CN117159806A - 一种载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的制备方法与应用。所述制备方法包括以下步骤：将地塞米松磷酸钠Dexp、硫化铜纳米颗粒CuS NPs、pH=8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris‑HCl溶液在避光条件下混合，得到载药硫化铜纳米颗粒D‑CuS NPs；在含三乙醇胺的1×PBS介质中，将D‑CuS NPs掺入四臂‑聚乙二醇‑巯基聚合物网络中进行交联，得到载药硫化铜聚乙二醇D‑CuS‑PEG水凝胶；通过3D打印获得聚己内酯PCL支架；通过浸渍涂布法将D‑CuS‑PEG水凝胶涂覆在PCL支架表面，待完全凝胶，得到载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯D‑CuS‑PEG‑PCL支架。

Description

一种载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的制备方 法与应用

技术领域

本发明属于生物材料制备技术领域，具体涉及一种载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的制备方法与应用。

背景技术

3D打印聚己内酯(PCL)支架具有优异的机械强度、良好的生物相容性、可靠的稳定性等，广泛应用于骨组织工程领域，是经美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的一种可靠的医用材料。然而，PCL支架生物功能不足、亲水性差等缺点也限制了其功能的进一步提升，最终导致植入材料的效果不太理想。

近年来，受到类器官概念的启发，研究人员通过多种改性手段来解决上述问题。其中包括生物矿化技术，生物活性微纳米材料和功能聚合物的引入等，来制备改性的PCL活性支架，以改善PCL支架的物理化学特性。但是，上述多种改性手段得到的PCL活性支架往往存在功能单一的缺点。为了实现哺乳动物大断骨缺损的高效骨再生，结合3D打印PCL支架，构建一种兼具空间力学支撑、可控药物释放、光热促成骨等多功能的水凝胶软硬复合支架药物递送体系是一个有效的策略。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种能够应用于骨修复材料的多功能载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的制备方法，该种复合支架具有良好的光热转换、药物控释、抗菌功能以及生物相容性和成骨分化能力，且在近红外光(NIR)的联合作用下，能够进一步增强其成骨分化能力。

具体来说，第一方面，本发明提供了一种载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的制备方法，包括以下步骤：

将地塞米松磷酸钠Dexp、硫化铜纳米颗粒CuSNPs、pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl溶液在避光条件下混合，得到载药硫化铜纳米颗粒D-CuSNPs；

在含三乙醇胺的1×PBS介质中，将所述D-CuSNPs掺入四臂-聚乙二醇-巯基4arm-PEG-SH聚合物网络中进行交联，得到载药硫化铜聚乙二醇D-CuS-PEG水凝胶；

通过3D打印获得聚己内酯PCL支架；

通过浸渍涂布法将所述D-CuS-PEG水凝胶涂覆在所述聚己内酯PCL支架的表面，待完全凝胶，得到所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯D-CuS-PEG-PCL支架。

较佳地，所述地塞米松磷酸钠、硫化铜纳米颗粒、Tris-HCl溶液的用量比为0.125-2.5mg：50-500μg：1-4mL，控制所述地塞米松磷酸钠载药的浓度为0.035-0.725mg/mL。

较佳地，控制1×PBS介质中三乙醇胺的浓度为200-600mM，CuS NPs的浓度为50-250μg/mL，4arm-PEG-SH的浓度为100-200mg/mL。

较佳地，所述聚己内酯原材料的重均分子量Mw为60000-100000。

较佳地，所述完全凝胶的温度为25-37℃，时间为0.6-6小时。

第二方面，本发明提供了一种根据上述制备方法得到的载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架。

较佳地，所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的孔隙率为30-60％。

较佳地，所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架中，以复合支架总质量为100wt％计，载药硫化铜聚乙二醇水凝胶的质量分数为5-20wt％，聚己内酯支架的质量分数为80-95wt％。

第三方面，本发明提供了一种上述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架在骨修复材料中的应用。

有益效果

采用本发明的制备方法得到的D-CuS-PEG-PCL支架是基于类器官概念构建的一种软硬结合的复合材料。该种复合支架具有良好的光热转换、药物控释、抗菌功能以及生物相容性和成骨分化能力，且在近红外光(NIR)的联合作用下，能够进一步增强其成骨分化能力；

本发明提供的制备方法所用设备简单、投资小，利于批量生产D-CuS-PEG-PCL支架，应用前景广阔。

附图说明

图1为实施例1步骤(2)制备得到的D-CuS-PEG水凝胶SEM图；

图2为实施例2步骤(2)制备得到不同CuS NPs浓度的D-CuS-PEG水凝胶实物图；

图3为实施例3步骤(2)制备得到的D-CuS-PEG水凝胶与对照组PEG水凝胶的流变学分析测试图；

图4为实施例4制备得到的PCL支架(a,d,g,j)、PEG-PCL支架(b,e,h,k)和CuS-PEG-PCL支架(c,f,i,l)的实物图和SEM图；

图5为实施例4不同药物浓度下D-CuS-PEG-PCL支架的药物释放曲线图，左图表示非光照组，右图表示光照组；

图6为实施例5制备得到的PEG-PCL支架(空白对照)、D-CuS-PEG-PCL支架和NIR+D-CuS-PEG-PCL支架的体外成骨分化效果图；

图7为PEG-PCL支架(空白对照)、CuS-PEG-PCL支架、NIR+CuS-PEG-PCL支架、D-CuS-PEG-PCL支架和NIR+D-CuS-PEG-PCL支架的体内4周、8周成骨效果图。

具体实施方式

以下通过实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明基于类器官软硬结合的概念，提供了一种应用于骨修复材料的多功能载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架及其制备方法。

以下示例性说明本发明所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的制备方法，所述制备方法主要包括以下步骤。

(1)载药硫化铜纳米颗粒制备。将地塞米松磷酸钠(Dexp)、硫化铜纳米颗粒(CuSNPs)、pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)溶液均匀混合；在避光、25℃、300rpm条件下的摇床中充分混合反应12-60h，过滤、干燥，制备得到所述载药硫化铜纳米颗粒(D-CuS NPs)。

在一些实施方式中，所述地塞米松磷酸钠、硫化铜纳米颗粒、Tris-HCl溶液的用量比可以为0.125-2.5mg：50-500μg：1-4mL，并控制地塞米松磷酸钠载药的浓度可以为0.035-0.725mg/mL。通过提高地塞米松磷酸钠的浓度，可以提高载药量；但是，当其浓度过大时，往往会导致载药纳米粒的沉聚，从而影响载药的效果。与此同时，Tris-HCl溶液的用量也会影响纳米粒与药物的装载效率，当其用量过大时，往往会导致装载效率降低；当其用量过小时，则会影响纳米颗粒与载药的有效扩散，同样会导致装载效率降低。

(2)载药硫化铜聚乙二醇水凝胶制备。在含三乙醇胺(TEA)的磷酸缓冲盐溶液1×PBS介质中，将步骤(1)中制备得到的D-CuS NPs掺入四臂-聚乙二醇-巯基(4arm-PEG-SH)聚合物网络中进行交联，制备得到所述载药硫化铜聚乙二醇(D-CuS-PEG)水凝胶。

在1×PBS介质中，D-CuS NPs和4arm-PEG-SH在催化剂三乙醇胺的作用下，加速了4arm-PEG-SH末端的-SH和D-CuS NPs上S的共价结合。在一些实施方式中，可以控制1×PBS介质中三乙醇胺的浓度为200-600mM，CuS NPs的浓度可以为50-250μg/mL，4arm-PEG-SH的浓度可以为100-200mg/mL。

所述载药硫化铜聚乙二醇(D-CuS-PEG)水凝胶的制备过程中，三乙醇胺的浓度影响水凝胶的成胶速度，过低的浓度会导致成胶速度较慢，过高的浓度则会产生毒副作用。CuS NPs的浓度主要影响复合PCL支架的光热转换能力，在一定程度上，CuS NPs的浓度和光热转换能力成正比，其浓度过低不能及时达到所需的温度，浓度过高则不容易掌控升温速率。4arm-PEG-SH的浓度同样影响着水凝胶的成胶速度，过低的浓度会导致成胶速度缓慢，过高的浓度则会产生毒副作用。

(3)聚己内酯PCL支架制备。通过熔融沉积法在3D打印机中制造3D-PCL支架：将PCL原材料(重均分子量Mw：60000-100000)在打印区于120℃下熔化；通过注射针头(直径：0.4mm)沿z轴以0°/60°/120°的设计图案进行打印；制作孔隙率为30-60％、高度为3mm的长方体模型(5cm×5cm)；选择直径为3mm或4mm的打孔器，制备得到圆柱型聚己内酯PCL支架。

(4)载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架制备。通过浸渍涂布法将步骤(2)制备得到的D-CuS-PEG水凝胶涂覆在步骤(3)制备得到的聚己内酯PCL支架的表面，待完全凝胶，得到所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯(D-CuS-PEG-PCL)支架。

所述浸渍涂布的工艺可以为：将PCL支架浸到D-CuS-PEG水凝胶中，之后将PCL支架取出，置于阴凉处待水凝胶完全成胶，得到所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯D-CuS-PEG-PCL支架。所述完全凝胶的温度可以为25-37℃，时间可以为0.6-6小时。

将未完全成胶的前驱液涂覆在PCL支架上，借助PEG的两亲性质，可以较好地改善PCL的表面疏水性质。所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的孔隙率为30-60％；以复合支架总质量为100wt％计，载药硫化铜聚乙二醇水凝胶的质量分数为5-20wt％，聚己内酯支架的质量分数为80-95wt％。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围，下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例。

实施例1

(1)载药硫化铜纳米颗粒制备。将地塞米松磷酸钠(Dexp)、硫化铜纳米粒(CuSNPs)、pH＝8.5的Tris-HCl溶液均匀混合；在避光、25℃、300rpm条件下的摇床中充分反应48h，过滤，干燥，得到所述载药硫化铜纳米颗粒(D-CuS NPs)。其中，所述地塞米松磷酸钠、硫化铜纳米颗粒、Tris-HCl溶液的用量比为1.5mg：500μg：2mL；载药的浓度为0.035mg/mL。

(2)载药硫化铜聚乙二醇水凝胶制备。在含三乙醇胺的1×PBS介质中，将步骤(1)中制备得到的D-CuS NPs掺入四臂-聚乙二醇-巯基(4arm-PEG-SH)聚合物网络中进行交联，制备得到所述载药硫化铜聚乙二醇(D-CuS-PEG)水凝胶。其中，控制三乙醇胺在1×PBS介质中的浓度为400mM，CuS NPs的浓度为150μg/mL，4arm-PEG-SH的浓度为100mg/mL。

(3)聚己内酯PCL支架制备。通过熔融沉积法在3D打印机中制造3D-PCL支架：将PCL原材料(Mw：80000)在打印区于120℃下熔化；通过注射针头(直径：0.4mm)沿z轴以0°/60°/120°的设计图案进行打印；制作孔隙率为50％、高度为3mm的长方体模型(5cm×5cm)；选择直径为3mm的打孔器，制备得到圆柱型聚己内酯PCL支架。

(4)载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架制备。通过浸渍涂布法将步骤(2)制备得到的D-CuS-PEG水凝胶涂覆在步骤(3)制备得到的聚己内酯PCL支架的表面，待完全凝胶，制备得到所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯(D-CuS-PEG-PCL)支架。其中，所述浸渍涂布的工艺为：将PCL支架浸到D-CuS-PEG水凝胶中，之后将PCL支架取出，置于阴凉处待水凝胶完全成胶，得到所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯D-CuS-PEG-PCL支架；所述完全凝胶的温度为30℃，时间为1小时。

实施例1制备得到的载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的孔隙率为50％；以复合支架总质量为100wt％计，载药硫化铜聚乙二醇水凝胶的质量分数为5wt％，聚己内酯支架的质量分数为95wt％。

图1为实施例1步骤(2)制备得到的D-CuS-PEG水凝胶SEM图。从图中可以看出，CuSNPs均匀地分散在水凝胶支架中。

实施例2

本实施例参照实施例1的制备步骤。主要区别在于：步骤(2)中控制CuS NPs的浓度分别为0μg/mL(对照组)、50μg/mL、150μg/mL和250μg/mL。

图2为实施例2步骤(2)制备得到不同CuS NPs浓度的D-CuS-PEG水凝胶实物图。其中，1、2、3、4分别代表CuS NPs浓度为0μg/mL、50μg/mL、150μg/mL和250μg/mL时制备得到的D-CuS-PEG水凝胶实物图。图a表示倾斜图；图b表示倒立图。通过本实施例及图2可以得到，随着CuS NPs浓度的升高，凝胶时间在不断缩短，表明CuS NPs浓度影响水凝胶的成胶速度且与粘附性呈正相关。

实施例3

本实施例参照实施例1的制备步骤。主要区别在于：步骤(2)中控制三乙胺在1×PBS介质中的浓度分别为200mM、400mM和600mM。

图3为实施例3步骤(2)制备得到的D-CuS-PEG水凝胶与对照组PEG水凝胶的流变学分析测试图。G’表示储能模量，也叫弹性模量；G”表示损耗模量。从图中可以看出，D-CuS-PEG水凝胶中G’和G”的间隙大于PEG水凝胶，这表明D-CuS-PEG水凝胶具有更优异的粘弹性。D-CuS NPs的加入缩短了水凝胶的形成时间，提高了水凝胶的粘弹性。在测试终点，D-CuS-PEG水凝胶表现出更强的机械性能，说明CuS NPs的引入也增加了复合水凝胶的力学性质。

实施例4

本实施例参照实施例1的制备步骤。主要区别在于：步骤(1)中载药的浓度分别为低(0.035mg/mL)、中(0.345mg/mL)、高(0.725mg/mL)三个药物浓度。同时，制备得到了PCL支架、PEG-PCL支架和CuS-PEG-PCL支架。

图4为实施例4制备得到的PCL支架(a,d,g,j)、PEG-PCL支架(b,e,h,k)和CuS-PEG-PCL支架(c,f,i,l)的实物图和SEM图。从图中可以看出，PEG-PCL支架呈现透明色，而CuS-PEG-PCL支架呈现墨绿色，且从SEM图的结果对比得出，CuS-PEG-PCL支架比PEG-PCL支架有更致密的结构，说明CuS NPs的引入提高了水凝胶的交联度。

图5为实施例4不同药物浓度下D-CuS-PEG-PCL支架的药物释放曲线图，左图表示非光照组，右图表示光照组。在光照组中，每个取样点取样之前，用1064nm激光器照射D-CuS-PEG-PCL支架，将温度升至42℃，持续照射10min，以期促进药物释放。从图中可以看出，无论是光照组还是非光照组，D-CuS-PEG-PCL支架不同时间点的药物累计释放量随着浓度的增加而增加。

实施例5

本实施例参照实施例1的制备步骤。主要区别在于：步骤(4)中制备的D-CuS-PEG-PCL支架分别进行近红外光(NIR)处理(NIR+D-CuS-PEG-PCL)和不进行近红外光(NIR)处理(D-CuS-PEG-PCL)。

图6为实施例5制备得到的PEG-PCL支架(空白对照)、D-CuS-PEG-PCL支架和NIR+D-CuS-PEG-PCL支架的体外成骨分化效果图。CoL-1为Ⅰ型胶原，OCN为骨钙素，RUNX-2为成骨特异性转录因子-2，BMP-2为骨形态发生蛋白-2。从图中可以看出，D-CuS-PEG-PCL支架比空白组有更好的成骨分化效果，且经过近红外光(NIR)处理后，D-CuS-PEG-PCL支架的成骨分化能力进一步增强，说明NIR处理通过增加药物释放和局部温热微环境可以促进间充质干细胞进一步加强其成骨分化效果。

实施例6

参照实施例1中的制备步骤，分别制备聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯(PEG-PCL)支架、硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯(CuS-PEG-PCL)支架、近红外光照后的硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯(NIR+CuS-PEG-PCL)支架、载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯(D-CuS-PEG-PCL)支架和近红外光照的载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯(NIR+D-CuS-PEG-PCL)支架，并将其植入大鼠骨缺损模型中进行体内治疗效果的评价。

图7为PEG-PCL支架(空白对照)、CuS-PEG-PCL支架、NIR+CuS-PEG-PCL支架、D-CuS-PEG-PCL支架和NIR+D-CuS-PEG-PCL支架的体内4周、8周成骨效果图。BV表示骨组织体积，TV表示总组织体积。从图中可以看出，经过NIR光照处理后的D-CuS-PEG-PCL支架的成骨能力最强，说明NIR处理通过增加药物释放和局部温热微环境可以促进骨组织的再生。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (9)

1.一种载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将地塞米松磷酸钠Dexp、硫化铜纳米颗粒CuS NPs、pH=8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl溶液在避光条件下混合，得到载药硫化铜纳米颗粒D-CuS NPs；

在含三乙醇胺的1×PBS介质中，将所述D-CuS NPs掺入四臂-聚乙二醇-巯基4arm-PEG-SH聚合物网络中进行交联，得到载药硫化铜聚乙二醇D-CuS-PEG水凝胶；

通过3D打印获得聚己内酯PCL支架；

通过浸渍涂布法将所述D-CuS-PEG水凝胶涂覆在所述聚己内酯PCL支架的表面，待完全凝胶，得到所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯D-CuS-PEG-PCL支架。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述地塞米松磷酸钠、硫化铜纳米颗粒、Tris-HCl溶液的用量比为0.125-2.5 mg：50-500μg：1-4 mL，控制所述地塞米松磷酸钠载药的浓度为0.035-0.725 mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，控制1×PBS介质中三乙醇胺的浓度为200-600 mM，CuS NPs的浓度为50-250 μg/mL，4arm-PEG-SH的浓度为100-200 mg/mL。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述聚己内酯原材料的重均分子量Mw为60000-100000。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所所述完全凝胶的温度为25-37℃，时间为0.6-6小时。

6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法得到的载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架。

7.根据权利要求6所述的载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架，其特征在于，所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架的孔隙率为30-60%。

8.根据权利要求6或7所述的载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架，其特征在于，所述载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架中，以复合支架总质量为100 wt%计，载药硫化铜聚乙二醇水凝胶的质量分数为5-20 wt%，聚己内酯支架的质量分数为80-95wt%。

9.一种权利要求6-8中任一项所述的载药硫化铜聚乙二醇水凝胶复合聚己内酯支架在骨修复材料中的应用。