CN117186217A - 抗muc5b蛋白的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抗MUC5B蛋白的抗体。本发明提供了特异性靶向MUC5B的抗体和抗体组合，及其在判断免疫检测样品质量中的用途。本发明的抗体组合能够与MUC5B高灵敏度、高特异性结合，适用于判读粘液或唾液采样样品的质量，具有操作简便、检测快速直观的优势。
Description
技术领域
本发明涉及抗体领域。具体地说，本发明涉及抗MUC5B蛋白的抗体。
背景技术
免疫检测技术是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测，利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。免疫检测在临床诊断，动物疫病和食品安全等领域占据着非常重要的地位，常见的免疫检测技术有放射性免疫、侧流免疫层析，酶联免疫、化学发光、电化学发光、纳米磁微粒化学发光。
侧流免疫层析不需要借助任何复杂的仪器设备就可以简单快速的检测样品中的痕量物质，对临床上的待确诊疾病，动物疫病或者生产中，海关通关中待放行的食品化妆品药品等进行定性判断。酶联免疫层析可以通过酶标仪对待测样品进行定量检测，更直观明确的确定疾病的发病程度，食品等产品的质量。随着技术的发展，免疫检测已经应用于更广阔的方面，越来越多的人会在工作和生活中接触到免疫检测。但是免疫检测在检测前需要进行采样和样品的前处理，由于免疫检测经常是对痕量物质进行检测，采样质量和样品处理流程对最终结果影响非常大，已经成为一个难以忽视的问题。并且，侧流免疫层析通常难以在检测当时直观地判断采样质量和样品处理质量的好坏。同时，在某些情况下可能需要非专业人士自行操作采样，进行样品处理。如果采样质量不能保证，所获取的检测结果容易出现假阴性，降低检测的可靠性。
因此，本领域需要开发一种能够应用于免疫检测采样质量判断的抗体试剂。
发明内容
本发明的目的就是提供抗MUC5B蛋白的抗体。
在本发明的第一方面，提供了一种抗MUC5B蛋白的抗体，所述的抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:2所示的LCDR1，
SEQ ID NO:3所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:4所示的LCDR3；
所述的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:9所示的HCDR1，
SEQ ID NO:10所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:11所示的HCDR3；
或者，
所述的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；
所述的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:23所示的HCDR1，
SEQ ID NO:24所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:25所示的HCDR3。
在另一优选例中，所述重链可变区和轻链可变区分别进一步包括骨架区(FR)。
在另一优选例中，所述的轻重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由骨架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.5所示的FR1、SEQ ID NO.6所示的FR2、SEQ ID NO.7所示的FR3和SEQ ID NO.8所示的FR4；和/或
所述的重链可变区具有SEQ ID NO.12所示的FR1、SEQ ID NO.13所示的FR2、SEQID NO.14所示的FR3和SEQ ID NO.15所示的FR4。
在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.19所示的FR1、SEQ ID NO.20所示的FR2、SEQ ID NO.21所示的FR3和SEQ ID NO.22所示的FR4；和/或
所述的重链可变区具有SEQ ID NO.26所示的FR1、SEQ ID NO.27所示的FR2、SEQID NO.28所示的FR3和SEQ ID NO.29所示的FR4。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链和/或重链进一步包括恒定区。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留MUC5B蛋白结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的30％，较佳地为20％，更佳地为10％。
在另一优选例中，所述的抗体为动物源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单域抗体、纳米抗体、单链抗体、双链抗体、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述MUC5B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的抗体。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的多核苷酸。
在本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体、或基因组中整合有外源的如本发明第五方面所述的多核苷酸、或表达如本发明第一方面所述的抗体。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的可检测标记物。
在本发明的第六方面，提供了一种抗MUC5B蛋白的抗体组合，所述抗体组合包括抗体S1和S2，所述抗体S1的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:2所示的LCDR1，
SEQ ID NO:3所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:4所示的LCDR3；
抗体S1的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:9所示的HCDR1，
SEQ ID NO:10所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:11所示的HCDR3；
所述抗体S2的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；
抗体S2的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:23所示的HCDR1，
SEQ ID NO:24所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:25所示的HCDR3。
在另一优选例中，所述重链可变区和轻链可变区分别进一步包括骨架区(FR)。
在另一优选例中，所述的轻重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由骨架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述抗体S1的轻链可变区具有SEQ ID NO.5所示的FR1、SEQ IDNO.6所示的FR2、SEQ ID NO.7所示的FR3和SEQ ID NO.8所示的FR4；和/或
其重链可变区具有SEQ ID NO.12所示的FR1、SEQ ID NO.13所示的FR2、SEQ IDNO.14所示的FR3和SEQ ID NO.15所示的FR4。
在另一优选例中，所述抗体S2的轻链可变区具有SEQ ID NO.19所示的FR1、SEQ IDNO.20所示的FR2、SEQ ID NO.21所示的FR3和SEQ ID NO.22所示的FR4；和/或
其重链可变区具有SEQ ID NO.26所示的FR1、SEQ ID NO.27所示的FR2、SEQ IDNO.28所示的FR3和SEQ ID NO.29所示的FR4。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链和/或重链进一步包括恒定区。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留MUC5B蛋白结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的30％，较佳地为20％，更佳地为10％。
在另一优选例中，所述的抗体为动物源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单域抗体、纳米抗体、单链抗体、双链抗体、或抗原结合片段。
在本发明的第七方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第五方面所述的抗体偶联物或如本发明第六方面所述的抗体组合在制备检测试剂或试剂盒中的用途。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于粘液或唾液样本检测。
在另一优选例中，所述的检测试剂为免疫层析试剂条。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了MUC5B纯化产物的WB检测结果。
图2显示了MUC5B纯化产物的HPLC检测结果。
图3显示了ELISA检测瞬转表达MUC5B抗体的细胞上清与唾液结合能力的结果。
图4显示了本发明侧流免疫层析试剂条的结构示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了抗MUC5B蛋白的抗体。具体地，本发明提供了特异性靶向MUC5B的抗体和抗体对，本发明的抗体对能够应用于侧流片检测，以高灵敏度、高特异性捕捉样本中的MUC5B蛋白，从而便于样本质量进行准确判断。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了对本发明提供清楚的说明，多个术语如下进行定义。
黏蛋白5B
如本文所用，术语“黏蛋白5B”也称MUC5B或Muc5b，其是一种蛋白质，在人类由MUC5B基因编码。它是五个形成凝胶的黏蛋白之一。黏蛋白MUC5B普遍存在于绝大部分人类的唾液、呼吸道粘液和宫颈粘液中。
如本文所用，术语“标志性物质”、“标志物”、“伴随标志物”均指待测样品中普遍且稳定存在的物质，可以用来进行免疫，并且伴随存在于免疫检测的整个过程。本发明选用的伴随标志物可以是样品中含有的蛋白，核酸，多糖等物质，在样品采集时可以一同被采集，并且在样品处理的过程中不会完全丢失。
抗体
本发明提供了特异性靶向MUC5B的抗体。在一种实施方式中，本发明的抗体是利用MUC5B作为抗原免疫动物得到的。
如本文所用，术语“抗原”，“免疫原”是指能引起机体免疫反应，并且产生相应抗体，与其特异性结合的物质。
如本文所用，术语“抗体”，“单克隆抗体”，“多克隆抗体”，指免疫球蛋白分子，其是通过结合两条相同的重链和两条相同的轻链而产生的异源四聚体蛋白质，并且通过由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)组成的抗原结合位点，执行抗原特异性结合，从而引起抗原特异性体液免疫应答。
如本文所用，术语“人源化抗体”，“单域抗体”，“单链抗体”，“纳米抗体”，“抗原结合肽”，“片段”、“衍生物”和“类似物”是指具有抗原结合能力的抗体或者抗体片段，并且包括通过用蛋白质切割酶切割抗体产生的片段以及以重组方式产生的片段，并且其实例包括Fab、F(ab')2、scFv、双链抗体、三链抗体、sdAb和VHH。
如本文所用，术语“特异性”是一种高度专一而高效相互作用方式，例如抗原与对应抗体可以发生特异性结合作用，而不能与其他抗体发生结合作用。
如本文所用，术语“可变区(V区)”是指免疫球蛋白轻链和重链靠近N端氨基酸序列变化较大的区域。
如本文所用，术语“恒定区(C区)”是指免疫球蛋白轻链和重链靠近C端氨基酸序列相对稳定的区域。
如本文所用，术语“互补决定区(CDR)”是指免疫球蛋白轻链和重链的可变区内各有三个高度可变区域在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补。
如本文所用，术语“骨架区(FR)”是指免疫球蛋白轻链和重链的可变区中，除CDR之外，氨基酸组成和排列顺序相对保守的区域。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括那些具有带有本发明提供的抗体轻链或重链CDR区的分子，只要其CDR与本发明鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有MUC5B蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以25内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明的抗体包括其保守性变异体。本发明抗体的保守性变异体指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生。
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术获得，包括但不限于杂交瘤细胞、噬菌体展示文库、酵母展示文库、单B细胞筛选。本发明的抗体可以通过使用伴随标志物免疫动物产生，例如可以通过免疫小鼠产生。
如本文所用，术语“杂交瘤细胞”是一种在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。
如本文所用，术语“噬菌体展示文库”是在噬菌体pⅢ基因一侧插入特定长度的随机寡核苷酸，从而在噬菌体表面展示与pⅢ融合的随机多肽。由于每一个噬菌体呈现一种序列的外源多肽，那么展示特定长度各种不同序列外源多肽的噬菌体集合体就构成一个完整的噬菌体展示文库。
如本文所用，术语“酵母展示文库”是在酵母表面表达展示特定长度各种不同序列外源多肽的方法，可以通过这样的方法，配合一定的筛选条件，获得亲和力优异的单克隆抗体序列。
如本文所用，术语“单B细胞筛选”是通过特殊装置，对单个B细胞表达的抗体进行检测，并筛选获得亲和力优异的单克隆抗体序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
如本文所用，术语“载体”、“表达体系”或“表达载体”是指以可操作的连接含有所需的编码序列和控制序列的核酸序列，以使得用这些序列转化的宿主能产生编码的蛋白质。为实现转化，该表达体系可包含在载体上；然而，相关核酸分子可随后也整合在宿主染色体中。
如本文所用，术语“宿主细胞”是一种细胞，其可支持表达载体的复制或表达。宿主细胞可为原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母细胞，昆虫细胞，两栖动物细胞，或哺乳动物细胞。
如本文所用，术语“转染”、“稳转”或“瞬时转染”是指表达载体被宿主细胞吸收，无论任何编码序列是否实际被表达。本领域技术人员已知多种转染方法。例如，转染在表达载体和高浓度的磷酸钙的存在下，通过电穿孔，通过使用噬菌体或病毒表达载体以插入宿主细胞，通过机械插入核酸，甚至通过在未包装的(unpackaged)核酸片段的存在下培养宿主细胞而完成。通常当操作感兴趣的载体的任何指示在宿主细胞中出现时确认转染成功。
检测方法
本发明提供了本发明的抗体或抗体组合用于制备检测试剂板或试剂盒的用途。利用本发明的抗体，可以在免疫检测的同时检测样品中的伴随标志物MUC5B，通过伴随标志物的阴阳性判断采样和样品处理是否符合要求的方法，从而检测免疫检测的采样和样品处理环节是否可信。
本发明通过在免疫检测检测目标组分的同时检测样品标志物，可以在判读目标组分的同时判读样品标志物，如果样品标志物检测到阳性，说明检测的样品中有足量的样品标志物，证明样品的采集过程和处理过程符合要求，在此基础上再去判读目标组分的定性或者定量具备可信度。反之，如果样品标志物检测阴性，说明检测的样品中没有样品标志物或者样品标志物过少，提示采样或者样品处理过程不符合要求，实验结果不可信，需要再次采样或者再次处理样品进行试验。通过本发明的方法，可以监测免疫检测试验采样和样品处理过程的质量，避免出现假阴性，使实验结果更准确，更可信。
本发明的方法可以应用于多种免疫检测方法中，例如免疫检测为免疫层析检测、酶联免疫检测、免疫磁珠检测、或化学发光检测。
如本文所用，术语“阴性”(-)在医学检查中，通常代表指标正常或病原体不存在，“阳性”(+)代表患病或病原体(例如病毒)存在。在医学上，术语阴性和阳性泛指存在与否，或用来表示检查的结果。
在一个实施方式中，本发明的方法可以应用于侧流免疫层析检测肺炎支原体。在检测肺炎支原体的同时，通过黏蛋白抗体检测鼻腔黏液中的黏蛋白MUC5B，来监测采样质量。
本发明的主要优点包括：
本发明提供了特异性靶向MUC5B的抗体和抗体对，本发明的抗体对在侧流层析检测中联合使用时能够最大化MUC5B检测显色效果，并且与肺炎支原体抗体不产生交叉反应，具备高灵敏度和高特异性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1黏蛋白MUC5B的制备
本实施例提供一种从唾液中分离纯化MUC5B的方法：
1.200mL唾液采自8位健康成人(年龄25～34岁，口腔健康，无全身疾病，3个月内未服用抗菌药物)。唾液收集前2h禁食并漱口。将收集到的新鲜唾液置于冰浴中，立即加入0.274mol/L十六烷基三甲基溴化铵，玻棒轻轻搅动至凝块形成于其上，此时MUC5B蛋白沉淀聚集于玻棒上。将凝块移至另一烧瓶，加入3mol/L NaC1 250ml，将凝块溶解。此溶液即为MUC5B粗提物。
2.用14K透析袋透析MUC5B粗提物48h，透析缓冲液为0.01M PBS，每隔12h换一次透析缓冲液。
3.凝胶过滤层析纯化MUC5B，将superdex 200填料用纯水重悬起来后，装填入层析柱(16×500mm)中，装填高度400mm，用PH＝7.0的0.01M PBS平衡柱子2h，流速控制在1mL/min。MUC5B用超滤管浓缩至3mg/mL，然后上样，每次上样体积2mL，流速1mL/min。采用自动收集器收集洗脱产物，合并多次收集产物，并调整浓度至1mg/mL。
4.做WB和HPLC对纯化得到的MUC5B进行鉴定。
图1显示了WB检测的MUC5B纯化产物，其中灰色区域代表可以与MUC5B抗体发生结合，表明存在MUC5B蛋白。图2显示了HPLC检测分析MUC5B纯化产物，其中8.3min和8.921min两个峰均为MUC5B，对应WB中的两个条带。
实施例2通过单B细胞筛选抗MUC5B单克隆抗体的方法
(1)使用纯化获得的MUC5B作为免疫原，对四只小鼠进行多次重复免疫。
(2)采微量尾血，通过间接ELISA确定血清效价，在血清效价达到10万以上时结束免疫。
(3)选取其中血清效价最高的一只小鼠，处死，取脾，破碎，获取细胞悬液。
(4)流式细胞仪分选表达抗体的B细胞，裂解细胞，提取抗体轻重链基因。
(5)将抗体基因构建到质粒上，瞬转表达。
(6)收集表达的抗体，用于后续筛选。
实施例3抗体与唾液样本结合检测
通过酶标板包被唾液，并用ELISA检测瞬转表达抗体的细胞上清，筛选8株阳性单克隆抗体。具体实施方式如下：
(1)收集唾液作为抗原，并用PH＝9.0的0.05M碳酸钠缓冲液稀释十倍，然后加入96孔酶标板中，每孔100uL，4℃孵育过夜；
(2)倒掉孵育的抗原，加入5％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔250uL，37℃，封闭3小时；
(3)倒掉封闭液，加入200uL PBST洗涤三次，并拍干；
(4)将得到的含有抗体的细胞上清四倍梯度稀释4、16、64、256、1024、4096、16384、65536倍，分别加入上述酶标板中，每孔100uL，37℃孵育1小时，孵育结束后，加入200uLPBST，洗涤三次，并拍干；
(5)加入用PBST 3000倍稀释的羊抗人HRP二抗，37℃，孵育1小时，孵育结束后，加入200uLPBST，洗涤三次，并拍干；
(6)每孔加入50uL TMB显色液，放置于暗处，孵育5分钟，加入50uL终止液(0.2M硫酸)终止反应；
用酶标仪30分钟内在450nm处读数，结果如图3所示。根据结果筛选出八株阳性单克隆抗体1M2B3、1M2C4、1M2C5、1M2F5、1M2G6、1M2B7、1M2C10、1M2F12。
实施例4MUC5B检测抗体对筛选
用侧流免疫层析法在八株MUC5B抗体中筛选可以配对用于抗体夹心法免疫检测的MUC5B抗体对，并应用于肺炎支原体免疫诊断的胶体金试纸条中。具体实施方式如下：
1.抗体的金标记
1)分别量取九份10ml金溶液，加入210uL 0.5M碳酸钾调节PH，逐滴加入90ug八种黏蛋白抗体或肺炎支原体抗体溶液，搅拌30分钟。
2)取10％ BSA,逐滴加入混合溶液，至终浓度0.5％，搅拌15分钟。
3)取10％ PEG(20 000)，逐滴加入混合溶液，至终浓度0.1％，搅拌15分钟。
4)离心，速度8000-9000RPM，4℃，10分钟
5)弃上清，后加入稀释液重悬胶体金颗粒，调整体积至1mL。
2.胶体金垫与样品垫的预处理
1)确定处理数量，A4纸张(或裁切成其他规格)，每10张一叠放置。
2)配置缓冲液(约30ml/A4纸张大小)。依据材料厚薄和性能调节处理液配方，基本元素：缓冲液+NaCl+其他。
3)将材料放入缓冲液完全浸透，浸泡10min，后取出脱水3min，平置在筛网上。
4)放入37℃干燥箱(湿度小于20％)，烘干至湿度恒定在20％左右。
5)将烘干后材料装入铝箔袋或塑料袋中密封保存，贴标签及记录批号，注意处理好的玻璃纤维不能长期暴露在湿度高的环境。
3.点样
1.胶体金喷点到胶体金垫
1)稀释标记胶体金至36D/mL，并将肺炎支原体标记的胶体金和八种黏蛋白抗体标记的胶体金分别混合，添加(终浓度):10-20％蔗糖，1-3％BSA，0.5-1％NaCl,0.5-1％表面活性剂.
2)在湿度20－40％,室温条件下，将溶液用喷金划膜仪的AIRJET喷头喷到胶体金垫上，压力设置为10PSI，喷点参数为7ul/cm。
3)将喷好的胶体金条带置于37℃干燥,湿度恒定在20％后，收起并密封贮存。
4.抗体划膜
1)取出NC膜，在室温和正常湿度下平衡1小时。
2)将NC膜非点样面粘贴于PVC底板。
3)用缓冲溶液将八种黏蛋白抗体，肺炎支原体抗体和羊抗人Fc抗体稀释到1mg/ml；pH范围：7.0，
4)使用喷金划膜仪，设定划膜量为0.5ul/cm，并划膜，每张膜上划三条线，自下到上分别为肺炎支原体，八种黏蛋白抗体中的其中一种，羊抗人Fc抗体。
5)烘箱干燥，37度2小时至湿度20％以下，后密封包装待用。
5.试纸条的组装、剪切、包装(环境要求：常温，20％湿度以下)
1)将不同黏蛋白抗体点样的胶体金垫和NC膜两两组合。
2)胶体金垫粘贴在NC膜的下方，覆盖NC膜1mm。
3)吸水垫粘贴在NC膜的上方，覆盖NC膜2mm。
4)样品垫粘贴在胶体金垫的下方，覆盖胶体金垫2mm。
5)在切条机中将粘贴好的检测板剪切成4mm宽的条。
6)装壳并和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签。
6.测试
1)阳性测试样品为用咽拭子采集的咽部黏液样品并用样品裂解液处理样品。阴性测试样品为未使用的咽拭子并用样品裂解液处理。
2)准备每种组合的胶体金试纸条各2条，分别上样阳性样品和阴性样品各1条，每条样品上样50ul。
3)静止5分钟后，观察实验结果，并与比色卡对比显色深浅，按照颜色由深至浅打分，分数依次为：G10-G0。
4)经过对比发现，5、7和8抗体标记的胶体金与肺炎支原体抗体有交叉反应，所以以上抗体作为标记的配对均不能选。排除以上条件后，配对序号1+2、1+4和2+4较优，其中又以1+4最优。
表1黏蛋白抗体信息
表2黏蛋白抗体配对检测结果
本发明涉及的序列如下表所示：
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种抗MUC5B蛋白的抗体，其特征在于，所述的抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:2所示的LCDR1，
SEQ ID NO:3所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:4所示的LCDR3；
所述的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:9所示的HCDR1，
SEQ ID NO:10所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:11所示的HCDR3；
或者，
所述的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；
所述的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:23所示的HCDR1，
SEQ ID NO:24所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:25所示的HCDR3。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区和轻链可变区分别进一步包括骨架区(FR)，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.5所示的FR1、SEQ ID NO.6所示的FR2、SEQ ID NO.7所示的FR3和SEQ ID NO.8所示的FR4；和/或
所述的重链可变区具有SEQ ID NO.12所示的FR1、SEQ ID NO.13所示的FR2、SEQ IDNO.14所示的FR3和SEQ ID NO.15所示的FR4。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区和轻链可变区分别进一步包括骨架区(FR)，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.19所示的FR1、SEQ ID NO.20所示的FR2、SEQ ID NO.21所示的FR3和SEQ ID NO.22所示的FR4；和/或
所述的重链可变区具有SEQ ID NO.26所示的FR1、SEQ ID NO.27所示的FR2、SEQ IDNO.28所示的FR3和SEQ ID NO.29所示的FR4。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体为动物源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
5.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的抗体。
6.一种载体，所述载体含有如权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的载体、或基因组中整合有外源的如权利要求5所述的多核苷酸、或表达如权利要求1所述的抗体。
8.一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的可检测标记物。
9.一种抗MUC5B蛋白的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合包括抗体S1和S2，所述抗体S1的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:2所示的LCDR1，
SEQ ID NO:3所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:4所示的LCDR3；
抗体S1的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:9所示的HCDR1，
SEQ ID NO:10所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:11所示的HCDR3；
所述抗体S2的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；
抗体S2的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:23所示的HCDR1，
SEQ ID NO:24所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:25所示的HCDR3。
10.如权利要求1所述的抗体、如权利要求8所述的抗体偶联物或如权利要求9所述的抗体组合在制备检测试剂或试剂盒中的用途。
Priority Applications (1)
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| CN202311145459.6A CN117186217A (zh) | 2023-09-06 | 2023-09-06 | 抗muc5b蛋白的抗体 |
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2023
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