NO3)2·4H2O配制矿化培养基，将丁酸梭菌菌体转接于矿化培养基中，于37℃下静置培养32-40h，可观察到菌液颜色由培养基颜色变为亮黄色；
(3)丁酸梭菌/CdS杂化体系光催化性能的检测：将收集的丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至新的50mL的TGY液体培养基中继续培养24-48h，使用1000-3000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的胞内的NADH浓度。
步骤(1)中TGY液体培养基配方为：10-30g/L蛋白胨，10-20g/L葡萄糖，10-20g/L酵母粉，0.5-1.0g/L半胱氨酸盐酸盐。
优选的，步骤(1)中TGY液体培养基通入高纯氮气(N2，99.999％)15-20min进行除氧后用橡胶塞密封。
优选的，步骤(2)中所配制的矿化培养基需要现配现用，放置时间不能超过10-12h。通过滴加1-2mol/L HCI或1-2mol/L NaOH来调节矿化培养基的pH至6.5-7.0左右。
优选的，步骤(3)中使用的可见光的波长范围为400-650nm。
优选的，步骤(3)中分别利用NADH检测试剂盒和高效液相色谱法检测胞内的NADH浓度和丁酸的产量。
所述的构建方法构建得到一种丁酸梭菌/CdS杂化体系。
所述丁酸梭菌/CdS杂化体系在生产丁酸、H2、乙醇、1,3-丙二醇中的应用。
丁酸梭菌/CdS杂化体系在制备丁酸中的应用，将丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至100-200mL的TGY培养基中进行批次发酵64-72h，使用1000-3000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的丁酸浓度。
丁酸梭菌/CdS杂化体系在制备H2中的应用，将丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至100-200mL的TGY培养基中进行批次发酵64-72h，使用1000-3000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的H2浓度。
丁酸梭菌/CdS杂化体系在制备乙醇中的应用，将丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至100-200mL的TGY培养基中进行批次发酵64-72h，使用1000-3000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的乙醇浓度。
丁酸梭菌/CdS杂化体系在制备1,3-丙二醇中的应用，将丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至100-200mL的TGY培养基中进行批次发酵64-72h，使用1000-3000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的1,3-丙二醇浓度。
丁酸梭菌/CdS杂化体系利用纳米粒子CdS在太阳能的驱动下增加丁酸梭菌胞内还原力NADH的再生强度，实现其高附加值产物的高效合成。
有益效果：本发明提出将丁酸梭菌与无机光催化材料CdS结合的策略，构建丁酸梭菌/CdS杂化系统，利用可再生能源强化丁酸梭菌的生产力，应用于高附加值产品的绿色生产。
附图说明
图1.丁酸梭菌/CdS杂化体系SEM图，(A)：标尺为2nm，(B)：标尺为4nm；
图2.不同的实施案例中构建的丁酸梭菌/CdS杂化体系的NADH水平。
具体实施方式
下面将通过具体实施例进一步清楚地描述本发明。
实施例1
(1)微生物的培养：将丁酸梭菌(CGMCC1.5205，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种于20mL的TGY液体培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐)，通入高纯氮气(N2，99.999％)15-20min进行除氧后用橡胶塞密封)中于37℃下静置培养12h。按5％(v/v)的比例将菌液加入新鲜的TGY液体培养基中继续培养10h，取50mL菌液于4℃，4000rpm下离心10min，去上清液获得丁酸梭菌菌体。
(2)丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建：在50mL的TGY液体培养基中加入0.1g/L的Cd(NO3)2·4H2O配制矿化培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，0.1g/L的Cd(NO3)2·4H2O)，以100％的接种量将丁酸梭菌菌体转接于矿化培养基中，于37℃下静置培养32h，可观察到菌液颜色由培养基颜色变为亮黄色，表明丁酸梭菌/CdS杂化系统已构建完成，如图1所示，可观察到光纳米粒子CdS均匀地包覆于丁酸梭菌细菌的表面，形成结构较为稳定的丁酸梭菌/CdS杂化体系。
丁酸梭菌/CdS杂化体系光催化性能的检测：将收集的丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至新的50mL的TGY液体培养基中继续培养48h，使用1000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的胞内的NADH浓度，结果如图2所示。
实施例2
(1)微生物的培养：将丁酸梭菌(CGMCC1.5205)接种于20mL的TGY液体培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐)，通入高纯氮气(N2，99.999％)15-20min进行除氧后用橡胶塞密封)中于37℃下静置培养12h。按5％(v/v)的比例将菌液加入新鲜的TGY液体培养基中继续培养10h，取50mL菌液于4℃，4000rpm下离心10min，去上清液获得丁酸梭菌菌体。
(2)丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建：在50mL的TGY液体培养基中加入0.1g/L的Cd(NO3)2·4H2O配制矿化培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，0.1g/L的Cd(NO3)2·4H2O)，以100％的接种量将丁酸梭菌菌体转接于矿化培养基中，于37℃下静置培养32h，可观察到菌液颜色由培养基颜色变为亮黄色，表明丁酸梭菌/CdS杂化系统已构建完成，如图1所示，可观察到光纳米粒子CdS均匀地包覆于丁酸梭菌细菌的表面，形成结构较为稳定的丁酸梭菌/CdS杂化体系。
丁酸梭菌/CdS杂化体系光催化性能的检测：将收集的丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至新的50mL的TGY液体培养基中继续培养48h，使用2000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的胞内的NADH浓度，结果如图2所示。
实施例3
(1)微生物的培养：将丁酸梭菌(CGMCC1.5205)接种于20mL的TGY液体培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐)，通入高纯氮气(N2，99.999％)15-20min进行除氧后用橡胶塞密封)中于37℃下静置培养12h。按5％(v/v)的比例将菌液加入新鲜的TGY液体培养基中继续培养10h，取50mL菌液于4℃，4000rpm下离心10min，去上清液获得丁酸梭菌菌体。
(2)丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建：在50mL的TGY液体培养基中加入0.2g/L的Cd(NO3)2·4H2O配制矿化培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，0.2g/L的Cd(NO3)2·4H2O)，以100％的接种量将丁酸梭菌菌体转接于矿化培养基中，于37℃下静置培养32h，可观察到菌液颜色由培养基颜色变为亮黄色，表明丁酸梭菌/CdS杂化系统已构建完成，如图1所示，可观察到光纳米粒子CdS均匀地包覆于丁酸梭菌细菌的表面，形成结构较为稳定的丁酸梭菌/CdS杂化体系。
丁酸梭菌/CdS杂化体系光催化性能的检测：将收集的丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至新的50mL的TGY液体培养基中继续培养48h，使用3000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的胞内的NADH浓度，结果如图2所示。
实施例4
(1)微生物的培养：将丁酸梭菌(CGMCC1.5205)接种于20mL的TGY液体培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐)，通入高纯氮气(N2，99.999％)15-20min进行除氧后用橡胶塞密封)中于37℃下静置培养12h。按5％(v/v)的比例将菌液加入新鲜的TGY液体培养基中继续培养10h，取50mL菌液于4℃，4000rpm下离心10min，去上清液获得丁酸梭菌菌体。
(2)丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建：在50mL的TGY液体培养基中加入0.2g/L的Cd(NO3)2·4H2O配制矿化培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，0.2g/L的Cd(NO3)2·4H2O)，以100％的接种量将丁酸梭菌菌体转接于矿化培养基中，于37℃下静置培养32h，可观察到菌液颜色由培养基颜色变为亮黄色，表明丁酸梭菌/CdS杂化系统已构建完成，如图1所示，可观察到光纳米粒子CdS均匀地包覆于丁酸梭菌细菌的表面，形成结构较为稳定的丁酸梭菌/CdS杂化体系。
丁酸梭菌/CdS杂化体系光催化性能的检测：将收集的丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至新的50mL的TGY液体培养基中继续培养48h，使用2000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的胞内的NADH浓度，结果如图2所示。
实施例5
(1)微生物的培养：将丁酸梭菌(CGMCC1.5205)接种于20mL的TGY液体培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐)，通入高纯氮气(N2，99.999％)15-20min进行除氧后用橡胶塞密封)中于37℃下静置培养12h。按5％(v/v)的比例将菌液加入新鲜的TGY液体培养基中继续培养10h，取50mL菌液于4℃，4000rpm下离心10min，去上清液获得丁酸梭菌菌体。
(2)丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建：在50mL的TGY液体培养基中加入0.3g/L的Cd(NO3)2·4H2O配制矿化培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，0.3g/L的Cd(NO3)2·4H2O)，以100％的接种量将丁酸梭菌菌体转接于矿化培养基中，于37℃下静置培养32h，可观察到菌液颜色由培养基颜色变为亮黄色，表明丁酸梭菌/CdS杂化系统已构建完成，如图1所示，可观察到光纳米粒子CdS均匀地包覆于丁酸梭菌细菌的表面，形成结构较为稳定的丁酸梭菌/CdS杂化体系。
丁酸梭菌/CdS杂化体系光催化性能的检测：将收集的丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至新的50mL的TGY液体培养基中继续培养48h，使用2000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的胞内的NADH浓度，结果如图2所示。
实施例6
(1)微生物的培养：将丁酸梭菌(CGMCC1.5205)接种于20mL的TGY液体培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐)，通入高纯氮气(N2，99.999％)15-20min进行除氧后用橡胶塞密封)中于37℃下静置培养12h。按5％(v/v)的比例将菌液加入新鲜的TGY液体培养基中继续培养10h，取50mL菌液于4℃，4000rpm下离心10min，去上清液获得丁酸梭菌菌体。
(2)丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建：在50mL的TGY液体培养基中加入0.4g/L的Cd(NO3)2·4H2O配制矿化培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，0.4g/L的Cd(NO3)2·4H2O)，以100％的接种量将丁酸梭菌菌体转接于矿化培养基中，于37℃下静置培养32h，可观察到菌液颜色由培养基颜色变为亮黄色，表明丁酸梭菌/CdS杂化系统已构建完成，如图1所示，可观察到光纳米粒子CdS均匀地包覆于丁酸梭菌细菌的表面，形成结构较为稳定的丁酸梭菌/CdS杂化体系。
丁酸梭菌/CdS杂化体系光催化性能的检测：将收集的丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至新的50mL的TGY液体培养基中继续培养48h，使用2000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的胞内的NADH浓度，结果如图2所示。
实施例7
(1)微生物的培养：将丁酸梭菌(CGMCC1.5205)接种于20mL的TGY液体培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐)，通入高纯氮气(N2，99.999％)15-20min进行除氧后用橡胶塞密封)中于37℃下静置培养12h。按5％(v/v)的比例将菌液加入新鲜的TGY液体培养基中继续培养10h，取50mL菌液于4℃，4000rpm下离心10min，去上清液获得丁酸梭菌菌体。
(2)丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建：在50mL的TGY液体培养基中加入0.3g/L的Cd(NO3)2·4H2O配制矿化培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，0.3g/L的Cd(NO3)2·4H2O)，以100％的接种量将丁酸梭菌菌体转接于矿化培养基中，于37℃下静置培养32h，可观察到菌液颜色由培养基颜色变为亮黄色，表明丁酸梭菌/CdS杂化系统已构建完成，如图1所示，可观察到光纳米粒子CdS均匀地包覆于丁酸梭菌细菌的表面，形成结构较为稳定的丁酸梭菌/CdS杂化体系。
丁酸梭菌/CdS杂化体系光催化性能的检测：将收集的丁酸梭菌/CdS杂化体系转移至新的50mL的TGY液体培养基中继续培养48h，使用3000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，规律间隔取样检测该体系中的胞内的NADH浓度，结果如图2所示。
对照组
(1)将丁酸梭菌菌体转接于50mL的TGY液体培养基(30g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐)中，于37℃下静置培养32h。
(2)将丁酸梭菌转移至新的50mL的TGY液体培养基中继续培养48h，规律间隔取样检测该体系中的胞内的NADH浓度，结果如图2所示。
通过检测可知，以浓度为0.1g/L的Cd(NO3)2·4H2O原位合成制备的丁酸梭菌/CdS胞内的NADH水平相对较高，主要归功于可见光激发CdS产生更多的光电子穿过细胞膜进入 到胞内辅助NADH的再生，有利于其进一步对高附加值产物的合成。而随着Cd(NO3)2·4H2O浓度的提高，胞内的NADH水平呈现下降的趋势，猜想是高浓度的Cd(NO3)2·4H2O对丁酸梭菌有毒害作用，抑制其细胞生长，影响胞内的NADH水平。另外，我们发现在2000W/m2的可见光下丁酸梭菌/CdS胞内的NADH水平显著高于其他强度下的，证明光照强度为影响细胞胞内NADH水平的关键因素。因此，实施例2中胞内的NADH水平表现最高。
实施例8丁酸梭菌/CdS杂化体系在光催化下制备丁酸
将步骤1和2制备的丁酸梭菌/CdS杂化体系在以60g/L的葡萄糖为初始碳源的培养基(30g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，0.5g/L半胱氨酸盐酸盐)中进行72h的批次发酵，使用2000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，以丁酸为测定指标评估可见光下丁酸梭菌/CdS杂化系统产丁酸的能力。结果如表1所示。
表1.丁酸梭菌/CdS杂化体系丁酸产量检测
结果可知，相较于对照组获得的13.42g/L的丁酸产量，实施例2中的丁酸产量提高了16.36％，且丁酸收益和丁酸产率均达到了更高的水平，猜想是胞内较高浓度的NADH促进了产物丁酸的合成。
综上所述，本发明提出的一种丁酸梭菌/CdS杂化体系可以显著增加丁酸梭菌胞内的还原力，促进以丁酸梭菌为生产菌株在太阳能的驱动下高附加值产物的高效合成，相较于以往基于合成生物学技术重定向碳通路，该体系可实现丁酸等化学品的绿色生产，缓解目前化石燃料持续性消耗带来的环境压力。
Claims (10)
1.一种丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)微生物的培养：将丁酸梭菌接种于10-20mL的TGY培养基中静置培养12-18h，按5-8％的体积比例将菌液加入新鲜的TGY培养基中继续培养10-16h，离心，去上清液；
(2)丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建：在TGY液体培养基中加入0.1-0.4g/L的Cd(NO3)2·4H2O配制矿化培养基，将丁酸梭菌菌体转接于矿化培养基中，静置培养32-40h，可观察到菌液颜色由培养基颜色变为亮黄色；构建得到丁酸梭菌/CdS杂化体系。
2.根据权利要求1所述的一种丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建方法，其特征在于，步骤(1)中TGY培养基的配方为：10-30g/L蛋白胨，10-20g/L葡萄糖，10-20g/L酵母粉，0.5-1.0g/L半胱氨酸盐酸盐。
3.根据权利要求1所述的一种丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述矿化培养基的配方为：10-30g/L蛋白胨，10-20g/L葡萄糖，10-20g/L酵母粉，0.5-1.0g/L半胱氨酸盐酸盐，0.1-0.4g/L的Cd(NO3)2·4H2O，pH至6.5-7.0。
4.根据权利要求3所述的一种丁酸梭菌/CdS杂化体系的构建方法，其特征在于，所述矿化培养基中Cd(NO3)2·4H2O浓度为0.1g/L。
5.权利要求1至4中任意一项所述的构建方法构建得到一种丁酸梭菌/CdS杂化体系。
6.权利要求5所述丁酸梭菌/CdS杂化体系在生产丁酸、H2、乙醇、1,3-丙二醇中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将丁酸梭菌/CdS杂化体系接种到发酵培养基中，使用1000-3000W/m2的可见光对培养基体系持续照射，增加丁酸梭菌胞内还原力NADH的再生强度，实现对农业废弃生物质的高效绿色转化，制得相应产物。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述可见光波长范围为400-650nm。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述可见光优选2000W/m2。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为10-30g/L蛋白胨，10-20g/L葡萄糖，10-20g/L酵母粉，0.5-1.0g/L半胱氨酸盐酸盐。
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