CN117205216A - 一种局部作用的雄激素受体拮抗剂与米诺地尔的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种局部作用的雄激素受体拮抗剂与米诺地尔的组合物及其应用，所述组合物包括4‑(3‑(4‑氰基‑3‑(三氟甲基)苯基)‑5,5‑二甲基‑4‑氧代‑2‑硫代咪唑啉‑1‑基)‑2‑氟苯甲酸仲丁酯或其立体异构体及米诺地尔或其药学上可接受的盐。本发明所提供的组合物增加了4‑(3‑(4‑氰基‑3‑(三氟甲基)苯基)‑5,5‑二甲基‑4‑氧代‑2‑硫代咪唑啉‑1‑基)‑2‑氟苯甲酸仲丁酯及其立体异构体在含水溶液中的稳定性。且复方组合物药效优于单独的4‑(3‑(4‑氰基‑3‑(三氟甲基)苯基)‑5,5‑二甲基‑4‑氧代‑2‑硫代咪唑啉‑1‑基)‑2‑氟苯甲酸仲丁酯或米诺地尔。

Description

一种局部作用的雄激素受体拮抗剂与米诺地尔的组合物及其 应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种局部作用的雄激素受体拮抗剂与米诺地尔的组合物及其应用。

背景技术

脱发是一类具有多种不同病因的导致身体毛发损失的疾病。最常见的脱发形式是雄激素性脱发(AGA)。AGA通常也被称为雄性秃、男性型脱发，或者男性型或女性型毛发损失。据报道，AGA影响了大约50％的40岁以上的男性。到70岁时，这种形式的脱发最终可能会影响到80％的白人男性，并影响大约全部女性中的一半。出于美观和心理原因，脱发常常会引起患者极大的注意，而脱发也可能是全身性疾病的重要病征。

AGA是一种遗传性毛囊疾病，它也取决于雄激素。二氢睾酮在AGA的发生和发展中起到尤为重大的作用。AGA的脱发是渐进的，使得患有该疾病的患者在一段时间内经历正常的4：1的终毛发与毫毛比例的减少。在这个过程中，终毛发被转变成不确定的毛发，最终成为毫毛。随着AGA的进展，男性表现出颞部头发稀疏，这继而会发展至冠区(头顶区域)头发稀疏。女性冠区通常存在更多的扩散性稀疏，这在男性型脱发中不太常见。

在活的有机体内，AGA的特征在于5α-还原酶同工酶的水平和活性增加。这些酶将睾酮(T)转化成其活性代谢物二氢睾酮(DHT)。由于激素对毛囊雄激素受体的结合能力增加，因此毛囊水平高浓度的DHT会缩短毛发生长周期并使头皮毛囊逐渐变小。在毛囊变小之后，纤维束仍然存在。在大多数情况下，这些DHT依赖性效应被认为是可逆的，使得AGA可能可以采用能够减少DHT生成、或拮抗与毛囊雄激素受体的DHT/T相互作用的药物进行治疗。

目前对AGA的医疗管理包括手术和药物治疗选择。对AGA最常见的手术干预形式是毛发移植。这种手术在过去四十年里已成功进行。毛发移植涉及通过毛囊单位剥离手术(FUSS)或毛囊单位提取(FUE)从患者头皮的安全捐发区(SDA)内收集完整的毛囊。在过去的十年中人们对这些手术进行了改进，使得头发生存率显著提高并获得更自然的效果。

手术后的美观效果往往令人满意，但只有当足够的可移植发囊(或毛囊)可用于覆盖一个或多个秃头区域时才能进行手术。此外，毛发移植通常用于经历过大面积脱发的患者以及AGA尚未继续发展的患者。例如，在年轻患者中，通常不推荐采用毛发移植，因为雄激素特别是DHT可以作用于新移植的毛囊，导致出现相同头发稀疏现象和最终的脱发现象，从而影响原来存在的毛囊。由于这个原因，在AGA一开始及初始阶段，药物干预是优选的。

目前，只有两种药物被批准用于治疗AGA：米诺地尔和非那雄胺。米诺地尔是一种局部药物制剂，现有两种浓度水平—2％(局部溶液)和5％(局部溶液或泡沫)。为了发挥其作用，需要通过磺基转移酶将米诺地尔转化为其活性代谢物米诺地尔硫酸盐。这种酶存在于生长期毛囊的外根鞘中。

尽管米诺地尔促进毛发生长的确切机制尚不清楚，但据信米诺地尔硫酸盐会打开细胞膜中对ATP敏感的钾通道，从而导致血管舒张。然而，血管舒张似乎并不是米诺地尔引起毛发生长的原因。米诺地尔对毛囊的其他可能影响包括：a)真皮乳头中血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达增加，这表明该药诱导真皮乳头中的血管生成；b)激活细胞保护性前列腺素合成酶-1(一种刺激毛发生长的细胞保护酶)；以及c)肝细胞生长因子(HGF，一种毛发生长促进因子)的表达增加。在各种临床试验中，与安慰剂相比，米诺地尔在治疗6至12个月后有效地显著改善了总发量和非毫毛量。尽管具有这些有益的效果，但米诺地尔不会减少二氢睾酮(DHT)或引起DHT在毛囊周围聚集的酶，即5-α还原酶，其为遗传易感个体中男性型脱发的主要介导物。因此，当停止治疗时，DHT会使遗传易感性毛囊萎缩并将其最终破坏。此外，临床推荐局部米诺地尔浓度主要有2％和5％两种，虽然有研究显示5％米诺地尔比2％治疗效果更好，但是使用5％剂型的患者中报道发生局部刺激性反应和过敏性皮炎的案例多于2％剂型，呈剂量依赖性。

另一方面，非那雄胺会抑制负责在毛囊处将睾酮转化为DHT的5-αII型还原酶。非那雄胺以1mg片剂制剂的形式口服。与基线相比，单次口服1mg非那雄胺可使血清DHT以及头皮DHT降低达70％。在几个已发表的临床试验中，与安慰剂相比，在采用1mg非那雄胺治疗6个月后，总发量显著改善。与安慰剂相比，采用非那雄胺1mg治疗的患者总发量显著增加的现象在长期治疗(长达60个月)中保持不变。

尽管非那雄胺有效地阻止了脱发并改善了新发生长情况，但也可能存在与使用这种药物相关的副作用。首先，由于怀疑非那雄胺存在致畸作用而禁止用于女性。因此，无论是否患有AGA，都强烈警告已怀孕或可能怀孕的妇女避免接触破碎或粉碎的片剂。此外，由于非那雄胺是全身性分布的，这不仅降低了毛囊中的DHT水平，而且降低了血浆中的DHT水平。这种全身性活性会带来非那雄胺的主要副作用，包括性欲减退、勃起功能障碍(阳萎)、射精障碍和射精量减少。其他较不常见的副作用包括乳房肿胀、心悸、睾丸疼痛、停药后性欲持续下降、不育症和抑郁症。

鉴于存在与非那雄胺和米诺地尔疗法有关的不足和缺点，显然在本领域中需要用于治疗脱发症，特别是AGA的新方法和活性剂。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种局部作用的雄激素受体拮抗剂与米诺地尔的组合物。

本发明还要解决的技术问题是提供上述组合物的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种组合物，包括(a)4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯或其立体异构体及(b)米诺地尔或其药学上可接受的盐；在一些实施例中，所述4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯为(R/S)4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯，(R)-4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯和(S)-4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯中的任意一种或几种组合。

在一些实施例中，所述4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯或其立体异构体和所述米诺地尔或其药学上可接受的盐的摩尔比为1:1～20；在一些实施例中，所述4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯或其立体异构体或其药学上可接受的盐和所述米诺地尔或其药学上可接受的盐的摩尔比为1:3～20；在一些实施例中，所述4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯或其立体异构体和所述米诺地尔或其药学上可接受的盐的摩尔比为1:9～10。

在一些实施例中，所述组合物还包括溶剂。

在一些实施例中，所述组合物中，4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯或其立体异构体的含量为0.5％～2％g/mL；在一些实施例中，所述组合物中，4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯或其立体异构体的含量为0.5％g/mL、1.0％g/mL、1.5％g/mL和2％g/mL中的任意一种。

在一些实施例中，所述组合物中，米诺地尔或其药学上可接受的盐的含量为2％～4％g/mL；在一些实施例中，所述组合物中，米诺地尔或其药学上可接受的盐的含量为2％g/mL或4％g/mL。

在一些实施例中，所述溶剂为一种或多种药学上可接受的溶剂；在一些实施例中，所述溶剂为水、多元醇、多元醇醚和C₁-C₇醇中的任意一种或几种组合；在一些实施例中，所述溶剂为多元醇醚和C₁-C₇醇的组合。

在一些实施例中，所述多元醇为乙二醇、丙二醇、丙三醇和己三醇中的任意一种或几种组合；在一些实施例中，所述多元醇为丙二醇。

在一些实施例中，所述多元醇醚为聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯-聚丙烯三嵌段共聚物、二丙二醇和二乙二醇单乙醚中的任意一种或几种组合；在一些实施例中，所述多元醇醚为二乙二醇单乙醚。

在一些实施例中，所述C₁-C₇醇为乙醇；在一些实施例中，所述C₁-C₇醇为95％乙醇或无水乙醇。

在一些实施例中，所述组合物中，95％乙醇或无水乙醇的含量为25％～50％g/mL，二乙二醇单乙醚的含量为25％～50％g/mL；在一些实施例中，所述组合物中，95％乙醇或无水乙醇的含量为46％g/mL，二乙二醇单乙醚的含量为30％g/mL。

在一些实施例中，所述组合物还包含至少一种乳化剂。

在一些实施例中，所述乳化剂为PEG-15羟基硬脂酸酯(也称为聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯)、PEG-30硬脂酸酯、PEG-40月桂酸酯、PEG-40油酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、PEG-20十六十八醇醚、聚乙二醇25十六十八醇醚、聚乙二醇1000单鲸蜡基醚、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脂肪酸的丙二醇酯、脂肪酸的聚甘油酯、聚氧乙烯5蓖麻油、聚氧乙烯15蓖麻油、聚氧乙烯35蓖麻油、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、辛酰癸酰聚乙二醇-8甘油酯、辛酰己酰聚乙二醇甘油酯、月桂酰聚乙二醇甘油酯和油酰聚乙二醇甘油酯中的任意一种或几种组合；在一些实施例中，所述乳化剂为聚山梨醇酯80。

在一些实施例中，所述组合物中，乳化剂的含量为0.05％～0.2％g/mL；在一些实施例中，所述组合物中，聚山梨醇酯80的含量为0.05％～0.2％g/mL；在一些实施例中，所述组合物中，聚山梨醇酯80的含量为0.1％g/mL。

在一些实施例中，所述组合物还包含至少一种抗氧化剂。

在一些实施例中，所述抗氧化剂为丁羟甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸、α-生育酚和没食子酸丙酯中的任意一种或几种组合；在一些实施例中，所述抗氧化剂为抗坏血酸棕榈酸酯。

在一些实施例中，所述组合物中，抗氧化剂的含量为0.1％～1％g/mL；在一些实施例中，所述组合物中，抗坏血酸棕榈酸酯的含量为0.1～1％g/mL；在一些实施例中，所述组合物中，抗坏血酸棕榈酸酯的含量为0.5％g/mL。

在一些实施例中，所述组合物还包含至少一种pH调节剂。

在一些实施例中，所述pH调节剂为柠檬酸一水合物、柠檬酸、盐酸、磷酸、马来酸、酒石酸、醋酸和硫酸中的任意一种或几种组合；在一些实施例中，所述pH调节剂为柠檬酸和/或柠檬酸一水合物。

在一些实施例中，所述组合物的pH为4.0～6.0；在一些实施例中，所述组合物的pH为4.0～5.5。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述组合物在制备治疗脱发产品中的应用。

在一些实施例中，所述应用为在制备治疗雄激素性脱发中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

本发明所提供的组合物增加了4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯及其立体异构体在含水溶液中的稳定性。并且在小鼠雄激素性脱发模型中，本发明的4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯和米诺地尔的复方组合物的药效优于单独的4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯或米诺地尔。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为C57BL/6小鼠毛发生长评分。

图2为C57BL/6小鼠毛发生长图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

冠词“一个”、“一种”和“所述”在本文中用于指物品的一个或多于一个的(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一种元素”是指一种元素或多于一种元素。

本文所用的术语“脱发”在总体上是指，或者如所指定的那样单独地指，雄激素性脱发(AGA)、斑秃(包括扩散性斑秃、单发性斑秃、多发性斑秃、蛇形斑秃、全秃和普秃)、休止期脱发、生长期脱发和拉扯性脱发。

如本文所用，术语“抗氧化剂”包括本领域普通技术人员已知的那些药学上可接受的抗氧化剂。示例包括但不限于丁羟甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸、α-生育酚(也称为维生素E)、没食子酸丙酯等。

如本文所用，短语“C₁-C₇醇“是指适用于局部药物制剂中的具有至多7个碳的醇。此类C₁-C₇醇的示例包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、正丙醇、苯甲醇等。不希望受任何特定理论的束缚，据信C₁-C₇醇，特别是短链C₁-C₇醇，如乙醇、丙醇或异丙醇，对4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯发挥出增溶作用。还据信，此类C₁-C₇醇有助于本文所述组合物的铺展性。

如本文所用，术语“多元醇”是指含有两个或更多个羟基的有机分子。示例性多元醇包括但不限于乙二醇、丙二醇、丙三醇、己三醇等。

如本文所用，短语“多元醇醚”是指适用于局部药物制剂中的多元醇醚。示例性多元醇醚包括但不限于聚丙二醇，聚乙二醇、聚乙烯-聚丙烯三嵌段共聚物、二丙二醇、二乙二醇单乙醚等。

如本文所用，术语“溶剂”是指适用于局部施用于包括但不限于头皮的一种药学上可接受的溶剂，或者是一种以上此类溶剂的混合物，用于使本文所述组合物中的4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯增溶。

术语“治疗”是指成功治疗或改善损伤、疾病或病症的任何征候，包括任何客观或主观的参数，诸如减轻；缓解；减弱症状或使患者更能耐受损伤、疾病或病症；减缓变性或衰退的速度；或改善患者的身体健康或精神健康。症状的治疗或改善可以基于客观或主体参数，包括体格检查结果、神经精神检查或精神病评估。

术语“预防”是指避免发生、存在或拖延应用有该术语的疾病、障碍或病症的发作或复发，或与疾病、障碍或病症相关的一种或多种症状的发作或复发。术语“预防”还指降低疾病、障碍或病症的发生率。术语“预防”是指预防这一行为。

如本文所用，短语“重量百分比(重量％)”旨在涵盖并公开这样的实施方案：其中对于某给定值，重量百分数是按体积计的重量百分数(w/v)以及按总重量计的重量百分数(w/w)。举例来说，包含10重量％的元素“X”的实施方案公开了包含10重量％的“X”(w/v)和10重量％“X”(w/w)这两者的实施方案。类似地，再次举例来说，包含10重量％的“X”、20重量％的“Y”和60重量％的“Z”的实施方案公开了包含以下项的实施方案：a)10重量％的“X”(w/v)、20重量％的“Y”(w/v)和60重量％的“Z”(w/v)；和b)10重量％的“X”(w/w)、20重量％的“Y”(w/w)和60重量％的“Z”(w/w)。尽管如此，在某些实施方案中，某一值将被具体地标记为“(w/w)”或“(w/v)”。在这些情况下，该值应该被解释为仅公开了标示值，即仅公开了(w/w)或仅公开了(w/v)，而非两者皆公开。

如本文所用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”等是开放式术语，意指“包括但不限于”。就本文所公开的给定实施方案而言，“包含”某些元素应该理解为，本公开还明确考虑并公开了“基本上由这些元素组成”以及“由这些元素组成”的实施方案。

如本文所用，术语“基本上由......组成”、“基本上由......构成”等应被解释为半封闭式术语，意指不包括对实施方案的基础和新颖特征产生实质影响的其他成分。如本文所用，术语“由...组成”、“由...构成”等应被解释为封闭式术语，使得“由一组特定元素组成”的实施方案排除了未在该实施方案中指定的任何元素、步骤或成分。

如本文所用，术语“乙醇”是指酒精，即CH₃CH₂OH，并且包括纯的(完全为)乙醇和95％乙醇，后者是含水量通常为约4体积％至约5.1体积％的乙醇。

实施例1：(R/S)4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯(化合物1)的制备

步骤1：化合物1-1的合成

250mL三颈瓶中加入150mL N,N-二甲基甲酰胺和15mL水，依次加入2-氟-4-溴苯甲酸10g、2-甲基丙氨酸7.25g、碳酸钾15.8g、碘化亚铜1.7g、2-乙酰基环己酮1.2g和三乙胺0.8g。110℃加热搅拌反应6h，加入500mL水稀释，用柠檬酸调pH至3-4。用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤3次。有机相经无水硫酸钠干燥后浓缩，所得固体粗品中加入50mL二氯甲烷，室温搅拌1h后过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤。收集并干燥滤饼，得9.3g化合物1-1。

步骤2：化合物1-2的合成

250mL三颈瓶中加入100mL甲醇和13g上述步骤1制备的化合物1-1，搅拌溶解后冰浴降温。在冰浴条件下缓慢滴加氯化亚砜25.6g，滴加完毕后加热回流反应。待反应完毕后，关闭加热，待冷至室温后加入50mL甲苯，减压浓缩。所得残渣用300mL乙酸乙酯复溶，用饱和食盐水洗涤1次，接着用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3次。有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，得11.3g化合物1-2。

步骤3：化合物1-3的合成

50mL三颈瓶中依次加入5mL二甲亚砜、10mL醋酸异丙酯、5g上述步骤2制备的化合物1-2和8.9g 4-异硫氰基-2-(三氟甲基)苯甲腈，90℃加热搅拌反应20h。关闭加热，自然冷至室温，反应液中加入50mL水稀释，用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，用饱和食盐水洗涤3次，有机相经无水硫酸钠干燥后浓缩。所得油状物加入35mL甲醇并室温搅拌2h。过滤，收集滤饼并干燥，的5.8g化合物1-3。

步骤4：化合物1-4的合成

将3.8g上述步骤3制备的化合物1-3溶于15mL四氢呋喃中，加入溶有0.68g氢氧化钠的水溶液15mL，室温搅拌反应过夜。反应完毕后，加入50mL水稀释，用1M稀盐酸调pH至3-4后，用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩有机相得3.0g化合物1-4。

步骤5：化合物1的合成

25mL圆底烧瓶中依次加入0.2g步骤4所得化合物1-4、5mL N,N-二甲基甲酰胺、0.25g 2-碘丁烷和0.15g碳酸钾，60℃加热反应过夜。反应完毕后，撤去加热，冷却至室温，加入25mL水稀释反应液。有乙酸乙酯萃取(15mL×3)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤(15mL×3)。有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，所得粗品经柱层析纯化得0.34g白色固体。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.13(t,J＝8.0Hz,1H),8.02(d,J＝8.3Hz,1H),7.97(d,J＝2.0Hz,1H),7.85(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.25–7.11(m,2H),5.25–5.11(m,1H),1.85–1.67(m,2H),1.64(s,6H),1.39(d,J＝6.3Hz,3H),1.02(t,J＝7.5Hz,3H).

MS(ESI,[M+H]⁺)m/z:508.4.

实施例2：(R)-4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯(化合物2)的制备

参照实施例1步骤5的方法，使用实施例1步骤4所得化合物1-4与(R)-2-丁醇反应制备得到化合物2。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.14(t,J＝8.0Hz,1H),8.02(d,J＝8.3Hz,1H),7.97(d,J＝2.0Hz,1H),7.85(dd,J＝8.2,2.1Hz,1H),7.25–7.11(m,2H),5.25–5.11(m,1H),1.85–1.67(m,2H),1.65(s,6H),1.38(d,J＝6.4Hz,3H),1.01(t,J＝7.3Hz,3H).

MS(ESI,[M+H]⁺)m/z:508.3.

实施例3：(S)-4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯(化合物3)的制备

参照实施例1步骤5的方法，使用实施例1步骤4所得化合物1-4与(S)-2-丁醇反应制备得到化合物3。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.13(t,J＝8.0Hz,1H),8.02(d,J＝8.3Hz,1H),7.97(d,J＝2.0Hz,1H),7.85(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.25–7.10(m,2H),5.25–5.11(m,1H),1.85–1.67(m,2H),1.64(s,6H),1.39(d,J＝6.3Hz,3H),1.02(t,J＝7.5Hz,3H).MS(ESI,[M+H]⁺)m/z:508.3.

下述实施例中，如无特殊说明，所述4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯为实施例1制备的(R/S)4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯(化合物1)。

下述实施例中所述稳定性研究，为将放置不同时间的复方制剂通过色谱法检测杂质，以确定各组合物的稳定性，具体色谱条件为：色谱柱Waters SunFire^TM C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相0.05％三氟乙酸水溶液(A):乙腈(B)，线性梯度洗脱，程序见表1；检测波长220nm；流速1.0mL/min；柱温度30℃；进样量10μL。

表1线性梯度洗脱程序

t/min	A/％	B/％
			0	80	20
50	10	90
			51	80	20
60	80	20

下述实施例中所述杂质，如无特殊说明，为除原料外的所有杂质。

实施例4：pH对复方制剂稳定性影响的评估

将二乙二醇单乙醚和无水乙醇混合，加入4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯溶解后，加入米诺地尔，随后加入抗氧化剂(抗坏血酸棕榈酸酯)和乳化剂(聚山梨醇酯80)，加入10mL纯化水稀释，加入柠檬酸一水合物调pH后，用纯化水定容至100mL，以制备具有下表2所示组分溶液。

表2

对制备得到的4批样品在30℃条件下进行短期稳定性研究，结果如表3所示。

表3

结果表明，pH低于5.5时，4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯的水解产物(恩杂鲁胺酸，CAS：1242137-15-0)生成量明显降低。

实施例5：不同抗氧化剂对组合物稳定性的影响。

将30g二乙二醇单乙醚和46g无水乙醇混合，加入0.5g 4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯溶解后，加入2g米诺地尔，随后分别加入抗氧化剂(0.3gα-生育酚、0.01g丁基羟基茴香醚、0.1g丁羟甲苯、0.1g没食子酸丙酯、0.1g抗坏血酸棕榈酸酯、0.5g抗坏血酸棕榈酸酯或1g抗坏血酸棕榈酸酯)和0.1g聚山梨醇酯80，加入10mL纯化水稀释，加入柠檬酸一水合物调pH至5.0后，用纯化水定容至100mL，以制备具有下表4所示组分溶液。

表4

结果表明，0.1％～1.0％g/mL抗坏血酸棕榈酸酯作为抗氧化剂时，可以有效抑制杂质的生成。

实施例6～11：4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯与米诺地尔复方溶液组合物的制备

将二乙二醇单乙醚和无水乙醇混合，加入4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯溶解后，加入米诺地尔，随后加入抗氧化剂(抗坏血酸棕榈酸酯)和乳化剂(聚山梨醇酯80)，加入10mL纯化水稀释，加入柠檬酸一水合物调pH至5.0后，用纯化水定容至100mL，以制备具有下表5所示组分溶液。表54-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯与米诺地尔复方溶液各组分用量

实施例12～17：不同浓度乙醇或二乙二醇单乙醚的溶液配制

将二乙二醇单乙醚和无水乙醇混合，加入4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯溶解后，加入米诺地尔，随后加入抗氧化剂(抗坏血酸棕榈酸酯)和乳化剂(聚山梨醇酯80)，加入10mL纯化水稀释，加入柠檬酸一水合物调pH后，用纯化水定容至100mL，以制备具有下表6所示组分溶液。

表6不同浓度乙醇或二乙二醇单乙醚的溶液成分

实施例18～21：不同聚山梨醇酯含量的组合物溶液配制

将二乙二醇单乙醚和无水乙醇混合，加入4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯溶解后，加入米诺地尔，随后加入抗氧化剂(抗坏血酸棕榈酸酯)和乳化剂(聚山梨醇酯80)，加入10mL纯化水稀释，加入柠檬酸一水合物调pH后，用纯化水定容至100mL，以制备具有下表7所示组分溶液。

表7不同聚山梨醇酯含量的组合物成分

应用实验例1：C57BL/6小鼠毛发生长模型

购买处于毛发周期的毛发生长终期的6至7周龄的雄性C57BL/6小鼠，并在标准条件下饲养于群笼中。通过在轻度麻醉下用电动剃须刀给下背部剃毛，后用脱毛膏脱去背部毛发，裸露皮肤约2cm×2cm，次日，挑选背部皮肤无破损，且皮肤颜色呈粉红色的小鼠进行随机分组，分为：空白对照组、模型组和治疗组，每组6只。

空白对照组：每日皮下注射溶媒(甘油:DMSO＝1:1)，并且每日两次再脱毛部位涂抹不含活性物质的实施例6组合物；

模型组：每日皮下注射二氢睾酮溶液(溶剂为甘油:DMSO＝1:1)，剂量为30mg/kg，并且每日两次在脱毛部位涂抹不含活性物质的实施例6组合物；

治疗组：

实施例6：每日皮下注射二氢睾酮溶液(溶剂为甘油:DMSO＝1:1)，剂量为30mg/kg，并且每日两次在脱毛部位涂抹100μL实施例6。

实施例10：每日皮下注射二氢睾酮溶液(溶剂为甘油:DMSO＝1:1)，剂量为30mg/kg，并且每日两次在脱毛部位涂抹100μL实施例10。

实施例11：每日皮下注射二氢睾酮溶液(溶剂为甘油:DMSO＝1:1)，剂量为30mg/kg，并且每日两次在脱毛部位涂抹100μL实施例11。

每两天记录毛发生长评分。

用于小鼠毛发生长的评分系统为：

a)0：没有毛发生长，粉色肤色；

b)1：剃毛区域的肤色从粉色变为灰色，没有可见的毛发生长，表明毛生长期启动；

c)2：剃毛区域的肤色为黑色，有微小的毛发；

d)3：剃毛区域短的黑色毛发；

e)4：剃毛区域的毛发几乎接近周边区域。

毛发评分如图1所示，小鼠毛发生长情况如图2所示。结果显示：经12天的治疗，实施例6具有显著的促进毛发生长的作用，且促毛发生长作用优于实施例10和实施例11。应用实施例2：化合物对雄激素受体的拮抗活性

1)所有测试化合物溶于DMSO中配置成15mM溶液，并且3倍连续稀释10次，配置成15mM、5mM、1.6667mM、0.5576mM、0.1852mM、0.0617mM、0.0206mM、0.0069mM、0.0023mM和0.0008mM溶液。

2)按照ATCC的建议(https://www.atcc.org/)培养HEK293T细胞(ATCC，CRL-3216)。细胞在指数生长期时进行检测。

3)从培养皿中去除培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，向培养皿中加入胰蛋白酶溶液，使细胞分离。用完全培养基清洗细胞一次。

4)使用磷酸盐缓冲液将细胞洗涤两次，以去除酚红，并将其重新悬浮在培养基中至适当浓度。

5)将6*10⁶HEK293T细胞播种到100毫米的培养皿中(只有存活率大于90％的细胞才用于分析)，并在37℃、5％CO₂条件下培养16h。

6)将质粒(pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]，Promega，E1360；pBIND-AR Vector，康龙化成；LTX&Plus Reagent，Invitrogen，15338-100)转染到HEK293T细胞中，并在37℃和5％CO₂条件下培养5-6h。

7)使用非接触式纳升级声波移液系统(Labcyte，Echo550)将50nl化合物稀释液转移到384孔分析板中。

8)将HEK293T细胞以15000个细胞/孔和1nM DHT(MCE，HY-A0120)终浓度接种到384孔的分析板中(25μl)。

9)细胞在37℃、5％CO₂条件下培养18-20小时。

10)将25μl荧光素酶分析试剂(britelite plus，PerkinElmer，6066769)加入384孔分析板的每个孔中。

11)使用酶标仪(Envision 2105，PerkinElmer)记录发光值，并计算IC₅₀。

表8化合物对雄激素受体的拮抗活性

实施例	IC50(μM)
		1	0.778
2	1.032
		3	0.508
恩杂鲁胺酸乙酯	1.527
		恩杂鲁胺	0.776
恩杂鲁胺酸	>30

结果说明，本发申请的化合物具有雄激素受体拮抗活性。

其中，所述恩杂鲁胺酸乙酯为应用实施例3：化学稳定性

温孵液配置：10mL 0.02M pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)加入9.8mL DMSO中，冰浴降温后震荡涡旋30s，配置成温孵液。

待测化合物用DMSO配制成10mM的储存液。用DMSO将待测化合物稀释至2mM。取15μL2mM的待测化合物溶液，加至1485μL温孵液中，涡旋30s后室温静置。于0h、2h、4h、6h、8h，取样300μL，14400rpm离心3min后，吸取200μL上清液，HPLC检测，计算浓度，并按照公式T_1/2＝-0.693/k计算半衰期。

表9化学稳定性

实施例	半衰期
		1	NA
2	NA
		3	NA
恩杂鲁胺酸乙酯	NA
		恩杂鲁胺	NA

^a 8h仍未观察到明显降解，无法拟合计算半衰期

结果显示，本发明化合物在pH7.4条件下稳定性较好。

应用实施例4：大鼠血浆稳定性

待测化合物用DMSO配制成10mM的储存液。用DMSO将待测化合物稀释至2mM工作液。取10μL 2mM工作液，加至990μL大鼠血浆中，涡旋5s，配置成初始浓度为20μM的反应体系，37℃温孵，并分别在0min、10min、20min、30min、1h、2h、4h和6h取80μL血浆样品。血浆样品中加入240μL甲醇，涡旋3min后14400rpm离心3min，吸取200μL上清液，HPLC检测，计算浓度，并按照公式T_1/2＝-0.693/k计算半衰期，结果如表9所示。

表10大鼠血浆半衰期及降解产物

实施例	半衰期	降解产物
			1	<5min	恩杂鲁胺酸
2	<5min	恩杂鲁胺酸
			3	<5min	恩杂鲁胺酸
恩杂鲁胺酸乙酯	<5min	恩杂鲁胺酸
			恩杂鲁胺	NAa	无

^a 6h仍未观察到明显降解，无法拟合计算半衰期

结果显示，本发明所提供的化合物在血浆中极不稳定，血浆温孵5min即可几乎全部降解为非活性代谢产物-恩杂鲁胺酸，10min完全不能检测到原型化合物，因此，本发明化合物进入血液后迅速失活，不能在全身分布，从而无法引起全身的雄激素拮抗作用，故而不会造成性欲降低、精子生成减少、ED等副作用，可有效解决现有药物如非那雄胺等药物系统性分布，导致全身性的雄激素抑制引起性欲降低、精子生成减少、ED等副作用的问题。

应用实施例5：小鼠10％皮肤匀浆液稳定性

1)待测化合物用DMSO配制成10mM的储存液，取20μL待测化合物储备液，加至80μLDMSO中，涡旋10s，配置成2mM工作液；

2)C57BL/6雄性小鼠(许可证号SCXK(豫)2020-0005)经脱毛膏对背部进行脱毛；

3)在麻醉状态下剥取背部皮肤，剔除血管、皮下组织和脂肪，并用预冷的生理盐水漂洗干净；

4)取2.3g皮肤，加至23mL预冷生理盐水中，在冰浴条件下充分匀浆(每匀浆15s，暂停10s)，5000rpm离心5min，吸取上清液，即皮肤组织匀浆液，置于冰上待用；

5)取皮肤组织匀浆液990μL，加入10μL 2mM待测化合物工作液，涡旋5s，并置于37℃水浴锅中，温孵，于0min、5min、10min、15min、30min、1h和2h分别取样80μL，加入240μL甲醇；

6)涡旋震荡3min后，13000rpm离心5min；

7)吸取上清液200μL，用HPLC进样分析，计算浓度，并按照公式T_1/2＝-0.693/k计算半衰期，结果如表10所示。

表11小鼠10％皮肤匀浆液稳定性及降解产物

实施例	半衰期	降解产物
			1	57.75min	恩杂鲁胺酸
2	51.34min	恩杂鲁胺酸
			3	62.71min	恩杂鲁胺酸
恩杂鲁胺酸乙酯	4.03min	恩杂鲁胺酸
			恩杂鲁胺	NAa	无

^a2h仍未观察到明显降解，无法拟合计算半衰期

本发明化合物在皮肤匀浆液中半衰期较长，稳定性较好。被缓慢降解为非活性代谢产物恩杂鲁胺酸。

本发明提供了一种局部作用的雄激素受体拮抗剂与米诺地尔的组合物及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括(a)4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯或其立体异构体及(b)米诺地尔或其药学上可接受的盐；

优选地，所述4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯或其立体异构体和所述米诺地尔或其药学上可接受的盐的摩尔比为1:1～20，优选为1:3～20，优选为1:9～10。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括溶剂；

优选地，所述组合物中，4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑啉-1-基)-2-氟苯甲酸仲丁酯或其立体异构体的含量为0.5％～2％g/mL，优选为0.5％g/mL、1.0％g/mL、1.5％g/mL和2％g/mL中的任意一种；

优选地，所述组合物中，米诺地尔或其药学上可接受的盐的含量为2％～4％g/mL，优选为2％g/mL或4％g/mL。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述溶剂为一种或多种药学上可接受的溶剂；优选地，所述溶剂为水、多元醇、多元醇醚和C₁-C₇醇中的任意一种或几种组合，优选为多元醇醚和C₁-C₇醇的组合；

优选地，所述多元醇为乙二醇、丙二醇、丙三醇和己三醇中的任意一种或几种组合，优选为丙二醇；

优选地，所述多元醇醚为聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯-聚丙烯三嵌段共聚物、二丙二醇和二乙二醇单乙醚中的任意一种或几种组合，优选为二乙二醇单乙醚；

优选地，所述C₁-C₇醇为乙醇，优选为95％乙醇或无水乙醇。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，95％乙醇或无水乙醇的含量为25％～50％g/mL，二乙二醇单乙醚的含量为25％～50％g/mL；优选地，所述组合物中，95％乙醇或无水乙醇的含量为46％g/mL，二乙二醇单乙醚的含量为30％g/mL。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包含至少一种乳化剂；

优选地，所述乳化剂为PEG-15羟基硬脂酸酯、PEG-30硬脂酸酯、PEG-40月桂酸酯、PEG-40油酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、PEG-20十六十八醇醚、聚乙二醇25十六十八醇醚、聚乙二醇1000单鲸蜡基醚、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脂肪酸的丙二醇酯、脂肪酸的聚甘油酯、聚氧乙烯5蓖麻油、聚氧乙烯15蓖麻油、聚氧乙烯35蓖麻油、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、辛酰癸酰聚乙二醇-8甘油酯、辛酰己酰聚乙二醇甘油酯、月桂酰聚乙二醇甘油酯和油酰聚乙二醇甘油酯中的任意一种或几种组合；优选为聚山梨醇酯80。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，乳化剂的含量为0.05％～0.2％g/mL；优选地，所述组合物中，聚山梨醇酯80的含量为0.05％～0.2％g/mL，优选为0.1％g/mL。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包含至少一种抗氧化剂；

优选地，所述抗氧化剂为丁羟甲苯、丁基羟基茴香醚、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸、α-生育酚和没食子酸丙酯中的任意一种或几种组合；优选为抗坏血酸棕榈酸酯。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，抗氧化剂的含量为0.1％～1％g/mL；优选地，所述组合物中，抗坏血酸棕榈酸酯的含量为0.1～1％g/mL，优选为0.5％g/mL。

9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包含至少一种pH调节剂；

优选地，所述pH调节剂为柠檬酸一水合物、柠檬酸、盐酸、磷酸、马来酸、酒石酸、醋酸和硫酸中的任意一种或几种组合，优选为柠檬酸和/或柠檬酸一水合物；

优选地，所述组合物的pH为4.0～6.0，优选为4.0～5.5。

10.如权利要求1～9中任意一项所述组合物在制备治疗脱发产品中的应用，优选为在制备治疗雄激素性脱发中的应用。