CN117229914A - 微流控芯片及利用微流控芯片构建软骨细胞的力-化-生耦合的微环境模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及微流控芯片及利用微流控芯片构建软骨细胞的力‑化‑生耦合的微环境模型的方法。本发明通过在芯片结构中的气压通道层设置多个并联的气体通道，能够高通量的实现对细胞三维培养层的细胞的可精确调控的机械压缩。本发明通过水凝胶等生物材料构建软骨模型，在微流控芯片的不同位置接种相应的细胞如巨噬细胞，准确模拟关节软骨所处真实的局部力学微环境和免疫微环境，成功利用微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的力‑化‑生耦合的微环境模型，从单细胞水平探究关节疾病的发病机理，搭建方便快捷经济的药物筛选平台，为关节疾病的治疗提供支撑。

Description

微流控芯片及利用微流控芯片构建软骨细胞的力-化-生耦合 的微环境模型的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及微流控芯片及利用微流控芯片构建软骨细胞的力-化-生耦合的微环境模型的方法。

背景技术

关节软骨是运动系统的重要组成部分，在人体的关节运动中提供支撑、缓冲、润滑等功能。关节软骨是关节表面一层薄(大约2～4mm)、无血管的结缔组织，主要为稀疏分布的软骨细胞和密集的细胞外基质组成，其中软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，仅仅占组织体积5～10％以下。但是由于关节软骨缺乏自愈能力，损伤后难以自我修复，极易发生诸多不可逆的致残性疾病，如骨关节炎和类风湿性关节炎，导致整个关节失去活动能力，严重影响人们的健康。因此，解析软骨稳态维持机制对骨关节炎和类风湿性关节炎等关节疾病的治疗有重要意义。

尽管目前已存在大量的关节软骨的研究，但是关节软骨损伤的机理研究依然未完全明确、缺乏有效的治疗手段和预防措施，造成这一现状的最主要原因之一可归结于关节软骨所处的复杂的力-化-生耦合的微环境。从力学微环境的角度，软骨细胞处于一个动态的力学刺激微环境中，包括压缩、剪切、拉伸和渗透压等多种不同类型的由日常的关节活动所产生的力学刺激。软骨细胞通过机械转导过程感知外界力学刺激并做出响应，随后启动生化反应。软骨细胞所处的生物力学微环境通过调控细胞的黏附、迁移、增殖和分化来影响软骨的发育、功能维持、甚至疾病的发生发展(W.Xu,J.Zhu,J.Hu,L.Xiao，Engineering thebiomechanical microenvironment of chondrocytes towards articular cartilagetissue engineering,Life Sciences,2022 Nov；(15)309:121043.doi:10.1016/j.lfs.2022.121043.)。除了机械负荷，关节内复杂的生化环境也会对软骨有重要影响。这些生化因素包括巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞以及这些细胞分泌的细胞因子等。这些生化因素通过不同的途径来影响软骨的稳态。比如，关节软骨周围的滑膜和滑膜液中存在较多的巨噬细胞，这些巨噬细胞受到关节内微环境的影响被活化后能够被极化为不同的细胞表型即促炎型巨噬细胞和抗炎型巨噬细胞。其中促炎型巨噬细胞分泌的炎症因子、生长因子、基质金属蛋白酶(MMPs)等可通过旁分泌作用于软骨细胞发生相互作用，导致随后的软骨降解和破坏，对骨关节炎等疾病的发生和发展起着至关重要的作用。此外，促炎型巨噬细胞在滑膜内的聚集与滑膜炎症也有密切的关联，而滑膜炎症的发生也会影响巨噬细胞的表型极化以及软骨细胞的损伤等。同样，机械负荷导致的软骨细胞的损伤而产生的细胞碎片、聚集蛋白等可作为危险相关分子模式(DAMPs)来刺激巨噬细胞活化并促使其分泌炎性细胞因子和趋化因子等和诱发滑膜炎等(H.Zhang,D.Cai,X.Bai，Macrophages regulate theprogression of osteoarthritis,Osteoarthritis Cartilage，2020 May；28(5):555-561.doi:10.1016/j.joca.2020.01.007.)。这些由力学刺激和生化刺激双重因素共同作用下这些细胞之间的相互影响、相互作用将在关节腔内形成恶性循环，诱发甚至加速关节疾病的发生和发展。

现有的研究关节疾病常用的体外2D细胞模型虽然有一定优点如成本低、操作简单等，但是缺乏生理相关性和关键特征。对于关节软骨细胞的三维生长环境这些关键性的特征极大的影响细胞的表型、行为和对测试药物的反应，如原代软骨细胞在2D培养中会逐渐丧失成软骨特征，进而影响细胞对外界刺激的响应。动物实验仍然是关节疾病研究中阐明疾病机制和药物试验的重要组成部分，但是动物模型的构建在经济性、伦理等方面存在诸多争议。这些传统的体外2D和体内动物实验不能满足对关节疾病研究的需求。因此，如何构建准确模拟关节软骨生理特征和微环境的模型是目前解决研究关节疾病发病机理和药物筛选障碍的最主要问题之一。

在微生理相关的“芯片”中对人体组织进行建模将越来越有助于揭示疾病背后的机制，并可能最终加快药物的开发及评估患者个体对特定药物的反应。微流控技术因其独特的优势，可作为模拟关节软骨微环境构建关节软骨微生理模型的新手段。微流控技术涉及诸多交叉学科如材料、生物医学工程、微机电等，主要利用先进微纳加工的手段制备的芯片的微通道中操控微小流体(nL～μL)来实现特定目的。微流控芯片因其加工方式的灵活性可设计和制备出具有不同的结构，因此能够通过合理的设计芯片的结构来实现在体外构建能够进行细胞长期培养和力学刺激、生化刺激的模型。结合细胞三维培养技术，借助生物材料为载体，模拟细胞外基质的空间结构及理化性质，近似的为细胞提供与体内相似的生长环境，最大限度的模拟软骨细胞在体内的三维生长状态，建立与体内微环境相似的芯片微环境。设备通常使用小体积(在微升范围内)，因此与二维和三维细胞培养模型相比，所需的分析试剂和细胞数量要少得多，有效减少实验研究对药品和试剂的消耗。因此，微流控芯片因其微小化、高集成度、耗材少、结构灵活等优势，能够很好地模拟再现关节软骨细胞的微环境，在构建关节软骨模型来研究发病机理和药物筛选方面具有较大前景。

通过合理的设计微流控芯片的结构能够实现关节软骨细胞力学微环境的再现，研究力学刺激下软骨细胞的行为。此外，关节软骨细胞复杂的生化微环境也可以通过合理的设计微流控芯片的结构来实现模拟再现。尤其是，免疫微环境在关节疾病如类风湿性关节炎和骨关节炎的发生和发展中也起到了至关重要的作用。如，Occhetta等人(P.Occhetta,A.Mainardi,E.Votta,Q.Vallmajo-Martin,M.Ehrbar,I.Martin,A.Barbero,M.Rasponi，Hyperphysiological compression of articular cartilage induces anosteoarthriticphenotype in a cartilage-on-a-chip model,Nature BiomedicalEngineering,2019 Jul；3(7):545-557.doi:10.1038/s41551-019-0406-3)建立了模拟生理和超生理压缩的芯片模型，揭示了病理性的机械刺激促进基质金属蛋白酶(MMP)的产生和软骨破坏，并进行了药物筛选。该文献中芯片的结构如下图12所示，该芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制备，包括两个由柔性膜分隔的腔室，上层为承载细胞三维培养的培养腔室，下层为用于机械加载的驱动腔室。对于细胞培养腔室，由一个300μm宽的中心通道、两侧为利用微结构进行间隔开的用于培养基补充的侧通道组成。用于间隔通道的微结构是两排平行的悬挂的微阵列，在细胞-水凝胶混合物接种和培养时提供限制的边界。这些悬挂的微阵列与下层的PDMS膜之间存在间隙(见图13)，当驱动室加压时，PDMS柔性膜向上弯曲，直至紧贴微阵列的底端，对细胞-水凝胶的三维结构进行的受限压缩。

但是，上述文献中的微生理系统是通过调整悬挂柱下方的距离PDMS弹性模的间隙来精确控制对细胞-水凝胶结构的机械压缩水平。由此可以看出，该文献中决定芯片的压缩性能的影响因素是在芯片制备时设置的悬挂柱下方的距离PDMS弹性膜的间隙，也就是定义控制机械驱动机制的行程长度，因此，该文献中的一个芯片只能实现对细胞的单一压缩水平。此外，该文献中的芯片培养腔室与下层PDMS柔性膜之间存在间隙，在微结构的中间通道接种细胞-水凝胶的混合物对细胞进行三维培养时，不能在进行区域化的其他类型的培养，比如在关节腔内较为丰富的免疫细胞、滑膜细胞等，这些细胞在研究关节疾病的时候是非常重要的，比如炎症细胞的存在会加剧软骨细胞对机械刺激的响应，该文献中的芯片不能满足此需求。

发明内容

本发明的目的在于提供微流控芯片及利用微流控芯片构建软骨细胞的力-化-生耦合的微环境模型的方法，本发明提供的微流控芯片具有更加贴合地模拟体内真实组织的三维结构和微环境等高仿真性的优势，能实现同时模拟再现软骨细胞在体内生长时的力学刺激和生化刺激多重因素的微环境。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种微流控芯片，包括基底层1和依次层叠设置于所述基底层1上的细胞三维培养层2和气压控制层3；所述基底层1、所述细胞三维培养层2和所述气压控制层3为透明材质；

所述细胞三维培养层2设置有细胞三维培养通道21和位于所述细胞三维培养通道21两侧的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23，所述细胞三维培养通道21与第一细胞培养液通道22之间以及细胞三维培养通道21与第二细胞培养液通道23之间由多个微结构分隔开，所述微结构之间存在间隙，所述细胞三维培养通道21的两端设有细胞载流液入口通道24和细胞载流液出口通道25，所述第一细胞培养液通道22两端设有第一细胞培养液入口通道26和第一细胞培养液出口通道27，所述第二细胞培养液通道23两端设有第二细胞培养液入口通道28和第二细胞培养液出口通道29；

所述气压控制层3中设有垂直于所述细胞三维培养通道21的多个气体通道，各所述气体通道的两端均设有气体出入口，各所述气体通道均设有位于两端的所述气体出入口之间的挤压部，各所述挤压部位于所述细胞三维培养通道21上方，所述气压控制层两端均设有三个液体通孔，各所述液体通孔分别连通细胞载流液入口通道24、细胞载流液出口通道25、第一细胞培养液入口通道26、第一细胞培养液出口通道27、第二细胞培养液入口通道28和第一细胞培养液出口通道29。

优选的，还包括叠放于所述气压控制层3上的储液层，所述储液层包括设置于所述气体通道两侧的两个储液池4，各所述储液池4中均设有三个储液通孔，各所述储液通孔分别连通各所述液体通孔。

优选的，所述细胞三维培养通道21、第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23为上部密封下部开口的通道结构；所述微结构呈栅栏形，所述微结构的一端与基底层1接触；细胞载流液入口通道24、细胞载流液出口通道25、第一细胞培养液入口通道26、第一细胞培养液出口通道27、第二细胞培养液入口通道28和第一细胞培养液出口通道29为上下贯通的通孔。

优选的，所述细胞三维培养层2的材质为聚二甲基硅氧烷；

所述细胞三维培养层2的厚度为200～400μm，所述细胞三维培养通道21的宽度为1～1.5mm；第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23的宽度为1～2mm；所述细胞三维培养通道21、第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23的深度为70～300μm。

优选的，所述气体通道为上部密封下部开口的结构；所述气体通道的数量为3个；

所述气压控制层3的材质为聚二甲基硅氧烷；所述气体通道的宽度为1～1.5mm，深度为50～200μm，所述挤压部的宽度大于所述气体通道的宽度。

优选的，所述基底层1的材质为玻璃；所述基底层1的厚度为0.13～0.17mm；

所述储液层的材质为聚二甲基硅氧烷，所述储液通孔的直径为1.5～3.5mm。

本发明提供了一种利用上述技术方案所述的微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的差异化力学微环境模型的方法，包括以下步骤：

将软骨细胞-水凝胶的混合物注入细胞三维培养层2的细胞三维培养通道21中，在紫外光照射下进行光固化，得到固化软骨细胞-水凝胶；然后将软骨细胞培养液注入细胞三维培养层2的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23中进行软骨细胞培养，在所述软骨细胞培养的过程中，向所述气压控制层3的气体通道中通入不同压力水平的压缩空气，对细胞三维培养通道21中不同区域的固化软骨细胞-水凝胶中的软骨细胞进行不同水平的机械力刺激。

本发明提供了一种利用上述技术方案所述的微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的力-化-生耦合的微环境模型的方法，包括以下步骤：

1)将与细胞三维培养层2的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23接触的基底层1表面用包被材料进行表面修饰；

2)将软骨细胞-水凝胶的混合物注入细胞三维培养层2的细胞三维培养通道21中，在紫外光照射下进行光固化，得到固化软骨细胞-水凝胶；

3)将复合细胞培养液注入封闭底面修饰后的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23中，所述复合细胞培养液中含有与软骨细胞相关的细胞、与软骨细胞相关的生化因子、与软骨细胞相关的趋化因子和药物试剂中的一种或多种，进行细胞共培养；在所述细胞共培养的过程中，向所述气压控制层3的气体通道中通入压缩空气，对细胞三维培养通道21中不同区域的固化软骨细胞水凝胶中的软骨细胞进行机械力刺激；或者向所述气压控制层3的气体通道中通入压缩空气，对细胞三维培养通道21中不同区域的固化软骨细胞-水凝胶中的软骨细胞进行机械力刺激；随后再将复合细胞培养液注入封闭底面修饰后的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23中，所述复合细胞培养液中含有与软骨细胞相关的细胞、与软骨细胞相关的生化因子、与软骨细胞相关的趋化因子和药物试剂中的一种或多种，进行细胞共培养。

优选的，所述压缩空气的压力为0～1500mbar。

优选的，所述软骨细胞-水凝胶的混合物包括软骨细胞和水凝胶溶液；软骨细胞的密度为2×10⁵～4×10⁶个细胞/mL；所述水凝胶溶液为甲基丙烯酰化明胶溶液，所述甲基丙烯酰化明胶溶液的质量含量为10～15％；所述光固化时，紫外光的功率为3W，固化时间≤10s。

相比于“Hyperphysiological compression of articular cartilage inducesan osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model”(P.Occhetta,A.Mainardi,E.Votta,Q.Vallmajo-Martin,M.Ehrbar,I.Martin,A.Barbero,M.Rasponi,Nature Biomedical Engineering,2019 Jul；3(7):545-557.doi:10.1038/s41551-019-0406-3)中公开的芯片，本发明提供的微流控芯片除了满足细胞三维培养、三维培养细胞的机械压缩等功能外，还具有以下优势：

本发明提供的芯片能够通过实时调控气压的大小来控制细胞的机械压缩水平，即在同一个芯片能够实现不同水平的机械压缩，并能够精确可控。

本发明供的微流控芯片在气压控制层3中设计了与细胞三维培养层2的细胞三维培养通道21相垂直的多个气压通道，每个气压通道均可以通过调控通入气体通道的压缩空气的水平，使细胞三维培养通道21的不同区域发生压缩形变，进而实现对细胞三维培养通道21中的水凝胶中的软骨细胞施加机械力；而且每个气体通道在施加气压时会对细胞三维培养通道21内的一部分水凝胶进行压缩，进而实现了同一芯片中的压缩区域的可控性。且气压控制层3中的多个气体通道可单独或者联合控制，可以设计不同的控制方案，如只对其中一个通道施加气压、三个通道一起施加气压或三通道轮流施加动态气压。多气体通道的设计可以让本发明提供的微流控芯片中细胞面临的机械刺激更加多样化，可以更好地模拟体内环境，也可以对更多组不同的气压输出方案分别进行研究。因此，本发明可在同一个微流控芯片中构建不同水平的局部力学微环境，能够实现对关节软骨机械刺激的通量化或局部化研究。

关节软骨在体内的生-化微环境包括巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞以及各类细胞分泌的细胞因子等。这些生-化因素能够影响软骨细胞的稳态，而软骨细胞由力学刺激等因素引发的损伤而产生的细胞碎片、聚集蛋白等可刺激其他细胞如巨噬细胞活化并促使其分泌细胞因子等。这些关节腔内的力-化-生耦合的微环境下细胞之间的相互作用(crosstalk)对关节疾病的发生和发展非常重要，而利用本发明设计的微流控芯片能构建软骨细胞的力-化-生耦合的微环境的模型，其中，生-化因素中的细胞因子等可以通过直接添加到第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23中的细胞培养液中来实现，本发明的通过巧妙地设计微流控芯片的结构实现了生-化因素中多细胞的共培养。

综上，本发明提供的微流控芯片基于逐层叠加的经典结构，同时兼顾多细胞共培养、力学刺激的功能，建立软骨仿生微流控芯片，不仅能够调控软骨组织受到机械刺激，同时能够实现多种细胞的共培养，实现关节组织的力学刺激和免疫微环境的共建。

本发明提供了一种利用上述技术方案所述的微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的力-化-生耦合的微环境模型的方法。本发明基于上述微流控芯片的模块化设计的灵活性，为解析关节微环境中的力学刺激和各免疫细胞对关节软骨稳态的影响提供了契机。本发明通过合理的设计微流控芯片的结构能够实现关节软骨在体内受到的生化和力学的微环境，建立更好的模拟关节软骨所处的力-化-生耦合的微环境的微生理系统模型，准确重现了人体器官的生理、病理活动以及机体各种生物学行为。

附图说明

图1是本发明提供的一种用于关节软骨细胞三维培养及其力学微环境构建的多功能微流控芯片的结构示意图；

图1中：1：基底层，2：细胞三维培养层；21：细胞三维培养通道；22：第一细胞培养液通道；23：第二细胞培养液通道；24：细胞载流液入口通道；25：细胞载流液出口通道；26：第一细胞培养液入口通道；27：第一细胞培养液出口通道；28：第二细胞培养液入口通道；29：第二细胞培养液出口通道；3:气压控制层；31：第一气体通道；32：第二气体通道；33：第三气体通道；311：第一挤压部；321：第二挤压部；331：第三挤压部；34～39：液体通孔；4：储液池；41～46：储液通孔；

图2为被标记TMRM探针的软骨细胞在紫外照射(P＝3W)下的荧光强度随照射时间的变化；

图3为在本发明中培养7天后的细胞活性荧光图；

图4为本发明中在水凝胶中均匀分布的三维培养的软骨细胞的示意图以及被施加机械压缩前后发生变形的原位细胞示意图，其中绿色为活细胞示踪标记荧光染料CFSE；

图5为本发明中模拟三维培养的细胞和2D培养的细胞进行共培养的示意图，其中绿色为荧光染料CFSE标记的原代软骨细胞，红色为荧光染料Dil标记的巨噬细胞RAW264.7；

图6本发明中水凝胶局部压缩效果的典型示意图，图6中的A为本发明中单个气体通道的图；图6中的B为两相邻气体通道同时施加气压时水凝胶的纵向形变图，图6中的C为施加气压时水凝胶的上表面，图6中的D为施加气压时水凝胶的下表面，绿色荧光为直径100nm的聚苯乙烯荧光颗粒；

图7为本发明中水凝胶局部压缩效果的量化结果图，图7中的A为本发明中单个气压通道通入不同水平的压缩空气时对应的水凝胶局部压缩形变的量化结果；图7中的B为本发明中单个气压通道通入不同水平的压缩空气时对相邻压缩通道下方对应的水凝胶局部压缩形变的影响的量化结果图；

图8为利用本发明构建的差异化力学环境下软骨细胞的基质合成的软骨生物功能评价的免疫荧光实验结果，其中Static为未受机械压缩；PC为细胞发生生理剂量的形变；HPC为细胞发生超生理剂量的形变；

图9为利用本发明构建的差异化力学环境下软骨细胞的基质破坏酶的软骨生物功能评价的免疫荧光实验结果，其中Static为未受机械压缩；PC为细胞发生生理剂量的形变；HPC为细胞发生超生理剂量的形变；

图10为利用本发明探究遭受超生理剂量的机械压缩的软骨细胞对巨噬细胞的促炎性标志物iNOS的含量的免疫荧光实验结果；

图11为利用本发明探究遭受超生理剂量的机械压缩的软骨细胞对巨噬细胞的促炎性标志物iNOS的含量的流式细胞仪检测结果；

图12为现有技术“Hyperphysiological compression of articular cartilageinduces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model”(P.Occhetta,A.Mainardi,E.Votta,Q.Vallmajo-Martin,M.Ehrbar,I.Martin,A.Barbero,M.Rasponi,Nature Biomedical Engineering,2019 Jul；3(7):545-557.doi:10.1038/s41551-019-0406-3)中公开的芯片模型；

图13为现有技术“Hyperphysiological compression of articular cartilageinduces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model”(P.Occhetta,A.Mainardi,E.Votta,Q.Vallmajo-Martin,M.Ehrbar,I.Martin,A.Barbero,M.Rasponi,Nature Biomedical Engineering,2019 Jul；3(7):545-557.doi:10.1038/s41551-019-0406-3)中公开的芯片模型中悬挂的微阵列与下层的PDMS膜之间的间隙示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种微流控芯片，包括基底层1和依次层叠设置于所述基底层1上的细胞三维培养层2和气压控制层3；所述基底层1、所述细胞三维培养层2和所述气压控制层3为透明材质；

所述细胞三维培养层2设置有细胞三维培养通道21和位于所述细胞三维培养通道21两侧的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23，所述细胞三维培养通道21与第一细胞培养液通道22之间以及细胞三维培养通道21与第二细胞培养液通道23之间由多个微结构分隔开，所述微结构之间存在间隙，所述细胞三维培养通道21的两端设有细胞载流液入口通道24和细胞载流液出口通道25，所述第一细胞培养液通道22两端设有第一细胞培养液入口通道26和第一细胞培养液出口通道27，所述第二细胞培养液通道23两端设有第二细胞培养液入口通道28和第二细胞培养液出口通道29；

所述气压控制层3中设有垂直于所述细胞三维培养通道21的多个气体通道，各所述气体通道的两端均设有气体出入口，各所述气体通道均设有位于两端的所述气体出入口之间的挤压部，各所述挤压部位于所述细胞三维培养通道21上方，所述气压控制层两端均设有三个液体通孔，各所述液体通孔分别连通细胞载流液入口通道24、细胞载流液出口通道25、第一细胞培养液入口通道26、第一细胞培养液出口通道27、第二细胞培养液入口通道28和第一细胞培养液出口通道29。

在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。

本发明提供的微流控芯片的结构示意图如图1所示，以下结合图1对本发明提供的微流控芯片进行详细描述。

本发明提供的微流控芯片包括基底层1。在本发明中，所述基底层1作为整个微流控芯片的基底，对所述细胞三维培养层2进行封装。

作为本发明的一个或多个实施例，所述基底层1的材质为玻璃。

作为本发明的一个或多个实施例，所述基底层1的厚度为0.13～0.17mm。

在本发明中，所述基底层1采用厚度为0.13～0.17mm的超薄玻璃，超薄玻璃由于其厚度较薄、透明等优点，能够允许在显微镜下实现细胞三维培养层2中三维培养的细胞的单细胞层面的原位观测及其力学行为分析。

本发明提供的微流控芯片包括设置于所述基底层1上的细胞三维培养层2。所述细胞三维培养层2设置有细胞三维培养通道21和位于所述细胞三维培养通道21两侧的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23，所述细胞三维培养通道21与第一细胞培养液通道22之间以及细胞三维培养通道21与第二细胞培养液通道23之间由微结构分隔开，所述微结构之间存在间隙，所述细胞三维培养通道21的两端设有细胞载流液入口通道24和细胞载流液出口通道25，所述第一细胞培养液通道22两端设有第一细胞培养液入口通道26和第一细胞培养液出口通道27，所述第二细胞培养液通道23两端设有第二细胞培养液入口通道28和第二细胞培养液出口通道29。在本发明中，所述细胞三维培养层2的作用为进行细胞培养。

作为本发明的一个或多个实施例，所述细胞三维培养通道21、第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23均为上部(顶部)密封下部开口的结构。

作为本发明的一个或多个实施例，所述微结构为直线排列的微柱体，相邻微柱体之间存在间隙，所述微结构用于将细胞三维培养通道21与第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23隔开，又允许各通道之间细胞和营养物质的通过和交换。

作为本发明的一个或多个实施例，所述微结构呈栅栏形，所述微结构的一端与基底层1接触。

作为本发明的一个或多个实施例，细胞载流液入口通道24、细胞载流液出口通道25、第一细胞培养液入口通道26、第一细胞培养液出口通道27、第二细胞培养液入口通道28和第一细胞培养液出口通道29为上下贯通的通孔结构。

作为本发明的一个或多个实施例，所述细胞三维培养通道21的宽度为1～1.5mm。第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23的宽度为1～2mm。所述细胞三维培养通道21、第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23的深度为70～300μm。

作为本发明的一个或多个实施例，所述细胞载流液入口通道24、细胞载流液出口通道25、第一细胞培养液入口通道26、第一细胞培养液出口通道27、第二细胞培养液入口通道28和第一细胞培养液出口通道29的直径为0.5～1.5mm。

作为本发明的一个或多个实施例，所述细胞三维培养层2的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，厚度为200～400μm。在本发明中，所述细胞三维培养层2的厚度与细胞三维培养通道21的深度之差为细胞三维培养层2承受压缩空气而发生形变的PDMS膜的厚度，该PDMS膜的厚度是影响后续使用过程中压缩空气对细胞-水凝胶混合物的压缩效果的关键因素。

在本发明中，所述细胞三维培养层2使用时，从细胞载流液入口通道24注入软骨细胞和水凝胶的混合液，由于细胞三维培养通道21和第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23之间有微结构进行间隔，因此软骨细胞和水凝胶的混合液会被限制在细胞三维培养通道21中。水凝胶固化之后，就在细胞三维培养通道21中实现了对软骨细胞在水凝胶中进行三维培养的目的。细胞的培养液由第一细胞培养液入口通道26和第二细胞培养液入口通道28注入。

本发明提供的微流控芯片包括设置于所述细胞三维培养层2上的气压控制层3。所述气压控制层3中设有垂直于所述细胞三维培养通道21的多个气体通道，各所述气体通道的两端均设有气体出入口，各所述气体通道均设有位于两端的所述气体出入口之间的挤压部，各所述挤压部位于所述细胞三维培养通道21上方，所述气压控制层两端均设有三个液体通孔，各所述液体通孔分别连通细胞载流液入口通道24、细胞载流液出口通道25、第一细胞培养液入口通道26、第一细胞培养液出口通道27、第二细胞培养液入口通道28和第一细胞培养液出口通道29。在本发明中，所述气压控制层3的功能是用来实现微流控芯片中对细胞三维培养层2力学加载区域的机械压缩功能，包括在关节软骨细胞的力-化-生耦合微环境构建中模拟细胞受到的机械压缩刺激。

作为本发明的一个或多个实施例，所述气体通道的个数为3个，如图1所示，分别为第一气体通道31，第二气体通道32和第三气体通道33。第一气体通道31设有位于两端的所述气体出入口之间的第一挤压部311。第二气体通道31设有位于两端的所述气体出入口之间的第二挤压部321。第三气体通道31设有位于两端的所述气体出入口之间的第三挤压部331。所述气体通道为上部(顶部)密封下部开口的结构，所述气体通道的宽度为1～1.5mm，深度为50～200μm。所述挤压部的宽度大于所述气体通道的宽度。所述挤压部的形状为矩形或圆形。所述挤压部用于对细胞三维培养层2施加机械压力。

在本发明中，各所述气体通道的两端均设有气体出入口。所述气体出入口的形状为圆形。所述气体出入口的直径优选为0.7mm。各所述气体通道通过气体出入口通过外接气压输出设备将压缩空气通入气压控制层3的气体孔道，通过气体孔道的挤压部致使细胞三维培养层2中的细胞三维培养通道21发生变形，且气压输出设备与气体入口连通的管道上设置有Elveflow微流体OB1压力流量控制器，Elveflow微流体OB1压力流量控制器能够对压缩空气的值实现超精确和快速响应的气压流量控制。每1个气压通道均可以通过调控通入气体通道的压缩空气的量，纵向压缩细胞三维培养通道21中的水凝胶并使其发生形变，从而对均匀混合在水凝胶中三维生长的软骨细胞施加机械压缩进而发生形变。同时，本发明每个气体通道在施加气压时会对细胞三维培养通道21内的一部分水凝胶进行压缩，进而实现了同一芯片中的压缩区域的可控性。所述气压控制层中的若干气体孔道可单独或者联合控制，可以设计不同的控制方案，具体的：只对其中一个气体通道施加气压、三个通道一起施加气压或三个通道轮流施加动态气压。本发明中多个气体通道的设计可以让芯片中细胞面临的机械刺激更加多样化，可以更好地模拟体内环境，也可以对更多组不同的气压输出方案分别进行研究。

本发明通过气压控制层3中设置有多个气体孔道，可在同一个芯片中构建不同水平的局部力学微环境，能够实现对关节软骨机械刺激的通量化或局部化研究。

作为本发明的一个或多个实施例，所述气压控制层3的材质为PDMS。

作为本发明的一个或多个实施例，所述气压控制层3上的液体通孔的直径为1.2mm。

本发明提供的微流控芯片优选还包括叠放于所述气压控制层3上的储液层，所述储液层包括设置于所述气体通道两侧的两个储液池4，各所述储液池4中均设有三个储液通孔，各所述储液通孔分别连通各所述液体通孔。在本发明中，所述储液层的功能主要是为细胞培养的培养液提供更多的存储空间。此外，在对细胞进行处理如生化分析的免疫荧光实验时，所述储液层能够提供更多的储液空间。

作为本发明的一个或多个实施例，所述储液通孔的直径为1.5～3.5mm。

作为本发明的一个或多个实施例，所述储液层的材质为PDMS。

本发明提供的微流控芯片从下至上优选包括：基底层1、细胞三维培养层2、气压控制层3和储液层。本发明提供的微流控芯片的气压控制层3包括若干气体孔道，能够实现对细胞三维培养通道的不同区域进行机械压缩，从而形成了多个机械压缩的细胞培养区域；为了实现多细胞的共培养采用了微结构间隔的通道。本发明不同层之间通过不可逆键合结合。本发明提供的微流控芯片利用PDMS制备而成，其光学透明性、透气性、可变形性和易于制造，这允许实时观测细胞和组织对力学刺激等的响应。

本发明提供了上述技术方案所述的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计并制备细胞三维培养层2和气压控制层3的掩膜版；

(2)利用掩膜版通过光刻技术制备含有细胞三维培养层2和气压控制层3结构的硅片；

(3)利用上述硅片制备PDMS基的三维培养层2和气压控制层3；

(4)将细胞三维培养层2和气压控制层3键合后，再与基底层1键合。

本发明制备细胞三维培养层2和气压控制层3的模板。在本发明中，所述模板的具体制备方法优选包括：利用CAD绘制细胞三维培养层2、气压控制层3和储液层的结构图；按照CAD绘制的结构图，在硅圆晶片上利用软光刻方法制备气压细胞三维培养层2、控制层3和储液层的模板，然后对模板进行疏水处理后，备用。

本发明利用模板制备气压细胞三维培养层2、气压控制层3和储液层。所述气压控制层3和储液层的制备方法优选包括：将混合除泡后的PDMS液浇筑进模板中，固化后翻模，得到气压控制层3和储液层。所述铸膜液优选为道康宁Sylgard 184 PDMS包括聚合体和交联剂，所述聚合体和交联剂的质量比为10：1。所述细胞三维培养层2的制备方法优选包括：将混合除泡后的PDMS通过旋涂的方式在模板上涂敷厚度均匀且可控的的膜，固化后翻模，得到细胞三维培养层2。所述旋涂优选包括依次进行低速旋涂和高速旋涂，所述：低速旋涂的转速优选为100rpm，时间优选为60s；所述高速旋涂的转速优选>100rpm，更优选为200～300rpm，时间优选为60s。所述固化的温度优选为65℃，时间优选为3～12h。在本发明中，细胞三维培养层2优选利用旋涂方法进行制备，厚度可以通过旋涂的转速参数和PDMS的配比等进行调控，因为旋涂的细胞三维培养层2的总厚度扣除通道深度后即为承受压缩空气而发生形变的PDMS膜的厚度，该PDMS膜的厚度是影响后续使用过程中压缩空气对细胞-水凝胶混合物的压缩效果的关键因素。

得到细胞三维培养层2、气压控制层3和储液层后，本发明将气压细胞三维培养层2和控制层3键合后，再与基底层1键合，最后与储液层键合，得到所述微流控芯片。在本发明中，所述键合的具体实施方式优选包括：将细胞三维培养层2、气压控制层3和储液层依次利用等离子体清洗机进行表面改性处理后，进行永久性键合在透明的基底层1上。芯片各层键合的步骤优选为：先用打孔器在气压控制层3的气压通道的两端打通孔，然后用胶带粘掉气压控制层、细胞三维培养层表面的灰尘，将需要键合在一起的面朝上，放置于等离子体清洗机进行表面改性处理后，将细胞三维培养层2和气压控制层3键合在一块，放于80℃加热台加热，加热时间≥1h；用打孔器将键合在一起的细胞三维培养层2和气压控制层3的注入细胞三维培养层2的通道的两端进行打孔，然后用胶带粘掉表面的灰尘，将需要键合在一起的面朝上，将其和基底层1放置于等离子体清洗机进行表面改性处理后，键合在一块，放于80℃加热台加热，加热时间≥1h；最后键合储液层后，放于80℃加热台加热，加热时间≥2h。

本发明提供了一种利用上述技术方案所述的微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的差异化力学微环境模型的方法，包括以下步骤：

将软骨细胞-水凝胶的混合物注入细胞三维培养层2的细胞三维培养通道21中，在紫外光照射下进行光固化，得到固化软骨细胞-水凝胶；然后将软骨细胞培养液注入细胞三维培养层2的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23中进行软骨细胞培养，在所述软骨细胞培养的过程中，向所述气压控制层3的气体通道中通入不同水平的压缩空气，对细胞三维培养通道21中不同区域的固化软骨细胞-水凝胶中的软骨细胞进行不同水平的机械刺激。

在本发明中，所述微流控芯片使用之前，优选进行灭菌处理。在本发明中，所述灭菌处理的具体操作优选为：利用移液枪将75％消毒酒精注入细胞三维培养层3的细胞三维培养通道21、第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23中，室温静置1～3h；随后，利用移液枪将PBS溶液注入细胞三维培养层3的细胞三维培养通道21、第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23中，室温静置；随后将洗涤后的芯片干燥。所述干燥的温度优选为37～65℃，所述干燥在热台或者烘箱烘干中进行，所述干燥为将微流控芯片中的液体除去。最后放于细胞操作台进行UV照射≥1h。所述软骨细胞-水凝胶的混合物优选包括软骨细胞和水凝胶溶液；软骨细胞的密度优选为2×10⁵～4×10⁶个细胞/mL。所述软骨细胞选自人、小鼠或大鼠等关节软骨分离的原代软骨细胞或者细胞系。所述水凝胶溶液为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液，所述甲基丙烯酰化明胶溶液的质量含量优选为10～15％，更优选为10％。在本发明的具体实施例中，所述GelMA溶液具体优选为GelMA60。所述光固化时，紫外光的功率为优选3W，固化时间优选≤10s，更优选为10s。所述压缩空气的压力优选为0～1500mbar。在本发明的具体实施例中，本发明通过外接Elveflow微流体OB1压力流量控制器调控通入气压控制层3致使PDMS膜发生变形的压缩空气的值实现超精确和快速响应的气压流量控制。Elveflow微流体OB1压力流量控制器是一种实现精密微流体压力控制的多通道可编程恒压泵，它允许在毫秒响应时间内无脉冲流动，通过ESI软件能够输出多样性波形的气压。所述压缩空气的气压波形优选为包括正弦、方波、三角波、斜坡及自定义波形。Elveflow微流体OB1压力流量控制器的压力输出通道的数量可以从1个通道到4个通道进行任意定制，能够实现芯片运行的通量化。在本发明的具体实施例中，所述压缩空气的气压波形优选为0.5Hz的正弦波。

本发明提供了一种利用上述技术方案所述的微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的力-化-生耦合的微环境模型的方法，包括以下步骤：

将与细胞三维培养层2的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23接触的基底层1表面用包被材料进行表面修饰；然后将软骨细胞-水凝胶的混合物注入细胞三维培养层2的细胞三维培养通道21中，在紫外光照射下进行光固化，得到固化软骨细胞-水凝胶；再将复合细胞培养液注入封闭底面修饰后的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23中，所述复合细胞培养液中含有与软骨细胞相关的细胞、与软骨细胞相关的生化因子、与软骨细胞相关的趋化因子和药物试剂中的一种或多种，进行细胞共培养；在所述细胞共培养的过程中，向所述气压控制层3的气体通道中通入压缩空气，对细胞三维培养通道21中不同区域的固化软骨细胞-水凝胶中的软骨细胞进行机械刺激。

或者，本发明提供了一种利用上述技术方案所述的微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的力-化-生耦合的微环境模型的方法，包括以下步骤：

将与细胞三维培养层2的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23接触的基底层1表面用包被材料进行表面修饰；然后将软骨细胞-水凝胶的混合物注入细胞三维培养层2的细胞三维培养通道21中，在紫外光照射下进行光固化，得到固化软骨细胞-水凝胶；再向所述气压控制层3的气体通道中通入压缩空气，对细胞三维培养通道21中不同区域的固化软骨细胞-水凝胶中的软骨细胞进行机械力刺激；最后将复合细胞培养液注入封闭底面修饰后的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23中，所述复合细胞培养液中含有与软骨细胞相关的细胞、与软骨细胞相关的生化因子、与软骨细胞相关的趋化因子和药物试剂中的一种或多种，进行细胞共培养。

在本发明中，所述微流控芯片使用之前进行的灭菌处理优选与上述相同，在此不再赘述。在本发明中，关节软骨在体内的生-化微环境包括巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞、滑膜细胞以及各类细胞分泌的细胞因子等。这些生-化因素能够影响软骨细胞的稳态，而软骨细胞由力学刺激等因素引发的损伤而产生的细胞碎片、聚集蛋白等可刺激其他细胞如巨噬细胞活化并促使其分泌细胞因子等。这些关节腔内的力-化-生耦合的微环境下细胞之间的相互作用(crosstalk)对关节疾病的发生和发展非常重要，因此，利用本发明设计的微流控芯片构建软骨细胞的力-化-生耦合的微环境的模型是非常有价值的。在本发明中，生-化因素中的细胞因子等可以通过直接添加到细胞培养液中来实现，生-化因素中的细胞通过巧妙地设计微流控芯片的结构来实现多细胞的共培养。本发明把关节内其他的细胞以2D生长的形式分布于芯片细胞三维培养层两侧的通道内。为了在芯片中接种关节内其他相关的细胞如巨噬细胞，本发明将与细胞三维培养层2的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23接触的基底层1表面用包被材料进行表面修饰。在本发明中，所述包被材料优选包括纤连蛋白或RGD，更优选为纤连蛋白。本发明中以纤连蛋白为对通道内玻璃基底进行表面修饰以使其适于细胞粘附生长。在本发明中，所述表面处理的具体实施方式优选包括：取经过灭菌烘干的芯片置于无菌培养皿内，先用无菌水冲洗一遍通道，再用移液枪吸取10μL包被液从通道一端注入微通道内对通道底部的玻璃表面进行包被，将含有包被液的芯片于超净台内孵育1h并吸出剩余包被液，后自然干燥1h备用。在本发明中，所述固化软骨细胞水凝胶的制备方法与上文记载相同，在此不再赘述。本发明复合细胞培养液注入封闭底面修饰后的第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23中，进行细胞共培养。在本发明中，所述复合细胞培养液中优选含有与软骨细胞相关的细胞、与软骨细胞相关的生化因子、与软骨细胞相关的趋化因子和药物试剂中的一种或多种。所述与软骨细胞相关的细胞优选包括免疫细胞，所述免疫细胞具体优选为巨噬细胞和/或淋巴细胞。所述与软骨细胞相关的生化因子优选包括与软骨细胞相关的细胞分泌的细胞因子。所述与软骨细胞相关的细胞选自人、小鼠或大鼠等分离的原代细胞或者细胞系。在本发明的具体实施例中，所述复合细胞培养液具体为含有与软骨细胞相关的细胞的培养液，所述含有与软骨细胞相关的细胞的培养液中与软骨细胞相关的细胞的密度优选为2×10⁵～4×10⁶个细胞/mL。所述压缩空气的压力优选为0～1500mbar。在本发明的具体实施例中，本发明通过外接Elveflow微流体OB1压力流量控制器调控通入气压控制层3致使PDMS膜发生变形的压缩空气的值实现超精确和快速响应的气压流量控制。Elveflow微流体OB1压力流量控制器是一种实现精密微流体压力控制的多通道可编程恒压泵，它允许在毫秒响应时间内无脉冲流动，通过ESI软件能够输出多样性波形的气压。所述压缩空气的气压波形优选为包括正弦、方波、三角波、斜坡及自定义波形。Elveflow微流体OB1压力流量控制器的压力输出通道的数量可以从1个通道到4个通道进行任意定制，能够实现芯片运行的通量化。在本发明的具体实施例中，所述压缩空气的气压波形优选为0.5Hz的正弦波。

本实施例的微流控芯片可重复使用。本发明优选利用水凝胶GelMA裂解液将细胞三维培养层的微结构通道内的水凝胶进行裂解，随后用胰酶将芯片通道内细胞进行消化、PBS对通道进行清洗，随后进行细胞接种前的灭菌处理。

本发明提供了一种能够实现多细胞共培养和机械压缩研究的多功能微流控芯片。本发明基于微流控技术利用光刻等微纳加工技术构建类软骨芯片，通过在芯片结构的气压的通道层设置多个并联的气体通道，能够高通量的实现对细胞三维培养层的细胞的可精确调控的机械压缩。通过水凝胶等生物材料构建关节软骨模型，在芯片的不同位置接种相应的细胞如巨噬细胞，准确模拟关节软骨所处的真实的局部力学微环境和免疫微环境，从单细胞水平探究关节疾病的发病机理，搭建方便快捷经济的药物筛选平台，为关节疾病的治疗提供支撑。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明以下实施例利用图1所示结构的微流控芯片进行实验。其中微流控芯片分为基底层1、细胞三维培养层2、气压控制层3和最上层的储液层四部分组成。所述的细胞三维培养层2为以微结构分割的三通道，细胞三维培养通道21的宽度为1.5mm，第一细胞培养液通道22和第二细胞培养液通道23的宽度为2mm，深度为100μm，上层的气压控制层3的气体通道个数为3个，气体孔道的宽度为1.5mm，深度为100μm，储液池为带有直径3.5mm的圆形通孔结构的长方体。

图1所示结构的微流控芯片的制备方法包括：(1)利用CAD绘制芯片结构图并制备掩膜版，在硅圆晶片上利用软光刻方法制备各结构层的模板，对硅片模板进行疏水处理后，备用。(2)利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)对气压控制层3和储液层的硅片模板进行浇筑、烘干、翻模，制备用于制备芯片的PDMS的气压控制层和储液层。(3)细胞三维培养层2需要利用旋涂方法进行制备，其中采用的PDMS的聚合体和交联剂的配比为10：1，PDMS的固化温度为65℃，固化时间为3h，本发明中采用的旋涂分为两步：细胞三维培养层2的厚度为200μm，旋涂参数为100rpm 60s和300rpm 60s，烘干后翻模。(4)将细胞三维培养层2、气压控制层1和储液层4依次利用等离子体清洗机进行表面改性处理后，进行永久性键合在透明的基底1上，以下实施例使用的基底为0.15±0.02mm的透光超薄玻片。芯片各层键合的步骤为：先用直径0.7mm的打孔器在气压控制层的气压通道的两端打通孔，然后用胶带粘掉气压控制层3、细胞三维培养层2表面的灰尘，将需要键合在一起的面朝上，放置于等离子体清洗机进行表面改性处理1min后，将气压控制层3和细胞三维培养层2键合在一块，放于80℃加热台烘1h；用直径1.2mm的打孔器将键合在一起的气压控制层3和细胞三维培养层2的注入细胞三维培养层2通道的两端进行打孔，然后用胶带粘掉表面的灰尘，将需要键合在一起的面朝上，将其和超薄玻片(厚度0.15±0.02mm)放置于等离子体清洗机进行表面改性处理1min后，键合在一块，放于80℃加热台烘1h；最后键合储液层后，放于80℃加热台烘≥2h，即可。

以下实施例使用的图1所示结构的微流控芯片在用于所有的细胞实验前需要对其进行灭菌处理。具体操作为：利用移液枪将75％消毒酒精注入细胞三维培养层2的通道中，室温静置3h，随后，利用移液枪将PBS溶液注入细胞三维培养层2的通道中，室温静置1h。随后在65℃的热台或者烘箱烘干芯片中的液体，放于细胞操作台进行UV照射1h，即可用于细胞培养。以下实施例中紫外光源的功率和照射时间的确定方法为：选用四甲基罗丹明甲基酯TMRM探针(Invitrogen，货号I34361)作为线粒体膜电位指示剂，TMRM探针是一种可以通透细胞膜的选择性染色活细胞线粒体的荧光染料，可以快速通过细胞膜，仅需几分钟就可被具有活性的线粒体所俘获，可以选择性的定位于线粒体中，并且对细胞没有毒性；TMRM探针的强荧光允许使用低探针浓度，从而避免聚集，因此TMRM探针为动态和最佳原位定量测量荧光染料之一。通过荧光信号的强弱来快速灵敏的检测线粒体膜电位的变化：荧光信号减弱，说明线粒体膜电位降低。具体实验操作为：将用胰酶消化后的软骨细胞用PBS洗两遍以去除血清；将用无血清培养基稀释的TMRM工作染液加入细胞悬液中，37℃，5％CO₂培养箱中孵育30min；PBS洗两遍细胞；随后将离心收集细胞、计数，用37℃预热的10％GelMA60溶液重悬细胞；将TMRM探针标记的细胞和水凝胶混合液注入芯片通道中，用紫外光源(P＝3W)照射不同的时间后，用激光共聚焦显微镜检测细胞的荧光强度。图2为利用荧光探针TMRM标记的原代软骨细胞后其荧光强度随紫外光源照射时间的变化。由图2可知，在功率P＝3W的紫外光源折射下，时间小于10s时不影响细胞的荧光强度；但是在照射时间大于10s时，细胞的荧光强度下降，说明细胞状态受到了影响，因此选定紫外照射时长为10s。

实施例1

本实施例利用微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的力-化-生耦合微环境模型，但不限于此，其他除软骨细胞外的其他在体细胞的力-化-生耦合的微环境也能够利用本发明来实现复杂微环境的构建。具体过程如下：

(1)软骨细胞在微流控芯片的接种和培养

将从出生3～5d的小鼠膝关节分离的原代小鼠软骨细胞混入水凝胶(10％的GelMA60)中，细胞悬液的密度范围在4×10⁶个细胞/mL。将原代软骨细胞-水凝胶混合物利用移液枪吸取10μL从芯片的储液通孔45缓慢注入，防止因速度太快而突破微结构的限制而漏入两侧的通道，随后紫外固化(功率P＝3W，T＝10s)。将软骨细胞培养液从两侧储液通孔41和43注入后，将200μL的移液枪枪头吸满培养液后垂直插在芯片两侧储液通孔41、42、43、和44处。随后将接种完细胞的芯片放入培养箱(37℃，5％CO₂)中。在芯片通道插入移液枪枪头，一方面是为了进行液封防止水凝胶失水变干，另一方面是为了给细胞生长提供充足的培养液，本芯片在细胞长期培养时的换液频率为≤3天，采用的这种细胞培养方式不影响细胞的活性，避免了芯片外接横流泵降低了细胞污染的风险、操作相对简单。

图3为原代小鼠软骨细胞在本发明的微流控芯片中三维培养7天后的细胞活性分析。细胞活性检测试剂为索莱宝Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒(货号：CA1630)，具体测定方法如下：首先用移液枪移去细胞三维培养层的通道22和23内的培养液并注入PBS进行清洗两遍，每次清洗时在37℃孵育15min；去除残留酯酶，将配制好的染液Calcein-AM工作液注入通道22和23中，37℃避光静置2h；用移液枪移去染液Calcein-AM，加入稀释的PI工作液，室温避光10min；孵育结束后，移除染色液，用PBS洗两遍，每次清洗时在37℃孵育15min；随后用激光共聚焦显微镜检测。由实验结果图3可知，原代软骨细胞在本发明的微流控芯片中培养7天后保持了良好的细胞活性。

(2)力学微环境的构建

利用本发明的微流控芯片能够模拟再现软骨细胞在体内所处的力学微环境，尤其是机械压缩。本实施例通过向气压控制层的通道内通入压缩空气使得下方的PDMS膜发生形变，变形的PDMS膜会纵向压缩下方细胞三维培养层通道中的水凝胶并使其发生形变，从而对均匀混合在水凝胶中三维生长的软骨细胞施加机械压缩进而发生形变。因此，通过控制细胞三维培养层中水凝胶的形变即可实现对细胞施加机械刺激-压缩的精确调控。

本实施例中通过外接Elveflow微流体OB1压力流量控制器调控通入气压控制层致使PDMS膜发生变形的压缩空气的值实现超精确和快速响应的气压流量控制。Elveflow微流体OB1压力流量控制器是一种实现精密微流体压力控制的多通道可编程恒压泵，它允许在毫秒响应时间内无脉冲流动，通过ESI软件能够输出多样性波形的气压，包括正弦、方波、三角波、斜坡及自定义波形的压力输出控制和微流体的流量流动控制，无需任何编程操作，能够实现水凝胶变形的精确测量，允许模拟细胞受到的不同类型的动态机械压缩的力学刺激；Elveflow微流体OB1压力流量控制器的压力输出通道的数量可以从1个通道到4个通道进行任意定制，能够实现芯片运行的通量化。本发明中使用的压缩空气的值在0～1500mbar之间。

原位检测水凝胶形变后细胞是否受到了机械压缩而发生形变，所需试剂为活细胞示踪标记荧光染料CFSE(货号HY-D0938)，CFSE是一种可穿透细胞膜的活细胞示踪染料，进入细胞后主要定位于细胞膜、细胞质和细胞核。具体是将培养皿培养的原代软骨细胞弃去培养基，加入胰蛋白酶消化细胞，离心弃去上清后，加入PBS洗涤两次，每次5分钟；然后加入1mL用预热好的无血清细胞培养基或PBS稀释的CFSE工作液(5～10μM)，室温孵育15分钟；然后离心弃上清，加入PBS洗涤细胞两次，每次5分钟；用37℃预热的10％GelMA60重悬染色后的细胞；用移液枪吸取10μL细胞-水凝胶混合液缓慢注入芯片通道中，紫外(P＝3W)固化10s；向细胞培养层的两侧通道注入培养液；在激光共聚焦显微镜下进行观察。图4中的A为本实施例中在水凝胶中均匀分布的三维培养的软骨细胞的图。图4中的B为被施加机械压缩前后发生变形的原位细胞图，由图4可知，水凝胶形变后，细胞也随着发生了形变。这说明采用本发明中控制细胞三维培养层中水凝胶的形变即可实现对细胞施加机械刺激-压缩的精确调控。

(3)生-化微环境的构建

关节软骨在体内的生-化微环境包括巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞以及各类细胞分泌的细胞因子等。这些生-化因素能够影响软骨细胞的稳态，而软骨细胞由力学刺激等因素引发的损伤而产生的细胞碎片、聚集蛋白等可刺激其他细胞如巨噬细胞活化并促使其分泌细胞因子等。这些关节腔内的力-化-生耦合的微环境下细胞之间的相互作用(crosstalk)对关节疾病的发生和发展非常重要，因此，利用本发明设计的微流控芯片构建软骨细胞的力-化-生耦合的微环境的模型是非常有价值的。其中，生-化因素中的细胞因子等可以通过直接添加到细胞培养液中来实现，生-化因素中的细胞通过巧妙地设计微流控芯片的结构来实现多细胞的共培养。

本实施例把关节内其他的细胞以2D生长的形式分布于芯片细胞三维培养层两侧的通道内。为了在芯片中接种关节内其他相关的细胞(本实施例为巨噬细胞)，本实施例首先需要在细胞三维培养区两侧的通道内的玻璃基底进行表面修饰，用于表面修饰的材料为纤连蛋白材料。本实施例中以纤连蛋白对通道内玻璃基底进行表面修饰以使其适于细胞粘附生长。具体操作为：取经过灭菌烘干的芯片置于无菌培养皿内，先用无菌水冲洗一遍通道，再用移液枪吸取10μL纤连蛋白包被液从通道一端注入微通道内对通道底部的玻璃表面进行包被，将含有包被液的芯片于超净台内孵育1h并吸出剩余包被液，后自然干燥1h备用。

进行细胞接种时，首先将需要进行三维培养的原代软骨细胞接种于芯片的中间通道，具体操作如步骤(1)中所述；随后将巨噬细胞的接种于芯片的两侧通道，具体是用移液枪取20μL用培养液配置的巨噬细胞悬液缓(细胞密度范围为：4×10⁶个细胞/mL)慢注入两侧通道，显微镜下确定细胞铺满侧面细胞培养通道，细胞均匀分散且不堆积，静置与培养箱(37℃，5％CO₂)培养1h以上即可贴壁。图5为本发明中模拟三维培养的原代软骨细胞和2D培养的巨噬细胞进行共培养的分布图，其中中间通道为绿色荧光探针CFSE(MCE，货号HY-D0938)标记的原代软骨细胞，两侧通道中为用细胞膜红色荧光染料Dil(碧云天，货号C1991S)标记的巨噬细胞RAW264.7。

本实施例的微流控芯片可重复使用。利用水凝胶GelMA裂解液将细胞三维培养层的微结构通道内的水凝胶进行裂解，随后用胰酶将芯片通道内细胞进行消化、PBS对通道进行清洗，随后进行细胞接种前的灭菌处理。

实施例2

本实施例利用微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的差异化力学微环境，具体过程如下：

(1)芯片细胞接种及培养

操作流程如实施例中的步骤(1)。

(2)利用微流控芯片可进行局部机械压缩的功能对三维培养的软骨细胞进行差异化力学环境的构建

本发明提供的微流控芯片为使芯片能够实现对关节软骨机械刺激的通量化或局部化研究，本发明在气压控制层中设计了与下方的细胞三维培养层中的水凝胶通道相垂直的三个气体通道，每个气体通道均可以通过调控通入上层气体通道的压缩空气的水平，使PDMS膜发生变形而挤压芯片最下层的水凝胶，使得水凝胶发生压缩形变，进而实现对水凝胶中的软骨细胞施加机械力；每个通道在施加气压时会对水凝胶通道内的一部分水凝胶进行压缩，进而实现了同一芯片中的压缩区域的可控性。这些气体通道可单独或者联合控制，可以设计不同的控制方案，如只对其中一个通道施加气压、三个通道一起施加气压或三通道轮流施加动态气压。多通道的设计可以让芯片中细胞面临的机械刺激更加多样化，可以更好地模拟体内环境，也可以对更多组不同的气压输出方案分别进行研究。气体通道两端也预留了用于打孔的圆形区域，方便接入气压输出设备进行控制。因此，本发明可在同一个芯片中构建不同水平的局部力学微环境。

本实施例为量化本发明中各气体通道使水凝胶发生的局部形变，在水凝胶溶液注入芯片通道前掺杂入示踪的聚苯乙烯荧光颗粒(Invitrogen，货号F8803)，荧光颗粒的尺寸在100nm，利用共聚焦显微镜对压缩前后芯片通道中水凝胶的厚度进行三维扫描重构，利用共聚焦显微镜软件NI-Elements测量水凝胶压缩前后的纵向形变。图6为用荧光颗粒标记的水凝胶在本发明中进行局部压缩的共聚焦成像图。单个气体通道与水凝胶在芯片中的相对位置关系如图6中的A所示。图6中的B为两相邻气体通道同时施加气压时水凝胶的纵向形变图，施加气压时水凝胶的上表面为图6中的C，下表面为图6中的D。由图6可知，每个气体通道在通入压缩空气时，均能使下方的水凝胶发生形变；且单个气体通道下方的水凝胶发生的形变与未压缩区域的水凝胶的纵向形态存在明显差异。

图7为本发明中水凝胶局部压缩效果的量化结果图，图7中的A为本发明中单个气压通道通入不同水平的压缩空气时对应的水凝胶局部压缩形变的量化结果；图7中的B为本发明中单个气压通道通入不同水平的压缩空气时对相邻压缩通道下方对应的水凝胶局部压缩形变的影响的量化结果图。由图7的A可知，通过改变气压值，可精确调控芯片中水凝胶发生的变形程度。当芯片结构参数一定时，随着施加气压的增大，水凝胶的压缩形变逐渐增大。单个通道施加气压时，对相邻通道的影响可忽略不计。因此证明了利用本发明在同一芯片中进行局部机械压缩构建了差异化力学环境。

(3)差异化力学微环境下软骨生物功能的检测

关节软骨细胞外基质的主要成分是II型胶原(Collagen II)和可聚蛋白多糖(Aggrecan)，是软骨组织的特征性标志，同时也是检测软骨细胞表型维持的重要指标。在最常见的关节退行性疾病如骨关节炎(OA)发病过程中，软骨细胞合成减少和降解软骨基质的酶活化导致的聚集蛋白丢失被认为是OA过程中最早发生的事件之一。因此本实施例检测软骨细胞的Collagen II和Aggrecan的合成水平可以评价软骨细胞的状态。此外，软骨细胞在损伤后产生的多种基质破坏酶，特别是基质金属肽酶(MMP13)和聚集酶2(ADAMTS5)的被认为在骨关节炎(OA)早期的软骨降解中起关键作用，负责软骨细胞外基质的降解，其含量的过度表达，软骨基质逐渐降解，这也是OA的主要特征。因此，本实施例通过检测MMP13和ADAMTS5的表达量可以评价软骨细胞的损伤情况。

为了探究不同水平的机械压缩对软骨细胞表型功能的影响，利用本发明构建差异化力学环境对三维培养的软骨细胞进行机械刺激后，在原位上进行了Collagen II、Aggrecan、MMP13和ADAMTS5的免疫荧光染色。具体为，首先将小鼠原代软骨细胞接种于芯片，接种方法和培养方法如前实施例1中步骤(1)所述。接种细胞后的芯片置于37℃5％CO₂的培养箱静态培养7天，期间细胞的换液每隔一天。随后对三维培养的细胞进行局部机械压缩，加载周期为14天，每天4小时，进行力学加载的方式是向芯片的气压控制层的不同气体通道内通入不同水平的压缩空气，输出的气压均为频率0.5HZ的正弦波形，三个气体通道中的机械加载分别模拟静态、生理剂量的刺激和超生理剂量(即机械过载)的机械刺激情况。本实例中三个通道中选取的参数为0、100mbar和600mbar。

机械刺激结束后，对局部力学刺激的细胞进行原位表征，具体操作是，用移液枪吸出芯片通道中的培养液，然后用移液枪吸取常温的PBS，缓慢注入芯片通道，清洗三次，每次30min；移液吸取细胞固定液4％多聚甲醛缓慢注入通道对芯片中的细胞进行固定，室温固定30min；去除通道内固定液，PBS缓冲液小心清洗三遍，每次30min；用0.2％TritonX-100渗透30min，PBS洗三遍，每次10min；用5％山羊血清封闭缓冲液室温封闭60min；封闭结束后加入一抗，4℃孵育过夜；PBS含0.1％Tween缓慢清洗三遍，每次30min，用抗体稀释液稀释二抗,室温避光60min；PBS缓冲液洗三遍，每次30min；细胞核染料DAPI，室温避光5min，染色结束后加入PBS缓冲液清洗三遍，每次10min；最后利用激光共聚焦显微镜进行拍照。

图8为利用本发明构建的差异化力学环境下软骨细胞的基质合成的软骨生物功能评价的免疫荧光实验结果。其中Static为未受机械压缩；PC(physiological compression)为水凝胶发生生理剂量的形变(此处为气体通道通入压缩空气值100mbar时水凝胶发生的形变)；HPC(hyper-physiological compression)为水凝胶发生超生理剂量的形变(此处为气体通道通入压缩空气值600mbar时水凝胶发生的形变)。由图8可知，同一块芯片中在局部进行不同机械刺激后的软骨细胞的Collagen II和Aggrecan的表达情况均发生了变化，不同区域之间的表达量有明显差异，具体来说，对于Collagen II，三个不同机械刺激下的软骨均有表达，生理剂量的机械刺激即PC组的表达量明显高于未进行机械刺激的Static组；超生理剂量的机械刺激即HPC组的表达量相比于PC组有明显下降，相比于Static组有所下降但不明显。对于Aggrecan，未进行机械刺激的Static组和生理剂量机械刺激的PC组均有表达，且PC组的表达量明显高于Static组；超生理剂量的机械刺激即HPC组基本未表达。从以上Collagen II和Aggrecan的表达量的结果可以看出，生理剂量的机械刺激促进了细胞基质的形成，而超生理剂量的机械加载抑制了细胞基质的形成。同时也说明，在本发明中构建差异化力学微环境可以作为研究不同水平的机械加载对软骨细胞基质合成的生物功能评价模型。

图9为利用本发明构建的差异化力学环境下软骨细胞的基质破坏酶的软骨生物功能评价的免疫荧光实验结果。由图9可知，同一块芯片中在局部进行不同机械刺激后的软骨细胞的MMP13和ADAMTS5的表达呈现了不同的量，超生理剂量的机械刺激区域的MMP13和ADAMTS5的表达量均高于未机械刺激区域即Static组和生理剂量的机械刺激区域即PC组；而PC区域和Static组的软骨细胞的MMP13和ADAMTS5的表达量较低，且没有明显差异，但两个区域的表达量均明显低于超生理剂量的机械刺激区域。这些实验结果说明超生理剂量的机械刺激促进了软骨细胞的基质破坏酶的形成。同时也说明，在本发明中构建差异化力学微环境可以作为研究不同水平的机械加载对软骨细胞损伤后基质破坏酶分泌的生物功能评价模型。

综上，利用本发明可进行局部机械压缩的功能对三维培养的软骨细胞进行差异化力学环境的构建，并且能够利用该差异化力学微环境建立模拟关节软骨的生物功能评价模型，研究机械刺激对软骨细胞的合成代谢和分解代谢的影响提供了有效的模型手段，有望帮助于骨关节炎等关节退化性疾病的机理研究和药物筛选。

实施例3

本实施例利用实施例1制备的微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的力-化-生耦合的微环境模型。利用本实施例构建的软骨细胞细胞的力-化-生耦合的微环境模型，可进行诸多研究，如微环境中单一因素或多因素联合作用下软骨细胞的合成与代谢、机械刺激的软骨细胞的细胞行为及其对微环境内其他细胞的影响、在关节微环境中力学刺激对免疫微环境的影响等。本实施例以机械过载下的软骨细胞对巨噬细胞的表型极化为例，具体实施步骤如下：

(1)微流控芯片的表面修饰和细胞接种

芯片通道内的表面用纤连蛋白进行处理，具体操作同实施例1中的步骤(3)所述。表面处理后的芯片在37℃烘干，随后进行软骨细胞的接种，细胞密度范围为：4×10⁶个细胞/mL，具体操作同实施例1中的步骤(1)所述。随后进行巨噬细胞的接种，选取小鼠巨噬细胞RAW264.7，细胞密度范围为：4×10⁶个细胞/mL，具体操作同实施例1中的步骤(3)所述。随后将芯片缓慢放入培养箱静置1h等待巨噬细胞的贴壁。利用显微镜观测巨噬细胞贴壁后，将200μL的移液枪枪头吸取200μL培养液后垂直插在芯片通道的入口处，将芯片放入培养箱(37℃，5％CO₂)中。

(2)机械压缩刺激软骨细胞

利用本发明的微流控芯片，通过调控通入气压控制层通道的压缩空气的气压值来使得水凝胶发生30％的变形为模拟体内关节软骨承受机械过载时发生的变形。基于前述实施例1中所述，为使水凝胶发生30％以上的变形，向芯片通入的压缩空气大小在600mbar。为模拟成年人走路时的频率，采用动态的气压频率为0.5HZ对软骨细胞刺激4h后，继续培养24h后，对巨噬细胞的细胞表型进行分析。

(3)巨噬细胞的表型检测

利用免疫荧光实验和流式测试巨噬细胞炎症型标志物(iNOS)进行表征。对于免疫荧光实验，具体操作为：在细胞培养结束后，用移液枪小心缓慢吸出芯片通道中的培养液，然后用移液枪吸取常温的PBS，缓慢注入芯片通道，清洗两次，每次10s；移液吸取细胞固定液4％多聚甲醛缓慢注入通道对芯片中的细胞进行固定，室温固定15min；去除通道内固定液，PBS缓冲液小心清洗三遍，每次5min；用0.2％TritonX-100渗透5min，PBS洗三遍，每次5min；用5％山羊血清封闭缓冲液室温封闭60min；封闭结束后加入一抗iNOS(Proteintech，货号22226-1-AP)，4℃孵育过夜；PBS含0.1％Tween缓慢清洗三遍，每次5min，用抗体稀释液稀释二抗DyLight 488(Boster，货号BA1145),室温避光60min；PBS缓冲液洗三遍，每次5min；细胞核染料DAPI，室温避光3min，染色结束后加入PBS缓冲液清洗三遍，每次3min；在激光共聚焦显微镜下观察细胞的iNOS表达情。图10为未遭受机械过载的软骨细胞和遭受机械过载的软骨细胞分别对巨噬细胞系RAW264.7的iNOS表达含量的影响，由图10可知，遭受机械过载的软骨细胞诱发了巨噬细胞的促炎性标志物iNOS的升高。也可利用流式细胞仪检测巨噬细胞炎症型标志物(iNOS)的表达水平，具体操作为：用移液枪吸出微流控芯片通道中的培养液，用PBS缓冲液洗三遍，将吸出的培养液和清洗的PBS缓冲液置于离心管中，减少细胞损失；将移酶注入通道，芯片在37℃放置1min，用移液枪吸出移酶，注入含有血清的培养液，反复用含有血清的培养液冲洗芯片的通道，直至显微镜下观测巨噬细胞被全部洗干净，将全部液体置于上述离心管，离心取细胞1000rpm 5min；PBS缓冲液洗两遍；加入预冷的固定/破膜试剂(BD,货号554714)4℃20min；用预冷的破膜/清洗缓冲液洗两遍；用5％山羊血清封闭，室温15min；加入荧光染料直标抗体(Invitrogen，货号17-5920-80)，4℃60min；破膜/清洗缓冲液洗两遍，调整细胞悬液浓度，利用流式细胞仪分析细胞。图11为未遭受机械过载的软骨细胞和遭受机械过载的软骨细胞分别对巨噬细胞系RAW264.7的iNOS表达含量的影响的流式测试结果，由图11可知，结论与免疫荧光实验结果一致，遭受机械过载的软骨细胞导致小鼠巨噬细胞系RAW264.7的炎症型标志物iNOS有所升高，进而说明利用本发明的微流控芯片成功研究了关节软骨受到机械过载后会对关节内其他的细胞造成影响，进一步说明关节软骨的微环境中力学微环境和生化微环境之间的相互影响的关系。

比较例1

“Hyperphysiological compression of articular cartilage induces anosteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model”(P.Occhetta,A.Mainardi,E.Votta,Q.Vallmajo-Martin,M.Ehrbar,I.Martin,A.Barbero,M.Rasponi,Nature Biomedical Engineering,2019 Jul；3(7):545-557.doi:10.1038/s41551-019-0406-3)中公开可进行机械压缩的微生理系统用于关节疾病骨关节炎的模型建立和药物筛选。该文献中芯片的结构如下图12所示，该文献中的芯片的三维细胞微结构机械受限压缩的微尺度系统。图12中的a所示：微尺度系统由两个分隔的PDMS微室组成，具有可配置的几何形状，并由PDMS膜分隔。图12中的b所示：顶部隔间通过两排t形悬挂柱(白色部分)被细分为容纳三维微结构的中央通道(蓝色部分)和两个介质补充通道(红色部分)。底部的腔室(灰色部分)代表驱动室。图12中的c所示：静态位置时，底部隔室保持常压，膜保持平整。图12中的d所示：通过对底部隔室加压，PDMS膜变形，压缩中央通道内的水凝胶(蓝色部分)，最终紧贴立柱两端，造成受限压缩。图12中的e为组装设备的照片。图12中的f为立体显微镜图像显示从上面看的t形柱子。图13为文献中的芯片的微结构的显微镜图像，以及PDMS膜与微结构中间的间隙和尺寸。Hposts和hgap分别表示吊柱高度和缝隙高度。高度根据压缩程度而设定。由图12和图13可知：该文献中的微生理系统是通过调整悬挂柱下方的距离PDMS弹性膜的间隙来精确控制对细胞-水凝胶结构的机械压缩水平。由此，该文献中的决定芯片的压缩性能的影响因素是在芯片制备时设置的悬挂柱的下表面与下方PDMS弹性模的间隙，因此，该文献中的一个芯片只能实现单一的压缩水平。

此外，该文献中的芯片培养腔室与下层PDMS柔性膜之间存在间隙，在微结构的中间通道接种细胞-水凝胶的混合物对细胞进行三维培养时，不能再对其他类型的细胞进行区域化的培养，比如在关节腔内较为丰富的免疫细胞、滑膜细胞等，这些细胞在研究关节疾病的时候是非常重要的，比如炎症细胞的存在会加剧软骨细胞对机械刺激的响应，该文献中的芯片不能满足此需求。

本发明提供的微流控芯片可构建软骨细胞的力-化-生微环境。具体通过设计微流控芯片的结构可实现：模拟关节软骨在体内的三维生长状态、模拟关节软骨细胞受到的机械压缩刺激、模拟关节软骨在体内的多细胞共存的微环境、模拟关节软骨机械刺激和生化协同的微环境。利用所述的多功能微流控芯片能够研究软骨细胞在受到机械刺激后在不间尺度上的响应。利用所述的多功能微流控芯片能够研究遭受不同程度机械压缩的软骨细胞对关节内其他细胞的影响，以模拟真实体内患病关节软骨中的软骨细胞是否会影响关节内其他细胞的响应以加重关节疾病的程度。此外，利用所述的多功能微流控芯片能够研究机械压缩和免疫细胞如巨噬细胞协同作用下软骨细胞的响应。利用所述的多功能微流控芯片可以建立关节损伤模型、药物研发等。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括基底层(1)和依次层叠设置于所述基底层(1)上的细胞三维培养层(2)和气压控制层(3)；所述基底层(1)、所述细胞三维培养层(2)和所述气压控制层(3)为透明材质；

所述细胞三维培养层(2)设置有细胞三维培养通道(21)和位于所述细胞三维培养通道(21)两侧的第一细胞培养液通道(22)和第二细胞培养液通道(23)，所述细胞三维培养通道(21)与第一细胞培养液通道(22)之间以及细胞三维培养通道(21)与第二细胞培养液通道(23)之间由多个微结构分隔开，所述微结构之间存在间隙，所述细胞三维培养通道(21)的两端设有细胞载流液入口通道(24)和细胞载流液出口通道(25)，所述第一细胞培养液通道(22)两端设有第一细胞培养液入口通道(26)和第一细胞培养液出口通道(27)，所述第二细胞培养液通道(23)两端设有第二细胞培养液入口通道(28)和第二细胞培养液出口通道(29)；

所述气压控制层(3)中设有垂直于所述细胞三维培养通道(21)的多个气体通道，各所述气体通道的两端均设有气体出入口，各所述气体通道均设有位于两端的所述气体出入口之间的挤压部，各所述挤压部位于所述细胞三维培养通道(21)上方，所述气压控制层两端均设有三个液体通孔，各所述液体通孔分别连通细胞载流液入口通道(24)、细胞载流液出口通道(25)、第一细胞培养液入口通道(26)、第一细胞培养液出口通道(27)、第二细胞培养液入口通道(28)和第一细胞培养液出口通道(29)。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，还包括叠放于所述气压控制层(3)上的储液层，所述储液层包括设置于所述气体通道两侧的两个储液池(4)，各所述储液池(4)中均设有三个储液通孔，各所述储液通孔分别连通各所述液体通孔。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞三维培养通道(21)、第一细胞培养液通道(22)和第二细胞培养液通道(23)为上部密封下部开口的通道结构；所述微结构呈栅栏形，所述微结构的一端与基底层(1)接触；细胞载流液入口通道(24)、细胞载流液出口通道(25)、第一细胞培养液入口通道(26)、第一细胞培养液出口通道(27)、第二细胞培养液入口通道(28)和第一细胞培养液出口通道(29)为上下贯通的通孔。

4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞三维培养层(2)的材质为聚二甲基硅氧烷；

所述细胞三维培养层(2)的厚度为200～400μm，所述细胞三维培养通道(21)的宽度为1～1.5mm；第一细胞培养液通道(22)和第二细胞培养液通道(23)的宽度为1～2mm；所述细胞三维培养通道(21)、第一细胞培养液通道(22)和第二细胞培养液通道(23)的深度为70～300μm。

5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述气体通道为上部密封下部开口的结构；所述气体通道的数量为3个；

所述气压控制层(3)的材质为聚二甲基硅氧烷；所述气体通道的宽度为1～1.5mm，深度为50～200μm，所述挤压部的宽度大于所述气体通道的宽度。

6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底层(1)的材质为玻璃；所述基底层(1)的厚度为0.13～0.17mm；

所述储液层的材质为聚二甲基硅氧烷，所述储液通孔的直径为1.5～3.5mm。

7.一种利用权利要求1～6任一项所述的微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的差异化力学微环境模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将软骨细胞-水凝胶的混合物注入细胞三维培养层(2)的细胞三维培养通道(21)中，在紫外光照射下进行光固化，得到固化软骨细胞-水凝胶；然后将软骨细胞培养液注入细胞三维培养层(2)的第一细胞培养液通道(22)和第二细胞培养液通道(23)中进行软骨细胞培养，在所述软骨细胞培养的过程中，向所述气压控制层(3)的气体通道中通入不同压力水平的压缩空气，对细胞三维培养通道(21)中不同区域的固化软骨细胞-水凝胶中的软骨细胞进行不同水平的机械力刺激。

8.一种利用权利要求1～6任一项所述的微流控芯片构建三维培养的软骨细胞的力-化-生耦合的微环境模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将与细胞三维培养层(2)的第一细胞培养液通道(22)和第二细胞培养液通道(23)接触的基底层(1)表面用包被材料进行表面修饰；

2)将软骨细胞-水凝胶的混合物注入细胞三维培养层(2)的细胞三维培养通道(21)中，在紫外光照射下进行光固化，得到固化软骨细胞-水凝胶；

3)将复合细胞培养液注入封闭底面修饰后的第一细胞培养液通道(22)和第二细胞培养液通道(23)中，所述复合细胞培养液中含有与软骨细胞相关的细胞、与软骨细胞相关的生化因子、与软骨细胞相关的趋化因子和药物试剂中的一种或多种，进行细胞共培养；在所述细胞共培养的过程中，向所述气压控制层(3)的气体通道中通入压缩空气，对细胞三维培养通道(21)中不同区域的固化软骨细胞-水凝胶中的软骨细胞进行机械力刺激；或者向所述气压控制层(3)的气体通道中通入压缩空气，对细胞三维培养通道(21)中不同区域的固化软骨细胞-水凝胶中的软骨细胞进行机械力刺激；然后再将复合细胞培养液注入封闭底面修饰后的第一细胞培养液通道(22)和第二细胞培养液通道(23)中，所述复合细胞培养液中含有与软骨细胞相关的细胞、与软骨细胞相关的生化因子、与软骨细胞相关的趋化因子和药物试剂中的一种或多种，进行细胞共培养。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述压缩空气的压力为0～1500mbar。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞-水凝胶的混合物包括软骨细胞和水凝胶溶液；软骨细胞的密度为2×10⁵～4×10⁶个细胞/mL；所述水凝胶溶液为甲基丙烯酰化明胶溶液，所述甲基丙烯酰化明胶溶液的质量含量为10～15％；所述光固化时，紫外光的功率为3W，固化时间≤10s。