CN117164524A - 具有parp7/hdac双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物及其制备方法和应用。本发明提供了式(I)所示结构的一种具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物、含有式(I)衍生物的药物组合物及水合物，以及这些化合物的同位素衍生物、手性异构体、变构体、不同的盐、前药和制剂等。本发明还提供了所述一种具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物的制备方法以及这些化合物在治疗实体瘤和血液瘤上的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)是调控包括基因表达、蛋白质降解和多细胞应激反应的基本细胞过程的十七种酶家族的成员，而聚(ADP-核糖)聚合酶7(Poly(ADP-ribose)polymerases7，简称PARP7)是一个由AHR调控的基因，是PARP家族的重要成员，能够参与DNA修复，基因组稳定性维持等一系列细胞过程。PARP7仅能够转移一个单ADP-核糖(MAR)，属于monoPARP。PARP7的PARP催化结构域中含有一个可赋予DNA结合的锌指基序，以及一个可介导蛋白质相互作用的WWE结构域。其介导的单ADP核糖基化是一种涉及多种重要生物过程的可逆翻译后修饰，如免疫细胞功能、转录调节、蛋白质表达和DNA修复。PARP7在神经元发育、干细胞维持、抗病毒感染和癌症中都发挥着重要的作用。基因组关联试验鉴定3q25基因座为卵巢癌的易感位点，PARP7在此癌症种类中发挥作用。机制上，PARP7可能通过核糖基化Tubulin，调控微管蛋白的稳定性，以及抑制一型干扰素信号通路，抑制机体的抗肿瘤免疫，促进肿瘤的生长和存活。基于PARP7在先天性免疫反应中的作用，PARP7在肿瘤免疫中的作用也越来越受到关注。异常表达或激活的PARP7可以通过抑制先天性免疫反应，进而抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫。在大规模基因筛选中，PARP7也被鉴定为T细胞激活的抑制因子。在黑色素瘤细胞中敲除PARP7，可以增强共培养的T细胞的增殖和生长。
组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,简称HDACs)通过影响肿瘤细胞增殖、控制细胞周期，诱导癌细胞对化疗药物产生耐药性、调控血管生成，调控负责侵袭转移的蛋白质的生成等，最终参与肿瘤的发生、增殖、侵袭和转移过程。研究发现，抑制HDACs可以诱导肿瘤细胞周期停滞、分化及凋亡。因此，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylaseinhibitor，HDACi)作为抗肿瘤药已经成为了当前的研究热点。与此同时，基于HDACi与其他抗癌药表现出协同的抗肿瘤效果，设计、合成单一分子的融合药物在最近几年也成为了科学家们争相研究的对象。
已有文献报道PARP抑制剂和HDAC抑制剂联合使用存在协同增效作用，可以促进DNA损伤累计，同时降低肿瘤细胞中同源重组途径的响应，从而促进多种肿瘤细胞死亡，对同源重组修复途径没有缺失的肿瘤细胞也有良好的杀伤效果。但是联合用药存在药代动力学复杂、可能发生药物相互作用、引发更多毒副作用的缺点。而具有多靶点抑制活性的单个小分子有希望避免这些问题。PARP7作为PARP家族的重要成员，其抑制剂可能是一种极佳的肿瘤治疗药物，筛选出全新品种的PARP7抑制剂具有重要意义。本发明提出一种具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物，以应对不同肿瘤的差异性和肿瘤环境的复杂性，能够更加造福癌症患者，具有深远意义。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物。
一种具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物，所述衍生物的结构如式(I)所示：
其中：
为化学键或者其中“/”表示与哒嗪酮连接的位点；表示与L1连接的位点；
L1为选自4-10元杂环烷基的单环或多环或者螺环，包括但不限于以下结构片段之一：
其中表示L1与连接的位点；表示L1与L2连接的位点；
分别独立选自以下结构片段之一：
其中n为4-6任一自然数,表示L1与L2连接的位点；
作为优选，所述具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物为如下结构所示的化合物1～30任意一种：
其中n为4-6任一自然数。
本发明的第二个目的是提供了上述具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物的制备方法。
若为化学键，则采用合成路线一，化合物a-1可由含LI与L2片段的化合物通过简单的酸胺缩合制得，化合物a-2其合成方法见WO2020223229,具体包括如下步骤：
(1)将中间体a-1和化合物a-2用EtOH溶解，加入Et3N，60℃搅拌4h，后处理纯化得化合物a-3；
(2)化合物a-3溶解在二氯甲烷溶液中，加入三氟乙酸溶液，室温搅拌，后处理得化合物a-4；
(3)将化合物a-4用MeOH和DCM溶解，冰浴搅拌下加入NaOH的MeOH溶液，紧接着加入羟胺水溶液，反应保持在0℃，搅拌1h，后处理得到式(I)化合物；
若为则采用合成路线二，化合物b-5可由含LI与L2片段的化合物通过简单的取代反应制得，具体包括如下步骤：
(1)化合物b-1与化合物b-2在碳酸铯的作用下进行迈克尔加成得到化合物b-3；
(2)化合物b-3在氢氧化钠的作用下水解得到化合物b-4；
(3)将化合物b-4和化合物b-5用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冰浴下依次加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)，搅拌过夜，后处理纯化得化合物b-6；
(4)化合物b-6在三氟乙酸的作用下脱保护制得化合物b-7；
(5)将路线一中所得化合物b-5和化合物b-7用EtOH溶解，加入Et3N，60℃搅拌4h，后处理纯化得化合物b-8；
(6)化合物b-8溶解在二氯甲烷溶液中，加入三氟乙酸溶液，室温搅拌，后处理纯化得化合物b-9；
(7)将化合物b-9用MeOH和DCM溶解，冰浴搅拌下加入NaOH的MeOH溶液，紧接着加入羟胺水溶液，反应保持在0℃，搅拌1h，后处理得到式(I)化合物；
本发明式(I)所示化合物可通过如上的方法制得，然而该方法的条件，如反应物、溶剂、所用化合物的量、反应温度、反应所需时间等不限于上面的解释。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
本发明的第三个目的是提供了所述的具有HDACi药效团的哒嗪酮衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供了一种抗肿瘤药物，含有安全有效量的所述的具有HDACi药效团的哒嗪酮衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物。
作为优选，所述抗肿瘤药物还可以包括药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。
作为优选，所述应用和所述抗肿瘤药物中，所述肿瘤包括实体瘤和血液瘤。
由于本发明化合物具有抑制各种肿瘤细胞株增殖的活性，因此，本发明化合物及其各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解各种疾病，包括各种癌症。
本发明所述“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-1000mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组分能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增溶剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，如羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，如甘油；(d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠；(e)缓溶剂，如石蜡；(f)吸收加速剂，如季胺化合物；(g)润湿剂，如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，如高岭土；(i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型，如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部位中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型，包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，如乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂，包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～5000mg，优选5～2000mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明将具有PARP7抑制效果的哒嗪酮结构和HDACi设计融合成单一的抗肿瘤分子，提供了式(I)所示结构的具有HDACi药效团的哒嗪酮衍生物、含有式(I)化合物的药物组合物及水合物，以及这些化合物的同位素衍生物、手性异构体、变构体、不同的盐、前药和制剂等，通过引入极性的HDACi药效团，能够在很大程度上改善原本哒嗪酮结构的物理化学特性、水溶性及其口服吸收利用度，在保留PARP7活性的同时，增加HDAC相关靶点的亲和活力，从而达到提高整体抗癌效果的作用。本发明通过高通量筛选、同系物合成、基底结构设计、片段组装策略将HDAC的官能团作用元件与特定的PARP7抑制剂小分子的关键结构哒嗪酮相结合以提高抗肿瘤活性，与简单的结构改造相比，具有开创性。本发明还提供了所述具有HDACi药效团的哒嗪酮衍生物的制备方法、用途，以及这些化合物对各种肿瘤细胞株增殖抑制的活性。本发明中的具有HDACi药效团的哒嗪酮衍生物有望成为抗肿瘤候选药物，治疗各种癌症，如实体瘤和血液瘤等。具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：化合物1的制备
步骤一：在0℃下和氮气保护下向1a(30.0g，118.1mmol，1.00当量)于DMF(300mL)中的溶液中分批加入氢化钠(24.0g，60％纯度,142mol，1.20当量)。将所得溶液在室温下搅拌1小时，接着在0℃下滴加[2-(氯甲氧基)乙基]三甲基硅烷(21.6g，130mmol，1.10当量)。将反应混合物在室温下搅拌9小时。经TLC检测后反应完全，然后通过添加500mL水。用3×500mLEtOAc萃取所得溶液并且合并有机层。将有机层用250mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：4)纯化，得无色油状化合物1b(34.0g，收率85.4％)用于下一步反应。LCMS:[M+H]+384.70。
步骤二：在室温下将1b(32.0g，83.3mmol，1.00当量)于MeOH(300mL)中的溶液中分批加入氢氧化钾(14.0g，142mol，1.20当量)。将所得溶液在室温下搅拌10小时。经TLC检测后反应完全，旋干反应液后，随后向所得粗品中添加500mL水。用3×500mLEtOAc萃取所得溶液并且合并有机层。将有机层用250mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压，所得的粗品经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)纯化，得黄色油状化合物1c(22.0g，收率79.0％)用于下一步反应。
步骤三：将1c(22.0g，62.1mmol，1.00当量)、1d(35.6g，186mmol，3.00当量)和CuI(9.46g，31.1mmol，0.50当量)加入到NMP(250mL)中，混合溶液在100℃下搅拌12小时。经TLC检测反应完全后，降温后过滤反应液，然后通过添加1000mL水淬灭反应物。将所得溶液用3×1000mLEtOAc萃取。将有机层合并并浓缩。将残余物施加至(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)硅胶柱上。将收集的洗脱份合并并浓缩以获得油状物，共得到1e(17.6g,收率87.4％)呈淡黄色油状的目标化合物。
步骤四：在20℃下向1e(20.0g，61.7mmol，1.00当量)于DMF(200mL)中的溶液中滴加TMSI(16.0g，80.2mmol，1.30当量)。在85℃下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加850mL水淬灭反应混合物并将所得溶液用3×500mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到1f(13.0g,收率70.2％)呈淡黄色固体状的目标化合物。
步骤五：在0-5℃下向1f(10.0g，32.3mmol，1.00当量)于DMF(100mL)中的溶液中滴加乙二酰氯(12.3g，96.7mmol，3.00当量)。在室温下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加200mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×300mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到1g(8.4g,收率79.4％)呈淡黄色液体的目标化合物。
步骤六：在0-5℃下向1g(250mg，0.762mmol，1.00当量)于无水乙醇(5mL)中的溶液中加入三乙胺(308mg，3.05mmol，4.00当量)与1h(12.3g，96.7mmol，3.00当量)。在室温下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加20mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×20mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到1i(200mg,收率58.3％)呈白色固体的目标化合物。
步骤七：将1i(200mg，0.443mmol，1.00当量)于DCM(3mL)中的溶液中滴加三氟乙酸(1mL)。在室温下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加20mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×10mL二氯甲烷萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到1j(70mg,收率48.6％)呈淡黄色液体的目标化合物。
步骤八：将化合物1j(70mg,0.22mmol,1.00当量)置于25mL的圆底烧瓶中，加入DCM溶液(1mL)、MeOH溶液(2mL)，冰浴条件下加入NH2OH水溶液(50％，215mg，6.54mmol,15.0当量)、NaOH(130.8mg，3.27mmol),冰浴条件，搅拌2h。TLC检测反应完全以后，在搅拌状态下，用HCl水溶液(1M)调节pH至7～8，随后加入二氯甲烷(10mL)萃取，保留水相并且在浓缩后，将残余物通过用H2O/CH3CN(1/1)洗脱的C18反相色谱法纯化，得到化合物1(48mg，收率68％)呈白色固体状的标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.43(s,1H),10.34(d,J＝1.5Hz,1H),8.67(d,J＝1.4Hz,1H),7.85(s,1H),7.08(tt,J＝6.5,3.4Hz,1H),3.35–3.26(m,2H),1.93(t,J＝7.4Hz,2H),1.48(h,J＝6.9Hz,4H),1.26(qd,J＝6.7,4.0,3.3Hz,4H).
实施例2：化合物2的制备
步骤一：在0℃下向2a(500mg，2.66mmol，1.00当量)于DMF(5mL)中的溶液中加入HATU(1.11g，2.93mmol，1.10当量)与DIPEA(686mg,5.32mmol,2.00eq)。将所得溶液在室温下搅拌0.5小时，接着在0℃下分批加入2b(798mg，3.99mmol，1.50当量)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。经TLC检测后反应完全，然后通过添加50mL水。用3×50mLEtOAc萃取所得溶液并且合并有机层。将有机层用25mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)纯化，得无色油状化合物2c(600mg，收率61.0％)用于下一步反应。
步骤二：在室温下向化合物2c(600mg，1.62mmol，1.00当量)于MeOH(5mL)中的溶液中加HCl·dioxane(5mL)。将所得溶液在室温下搅拌12小时。经TLC检测后反应完全，旋干反应液，得无色油状化合物2d(340mg，收率85.4％)无需纯化直接用于下一步反应。
步骤三：在0-5℃下向2e(300mg，0.914mmol，1.00当量)于无水乙醇(5mL)中的溶液中加入三乙胺(277mg，2.77mmol，3.00当量)与2d(336mg，1.07mmol，1.20当量)。在室温下搅拌所得溶液12小时。然后通过添加20mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×20mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到2f(320mg,收率62.4％)呈白色固体的目标化合物。
步骤四：将2f(280mg，0.498mmol，1.00当量)于DCM(1mL)中的溶液中滴加三氟乙酸(1mL)。在室温下搅拌所得溶液4小时,然后通过添加20mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×10mL二氯甲烷萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到2g(160mg，收率74.4％)呈淡黄色液体的目标化合物。
步骤五：将化合物2g(140mg,0.324mmol,1.00当量)置于25mL的圆底烧瓶中，加入DCM溶液(1mL)、MeOH溶液(2mL)，冰浴条件下加入NH2OH水溶液(50％，321mg，4.86mmol,15.0当量)、NaOH(129mg，3.24mmol),冰浴条件，搅拌1h。TLC检测反应完全以后，在搅拌状态下，用HCl水溶液(1M)调节pH至7～8，随后加入二氯甲烷(10mL)萃取，保留水相并且在浓缩后，将残余物通过用H2O/CH3CN(1/1)洗脱的C18反相色谱法纯化，得到化合物2(70mg，收率49.9％)呈白色固体状的标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.49(s,1H),10.32(s,1H),8.65(s,1H),8.02(s,1H),6.40(dq,J＝7.0,3.3Hz,1H),4.38(d,J＝13.2Hz,1H),4.09(q,J＝5.3Hz,1H),4.05–3.91(m,1H),3.86(d,J＝13.7Hz,1H),3.17(d,J＝5.2Hz,2H),3.12–2.99(m,1H),2.60(td,J＝13.0,2.7Hz,1H),2.28(t,J＝7.5Hz,2H),1.93(t,J＝7.4Hz,2H),1.89–1.72(m,2H),1.69–1.51(m,1H),1.47(dd,J＝7.3,4.4Hz,4H),1.37–1.14(m,4H).
实施例3：化合物3的制备
步骤一：在0℃下向3b(1.15g，5.02mmol，1.00当量)于DMF(5mL)中的溶液中加入HATU(2.09g，5.52mmol，1.10当量)与DIPEA(1.792g,15.06mmol,3.00eq)。将所得溶液在室温下搅拌0.5小时，接着在0℃下分批加入3a(0.908g，5.02mmol，1.00当量)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。经TLC检测后反应完全，然后通过添加50mL水。用3×50mLEtOAc萃取所得溶液并且合并有机层。将有机层用25mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)纯化，得无色油状化合物3c(820mg，收率45.9％)用于下一步反应。
步骤二：在室温下向化合物3c(800mg，2.24mmol，1.00当量)于MeOH(5mL)中的溶液中加HCl·dioxane(5mL)。将所得溶液在室温下搅拌12小时。经TLC检测后反应完全，旋干反应液，得无色油状化合物3d(470mg，收率71.8％)无需纯化直接用于下一步反应。
步骤三：在0-5℃下向3e(300mg，0.914mmol，1.00当量)于无水乙醇(5mL)中的溶液中加入三乙胺(277mg，2.77mmol，5.00当量)与3d(470mg，1.60mmol，1.76当量)。在室温下搅拌所得溶液12小时。然后通过添加20mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×20mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到3f(320mg,收率64.0％)呈白色固体的目标化合物。
步骤四：将3f(320mg，0.58mmol，1.00当量)于DCM(5mL)中的溶液中滴加三氟乙酸(3mL)。在室温下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加20mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×10mLDCM萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到3g(95mg，收率38.5％)呈淡黄色液体的目标化合物。
步骤五：将化合物3g(95mg,0.227mmol,1.00当量)置于25mL的圆底烧瓶中，加入DCM溶液(1mL)、MeOH溶液(2mL)，冰浴条件下加入NH2OH水溶液(50％，224.7mg，3.41mmol,15.0当量)、NaOH(90.8mg，2.27mmol,10.0当量),冰浴条件，搅拌1h。TLC检测反应完全以后，在搅拌状态下，用HCl水溶液(1M)调节pH至7～8，随后加入二氯甲烷(10mL)萃取，保留水相并且在浓缩后，将残余物通过用H2O/CH3CN(1/1)洗脱的C18反相色谱法纯化，得到化合物3(40mg，收率42.1％)呈白色固体状的标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.32(s,1H),8.64(s,1H),7.95(s,1H),7.81(t,J＝5.6Hz,1H),3.71–3.55(m,2H),3.30(s,2H),3.16(t,J＝12.5Hz,2H),3.00(q,J＝6.6Hz,2H),2.42–2.31(m,1H),1.92(t,J＝7.4Hz,2H),1.72(dd,J＝13.6,3.8Hz,2H),1.62(qd,J＝11.9,3.9Hz,2H),1.46(p,J＝7.5Hz,2H),1.36(p,J＝7.2Hz,2H),1.20(qd,J＝9.7,9.0,6.0Hz,2H).
实施例4：化合物4的制备
步骤一：在室温下向4a(5.00g，28.6mmol，1.00当量)和4b(12.8g，142.8mmol，5.00当量)的无水乙腈(100mL)中的溶液中加入碳酸铯(14.0g，42.8mmol，1.50当量)。在25℃下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加200mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×200mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到4c(4.20g，收率61.7％)呈淡黄色液体的目标化合物。
步骤二：将4c(4.2g，16,1mmol，1.00当量)于MeOH(100mL)和H2O(20mL)中的溶液中加入NaOH(3.20g，80.5mmol，5.00当量)。在室温下搅拌所得溶液12小时。然后通过添加200mL(1MHCl)淬灭反应物。并将所得溶液用3×500mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩得到4d(3.20g，收率80.6％)呈淡黄色液体的目标化合物,无需纯化即可直接用于下一步反应。
步骤三：在室温下向4e(1.00g，5.81mmol，1.00当量)和4f(1.30g，6.97mmol，1.00当量)的无水NMP(15mL)中的溶液中加入碳酸钾(1.23g，11.6mmol，2.00当量)。在25℃下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到4g(1.80g，收率92.2％)呈白色固体的目标化合物。
步骤四：在室温下向化合物4g(1.80g，2.66mmol，1.00当量)于MeOH(5mL)中的溶液中加盐酸二氧六环溶液(5mL)。将所得溶液在室温下搅拌12小时。经TLC检测后反应完全，过滤固体并且真空干燥，得白色固体化合物4h(780mg，收率62.9％)无需纯化直接用于下一步反应。
步骤五：在0℃下向4d(330mg，1.336mmol，1.00当量)于DMF(5mL)中的溶液中加入HATU(609mg，1.60mmol，1.20当量)与DIPEA(634mg,5.34mmol,4.00eq)。将所得溶液在室温下搅拌0.5小时，接着在0℃下分批加入4h(391mg，130mmol，1.10当量)。将反应混合物在室温下搅拌9小时。经TLC检测后反应完全，然后通过添加50mL水。用3×50mLEtOAc萃取所得溶液并且合并有机层。将有机层用25mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)纯化，得白色固体化合物4i(509mg，收率84.5％)用于下一步反应。
步骤六：在室温下向化合物4i(400mg，0.887mmol，1.00当量)于DCM(3mL)中的溶液中加三氟乙酸(1mL)。将所得溶液在室温下搅拌12小时。经TLC检测后反应完全，旋干反应液，得无色油状化合物4j(300mg，粗品)无需纯化直接用于下一步反应。
步骤七：在室温下向4k(250mg，0.762mmol，1.00当量)于无水乙醇(5mL)中的溶液中加入三乙胺(1mL)与4j(300mg，0.84mmol，1.10当量)。在65摄氏度下搅拌所得溶液12小时。然后通过添加20mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×20mL EtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到4l(180mg,收率36.7％)呈白色固体的目标化合物。
步骤八：将4l(180mg，0,28mmol，1.00当量)于DCM(2mL)中的溶液中滴加三氟乙酸(1mL)。在室温下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加20mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×10mL二氯甲烷萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到化合物4m(52mg,收率36.2％)呈无色液体的目标化合物。
步骤九：将化合物4m(52mg,0.101mmol)置于25mL的圆底烧瓶中，加入DCM溶液(1mL)、MeOH溶液(2mL)，冰浴条件下加入NH2OH水溶液(50％，100.3mg，1.50mmol)、NaOH(40.5mg，1.01mmol),冰浴条件，搅拌1h。在搅拌状态下，用HCl水溶液(1M)调节pH至7～8，在浓缩后，将残余物通过用H2O/CH3CN(1/1)洗脱的C18反相色谱法纯化，得到化合物4(32mg,收率61.5％)呈白色固体状的标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.43(s,1H),11.08(s,1H),9.02(s,1H),8.69(s,2H),7.90(s,1H),6.26(dt,J＝8.6,4.1Hz,1H),4.12(dt,J＝20.3,6.4Hz,1H),3.78(dt,J＝24.7,5.2Hz,4H),3.74–3.62(m,2H),3.53(d,J＝5.3Hz,4H),3.48(d,J＝5.6Hz,2H),3.16(d,J＝3.2Hz,1H),2.58(t,J＝6.5Hz,2H),2.54(s,1H),1.14(d,J＝6.5Hz,3H)13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ168.9,161.3,157.9,157.1,146.1,128.6,125.9,123.8,114.9,73.4,67.0,48.5,44.6,43.6,43.2,40.7,40.4,32.7,17.6.
实施例5：化合物5的制备
参照化合物4的合成方法，第一步经取代反应制得黄色固体化合物5c(4.00g，收率85.2％)；第二步盐酸二氧六环溶液脱去叔丁氧羰基制得黄色固体化合物5d(2.10g，收率76.9％)的粗品；第三步化合物5d与化合物5e经酸氨缩合制得白固体化合物5f(1.05g，收率57.6％)；第四步经TFA脱去保护基得无色油状化合物5g(300mg，粗品)；第五步经亲核取代反应制得无色油状化合物5h(220mg，收率46.9％)；第六步经TFA脱去保护基得白固体化合物5i(105mg，收率66.7％)第七步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得浅黄色固体化合物5(44mg，收率46.3％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.47(s,1H),11.02(s,1H),8.91(s,1H),8.51(d,J＝2.4Hz,1H),7.92(s,1H),7.87(dd,J＝9.0,2.5Hz,1H),6.84(d,J＝9.0Hz,1H),6.30(dt,J＝8.6,4.2Hz,1H),4.14(dp,J＝10.1,6.1Hz,1H),3.67(q,J＝6.3Hz,2H),3.61(dd,J＝6.6,3.3Hz,2H),3.54(t,J＝5.1Hz,6H),3.48(d,J＝5.6Hz,2H),2.58(t,J＝6.5Hz,2H),1.14(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ168.9,159.5,157.9,147.2,146.1,136.2,128.6,125.9,123.8,117.1,105.8,73.4,66.9,48.5,44.4,44.2,44.0,40.6,32.7,17.6.
实施例6：化合物6的制备
步骤一：将6a(2.7g，5.99mmol，1.00当量)于MeOH(10mL)和H2O(5mL)中的溶液中加入NaOH(1.20g，29.9mmol，5.00当量)。在室温下搅拌所得溶液12小时。然后通过添加100mL(1MHCl)淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mL乙酸乙酯萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩得到6b(1.60g,收率61.2％)呈白色固体的目标化合物,无需纯化即可直接用于下一步反应
步骤二：在0℃下向6b(600mg，1.37mmol，1.00当量)于DMF(5mL)中的溶液中加入HATU(626mg，1.65mmol，1.20当量)与DIPEA(490mg,4.12mmol,3.00eq)。将所得溶液在室温下搅拌0.5小时，接着在0℃下分批加入6c(535g，2.75mmol，2.00当量)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。经TLC检测后反应完全，然后通过添加50mL水。用3×50mL乙酸乙酯萃取所得溶液并且合并有机层。将有机层用25mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)纯化，得白色固体化合物6d(720mg，收率90.7％)用于下一步反应。
步骤三：在室温下向化合物6d(700mg，1.21mmol，1.00当量)于DCM(5mL)中的溶液中加三氟乙酸(5mL)。将所得溶液在室温下搅拌12小时。经TLC检测后反应完全，旋干反应液，得无色油状化合物6e(600mg，粗品)无需纯化直接用于下一步反应。
步骤四：在室温下向6f(360mg，1.10mmol，1.00当量)于无水乙醇(5mL)中的溶液中加入三乙胺(1mL)与6e(600mg，粗品)。在60℃下搅拌所得溶液4小时。然后通过添加20mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×20mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到6g(420mg，收率49.6％)呈无色液体的目标化合物。
步骤五：将6g(10.0g，32.3mmol，1.00当量)于DCM(5mL)中的溶液中滴加三氟乙酸(2mL)。在室温下搅拌所得溶液4小时。然后通过添加50mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×50mLDCM萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到6h(260mg，收率78.3％)呈白色结晶固体的目标化合物。
步骤六：将化合物6h(180mg,0.28mmol)置于25mL的圆底烧瓶中，加入DCM溶液(2.5mL)、MeOH溶液(5mL)，冰浴条件下加入NH2OH水溶液(50％，278mg，8.43mmol,15.0当量)、NaOH(112mg，2.81mmol,10.0当量),冰浴条件，搅拌1h。在搅拌状态下，用HCl水溶液(1M)调节pH至7～8，在浓缩后，将残余物通过用H2O/CH3CN(1/1)洗脱的C18反相色谱法纯化，得到6(115mg,收率63.5％)呈白色固体状的标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.44(s,1H),10.32(s,1H),8.77(d,J＝1.4Hz,2H),8.65(d,J＝2.0Hz,1H),8.32(t,J＝5.5Hz,1H),7.91(s,1H),6.27(dt,J＝8.7,4.3Hz,1H),4.15(p,J＝6.5Hz,1H),4.09(qd,J＝5.3,1.5Hz,1H),3.79(dt,J＝25.2,5.1Hz,4H),3.68(tt,J＝10.2,5.2Hz,2H),3.52(t,J＝5.2Hz,4H),3.48(d,J＝5.5Hz,2H),3.32(s,1H),3.21(q,J＝6.7Hz,2H),3.16(dd,J＝5.2,1.2Hz,1H),2.59(t,J＝6.4Hz,2H),1.93(t,J＝7.4Hz,2H),1.48(p,J＝7.2Hz,4H),1.27(dh,J＝12.2,6.8,5.2Hz,4H),1.19–1.09(m,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ169.1,168.9,163.4,161.3,157.9,157.5,146.1,128.6,125.9,116.6,73.4,67.0,48.5,44.6,43.6,43.2,40.7,32.7,32.2,29.1,28.3,26.2,25.1,17.6.
实施例7：化合物7的制备
参照化合物6的合成方法，第一步经酸氨缩合制得白色固体化合物7c(500mg，收率85％)；第二步三氟乙酸脱去叔丁氧羰基制得无色油状液体化合物7d(460mg，收率100％)的粗品；第三步经亲核取代反应制得无色油状化合物7f(410mg，收率63.7％)；第六步经TFA脱去保护基得白固体化合物7g(160mg，收率48.3％)第七步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得浅黄色固体化合物7(105mg，收率65.6％)1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.45,10.34,8.77,8.74–8.58(m),8.34(t,J＝5.6Hz),7.91,6.28(dq,J＝8.3,4.0Hz),4.15(p,J＝6.3Hz),3.88–3.73(m),3.67(q,J＝6.3Hz),3.53(d,J＝5.2Hz),3.48(d,J＝5.6Hz),3.20(q,J＝6.7Hz),2.58(t,J＝6.5Hz),1.94(t,J＝7.4Hz),1.49(h,J＝6.9Hz),1.26(ddt,J＝15.2,9.8,5.9Hz),1.14(d,J＝6.5Hz).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ169.1,168.9,163.4,161.3,157.9,157.5,146.1,128.6,125.9,123.8,73.4,67.0,48.5,44.6,43.6,43.2,40.7,32.7,32.2,28.9,26.1,24.9,17.6.实施例8：化合物8的制备
参照化合物6的合成方法，第一步经酸氨缩合制得白色固体化合物8c(550mg，收率83％)；第二步三氟乙酸脱去叔丁氧羰基制得无色油状液体化合物8d(720mg，收率100％)的粗品；第三步经亲核取代反应制得无色油状化合物8f(390mg，收率52.5％)；第六步经TFA脱去保护基得白固体化合物8g(180mg，收率55.9％)第七步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得浅黄色固体化合物8(93mg，收率51.7％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.78(s,2H),8.36(t,J＝5.6Hz,1H),7.91(s,1H),6.26(d,J＝7.2Hz,1H),4.15(p,J＝6.7Hz,1H),3.79(ddd,J＝25.2,6.9,4.1Hz,4H),3.73–3.63(m,2H),3.53(t,J＝5.3Hz,4H),3.48(d,J＝5.6Hz,2H),3.21(q,J＝6.3Hz,2H),3.17(s,1H),2.59(t,J＝6.5Hz,2H),1.97(t,J＝7.0Hz,2H),1.58–1.41(m,4H),1.15(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ169.0,168.9,163.4,161.3,157.9,157.5,146.1,128.6,126.0,123.8,116.6,73.4,67.0,48.5,44.6,43.6,43.2,40.7,38.7,32.7,32.0,28.8,22.8,17.6.
实施例9：化合物9的制备
参照化合物6的合成方法，第一步经酸氨缩合制得白色固体化合物9c(900mg，收率88％)；第二步三氟乙酸脱去叔丁氧羰基制得无色油状液体化合物9d(940mg，收率100％)的粗品；第三步经亲核取代反应制得无色油状化合物9f(623mg，收率49.8％)；第六步经三氟乙酸脱去保护基得白固体化合物9g(289mg，收率48.8％)第七步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得淡红色固体化合物9(193mg，收率66.8％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.78(s,2H),8.36(t,J＝5.6Hz,1H),7.91(s,1H),6.26(d,J＝7.2Hz,1H),4.15(p,J＝6.7Hz,1H),3.79(ddd,J＝25.2,6.9,4.1Hz,4H),3.73–3.63(m,2H),3.53(t,J＝5.3Hz,4H),3.48(d,J＝5.6Hz,2H),3.21(q,J＝6.3Hz,2H),3.17(s,1H),2.59(t,J＝6.5Hz,2H),1.97(t,J＝7.0Hz,2H),1.58–1.41(m,4H),1.15(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ169.0,168.9,163.4,161.3,157.9,157.5,146.1,128.6,126.0,123.8,116.6,73.4,67.0,48.5,44.6,43.6,43.2,40.7,38.7,32.7,32.0,28.8,22.8,17.6.
实施例10：化合物10的制备
参照化合物6的合成方法，第一步经水解反应制得10b(440mg，收率75.9％)，第二步经酸氨缩合制得白色固体化合物10d；第三步三氟乙酸脱去叔丁氧羰基制得无色油状液体(460mg，收率100％的粗品)；第四步经亲核取代反应制得无色油状化合物10f(320mg，收率54.5％)；第五步经TFA脱去保护基得白固体化合物10g(200mg，收率75.3％)第六步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得浅黄色固体化合物10(70mg，收率41.2％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.47(s,1H),10.35(d,J＝1.5Hz,1H),8.64(dd,J＝30.9,2.0Hz,2H),8.25(t,J＝5.6Hz,1H),8.06–7.84(m,2H),6.85(d,J＝9.0Hz,1H),6.30(dt,J＝8.6,4.2Hz,1H),4.17(s,1H),4.13(dt,J＝10.4,5.2Hz,1H),3.68(q,J＝6.2Hz,2H),3.62(dd,J＝6.7,3.3Hz,2H),3.55(p,J＝5.3Hz,6H),3.49(d,J＝5.6Hz,2H),3.19(dd,J＝15.4,6.0Hz,3H),2.59(t,J＝6.5Hz,2H),1.94(t,J＝7.3Hz,2H),1.49(p,J＝7.1Hz,4H),1.26(dq,J＝9.6,5.9Hz,4H),1.15(d,J＝6.4Hz,3H).
实施例11：化合物11的制备
步骤一：在室温下向11a(2.9g,11.1mmol)置于DCM(30mL)中的溶液中并添加三氟乙酸(5mL)。将反应混合物在室温暗环境下搅拌6h。在减压下去除溶剂，得到中间体11b(粗品)，该物质直接用于下一阶段，无需进一步纯化。
步骤二：添加粗制的中间体11b中加入Et3N(10mL)和EtOH(100mL)和中间体11c(3.7g,11.1mmol)。反应混合物在60℃下搅拌12h。通过TLC监测反应。将混合物在室温下用冷水(200mL)淬灭，并用EtOAc(300mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL×2)洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。通过柱层析(DCM/MEOH＝20:1,v/v)纯化粗制物，得到无色油状物的中间体11d(2.7g，产率54％)。
步骤三：在室温下向化合物11d(2.7g,5.95mmol)于DCM(30mL)中的溶液中加三氟乙酸(5mL)。将所得溶液在室温下搅拌12小时。室温搅拌2h，直到TLC(DCM/MeOH＝20:1)显示反应完成。在室温下用冷水(100mL)淬火，用DCM(200mL×2)提取。将组合有机层用盐水(100mL×2)洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩。得无色油状化合物11e(1.8g，产率94％)无需纯化直接用于下一步反应。
步骤四：将11e(1.8g，5.6mmol，1.00当量)于MeOH(100mL)和H2O(20mL)中的溶液中加入NaOH(1.1g，27.8mmol，5.00当量)。在室温下搅拌所得溶液12小时。然后通过添加50mL(1MHCl)淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩得到11f(1.50g，收率87.3％)呈淡黄色液体的目标化合物,无需纯化即可直接用于下一步反应。
步骤五：在室温下向11g(3.00g,18.80mmol，1.00当量)和11h(4.20g,22.57mmol，1.20当量)的无水THF(50mL)中的溶液中加入Et3N(3.8g,37.61mmol，2.00当量)。在0℃下搅拌所得溶液1小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到11i(1.80g，收率92.2％)呈黄色固体的目标化合物。
步骤六：在室温下向化合物11i(5.3g,17.1mmol，1.00当量)于MeOH(30mL)中的溶液中加盐酸二氧六环溶液(15mL)。将所得溶液在室温下搅拌12小时。经TLC检测后反应完全，过滤固体并且真空干燥，得黄色固体化合物11j(3.7g，收率88.2％)无需纯化直接用于下一步反应。
步骤七：在室温下向11f(1.00g，3.23mmol，1.00当量)和11j(872.9mg,3.55mmol，1.10当量)的无水DMF(15mL)中的溶液中加入DIPEA(1669.8mg,12.92mmol，4.00当量)和EDCI(1610.28mg,8.40mmol，2.60当量)和HOBt(567.50mg,4.20mmol，1.30当量)。在25℃下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到11k(920.0mg，收率57％)呈白色固体的目标化合物。
步骤八：在室温下向11k(920.0mg,1.84mmol，1.00当量)的无水乙醇(15mL)和水(5mL)中的溶液中加入铁粉(791mg,9.20mmol，5.00当量)和氯化铵(492.1mg,9.20mmol，5.00当量)。随后在反应液在60℃下搅拌所得溶液10小时。通过硅藻土过滤然后，然后添加100mL水。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到11i(420mg,收率48.2％)呈白色固体的目标化合物。
步骤九：在0℃下向11i(200.0mg,0.43mmol，1.00当量)和11m(88.9mg,0.51mmol，1.20当量)的无水DMF(15mL)中的溶液中加入DIPEA(166.4mg，1.29mmol，3.00当量)和EDCI(214.3mg，1.12mmol，2.00当量)和HOBt(75.46mg，0.56mmol，1.30当量)。将反应混合物在室温下搅拌9小时。经TLC检测后反应完全，然后通过添加50mL水。用3×50mLEtOAc萃取所得溶液并且合并有机层。将有机层用25mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)纯化，得白色固体化合物11n(140.0mg，收率52.3％)用于下一步反应。
步骤十：将化合物11n(140.0mg,0.22mmol)置于25mL的圆底烧瓶中，加入DCM溶液(2.5mL)、MeOH溶液(5mL)，冰浴条件下加入NH2OH水溶液(50％，221.3mg，3.35mmol,15.0当量)、NaOH(134.2mg，3.35mmol,15.0当量),冰浴条件，搅拌1h。在搅拌状态下，用HCl水溶液(1M)调节pH至7～8，在浓缩后，将残余物通过用H2O/CH3CN(1/1)洗脱的C18反相色谱法纯化，得到11(115mg,收率63.5％)呈白色固体状的标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.44(s,1H),10.33(s,1H),9.80(s,1H),8.66(s,1H),8.54(s,2H),7.91(s,1H),6.26(dd,J＝8.5,4.2Hz,1H),4.14(p,J＝6.3Hz,1H),3.74–3.58(m,6H),3.49(dd,J＝9.4,5.3Hz,6H),2.58(t,J＝6.5Hz,2H),2.27(t,J＝7.4Hz,2H),1.95(t,J＝7.3Hz,2H),1.53(dp,J＝29.9,7.5Hz,4H),1.26(tt,J＝9.6,6.5Hz,2H),1.15(d,J＝6.4Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ171.2，169.0,168.8,157.9,150.1,146.1,128.6,124.8,124.6,73.4,67.0,48.5,44.6,43.9,43.5,40.7,35.7,32.7,32.1,28.2,24.9,24.7,17.6.
实施例12：化合物12的制备
参照化合物11的合成方法，第一步经酸氨缩合反应制得12c(160mg，收率75.9％)，第二步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得浅黄色固体化合物12(70mg，收率43.8％)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.44(s,1H),10.33(s,1H),9.80(s,1H),8.54(s,3H),7.91(s,1H),6.27(dq,J＝8.1,4.0Hz,1H),4.15(p,J＝6.5Hz,1H),3.76–3.58(m,6H),3.50(dt,J＝9.6,5.2Hz,6H),2.58(t,J＝6.5Hz,2H),2.27(t,J＝7.4Hz,2H),1.93(t,J＝7.4Hz,2H),1.52(dp,J＝37.7,7.0Hz,4H),1.26(qd,J＝9.7,7.8,4.8Hz,4H),1.15(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ171.3,169.1,168.8,158.0,157.9,150.0,146.1,128.6,124.8,73.4,68.0,48.5,44.6,43.9,43.5,40.7,35.8,32.7,32.2,28.4,28.4,25.0,24.9,17.6.
实施例13：化合物13的制备
步骤一：在室温下向13a(3.0g，23.00mmol，1.00当量)和13b(5.8g，27.58mmol，1.20当量)的无水DMF(50mL)中的溶液中加入CS2CO3(11.2g，34.5mmol，1.50当量)。在60℃下搅拌所得溶液3小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到13c(2.80g，收率47.2％)呈灰白色固体的目标化合物。
步骤二：在室温下向13c(2.8g，10.82mmol，1.00当量)和13d(2.4g，13.00mmol，1.20当量)的无水NMP(50mL)中的溶液中加入K2CO3(3.8g，37.61mmol，2.00当量)。在60℃下搅拌所得溶液12小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到13e(2.30g，收率52.2％)呈黄色固体的目标化合物。
步骤三：在室温下向化合物13e(2.3g，5.63mmol，1.00当量)于MeOH(20mL)中的溶液中加盐酸二氧六环溶液(10mL)。将所得溶液在室温下搅拌12小时。经TLC检测后反应完全，过滤固体并且真空干燥，得黄色固体化合物13f(1.7g，收率88.3％)无需纯化直接用于下一步反应。
步骤四：在室温下向13f(533.8mg，1.55mmol，1.00当量)和13g(400mg，1.29mmol，1.00当量)的无水DMF(15mL)中的溶液中加入DIPEA(668.7mg，5.17mmol，4.00当量)和EDCI(644.1mg，3.36mmol，2.60当量)和HOBt(227.0g，1.68mmol，1.30当量)。在25℃下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到13h(270mg，收率31.3％)呈白色固体的目标化合物。
步骤五：将化合物13h(270mg，0.45mmol)置于25mL的圆底烧瓶中，加入DCM溶液(2.5mL)、MeOH溶液(5mL)，冰浴条件下加入NH2OH水溶液(50％，445mg，6.75mmol,15.0当量)、NaOH(270mg，6.75mmol，15.0当量),冰浴条件，搅拌1h。在搅拌状态下，用HCl水溶液(1M)调节pH至7～8，在浓缩后，将残余物通过用H2O/CH3CN(1/1)洗脱的C18反相色谱法纯化，得到13(120mg,收率44.5％)呈白色固体状的标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.44(s,1H),10.33(s,1H),9.80(s,1H),8.66(s,1H),8.54(s,2H),7.91(s,1H),6.26(dd,J＝8.5,4.2Hz,1H),4.14(p,J＝6.3Hz,1H),3.74–3.58(m,6H),3.49(dd,J＝9.4,5.3Hz,6H),2.58(t,J＝6.5Hz,2H),2.27(t,J＝7.4Hz,2H),1.95(t,J＝7.3Hz,2H),1.53(dp,J＝29.9,7.5Hz,4H),1.26(tt,J＝9.6,6.5Hz,2H),1.15(d,J＝6.4Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ169.0,168.8,157.9,157.1,146.1,145.7,145.6,128.6,125.9,123.8,73.4,69.2,67.0,48.5,44.7,44.3,43.9,40.7,32.8,32.2,28.5,25.0,24.9,17.6.
实施例14：化合物14的制备
参照化合物17的合成方法，第一步经取代反应制得14c(3.1g，收率66.2％)；第二步经取代反应制得白色固体化合物14e(3.4g，收率74.2％)；第三步盐酸·二氧六环脱去叔丁氧羰基制得白色固体14f(2.8g，收率95.9％)的粗品；第四步经酸氨缩合反应制得无色固体化合物14h(140mg，收率22.1％)；第六步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得浅白色固体化合物14(70mg，收率50.2％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.45(s,1H),10.76(s,1H),9.08(s,1H),8.27(s,2H),7.90(s,1H),7.58(d,J＝7.9Hz,2H),7.51–7.44(m,2H),6.47(d,J＝15.8Hz,1H),6.26(dt,J＝8.6,4.2Hz,1H),5.13(s,2H),4.14(dd,J＝10.5,4.4Hz,1H),3.72–3.65(m,2H),3.63(q,J＝5.8,4.6Hz,2H),3.58(dd,J＝6.9,3.7Hz,2H),3.49(q,J＝5.4Hz,6H),2.57(t,J＝6.5Hz,2H),1.14(d,J＝6.4Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ168.9,157.9,157.2,146.2,146.1,145.2,137.9,134.6,130.7,128.6,128.4,127.6,126.0,123.8,119.3,73.4,70.6,67.0,48.5,44.7,44.3,43.9,40.7,32.8,17.6.
实施例15：化合物15的制备
参照化合物13的合成方法，第一步经取代反应制得15c(3.2g，收率61.2％)；第二步经取代反应制得白色固体化合物15e(2.5g，收率51.2％)；第三步盐酸·二氧六环脱去叔丁氧羰基制得白色固体15f(1.8g，收率96.9％)的粗品；第四步经酸氨缩合反应制得无色固体化合物15h(110mg，收率22.3％)；第五步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得浅白色固体化合物15(70mg，收率50.2％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.19(s,2H),7.90(s,1H),6.25(dt,J＝8.1,4.0Hz,1H),4.13(p,J＝6.4Hz,1H),3.94(t,J＝6.5Hz,2H),3.73–3.64(m,2H),3.64–3.54(m,4H),3.49(q,J＝5.7Hz,6H),2.58(t,J＝6.5Hz,2H),1.95(t,J＝7.3Hz,2H),1.65(p,J＝6.7Hz,2H),1.50(p,J＝7.5Hz,2H),1.37(p,J＝7.1Hz,2H),1.32–1.23(m,2H),1.15(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ169.1,168.9,157.9,157.1,146.1,145.8,145.6,128.6,126.0,123.8,73.4,69.3,67.0,48.6,44.7,44.4,43.9,40.7,32.8,32.2,28.6,28.3,25.1,25.1,17.6.
实施例16：化合物16的制备
参照化合物13的合成方法，第一步经取代反应制得16c(3.2g，收率59.4％)；第二步经取代反应制得白色固体化合物16e(2.5g，收率51.1％)；第三步盐酸·二氧六环脱去叔丁氧羰基制得白色固体16f(1.8g，收率94.0％)的粗品；第四步经酸氨缩合反应制得无色固体化合物16h(165mg，收率27.4％)；第五步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得浅白色固体化合物16(83mg，收率50.3％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.45(s,1H),11.22(s,1H),9.06(s,1H),8.27(s,2H),7.90(s,1H),7.82–7.69(m,2H),7.56–7.42(m,2H),6.26(dq,J＝7.9,4.0Hz,1H),5.16(s,2H),4.14(p,J＝6.4Hz,1H),3.72–3.64(m,2H),3.60(ddd,J＝24.6,6.7,3.8Hz,4H),3.49(q,J＝5.4Hz,6H),2.57(t,J＝6.5Hz,2H),1.14(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ168.8,157.9,157.2,146.2,146.1,145.2,139.7,132.4,128.6,127.6,127.1,73.4,70.4,67.0,48.5,44.6,44.2,43.8,40.7,32.7,17.6.
实施例17：化合物17的制备
步骤一：在0℃下向17a(2.4g，9.57mmol，1.00当量)mmol的无水DMF(50mL)中的溶液中加入NaH(60％纯度)(574.2mg，14.35mmol，1.50当量)。在0℃下搅拌所得溶液1小时后，再缓慢加入17b(2.23g，11.48mmol，1.00当量),随后该反应在0度下搅拌2个小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到17c(2.4g，收率77.3％)呈无色油状液体的目标化合物。
步骤二：在室温下向17c(2.4g，7.45mmol，1.00当量)和17d(1.77g，11.18mmol，1.20当量)的无水DMF(50mL)与H2O(10mL)中的溶液中加入Na2CO3(1.58g，14.90mmol，2.00当量)和DCM(0.5mL)。随后氮气排氧15min，随后加入(dppf)PdCl2(272.7mg,0.37mmol，0.05当量)在60℃下搅拌所得溶液12小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到17e(950mg，收率41.2％)呈黄色固体的目标化合物。
步骤三：在室温下向17e(950mg，3.08mmol，1.00当量)和14d(861.2mg，4.63mmol，1.20当量)的无水NMP(10mL)中的溶液中加入K2CO3(851.3mg，6.17mmol，2.00当量)。在100℃下搅拌所得溶液12小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到17f(980mg，收率70.2％)呈黄色固体的目标化合物。
步骤四：在室温下向化合物17f(980mg，7.49mmol，1.00当量)于MeOH(10mL)中的溶液中加盐酸二氧六环溶液(5mL)。将所得溶液在室温下搅拌10小时。经TLC检测后反应完全，过滤固体并且真空干燥，得黄色固体化合物17g(805mg，收率98.3％)无需纯化直接用于下一步反应。
步骤四：在室温下向17g(560.4mg，1.42mmol，1.10当量)和17h(400mg，1.29mmol，1.00当量)的无水DMF(15mL)中的溶液中加入DIPEA(668.7mg，5.17mmol，4.00当量)和EDCI(643.0mg，3.35mmol，2.60当量)和HOBt(227.0g，1.68mmol，1.30当量)。在25℃下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到17i(223.0mg，收率31.3％)呈白色固体的目标化合物。
步骤五：将化合物17i(220mg，0.34mmol)置于25mL的圆底烧瓶中，加入DCM溶液(2.5mL)、MeOH溶液(5mL)，冰浴条件下加入NH2OH水溶液(50％，445mg，338.3mg,15.0当量)、NaOH(205.0mg，5.13mmol，15.0当量),冰浴条件，搅拌1h。在搅拌状态下，用HCl水溶液(1M)调节pH至7～8，在浓缩后，将残余物通过用H2O/CH3CN(1/1)洗脱的C18反相色谱法纯化，得到17(110.2mg,收率54.4％)呈白色固体状的标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.45(s,1H),10.34(s,1H),8.62(s,2H),8.12(s,1H),7.91(s,1H),7.83(d,J＝0.8Hz,1H),6.27(dq,J＝8.2,4.0Hz,1H),4.15(p,J＝6.0Hz,1H),4.08(t,J＝7.0Hz,2H),3.74(t,J＝5.2Hz,2H),3.68(q,J＝6.7Hz,4H),3.52(q,J＝4.9Hz,4H),3.49(d,J＝5.5Hz,2H),2.59(t,J＝6.5Hz,2H),1.94(t,J＝7.4Hz,2H),1.84–1.73(m,2H),1.52(p,J＝7.5Hz,2H),1.26–1.19(m,2H),1.15(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ168.9,168.8,159.8,157.9,154.4,146.1,135.3,128.6,126.0,116.0,115.8,73.4,67.03,48.5,44.7,43.7,43.3,40.7,32.8,32.1,29.6,25.6,24.6.
实施例18：化合物18的制备
参照化合物17的合成方法，第一步经取代反应制得18c(2.1g，收率85.2％)；第二步经Suzuki偶联反应制得18e(970.2mg，收率48.2％)，第三步经取代反应制得白色固体化合物18f(1050.1mg，收率74.2％)；第四步盐酸·二氧六环脱去叔丁氧羰基制得白色固体18g(560mg，收率75.9％)的粗品；第五步经酸氨缩合反应制得无色固体化合物18i(140mg，收率33.1％)；第六步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得浅白色固体化合物18(70mg，收率50.2％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.44(s,1H),10.34(s,1H),8.62(s,2H),8.18–8.06(m,1H),7.91(s,1H),7.83(d,J＝0.7Hz,1H),6.27(dq,J＝8.1,4.0Hz,1H),4.19–4.11(m,1H),4.08(t,J＝7.1Hz,2H),3.73(q,J＝3.7,2.3Hz,2H),3.68(q,J＝6.9Hz,4H),3.52(q,J＝4.8Hz,4H),3.49(d,J＝5.6Hz,2H),2.59(t,J＝6.5Hz,2H),1.93(t,J＝7.4Hz,2H),1.77(p,J＝6.7Hz,2H),1.47(p,J＝7.2Hz,2H),1.24(dq,J＝8.3,4.3Hz,4H),1.15(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ168.9,159.8,157.9,154.4,146.1,135.3,128.6,126.0,116.0,115.8,73.4,67.0,51.4,48.5,44.7,43.7,43.3,40.7,32.8,32.2,29.7,28.1,25.7,25.0,17.6.
实施例19：化合物19的制备
步骤一：在室温下向19a(1.00g，5.81mmol，1.00当量)和19b(1.30g，6.97mmol，1.00当量)的无水NMP(15mL)中的溶液中加入碳酸钾(1.23g，11.6mmol，2.00当量)。在25℃下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到19c(1.53g，收率81.6％)呈白色固体的目标化合物。
步骤二：在室温下向化合物19c(1.53g，4.75mmol，1.00当量)于MeOH(5mL)中的溶液中加盐酸二氧六环溶液(5mL)。将所得溶液在室温下搅拌12小时。经TLC检测后反应完全，过滤固体并且真空干燥，得白色固体化合物19d(1.03mg，收率97.8％)无需纯化直接用于下一步反应。
步骤三：在室温下向19d(286.6mg，1.29mmol，1.00当量)和19e(400mg，1.29mmol，1.00当量)的无水DMF(5mL)中的溶液中加入DIPEA(668.7mg，5.17mmol，4.00当量)和EDCI(644.1mg，3.36mmol，2.60当量)和HOBt(227.0g，1.68mmol，1.30当量)。在25℃下搅拌所得溶液10小时。然后通过添加100mL水淬灭反应物。并将所得溶液用3×100mLEtOAc萃取，并且将有机层合并并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩有机层并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到19f(190.0mg，收率28.7％)呈白色固体的目标化合物。
步骤四：将化合物19f(190mg，0.37mmol)置于25mL的圆底烧瓶中，加入DCM溶液(2.5mL)、MeOH溶液(5mL)，冰浴条件下加入NH2OH水溶液(50％，366.5mg，5.55mmol,15.0当量)、NaOH(222.1mg，5.55mmol，15.0当量),冰浴条件，搅拌1h。在搅拌状态下，用HCl水溶液(1M)调节pH至7～8，在浓缩后，将残余物通过用H2O/CH3CN(1/1)洗脱的C18反相色谱法纯化，得到13(90.0mg,收率47.3％)呈白色固体状的标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.56(d,J＝1.3Hz,1H),8.22(d,J＝1.4Hz,1H),7.91(s,1H),6.27(dq,J＝8.1,4.0Hz,1H),4.15(p,J＝6.3Hz,1H),3.75–3.62(m,6H),3.57(dd,J＝6.7,3.9Hz,4H),3.48(d,J＝5.6Hz,2H),2.59(t,J＝6.4Hz,2H),2.54(s,1H),1.15(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ170.0,161.3,157.9,154.8,146.1,141.1,132.9,130.0,128.6,125.9,123.8,73.5,66.9,48.5,44.3,43.8,43.5,40.4,32.7,17.6.
实施例20：化合物20的制备
参照化合物19的合成方法，第一步经取代反应制得20c(810mg，收率82.3％)，；第二步盐酸·二氧六环脱去叔丁氧羰基制得白色固体20d(460mg，收率78.4％)的粗品；第三步经酸氨缩合反应制得无色固体化合物20f(160mg，收率37.9％)；第五步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得淡黄色固体化合物20(77mg，收率48.1％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.66(d,J＝8.2Hz,2H),7.95–7.82(m,1H),6.26(tt,J＝8.7,4.2Hz,1H),4.13(tp,J＝13.0,6.6,5.9Hz,1H),3.72–3.56(m,5H),3.55–3.49(m,2H),3.49–3.35(m,12H),3.36–3.19(m,2H),2.45(dt,J＝13.1,6.4Hz,2H),1.92(tt,J＝7.0,3.3Hz,3H),1.87–1.76(m,1H),1.18–1.10(m,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ168.90,168.88,168.7,162.8,160.20,160.19,160.0,157.0,146.22,146.18,128.73,128.69,126.0,123.8,114.3,73.6,73.5,66.93,66.89,66.8,55.2,54.9,53.9,48.64,48.59,48.4,46.6,45.9,45.8,45.3,44.5,34.5,34.4,34.0,33.82,33.79,33.7,33.2,17.60,17.58,17.55.
实施例21：化合物21的制备
参照化合物19的合成方法，第一步经取代反应制得21c(3.5g，收率75.9％)，第二步盐酸·二氧六环脱去叔丁氧羰基制得白色固体21d(2.2g，收率88.2％)的粗品；第三步经酸氨缩合反应制得无色固体化合物21f(320mg，收率37.3％)；第五步经氨酯交换以及C18反相色谱法纯化制得浅白色固体化合物18(142mg，收率44.4％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.65(s,2H),7.90(d,J＝4.1Hz,1H),6.26(dt,J＝8.9,4.5Hz,1H),4.12(h,J＝6.1Hz,1H),3.79–3.72(m,2H),3.71–3.50(m,5H),3.45–3.42(m,2H),3.39(dt,J＝10.7,4.0Hz,3H),3.22(dd,J＝12.3,4.7Hz,1H),3.07–2.89(m,2H),2.54(s,1H),2.45(td,J＝6.4,1.9Hz,2H),1.13(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ168.9,160.14,157.95,156.73,146.13,128.68,128.63,125,90,125.80,115.07,73.46,73.38,66.9,66.8,50.5,50.3,49.9,49.2,48.5,41.6,40.4,34.3,17.6,17.5.
实施例9：化合物对PARP7酶抑制活性测试
1.实验材料和仪器
实验材料:PARP7(BPS,Cat.No.80527),组蛋白(Active Motif,Cat.No.81167)，SuperSignal ELISA Femto Substrate(THERMO PIERCE,Cat.No.37074)，Biotin-NAD+(R&D,Cat.No.6573)，Strep-HRP(Thermo Pierce,Cat.No.21127)
仪器：SpectraMax Paradigm多功能微孔板检测仪；
2.实验方法
制备组蛋白包被的384孔板，每孔加入25μL组蛋白溶液，4℃孵育过夜；制备PBST缓冲液、阻断缓冲液和检测缓冲液；用PBST缓冲液清洗组蛋白包覆的384孔板3次。在室温下，1小时内，用50μL的阻断缓冲液进行阻断。用PBST缓冲液清洗平板3次。在源板中制备2000x的化合物。用19.95ul的检测缓冲液将50nl的化合物从源板转移到96孔的中间板上。1000转/分，1min。将5μLDMSO/化合物转移到每个井中。酶反应：在25℃下孵育酶混合物10min。加入10μL酶混合物(期望最小对照)，室温化合物孵育10min，加入10μL检测缓冲液。每孔中加入10μL2.5倍生物素-nad+，25℃孵育90min。用PBST缓冲液清洗平板3次。
探测：添加25μL的Stre-HRP。在室温下孵育1h，用PBS缓冲液洗涤平板3次。加入25μL的定量增强剂混合物。孵育10min。加入2.5μL定量红停止液和摇板，持续10-30s，停止过氧化物酶活性。
数据处理:
使用等式(1)在Excel中拟合数据以获得抑制值。
等式(1)：Inh％＝(Max-Signal)/(Max-Min)*100。
使用等式(2)拟合XL-Fit中的数据以获得IC50值。
等式(2)：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+(IC50/X)*HillSlope)
其中Y是抑制百分比，X是化合物浓度
3.实验结果
按上述实验方法测定了部分目标化合物对PARP7酶抑制作用，结果如表1所示。
表1目标化合物对PARP7酶的半数抑制浓度
注：N/D–没有测定
结论：本发明代表性化合物能有效抑制PARP7酶活。
实施例10：化合物对HDAC1和HDAC6酶抑制活性测试
1.实验材料和仪器
实验材料：HDAC1(BPS,Cat.No.50051)；Tris缓冲液；HDAC6(BPS,Cat.No.50006)；384-well plate(Perkin Elmer,Cat.No.6007279)；DMSO(Coolaber)；
仪器：SpectraMax Paradigm多功能微孔板检测仪；
2.实验方法
准备1x检测缓冲液：准备1x检测缓冲液(改良的Tris缓冲液)；复合系列稀释：通过Echo在100％DMSO中将化合物转移到测定板，DMSO的含量不超过1％；制备酶溶液：在1x检测缓冲液中制备酶溶液；制备底物溶液：在1x检测缓冲液中加入胰蛋白酶和乙酰化肽底物，制成底物溶液；将15μL酶溶液转移到检测板或用于低对照转移15μL1x测定缓冲液；在室温下孵育15分钟；向每个孔中加入10μL底物溶液以开始反应；在Paradigm上读取板，激发波长为355nm，发射波长为460nm；曲线拟合：使用等式(1)在Excel中拟合数据以获得抑制值等式(1)：Inh％＝(Max-Signal)/(Max-Min)*100使用等式(2)拟合XL-Fit中的数据以获得IC50值等式(2)：Y＝底部+(顶部-底部)/(1+(IC50/X)*HillSlope)。其中Y是抑制百分比，X是化合物浓度。
3.实验结果
按上述实验方法测定了部分目标化合物对HDAC1酶和HDAC6酶的抑制作用。结果如表2所示。
表2目标化合物对HDAC1酶和HDAC6酶的半数抑制浓度
| 化合物编号 | HDAC1IC50(nM) | HDAC6IC50(nM) |
| 1 | 49 | 6.7 |
| 2 | 328 | 72 |
| 3 | N/D | N/D |
| 4 | 31 | 71 |
| 5 | 134 | 36 |
| 6 | 63 | 8.7 |
| 7 | 99 | 39 |
| 8 | 929 | 342 |
| 9 | >1250 | >1250 |
| 10 | 48 | 7.2 |
| 11 | 62.2 | 6.9 |
| 12 | 96.5 | 30.5 |
| 13 | 169.2 | 22.4 |
| 14 | 35.2 | 6.4 |
| 15 | 34.1 | 11.7 |
| 16 | 375.0 | 9.4 |
| 17 | 2.2 | 5.4 |
| 18 | 11.0 | 8.5 |
| 19 | 954.0 | 819.0 |
| 20 | 72.0 | 166.0 |
| 21 | 80.2 | 214.9 |
| SAHA | 15 | 6 |
| RBN-2397 | >10000 | >10000 |
注：N/D–没有测定。
结论：本发明代表性化合物能有效抑制HDAC1和HDAC6酶活。
实施例24：部分化合物对肿瘤细胞抑制活性测试
1.细胞系和细胞培养。
人肺腺癌NCI-H1373细胞，NCI-H2066细胞，人髓性单核细胞白血病细胞MV-4-11和人组织细胞淋巴瘤细胞U937,细胞购自上海中樵新洲生物技术有限公司。NCI-H1373细胞和CT26细胞在改良RPMI培养基中培养，添加10％(vol/vol)胎牛血清、50μg/mL青霉素和50μg/mL链霉素。将所有细胞系在37℃含5％CO2的湿化气氛中孵育。
2.细胞活力测定。
将细胞以之前优化的接种密度接种到两个384孔的白壁组织培养处理板中，并将该板置于5％CO2培养箱中过夜。药物处理6d后，采用CellTiter-Glo发光活性检测仪(Promega)检测细胞生长活力。使用CellTiterGlo(CTG,Promega,G7573)在给药后立即(第0日)和孵育6天后测定细胞活力。通过将原始发光计数与DMSO对照(Ctrl.)处理的细胞进行标准化来计算相对活力。采用Graphpad/Prism8软件计算半数抑制浓度(IC50)值，并拟合乙状剂量-反应曲线。
表3目标化合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度
结论：本发明代表性化合物能有效抑制不同肿瘤，包括血液瘤与实体瘤。
Claims (8)
1.一种具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物，其特征在于，所述衍生物的结构如式(I)所示：
其中：
为化学键或者其中表示与哒嗪酮连接的位点；表示与L1连接的位点；
L1为选自4-10元杂环烷基的单环或多环或者螺环，包括但不限于以下结构片段之一：
其中表示L1与连接的位点；表示L1与L2连接的位点；
分别独立选自以下结构片段之一：
其中n为4-6任一自然数,表示L1与L2连接的位点。
2.根据权利要求1所述的一种具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物，其特征在于，所述具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物化学结构式为如下式1～30中任意一种：
3.一种制备如权利要求1-2任一项所述的具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物的方法，其特征在于该方法具体是：
(1)将中间体a-1和化合物a-2用EtOH溶解，加入Et3N，60℃搅拌4h，后处理纯化得化合物a-3；
(2)化合物a-3溶解在二氯甲烷溶液中，加入三氟乙酸溶液，室温搅拌，后处理得化合物a-4；
(3)将化合物a-4用MeOH和DCM溶解，冰浴搅拌下加入NaOH的MeOH溶液，紧接着加入羟胺水溶液，反应保持在0℃，搅拌1h，后处理得到式(I)化合物；
路线-。
4.一种制备如权利要求1-2任一项所述的具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物的方法，其特征在于该方法具体是：
(1)化合物b-1与化合物b-2在碳酸铯的作用下进行迈克尔加成得到化合物b-3；
(2)化合物b-3在氢氧化钠的作用下水解得到化合物b-4；
(3)将化合物b-4和化合物b-5用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，冰浴下依次加入N,N-二异丙基乙胺DIPEA、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDCI、1-羟基苯并三氮唑HOBt，搅拌过夜，后处理纯化得化合物b-6；
(6)化合物b-6在三氟乙酸的作用下脱保护制得化合物b-7；
(7)将化合物a-2和化合物b-7用EtOH溶解，加入Et3N，60℃搅拌4h，后处理纯化得化合物b-8；
(9)化合物b-8溶解在二氯甲烷溶液中，加入三氟乙酸溶液，室温搅拌，后处理纯化得化合物b-9(10)将化合物b-9用MeOH和DCM溶解，冰浴搅拌下加入NaOH的MeOH溶液，紧接着加入羟胺水溶液，反应保持在0℃，搅拌1h，后处理得到式(I)化合物；
路线二。
5.根据权利要求1-2任一项所述的具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述肿瘤包括实体瘤和血液瘤。
7.一种抗肿瘤药物，含有安全有效量的所述的具有PARP7/HDAC双靶点抑制活性的哒嗪酮衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物。
8.根据权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于还包括药理上可接受的盐及药理上可接受的赋形剂或载体。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |