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CN117143203A - 可提高aav病毒全眼感染能力的衣壳蛋白突变体及其应用 - Google Patents

可提高aav病毒全眼感染能力的衣壳蛋白突变体及其应用 Download PDF

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CN117143203A
CN117143203A CN202311141635.9A CN202311141635A CN117143203A CN 117143203 A CN117143203 A CN 117143203A CN 202311141635 A CN202311141635 A CN 202311141635A CN 117143203 A CN117143203 A CN 117143203A
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capsid protein
virus
eye
aav
aav2
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袁丽
任盛
霍喾赓
高翠
伍辰光
高媛
郭洪志
钟雨婷
李锦霞
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Guangzhou Decode Gene Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Decode Gene Technology Co ltd
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Abstract

本发明公开了可提高AAV病毒全眼感染能力的衣壳蛋白突变体及其应用。发明人研究发现使用特定的肽替换野生型AAV2病毒衣壳蛋白的561至588位氨基酸，可以有效提高AAV病毒全眼感染能力，从根本上解决AAV2对眼睛感染效率的问题。

Description

可提高AAV病毒全眼感染能力的衣壳蛋白突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及可提高AAV病毒全眼感染能力的衣壳蛋白突变体。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是基因治疗递送常用载体，其原理是通过基因工程方法将AAV基因组ITR之间序列替换成目的基因序列，经细胞感染将目的基因递送至靶细胞，达到基因治疗目的。基于重组AAV具有安全性、高效性、稳定性、持续性、特异性、低整合性等特点，使得AAV成为基因治疗领域主要递送手段之一。在基因治疗过程中，动物体内注射往往需要高剂量、高纯度的AAV病毒，而高昂的AAV生产成本成为基因治疗过程中的瓶颈之一。
伴随着基因治疗下游研发技术的成熟，上游AAV生产通量问题的限制变得越来越明显。为了解决这个问题，现有的策略集中在以下两个方面，一是优化现有的AAV生产工艺，提高产量；二是对AAV衣壳蛋白进行改造，提高其对特定组织的靶向性及感染能力，以其实现更低、更安全的给药剂量。AAV生产工艺更多的是通过优化质粒配比、转染试剂配比、细胞培养条件、放大生产规格等达到提搞病毒产量的目的，不涉及AAV本身的改造。而基于AAV病毒的结构特征，其病毒特性如组织靶向性、免疫原性、包装产量等主要由其表面衣壳蛋白决定。过往研究显示在Cap2的561至588区域氨基酸位点进行突变，可以优化其对小鼠眼组织的感染能力。然而具体何种突变可以提高AAV病毒的全眼感染能力，依然是未知的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供可提高AAV病毒全眼感染能力的衣壳蛋白突变体。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
可提高AAV病毒全眼感染能力的衣壳蛋白突变体，使用如下多肽中的一条替代野生型AAV病毒衣壳蛋白的561至588位氨基酸得到：
1)DEHEIKTTNPVATEGYGEVATNWQRGNR
2)DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGRSAGLGTGLSR
3)DEQEIAATNPVATEQYGSVSTNLQRGNR
4)DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGGMVLVSAKSGLSR
5)DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGGRILVATTGLSR
6)DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGPLLDGTKGLSR
7)DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGSSPIKDGTKGLSR。
在一些衣壳蛋白突变体的实例中，所述野生型AAV2病毒衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。
本发明的第二个方面，提供：
一种基因，编码本发明第一个方面所述的衣壳蛋白突变体。
在一些基因的实例中，根据表达体系进行密码子优化。
本发明的第三个方面，提供：
一种表达体系，其插入有本发明第二个方面所述的基因。
在一些表达体系的实例中，所述表达体系为重组AAV载体。
在一些表达体系的实例中，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10及其变体的任意一种。
本发明的第四个方面，提供：
一种组合物，包括本发明第三个方面所述的表达体系。
在一些组合物的实例中，还添加有辅料。
本发明的第五个方面，提供：
本发明第四个方面所述的组合物在制备基因治疗制剂或转基因制剂中的应用。
在一些应用的实例中，用于制备靶向眼的基因治疗制剂或转基因制剂。
本发明的第五个方面，提供：
一种转基因动物模型的构建方法，包括向动物体内导入本发明第四个方面所述的组合物。
在一些构建方法的实例中，用于眼部疾病转基因动物模型的构建。
本发明的有益效果是：
本发明的一些实例的衣壳蛋白突变体，可以有效提高AAV病毒全眼感染能力，从根本上解决AAV2对眼睛感染效率的问题。
附图说明
图1为本发测试例中所构建的突变体质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图2为本发测试例中所构建的表达质粒pAAV-CAG-EGFP-Barcod-HGH琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图3为本发明实施例中pAAV2-Rep2/Cap2包装质粒图谱。
图4为本发明实施例中pAAV2-7M8-Rep2/Cap2-7M8包装质粒图谱。
图5为本发明实施例中构建得到的pAAV2-Mut-Rep2/Cap2-Mut包装质粒图谱。
图6为本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pAAV-CAG-EGFP-Barcod-HGH表达质粒图谱。
图7为本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pHelper辅助质粒图谱。
图8为本发明测试例中的方案制备得到的腺相变体病毒和野生型病毒食蟹猴全眼感染性能结果。
图9为本发明实施例的野生型、7M8和AAV2-EYE-01～EYE-07氨基酸序列比对图。
具体实施方式
本发明的第一个方面，提供：
可提高AAV病毒全眼感染能力的衣壳蛋白突变体，使用如下多肽中的一条替代野生型AAV病毒衣壳蛋白的561至588位氨基酸得到：
1)DEHEIKTTNPVATEGYGEVATNWQRGNR
2)DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGRSAGLGTGLSR
3)DEQEIAATNPVATEQYGSVSTNLQRGNR
4)DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGGMVLVSAKSGLSR
5)DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGGRILVATTGLSR
6)DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGPLLDGTKGLSR
7)DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGSSPIKDGTKGLSR。
野生型AAV病毒衣壳蛋白具有相近的结构，通过相同的改造后具有相同或相近的功能。
在一些衣壳蛋白突变体的实例中，所述野生型AAV2病毒衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。实验数据显示对野生型AAV2病毒衣壳蛋白进行改造后，可以有效提高AAV病毒全眼感染能力。
本发明的第二个方面，提供：
一种基因，编码本发明第一个方面所述的衣壳蛋白突变体。
在一些基因的实例中，根据表达体系进行密码子优化。
本发明的第三个方面，提供：
一种表达体系，其插入有本发明第二个方面所述的基因。
在一些表达体系的实例中，所述表达体系为重组AAV载体。
在一些表达体系的实例中，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10及其变体的任意一种。
本发明的第四个方面，提供：
一种组合物，包括本发明第三个方面所述的表达体系。
在一些组合物的实例中，还添加有辅料。辅料是AAV表达体系常用的辅料。
本发明的第五个方面，提供：
本发明第四个方面所述的组合物在制备基因治疗制剂或转基因制剂中的应用。
在一些应用的实例中，用于制备靶向眼的基因治疗制剂或转基因制剂。
本发明的第五个方面，提供：
一种转基因动物模型的构建方法，包括向动物体内导入本发明第四个方面所述的组合物。
在一些构建方法的实例中，用于眼部疾病转基因动物模型的构建。
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例
本实施例基于AI设计和过往研究提供了多种腺相关病毒变体（AAV2-EYE-01至AAV2-EYE-07），所述腺相关病毒变体的制备包括以下步骤：
1、质粒构建
通过基因合成（金唯智生物科技有限公司）AAV2-EYE-01～EYE-07氨基酸序列（如表1所示）对应的核酸序列，将合成得到的序列克隆至pAAV2-Rep2/Cap2质粒，将Cap2 561至588序列替换为突变序列，构建pAAV-突变质粒载体；连接产物转化大肠杆菌感受态Stbl3，挑取单菌落提取质粒进行测序验证与酶切验证，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，突变质粒构建成功。
通过基因合成（金唯智生物科技有限公司）Barcode41-Barcode49（如表2所示）核酸序列，将合成得到的序列克隆至pAAV-CAG-EGFP-hGH质粒，在EGFP蛋白终止密码子TAA与hGH-polyA之间插入长度为15bp的核酸序列，构建pAAV-CAG-EGFP-Barcode-hGH质粒，连接产物经转化、挑单菌落、提取质粒进行测序和酶切验证，琼脂糖凝胶电泳鉴定，如果如图2所示，Barcode质粒构建成功。
2、AAV2-WT、AAV突变体-Barcode病毒库包装
AAV2-WT或AAV2-突变体包装质粒，与pAAV-CAG-EGFP-Barcode-hGH表达质粒和pHelper辅助质粒三质粒共转染至悬浮HEK293T细胞中。包装质粒与唯一条型码（Barcode序列)的pAAV-CAG-EGFP-Barcode-hGH表达质粒一一对应，如表3所示。AAV2-WT、AAV2-突变体、pAAV-CAG-EGFP-Barcode-hGH及pHelper质粒图谱分别如图3～7所示。
病毒包装包括以下步骤：
A、细胞培养
（1）从液氮罐中取出一支悬浮293T细胞，放入37℃水浴中，快速晃动，使细胞解冻，加入装有5mlWayne 293无血清培养基的离心管中，200×g离心5min，弃上清，重悬至10mlWayne 293无血清培养基中，置于125ml三角摇瓶中，补Wayne 293无血清培养基培养基至20ml，在120rpm，37℃，5％的CO2中培养；
（2）培养48-72小时后，细胞密度达2-3E+6cell/ml，可对细胞进行传代培养；
（3）取出种子细胞至超净工作台，摇匀后吸取约500µl样品，取20ul样品加入20µl台盼蓝混匀，吸取20µl混合液加入细胞计数板，在自动细胞计数仪读取3次数据，取平均值即为细胞密度；
（4）取适量细胞，用新鲜的Wayne 293无血清培养稀释至0.6-0.65E+6cell/ml，置于125ml三角摇瓶中培养，每瓶培养体积为25ml。于振荡CO2细胞培养箱中培养，培养条件为：120rpm，37℃，5％的CO2。
B、细胞转染
（1）将上述细胞培养48h，细胞密度达3-3.8E+6 cell/ml，可对细胞进行转染。每种包装质粒转染1瓶细胞；
（2）每瓶细胞，向1mL DMEM培养基中依次加入包装质粒、pHelper、pAAV-CAG-EGFP--Barcode-hGH 共37.5μg，充分混匀，即为“质粒稀释液”；
（3）另取1mL DMEM培养基，加入112.5μgPEI混匀，即为“PEI稀释液”；
（4）将“PEI稀释液”倒入“质粒稀释液”中，快速混匀，在室温静置25分钟，形成转染复合物；将转染复合物加入边轻轻摇晃边逐滴加入细胞液中；
（5）将培养瓶置于振荡CO2细胞培养箱中培养，培养条件为：120rpm，37℃，5％的CO2。
C、病毒收获
（1）转染后细胞继续培养72小时，开始进行病毒收获；
（2）将各瓶细胞悬液混合收集于离心瓶中，1000g离心5min，收集上清于1个新的离心瓶中，每ml上清中加入0.245mL的50% PEG8000溶液（含0.5mol/L NaCl)，充分混匀，2-8℃静置过夜；
（3）向细胞沉淀中加入适量的0.5%TritonX-100细胞裂解缓冲液（含全能核酸酶），37 ℃处理1-2h，然后加入1/10体积的5mol/L NaCl，充分混匀后4℃、3000g离心15min，收集上清，即为“病毒粗提液”暂存于2-8℃；
（4）将PEG8000浓缩后的上清4℃、3000g离心15min，弃上清，，用步骤（3）中的“病毒粗提液”重悬，备用。
D 、病毒纯化
（1）取一支超速离心管，用不锈钢针在每个超速离心管中从底部依次缓慢加入“病毒粗提液”15 ml，15 %碘克沙醇9 ml，25 %碘克沙醇6 ml，40 %碘克沙醇5 ml和60%碘克沙醇5 ml；配平后用热封仪封口；
（2）超速离心机，340000 ×g（57500 rpm），16℃，离心2h；
（3）用注射器小心抽取超速离心管40%Iodixanol-60%Iodixanol交界液层（即为病毒液）4-5ml，避免吸到白膜层；
（4）取一支超滤管，用4mL PBS缓冲液润洗滤膜，将步3）中的收集的病毒液到入超滤管；
（5）加入适量PBS缓冲液吹打均匀，3000g离心3-5 min，重复此步骤5-7次至去除碘克沙醇；
（6）加入1mL PBS缓冲液吹打40～50下成病毒悬液，转移到EP管中；
（7）用1mL注射器吸取EP管中病毒悬液0.22μm过滤器过滤，收取20μL病毒液做检测样品后，剩余病毒以100μL每管分装，得到AAV-CAG-EGFP-Barcode病毒库。
3、病毒产量检测
A、病毒裂解
（1）取Barcode病毒库样品20μL，分别加入10%SDS、0.5mol/L EDTA、proteinaseK各1μL，混匀；
（2）恒温混匀仪中56℃孵育1小时，然后90℃孵育10min；
（3）取10ul病毒裂解液，10倍梯度稀释至1000倍，即为“病毒稀释液”，备用。
B、 PCR扩增
针对插入的Bacode序列用步骤（1）中的“病毒稀释液”作为DNA模板进行PCR扩增。PCR体系为
（1）PCR扩增引物：
正向引物 5’- GAGTTCGTGACCGCCGCC-3’（SEQ ID NO.21）；
反向引物 5’- TTTATTAGGACAAGGCTGGT-3’ （SEQ ID NO.22）。
（2）PCR扩增体系如表4所示。
（3）PCR扩增条件为
预变性：98℃，3 min；
25×循环：98℃，15s；60℃，20s；72℃，24s。
延伸：72℃，2min。
C、PCR产物胶回收
将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察，切取条带正确的胶块，用胶回收试剂盒进行胶回收。
D、 NGS测序
将胶回收产物寄送至华大基因进行NGS测序。并对测序结果进行分析，分析不同Barcode序列的读数及序列占比，测序结果均做标准化处理（RPM，该样本不受基因长度影响），因每种包装质粒与Barcode表达质粒是一一对应的，故Barcode病毒库中每种Barcode序列RPM值和与之对应的包装质粒的产量成正比。用RPM作为每种突变体病毒的产量性能指标。
对比例1
本对比例提供了一种野生型腺相关病毒（AAV2-WT），与AAV2-突变体按实施例1的方法制备，其区别仅在于腺相关病毒衣壳蛋白的序列采用野生型AAV2衣壳蛋白序列（SEQID NO.1）。
对比例2
本对比例提供了一种已用于临床实验的视网膜靶向能力较强的AAV2腺相关病毒突变体（AAV2/7M8），与AAV2-突变体按实施例1的方法制备，其区别仅在于腺相关病毒衣壳蛋白序列采用突变体AAV2/7M8衣壳蛋白序列（SEQ ID NO.2）。
测试例
NHP全眼感染效果测试
将AAV-CAG-EGFP-Barcode病毒库注射食蟹猴体内，取全眼组织，提取DNA对病毒基因组Barcode区域进行PCR扩增，送测NGS，根据不同Barcode扩增产物的读数来评估病毒对全眼组织的感染性能。
具体操作步骤如下所示：
A、病毒注射
将食蟹猴麻醉后，取出AAV-CAG-EGFP-Barcode病毒库，玻璃体腔注射，每只眼睛注射100µl，每天用典必殊和强的松处理眼睛，及观察眼睛情况。
B、取材
（1）病毒注射3W后，对食蟹猴进行安乐死，摘取眼球，放在冰上预冷的DMEM培养基中；
（2）取1个10cm培养皿，倒入2ml 左右DMEM培养基置于冰上，去除眼周围肌肉和结缔组织；
（3）胰岛素注射器针尖刺戳角膜，维纳斯剪沿着角膜和脉络膜分界处（呈白色）剪开，去除角膜、虹膜和晶状体，剩余组织部分作为全眼组织，平均分为10份。
C、基因组DNA提取、PCR扩增及胶回收
（1）将全眼组织置于匀浆管中，加入锆珠和血液/ 细胞/ 组织基因组DNA 提取试剂盒中的Buffer GA，室温，65Hz，运行30s，停30s 进行匀浆，重复4次；
（2）将组织匀浆液用血液/ 细胞/ 组织基因组DNA 提取试剂盒进行组织基因组DNA提取，超微量紫外分光光度计测量DNA浓度；
（3）将组织DNA稀释至100ng/ml，作为DNA模板进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、胶回收及浓度测定，具体实验操作与病毒产量验证与相同。
D、NGS测序及分析
将扩增产物送华大基因进行NGS测序。对测序结果进行分析，分析不同Barcode序列读数及其占比，占比越高说明其对应的突变体病毒在组织中的占比越高。对测试结果做标准化处理（RPM，该样本不受基因长度影响），排除测序深度对不同样本的影响。之后将Barcode序列在组织中的RPM除以病毒库中的RPM（详见实施例中病毒产量检测）的值作为其对应突变体病毒组织靶向性性能指标。
病毒注射3周后，取材，提取基因组DNA，进行NGS检测，结果如图8所示，AAV2-7M8全眼感染能力为AAV2-WT的4.3倍。所述腺相关突变体全眼感染能力为AAV2-WT的1.1～6.2倍，其中AAV2-EYE-04感染能力最强。
综上所述，本发明方案制备得到的腺相关病毒变体相较野生型能够显著增强AAV2病毒的全眼感染能力。
腺相关病毒变体衣壳蛋白的序列比对结果图如图9所示。所述腺相关病毒变体EYE-01～EYE-07衣壳蛋白的序列相对于野生型AAV2衣壳蛋白的区别在于，其将野生型衣壳蛋白D561至R588的序列（SEQ ID NO.3所示）替换为28至42个氨基酸的多肽序列，其中EYE-01和EYE-03为部分氨基酸的替换，EYE-02、EYE-04、EYE-05、EYE-06、EYE-07为多个氨基酸的插入。
表1、AAV2突变体在Cap2 D561至R588位点被替换氨基酸序列信息
序列名称 序列信息 SEQ ID NO.：
AAV2-WT DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNR 3
AAV2-7M8 DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLALGETTRPAR 4
AAV2-EYE-01 DEHEIKTTNPVATEGYGEVATNWQRGNR 5
AAV2-EYE-02 DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGRSAGLGTGLSR 6
AAV2-EYE-03 DEQEIAATNPVATEQYGSVSTNLQRGNR 7
AAV2-EYE-04 DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGGMVLVSAKSGLSR 8
AAV2-EYE-05 DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGGRILVATTGLSR 9
AAV2-EYE-06 DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGPLLDGTKGLSR 10
AAV2-EYE-07 DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGSSPIKDGTKGLSR 11
表2、pAAV-CAG-EGFP-Barcode-hGH质粒Barcode核酸序列
序列名称 Barcode序列信息 SEQ ID NO.：
Barcode41 GAGCGTAATTGTGAG 12
Barcode42 GTCGACTTCATGGCA 13
Barcode43 GGGCCCTAGCGCGTG 14
Barcode44 CGTGACCCAGGAAGT 15
Barcode45 GACTTTGACATGTCA 16
Barcode46 GTCCCGACTAGGACT 17
Barcode47 GGCCACCGTGTGTGA 18
Barcode48 TTGGACTCACAGATG 19
Barcode49 CAATCCGGCGCGGGT 20
表3 包装质粒与表达质粒对应关系
实验组 包装质粒 表达质粒
1 AAV2-WT pAAV-CAG-EGFP-Barcode41
2 AAV2-7M8 pAAV-CAG-EGFP-Barcode42
3 AAV2-EYE-01 pAAV-CAG-EGFP-Barcode43
4 AAV2-EYE-02 pAAV-CAG-EGFP-Barcode44
5 AAV2-EYE-03 pAAV-CAG-EGFP-Barcode45
6 AAV2-EYE-04 pAAV-CAG-EGFP-Barcode46
7 AAV2-EYE-05 pAAV-CAG-EGFP-Barcode47
8 AAV2-EYE-06 pAAV-CAG-EGFP-Barcode48
9 AAV2-EYE-07 pAAV-CAG-EGFP-Barcode49
10 AAV2-EYE-08 pAAV-CAG-EGFP-Barcode50
11 AAV2-EYE-09 pAAV-CAG-EGFP-Barcode51
12 AAV2-EYE-10 pAAV-CAG-EGFP-Barcode52
表4、PCR扩增体系
试剂名称 加入体积
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 25ul
10 µM 正向引物（SEQ ID NO.21） 2.5ul
10 µM 反向引物（SEQ ID NO.22） 2.5ul
模板DNA 10µl
无核酸水 加至50ul
相关Cap2蛋白序列：
野生型腺相关病毒衣壳蛋白Cap2：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(Genbank ID：YP_680426.1) (SEQ ID NO.1)。
腺相关病毒变体7M8衣壳蛋白Cap2：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVTTTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLALGETTRPARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSINVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ IDNO.2)。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.可提高AAV病毒全眼感染能力的衣壳蛋白突变体，其特征在于，使用如下多肽中的一条替代野生型AAV病毒衣壳蛋白的561至588位氨基酸得到：
1）DEHEIKTTNPVATEGYGEVATNWQRGNR
2）DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGRSAGLGTGLSR
3）DEQEIAATNPVATEQYGSVSTNLQRGNR
4）DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGGMVLVSAKSGLSR
5）DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGGRILVATTGLSR
6）DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGPLLDGTKGLSR
7）DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNTGSSPIKDGTKGLSR。
2.根据权利要求1所述的衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述野生型AAV2病毒衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。
3.一种基因，编码权利要求1或2所述的衣壳蛋白突变体。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，根据表达体系进行密码子优化。
5.一种表达体系，其插入有权利要求3或4所述的基因。
6.根据权利要求5所述的表达体系，其特征在于，所述表达体系为重组AAV载体。
7.根据权利要求6所述的表达体系，其特征在于，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10及其变体的任意一种。
8.一种组合物，其特征在于，包括权利要求5～7任一项所述的表达体系。
9.权利要求8所述组合物在制备基因治疗制剂或转基因制剂中的应用。
10.一种转基因动物模型的构建方法，包括向动物体内导入权利要求8所述的组合物。
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