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CN117137871A - 一种肿瘤转移相关七肽cgwtpvi新剂型的制备方法 - Google Patents

一种肿瘤转移相关七肽cgwtpvi新剂型的制备方法 Download PDF

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CN117137871A
CN117137871A CN202311037084.1A CN202311037084A CN117137871A CN 117137871 A CN117137871 A CN 117137871A CN 202311037084 A CN202311037084 A CN 202311037084A CN 117137871 A CN117137871 A CN 117137871A
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tumor metastasis
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李一雷
邢子毅
邵晶
倪福顺
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Jilin University
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Jilin University
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Abstract

本发明涉及一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，包括采用逆向蒸发法合成七肽CGWTPVI脂质体及性能验证。本发明制备方法，进入胞内的合成七肽CGWTPVI与线粒体ATP5B结合而不与细胞膜ATP5B结合，从而特异性封闭线粒体ATP5B，且不干扰原有ATP5B的合成，进而抑制细胞膜ATP5B的异位表达能力；揭示了肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型抑制肿瘤细胞迁移侵袭的功能机制；合成多肽被用作为包裹药物，可用叶酸、转铁蛋白或是Cav‑1抗体作为表面修饰配体，提高其后期动物实验的主动靶向性；肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型作为特异性靶向分子对前列腺癌的治疗提供有力的技术支持。

Description

一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法。
背景技术
前列腺癌是一种危害男性健康的严重癌症，其在早期阶段可以选择的治疗方式主要为手术和放射治疗方法。但当前列腺癌进展到晚期阶段发生转移以后，需要系统性的治疗来改善患者的生存。相关治疗方案包括化疗法、激素疗法、免疫治疗剂和骨质调节剂法，但也存在诸多弊端。
其中，化疗法中的联合用药法虽降低了肿瘤负担和死亡率，但其也会引发盐皮质激素毒性，包括高血压、低钾血症和水肿并伴有肝脏功能异常。有时还会导致暴发性肝炎和急性肝硬化、心血管疾病、骨折、代谢功能障碍和认知功能受损的发生。化学治疗方法中常用药物紫杉类药物，具有常见不良反应如下：包括发热性中性粒细胞减少症、腹泻、血液相关感染以及尿血增多。而免疫治疗法也可引起寒战、发热和头痛。
ATP5B通常表达于线粒体内膜，在某些细胞中可以异位表达于细胞膜，其功能和异位途经尚不明确。肿瘤细胞的转移能力与细胞膜上ATP5B的多寡具有很强的正相关性。同时，特异性抑制细胞膜表面的ATP5B蛋白可以影响肿瘤细胞的转移能力。通过噬菌体展示技术已获得与人高转移前列腺癌细胞系PC-3M特异性结合的七肽CGWTPVI，继而反向钓取筛选获得PC-3M细胞膜上与七肽CGWTPVI特异性结合的目标蛋白ATP5B。而七肽CGWTPVI能够抑制PC3M细胞的铺展、迁移和侵袭能力。
但与高转移前列腺癌细胞膜表面ATP5B特异性结合的七肽CGWTPVI为噬菌体表面外壳蛋白上随机生成，其载体M13噬菌体由于其性质，无法进入细胞内，且由于其体积过大，不适于被包裹进脂质体，无法对其抑制肿瘤细胞迁移侵袭机制进行进一步的研究。目前，还无相关生物技术攻克这一难题。
基于此，制备一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型是十分有必要的，其能够对研究七肽CGWTPVI抑制肿瘤细胞迁移侵袭机制提供关键性的技术支持，并为肿瘤转移治疗开辟了新途径。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，以解决制备出能够进入肿瘤细胞的肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型，为前列腺癌的精准治疗提供依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，包括以下步骤：
A、采用逆向蒸发法合成七肽CGWTPVI脂质体
A1、将卵磷脂和胆固醇溶解到有机相中，再将七肽CGWTPVI溶解到水相中；
A2、将水相和油相混合，超声一段时间使油水两相混合成乳白色乳液；
A3、将步骤A2所制乳液放置于旋转蒸发仪中进行减压旋蒸，直至移除全部有机相；
A4、加入4mL 10％的PBS溶液，继续旋转水化，再进行水浴超声10min；
A5、取出制备液体，高压过滤，过220nmPES滤膜5次，随后过80nmPES滤膜5次，收集备用；
B、七肽CGWTPVI脂质体性能验证
B1、HPLC建立七肽CGWTPVI标准曲线
B11、将七肽CGWTPVI标准品溶解于水溶液中，制备成终浓度为2mg/mL的七肽CGWTPVI水溶液备用；
B12、将2mg/mL七肽CGWTPVI水溶液制备浓度为0ug/mL，12.5ug/mL，25ug/mL，50ug/mL，100ug/mL，200ug/mL及400ug/mL的梯度七肽CGWTPVI溶液样品，放入高效液相色谱仪HPLC中进样检测；
B13、以七肽CGWTPVI检测峰面积以及七肽CGWTPVI浓度做线性回归方程，制作标准曲线；
B2、HPLC检测七肽CGWTPVI脂质体包封率
B21、取制备好的七肽CGWTPVI脂质体溶液两份，一份加入Triton X-100溶液破乳混匀，另一份采用超高速低温离心机，在12000r/min的转速下离心1h，提取上清；
B22、两份样品送入HPLC中检测
B23、根据HPLC所检测出来的峰面积，带入七肽CGWTPVI标准曲线方程中计算游离七肽CGWTPVI浓度以及溶液中总七肽CGWTPVI的浓度，对包封率进行计算。
进一步地，步骤A1，所述卵磷脂、胆固醇溶和七肽CGWTPVI的质量比为20:5:1。
进一步地，步骤A1，所述有机相为氯仿，水相为水溶液，水相与有机相的体积比为4:1。
进一步地，步骤A2，使用超声探头超声5min。
进一步地，步骤A3，减压旋蒸的压力0.6mpa，温度为40℃，旋转速度为130r/min。
进一步地，步骤A4，加入PBS溶液与步骤A1中水相的体积比为1:10。
进一步地，步骤A4，旋转水化的时间为1h，温度为40℃，旋转速度为130r/min，水浴超声的时间为10min。
进一步地，步骤B12，HPLC条件如下：柱温：35℃，流速：1.0ml/min，上样量：20ul，柱子：C-18，检测器：DAD，检测波长：220nm，流动相A：乙腈，流动相B：超纯水。
进一步地，步骤B22，检测条件如下：柱温：35℃，流速：1.0ml/min，上样量：20ul，柱子：C-18，检测器：DAD，检测波长：220nm，流动相A：乙腈，流动相B：超纯水。
进一步地，步骤B23，包封率计算公式为：
包封率(％)＝载入脂质体中七肽CGWTPVI浓度/七肽CGWTPVI总浓度×100％
＝(七肽CGWTPVI总浓度-游离七肽CGWTPVI总浓度)/七肽CGWTPVI总浓度×100％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明人工合成与噬菌体表面表达七肽CGWTPVI具备相同的封闭抑制功能短肽单链，可用作为包裹药物进入胞内成为肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型即七肽CGWTPVI脂质体，攻克了噬菌体表面表达七肽CGWTPVI无法进入细胞内的难题；进入胞内的合成七肽CGWTPVI与线粒体ATP5B结合而不与细胞膜ATP5B结合，从而特异性封闭线粒体ATP5B，且不干扰原有ATP5B的合成，进而抑制细胞膜ATP5B的异位表达能力；本发明揭示了肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型抑制肿瘤细胞迁移侵袭的功能机制；本发明合成多肽被用作为包裹药物，可用叶酸、转铁蛋白或是Cav-1抗体作为表面修饰配体，来提高其后期动物实验的主动靶向性；肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型作为特异性靶向分子应用于前列腺癌的治疗提供有力的技术支持。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
研究发现，与高转移前列腺癌细胞膜表面ATP5B特异性结合的七肽CGWTPVI，该短肽为噬菌体表面外壳蛋白上随机生成，其载体M13噬菌体由于其性质，无法进入细胞内，且由于其体积过大，不适于被包裹进脂质体，无法制成肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型。因此，无法探究其抑制肿瘤细胞迁移侵袭机制，进而为精准治疗提供依据。基于此，制备出一种能够进入肿瘤细胞的肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型是目前亟待解决的问题。
脂质体是一种通过磷脂双分子膜将药物包裹在其中的一种药物载体，其在临床上被认为是多种疾病，特别是癌症等多种疾病通用的药物传递系统。目前，将药物掺入各种纳米级的生物相容性脂质中制备成的脂质纳米载体已成为一种药物传递途径。在脂质体上加入聚乙二醇(PEG)涂层可以避其在免循环中被快速清除。通过使用各种配体修饰立体稳定的脂质体，可以实现主动靶向，降低毒副作用。在不同类型的靶向配体中，多肽是日益关注的目标，部分原因是其易于合成和高通量筛选。肽配体通过占据相应受体的大界面而表现出高的效价和特异性。
本发明首先人工合成与噬菌体表面表达七肽CGWTPVI具备相同的封闭抑制功能短肽单链，这一短肽可被包裹进脂质体，成为肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型；再采用逆向蒸发法制备七肽CGWTPVI脂质体，HPLC建立七肽CGWTPVI标准曲线，HPLC检测脂质体包封率，成功制备了七肽CGWTPVI脂质体，作为肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型。
实施例1
一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，包括以下步骤：
1、采用逆向蒸发法合成七肽CGWTPVI脂质体
11、称取40mg卵磷脂和10mg胆固醇溶解到10mL氯仿中，之后将2mg七肽CGWTPVI溶解到40mL水溶液中；
12、将水相和油相混合，使用超声探头超声5min，使油水两相混合成乳白色乳液；
13、将乳液倒入100mL球形瓶中，放置到旋转蒸发仪中进行减压旋蒸(0.6mpa，40℃，130r/min)，直至移除全部有机相；
14、随后加入4mL 10％的PBS溶液，继续旋转水化(1h，40℃，130r/min)，取出球形瓶，进行水浴超声10min；
15、取出制备液体，高压过滤，过220nmPES滤膜5次，随后过80nmPES滤膜5次，收集备用。
2、验证七肽CGWTPVI脂质体性能
21、HPLC建立七肽CGWTPVI标准曲线
211、称取2mg七肽CGWTPVI标准品，溶解于1mL水溶液中，制备成终浓度为2mg/mL的七肽CGWTPVI水溶液备用。
212、将2mg/mL七肽CGWTPVI水溶液制备浓度为0ug/mL，12.5ug/mL，25ug/mL，50ug/mL，100ug/mL，200ug/mL及400ug/mL的梯度七肽CGWTPVI溶液样品，放入高效液相色谱仪HPLC中进样检测。
HPLC条件如下：
柱温：35℃，流速：1.0ml/min，上样量：20ul，柱子：C-18，检测器：DAD，检测波长：220nm，流动相A：乙腈，流动相B：超纯水。
表1梯度洗脱条件
213、以七肽CGWTPVI检测峰面积以及七肽CGWTPVI浓度做线性回归方程，制作标准曲线。
22、HPLC检测七肽CGWTPVI脂质体包封率
221、取制备好的七肽CGWTPVI脂质体溶液两份，一份加入Triton X-100溶液破乳混匀，另一份采用超高速低温离心机，在12000r/min的转速下离心1h，提取上清。
222、两份样品送入HPLC中检测，条件如下：
柱温：35℃，流速：1.0ml/min，上样量：20ul，柱子：C-18，检测器：DAD，检测波长：220nm，流动相A：乙腈，流动相B：超纯水。
表2梯度洗脱条件
223、根据HPLC所检测出来的峰面积，带入七肽CGWTPVI标准曲线方程中计算游离七肽CGWTPVI浓度以及溶液中总七肽CGWTPVI的浓度，并对包封率进行计算，包封率计算公式为：
包封率(％)＝载入脂质体中七肽CGWTPVI浓度/七肽CGWTPVI总浓度×100％
＝(七肽CGWTPVI总浓度-游离七肽CGWTPVI总浓度)/七肽CGWTPVI总浓度×100％。
以上为本实施例全部内容，可有效制备肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型。采用逆向蒸发法制备七肽CGWTPVI脂质体后，HPLC建立七肽CGWTPVI标准曲线，HPLC检测脂质体包封率，从而成功制备了七肽CGWTPVI脂质体，作为肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型
注意，本发明人工合成与噬菌体表面表达七肽CGWTPVI具备相同的封闭抑制功能短肽单链，可作为包裹药物进入胞内成为肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型即七肽CGWTPVI脂质体，攻克了噬菌体表面表达七肽CGWTPVI无法进入细胞内的难题；进入胞内的合成七肽CGWTPVI与线粒体ATP5B结合而不与细胞膜ATP5B结合，从而特异性封闭线粒体ATP5B，且不干扰原有ATP5B的合成，进而抑制细胞膜ATP5B的异位表达能力；本发明揭示了肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型抑制肿瘤细胞迁移侵袭的功能机制。通过该实施例已对上述有益效果提供了充分的数据支持。
上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims (10)

1.一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、采用逆向蒸发法合成七肽CGWTPVI脂质体
A1、将卵磷脂和胆固醇溶解到有机相中，再将七肽CGWTPVI溶解到水相中；
A2、将水相和油相混合，超声一段时间使油水两相混合成乳白色乳液；
A3、将步骤A2所制乳液放置于旋转蒸发仪中进行减压旋蒸，直至移除全部有机相；
A4、加入4mL 10％的PBS溶液，继续旋转水化，再进行水浴超声10min；
A5、取出制备液体，高压过滤，过220nmPES滤膜5次，随后过80nmPES滤膜5次，收集备用；
B、七肽CGWTPVI脂质体性能验证
B1、HPLC建立七肽CGWTPVI标准曲线
B11、将七肽CGWTPVI标准品溶解于水溶液中，制备成终浓度为2mg/mL的七肽CGWTPVI水溶液备用；
B12、将2mg/mL七肽CGWTPVI水溶液制备浓度为0ug/mL，12.5ug/mL，25ug/mL，50ug/mL，100ug/mL，200ug/mL及400ug/mL的梯度七肽CGWTPVI溶液样品，放入高效液相色谱仪HPLC中进样检测；
B13、以七肽CGWTPVI检测峰面积以及七肽CGWTPVI浓度做线性回归方程，制作标准曲线；
B2、HPLC检测七肽CGWTPVI脂质体包封率
B21、取制备好的七肽CGWTPVI脂质体溶液两份，一份加入Triton X-100溶液破乳混匀，另一份采用超高速低温离心机，在12000r/min的转速下离心1h，提取上清；
B22、两份样品送入HPLC中检测
B23、根据HPLC所检测出来的峰面积，带入七肽CGWTPVI标准曲线方程中计算游离七肽CGWTPVI浓度以及溶液中总七肽CGWTPVI的浓度，对包封率进行计算。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，其特征在于：步骤A1，所述卵磷脂、胆固醇溶和七肽CGWTPVI的质量比为20:5:1。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，其特征在于：步骤A1，所述有机相为氯仿，水相为水溶液，水相与有机相的体积比为4:1。
4.根据权利要求1所述的一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，其特征在于：步骤A2，使用超声探头超声5min。
5.根据权利要求1所述的一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，其特征在于：步骤A3，减压旋蒸的压力0.6mpa，温度为40℃，旋转速度为130r/min。
6.根据权利要求1所述的一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，其特征在于：步骤A4，加入PBS溶液与步骤A1中水相的体积比为1:10。
7.根据权利要求1所述的一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，其特征在于：步骤A4，旋转水化的时间为1h，温度为40℃，旋转速度为130r/min，水浴超声的时间为10min。
8.根据权利要求1所述的一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，其特征在于：步骤B12，HPLC条件如下：柱温：35℃，流速：1.0ml/min，上样量：20ul，柱子：C-18，检测器：DAD，检测波长：220nm，流动相A：乙腈，流动相B：超纯水。
9.根据权利要求1所述的一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，其特征在于：步骤B22，检测条件如下：柱温：35℃，流速：1.0ml/min，上样量：20ul，柱子：C-18，检测器：DAD，检测波长：220nm，流动相A：乙腈，流动相B：超纯水。
10.根据权利要求1所述的一种肿瘤转移相关七肽CGWTPVI新剂型的制备方法，其特征在于：步骤B23，包封率计算公式为：
包封率(％)＝载入脂质体中七肽CGWTPVI浓度/七肽CGWTPVI总浓度×100％
＝(七肽CGWTPVI总浓度-游离七肽CGWTPVI总浓度)/七肽CGWTPVI总浓度×100％。
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