CN117126904A - 一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法。本发明属于生物技术领域，所要解决的技术问题是提高发酵鼠李糖脂的合成产率和底物转化率。本发明公开的循环持续发酵鼠李糖脂的方法包括将产鼠李糖脂的微生物在发酵培养基中进行发酵培养、发酵过程中控制碳氮比、在一定条件下取出部分发酵液等步骤。采用本发明的方法，鼠李糖脂的合成产率达到86 g/L以上，底物转化率达到68%，并且可以实现鼠李糖脂的不间断生产。

Description

一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法。

背景技术

鼠李糖脂是目前应用最为广泛的一种高效阴离子生物表面活性剂，具有乳化、起泡、抗菌、抗病毒和抗支原体等多种功能，目前主要应用于精细化工、石油开采、环境保护、土壤修复等领域。

鼠李糖脂的制备主要采用微生物发酵法，该法存在下列优点：a.利用微生物的代谢过程能够生成结构复杂的目标分子，其他方法来合成较为困难，此外，还可通过基因工程手段修饰或改变微生物的生物转化途径，从而改造复杂的分子结构，使其性能更优越。b.原料来源广泛，产物可完全降解，发酵液对人体无毒，对环境危害小。c.发酵生产工艺简单，成本低廉，安全经济，具有良好的工业价值。当然，该法也存在缺点，如发酵液中产物浓度较低，产物被分泌到胞外，使得产物分离和纯化较为麻烦。

鼠李糖脂产品属于环保类产品，与传统化学类表面活性剂产品相比具有产品稳定性好、适用范围广、绿色环保、可生物降解、不会带来二次污染等优点。

鼠李糖脂是由一个或两个鼠李糖分子与一个或两个不同链长的3-羟基脂肪酸通过β-糖苷键连接而成的一种化学结构不均一的次生代谢产物，其中鼠李糖构成其亲水基团，脂肪酸构成其疏水基团。常见的鼠李糖脂都是一种混合物，除特定实验用途外，一般的产品中都包含多种同族化合物。目前有统计显示，已经报道的鼠李糖脂结构多达28种，各种同系物之间的差异主要来自于糖基部分与糖苷配基部分修饰的差异。大体上可以分为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。鼠李糖脂产物的具体结构受到菌种、碳源种类、碳氮比以及发酵温度等相关参数的影响。在大规模的工业发酵过程中，产物中常见的鼠李糖脂结构有四种，分别是双糖双脂结构RL1，单糖双脂结构RL2，双糖单脂结构RL3，单糖单脂结构RL4。

发酵鼠李糖脂的产量不仅受氮源种类的影响，也显著地受C/N比例的影响，营养条件会显著影响相关基因的表达进而影响鼠李糖脂的生物合成。许多研究结果显示疏水性碳源较亲水性碳源而言，有利于获得高产量的鼠李糖脂。若发酵工艺设计不合理，鼠李糖脂产率会低，且存在发酵过程中由于鼠李糖脂的产生导致发酵液中泡沫增多，发酵过程中通风量小，菌种供氧量不足，影响发酵过程中的菌种代谢速度等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提高发酵鼠李糖脂的合成产率和底物转化率。

为此，本发明提供一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法，包括如下步骤：

(1)将产鼠李糖脂的微生物在发酵培养基中进行发酵培养；

(2)发酵24-28 h时，流加碳源和氮源；开始流加碳源和氮源后至发酵48-52 h过程中控制碳氮比为200-400:1；之后，控制碳氮比为80-100:1；碳源流速固定为每分钟流加初始发酵体积的0.02-0.04%，根据碳氮比调节氮源流速；

(3)当发酵液体积达到初始发酵体积的150%-200%并且鼠李糖脂合成产率大于80g/L时，取出1/3-2/3体积的发酵液，发酵罐中的发酵继续进行；将取出的发酵液进行固液分离，得到发酵液上清和菌体沉淀；将所述发酵液上清用于提取鼠李糖脂；将所述菌体沉淀经过破菌处理后制成菌体补料；

(4) 在步骤(3)取出发酵液4-6 h后，流加所述菌体补料，流速为每分钟流加初始发酵体积的0.01-0.03%；

(5) 继续发酵培养，重复步骤(3)-(4)至少一次；

该循环持续发酵鼠李糖脂的方法可以持续至少1248 h。

在一些实施方案中，上述方法中，所述发酵培养基的组成为：甘油 2-3%、NaNO₃0.5-2%、KH₂PO₄0.05-0.1%、Na₂HPO₄·12H₂O 0.05-0.1%、MgSO₄·7H₂O 0.01-0.1%、CaCl₂·2H₂O 0.5-0.8%、FeSO₄0.01%-0.1%、CoCl₂0.01%-0.1%，余量为水。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述发酵培养的初始pH 为6.8-7.4，例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4，或这些数值任意二者之间的范围或数值。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述发酵培养的初始OD₆₀₀为0.8-4，例如2-3，再例如2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0，或这些数值任意二者之间的范围或数值。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述发酵培养的发酵温度为25-40℃，例如35-37℃；初始搅拌150-200 rpm、初始通气0.2-0.6 vvm，发酵过程中随着溶氧的下降逐渐提高转速和通气量，保证溶氧＞20%。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，步骤(2)中流加的所述碳源为含有10-30 g/100ml的甘油和10-30 g/100ml的丙烯-1,2-二醇的水溶液，优选其中甘油与丙烯-1,2-二醇的质量比为1:1。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，步骤(2)中流加的所述氮源为经过除菌过滤的含有1-5 g/100ml 的NaNO₃和0.1-1 g/100ml的谷氨酸的水溶液。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述提取鼠李糖脂包括如下步骤：将所述发酵液上清的pH调节至1.5-2.4（例如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4，或这些数值任意二者之间的范围或数值），鼠李糖脂在酸性条件下溶解度很低，会以沉淀的方式伴随杂质一起沉淀出来，静置得到沉淀；在沉淀中加入1/5-1/10体积的乙酸乙酯萃取，得到下层萃取液；将下层萃取液在80-85℃下蒸馏出乙酸乙酯，得到红色的含有鼠李糖脂及杂质的糊状物；再在该糊状物中加入1/5-1/10体积的乙酸乙酯萃取2-3次，得到下层萃取液，再置于80-85℃下蒸馏出乙酸乙酯，即得到鼠李糖脂纯品，其纯度达到92%以上。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述破菌处理包括如下步骤：在所述菌体沉淀中加入溶菌酶进行酶解，再进行低温（2-8℃）高压破菌，在破菌后的均质液中加水配成20-50 g/100ml的菌体补料，灭菌（例如121℃、30分钟灭菌）。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，在步骤(1)之前还进行了种子培养步骤；

所述种子培养时的种子培养基组成为：葡萄糖1-3%、NaNO₃0.5-3%、酵母膏0.5-2%、胰蛋白胨1-3%，余量为水，pH 7-7.4。

在一些实施方案中，上述方法中，所述种子培养包括两级种子培养步骤；

一级种子培养的条件为25-40℃、150-220 rpm培养26-30 h；例如33℃、180 rpm培养28 h；

二级种子培养的条件为25-40℃、200-250 rpm培养30-38 h；例如32℃、220 rpm培养35 h。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述产鼠李糖脂的微生物是假单胞菌微生物，优选铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putica)中的一种或多种。

本发明具有以下优势：

1、本发明发酵培养基中的微量元素钴与亚铁离子能促进合成鼠李糖脂；

2、本发明流加的碳源为甘油和丙烯-1,2-二醇，甘油与丙烯-1,2-二醇1:1组合是合成鼠李糖脂的前体物质，该碳源组合使鼠李糖脂合成更快；

3、本发明流加的氮源为NaNO₃和谷氨酸，硝酸盐氮比氨态氮更能促进鼠李糖脂的产生，谷氨酸有利于菌体合成鼠李糖脂；

4、根据菌体生长不同时期的碳氮比需求不同，本发明在发酵前期控制碳氮比为200-400:1，有利于菌体快速生长；后期控制碳氮比为80-100:1，更有利于菌体合成鼠李糖脂；

5、发酵液上清的处理：三次乙酸乙酯萃取，大幅度提高收率和纯度；

6、本发明对发酵液的菌体沉淀进行了循环利用，通过酶解加低温高压破菌，使菌体内部未分泌出的鼠李糖脂释放出来，提高鼠李糖脂产量，且分离的菌体可以继续作为营养成分使用，极大地缩短了发酵周期，且减少了废弃物的产生，具有竞争性的成本优势；

7、采用本发明的工艺，鼠李糖脂的合成产率为86 g/L以上，底物转化率达到68%，且能持续保持该生产速度，可以实现鼠李糖脂不间断生产，可以至少放补9次，发酵1248 h以上，本发明的方法有效缓解有害代谢产物的积累，同时补加的菌体裂解物和补料正好契合菌体生长；

8、本发明不需要频繁配置培养基灭菌，不需要有复杂的过程调控，且发酵过程泡沫较少。

传统发酵方法生产鼠李糖脂的过程中，都是单批次逐批生产，发酵开始准备培养基，发酵过程消泡调控，后期分离菌液提取鼠李糖脂，该生产过程生产周期长，步骤重复繁琐，过程控制困难，菌渣被浪费，且效率低下。本发明的循环持续发酵鼠李糖脂的方法，通过优化培养基组成促进菌体快速成长、改善过程调控策略以减少泡沫产生，当发酵体积达到合适范围且鼠李糖脂合成速率最大时，按照比例进行放料，将放出发酵液分离上清用于提取鼠李糖脂，沉淀菌体经过处理后进行补料继续循环使用，使得菌体内部积累未分泌出的初级代谢产物鼠李糖脂重新返回到发酵液中。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域常规操作，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

鼠李糖脂的浓度检测：采用蒽酮-硫酸法测定鼠李糖脂含量，其中鼠李糖脂的含量以测得的鼠李糖含量乘以系数3.4计算得到。

底物转化率(%)计算方法：

发酵液中鼠李糖脂浓度(g/L)乘以发酵液总体积(L)，得到发酵液中鼠李糖脂总量(g)，除以基础培养基和当前时间补进的补料培养基中所有碳源的质量(g)，即得到底物转化率(%)。

种子培养基：葡萄糖2.5%、NaNO₃0.5%、酵母膏1%、胰蛋白胨2%，余量为水，pH 7.2，121℃灭菌20分钟。

发酵培养基：甘油 2%、NaNO₃0.5%、KH₂PO₄0.05%、Na₂HPO₄·12H₂O 0.05%、MgSO₄·7H₂O 0.01%、CaCl₂·2H₂O 0.5%、FeSO₄0.01%、CoCl₂0.01%，余量为水，在不添加FeSO₄和CoCl₂的情况下将培养基121℃灭菌20分钟，然后待灭菌后的培养基冷却后，将一定量的0.25 μm滤膜除菌过滤后的FeSO₄和CoCl₂加入培养基中。

种子培养基和发酵培养基中的“%”表示“g/100ml”。

实施例1：循环持续发酵鼠李糖脂

1、将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号：CICC 10351）接种到200 ml种子培养基中，33℃、180 rpm培养28 h，得到一级种子液。

2、将一级种子液按照10%（体积比）的接种量接种到2000 ml种子培养基中，32℃、220 rpm培养35 h，得到二级种子液。

3、将二级种子液按照10%（体积比）的接种量接种到装有20 L发酵培养基的50 L发酵罐内，需要时用盐酸或氢氧化钠调节初始pH为7.1，初始OD₆₀₀为2.1，在35℃进行发酵培养，初始转速为200 rpm，通气量为0.2 vvm，并随着溶氧的下降逐渐提高转速和通气量，保证溶氧＞20%。

4、发酵24 h时（即，刚开始进入稳定期时），流加组分①（碳源）和组分②（氮源），其中碳源为含有30 g/100ml的甘油和30 g/100ml的丙烯-1,2-二醇的水溶液，氮源为经过除菌过滤的含有5 g/100ml的NaNO₃和1 g/100ml的谷氨酸的水溶液；发酵24 h-52 h过程中控制碳氮比为200:1，以有利于菌体快速生长；发酵52 h后，控制碳氮比为80:1，以更有利于菌体合成鼠李糖脂，发酵过程中通过控制碳源和氮源的流加速度来调控碳氮比，碳源流速固定为4 ml/min，根据碳氮比调节氮源流速。

5、发酵168 h时，发酵液体积为40 L（达到初始发酵培养基体积的200%）时鼠李糖脂合成产率（即，发酵液中的鼠李糖脂浓度）为86.7 g/L，取出16 L体积的发酵液，发酵罐中的发酵继续进行。

将取出的发酵液于10℃、10000 rpm 离心20 分钟，得到发酵液上清和菌体沉淀，分别进行如下处理：

将发酵液上清的pH用盐酸调至2.2，静置得到沉淀；在沉淀中加入1/5体积的乙酸乙酯萃取，得到下层萃取液；再将下层萃取液置于85℃下蒸馏出乙酸乙酯，得到红色的含有鼠李糖脂及杂质的糊状物；在该糊状物中加入1/10体积的乙酸乙酯进行第一次萃取，得到第一下层萃取液，再在第一下层萃取液中加入1/10体积的乙酸乙酯进行第二次萃取，得到第二下层萃取液，再在第二下层萃取液中加入1/10体积的乙酸乙酯进行第三次萃取，得到第三下层萃取液，共进行三次乙酸乙酯萃取，将最终得到的下层萃取液（即，第三下层萃取液）再置于85℃下蒸馏20 h，即得到鼠李糖脂纯品，其纯度达到92.7%。

在菌体沉淀中加入等体积的浓度为1 mg/ml的溶菌酶，37℃下进行酶解处理2 h（破坏细胞壁，有助于后续破菌），再在2-8℃经过高压均质机破菌2-3遍；将破菌后的均质液用水配制为20 g/100ml的溶液，经过121℃灭菌30 分钟作为组分③。

6、在步骤5取出部分发酵液4 h后开始流加组分③，流加速度为4 ml/min。

7、继续发酵培养，重复步骤5-6至少一次，实现鼠李糖脂不间断生产。

本实施例在发酵1248 h（经过9次部分取出和9次组分③循环补料，最终发酵液体积达到发酵罐总容积的80%时），放出发酵罐中所有的发酵液。

本实施例中，步骤5发酵液的取出时间点、取出的发酵液的体积、以取出的发酵液为样品计算得到的鼠李糖脂的合成产率、取出的发酵液经乙酸乙酯萃取后得到的鼠李糖脂的纯度见表1。

鼠李糖脂的合成产率达到86 g/L以上，第一次取出时底物转化率达到68%，发酵过程无泡沫产生，且能持续保持该生产速度，可以实现鼠李糖脂不间断生产。

表1

实施例2：循环持续发酵鼠李糖脂

1、将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CICC 10351接种到200 ml种子培养基中，33℃、180 rpm培养28 h，得到一级种子液。

2、将一级种子液按照10%（体积比）的接种量接种到2000 ml种子培养基中，32℃、220 rpm培养35 h，得到二级种子液。

3、将二级种子液按照10%（体积比）的接种量接种到装有20 L发酵培养基的50 L发酵罐内，需要时用盐酸或氢氧化钠调节初始pH为7.1，初始OD₆₀₀为2.3，在35℃进行发酵培养，初始转速为170 rpm，通气量为0.6 vvm，并随着溶氧的下降逐渐提高转速和通气量，保证溶氧＞20%。

4、发酵26 h时（即，刚开始进入稳定期时），流加组分①（碳源）和组分②（氮源），其中碳源和氮源与实施例1中相同；发酵26 h-52 h过程中控制碳氮比为300:1，以有利于菌体快速生长；发酵52 h后，控制碳氮比为90:1，以更有利于菌体合成鼠李糖脂，发酵过程中通过控制碳源和氮源的流加速度来调控碳氮比，碳源流速固定为6 ml/min，根据碳氮比调节氮源流速。

5、发酵168 h时，发酵液体积为40 L（达到初始发酵培养基体积的200%）时鼠李糖脂合成产率为86.7 g/L，取出14 L体积的发酵液，发酵罐中的发酵继续进行。

将取出的发酵液于10℃、10000 rpm 离心20 分钟，得到发酵液上清和菌体沉淀，分别进行如下处理：

将发酵液上清的pH用盐酸调至2.2，静置得到沉淀；在沉淀中加入1/5体积的乙酸乙酯萃取沉淀，得到下层萃取液；再将下层萃取液置于85℃下蒸馏出乙酸乙酯，得到红色的含有鼠李糖脂及杂质的糊状物；在该糊状物中加入1/10体积的乙酸乙酯进行第一次萃取，得到第一下层萃取液，再在第一下层萃取液中加入1/10体积的乙酸乙酯进行第二次萃取，得到第二下层萃取液，再在第二下层萃取液中加入1/10体积的乙酸乙酯进行第三次萃取，得到第三下层萃取液，共进行三次乙酸乙酯萃取，将最终得到的下层萃取液（即，第三下层萃取液）再置于85℃下蒸馏20 h，即得到鼠李糖脂纯品，其纯度达到92.7%。

在菌体沉淀中加入等体积的浓度为1 mg/ml的溶菌酶，37℃下进行酶解处理2 h（破坏细胞壁，有助于后续破菌），再在2-8℃经过高压均质机破菌2-3遍；将破菌后的均质液用水配制为20 g/100ml的溶液，经过121℃灭菌30 分钟作为组分③。

6、在步骤5取出部分发酵液4 h后开始流加组分③，流加速度为4 ml/min。

7、继续发酵培养，重复步骤5-6至少一次，实现鼠李糖脂不间断生产。

本实施例在发酵1248 h（经过9次部分取出和9次组分③循环补料，最终发酵液体积达到发酵罐总容积的80%时），放出发酵罐中所有的发酵液。

本实施例中，步骤5发酵液的取出时间点、取出的发酵液的体积、以取出的发酵液为样品计算得到的鼠李糖脂的合成产率、取出的发酵液经乙酸乙酯萃取后得到的鼠李糖脂的纯度见表2。

鼠李糖脂的合成产率达到86 g/L以上，第一次取出时底物转化率达到68%，发酵过程无泡沫产生，且能持续保持该生产速度，可以实现鼠李糖脂不间断生产。

表2

实施例3：循环持续发酵鼠李糖脂

1、将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CICC 10351接种到200 ml种子培养基中，33℃、180 rpm培养28 h，得到一级种子液。

2、将一级种子液按照10%（体积比）的接种量接种到2000 ml种子培养基中，32℃、220 rpm培养35 h，得到二级种子液。

3、将二级种子液按照10%（体积比）的接种量接种到装有20 L发酵培养基的50 L发酵罐内，需要时用盐酸或氢氧化钠调节初始pH为7.1，初始OD₆₀₀为2.2，在35℃进行发酵培养，初始转速为150 rpm，通气量为0.4 vvm，并随着溶氧的下降逐渐提高转速和通气量，保证溶氧＞20%。

4、发酵28h时（即，刚开始进入稳定期时），流加组分①（碳源）和组分②（氮源），其中碳源和氮源与实施例1中相同；发酵28 h-52 h过程中控制碳氮比为400:1，以有利于菌体快速生长；发酵52 h后，控制碳氮比为100:1，以更有利于菌体合成鼠李糖脂，发酵过程中通过控制碳源和氮源的流加速度来调控碳氮比，碳源流速固定为8 ml/min，根据碳氮比调节氮源流速。

5、发酵168 h时，发酵液体积为40 L（达到初始发酵培养基体积的200%）时鼠李糖脂合成产率为86.5 g/L，取出18 L体积的发酵液，发酵罐中的发酵继续进行。

将取出的发酵液于10℃、10000 rpm 离心20 分钟，得到发酵液上清和菌体沉淀，分别进行如下处理：

将发酵液上清的pH用盐酸调至2.2，静置得到沉淀；在沉淀中加入1/5体积的乙酸乙酯萃取沉淀，得到下层萃取液；再将下层萃取液置于85℃下蒸馏出乙酸乙酯，得到红色的含有鼠李糖脂及杂质的糊状物；在该糊状物中加入1/10体积的乙酸乙酯进行第一次萃取，得到第一下层萃取液，再在第一下层萃取液中加入1/10体积的乙酸乙酯进行第二次萃取，得到第二下层萃取液，再在第二下层萃取液中加入1/10体积的乙酸乙酯进行第三次萃取，得到第三下层萃取液，共进行三次乙酸乙酯萃取，将最终得到的下层萃取液（即，第三下层萃取液）再置于85℃下蒸馏20 h，即得到鼠李糖脂纯品，其纯度达到92.8%。

在菌体沉淀中加入等体积的浓度为1 mg/ml的溶菌酶，37℃下进行酶解处理2 h（破坏细胞壁，有助于后续破菌），再在2-8℃经过高压均质机破菌2-3遍；将破菌后的均质液用水配制为20 g/100ml的溶液，经过121℃灭菌30 分钟作为组分③。

6、在步骤5取出部分发酵液4 h后开始流加组分③，流加速度为4 ml/min。

7、继续发酵培养，重复步骤5-6至少一次，实现鼠李糖脂不间断生产。

本实施例在发酵1248 h（经过9次部分取出和9次组分③循环补料，最终发酵液体积达到发酵罐总容积的80%时），放出发酵罐中所有的发酵液。

本实施例中，步骤5发酵液的取出时间点、取出的发酵液的体积、以取出的发酵液为样品计算得到的鼠李糖脂的合成产率、取出的发酵液经乙酸乙酯萃取后得到的鼠李糖脂的纯度见表3。

鼠李糖脂的合成产率达到86 g/L以上，第一次取出时底物转化率达到68%，发酵过程无泡沫产生，且能持续保持该生产速度，可以实现鼠李糖脂不间断生产。

表3

比较例1：单批发酵鼠李糖脂

按照实施例1的步骤1-4得到发酵168 h的发酵液，之后进行如下步骤：

5、将发酵液全部取出，10℃、10000 rpm 离心20分钟，得到发酵液上清；并通过实施1步骤5中的乙酸乙酯萃取得到鼠李糖脂纯品。

经检测，本实施例单批发酵的鼠李糖脂的合成产率为87.2 g/L，底物转化率为68.4%，鼠李糖脂纯度为92.8%。

比较例2：碳源替换为食用油

重复实施例1，区别仅在于将组分①（碳源）替换为食用油；并且在发酵168 h时，发酵液体积为40 L（达到初始发酵培养基体积的200%）时，放出1/3-2/3体积的发酵液，发酵罐中的发酵继续进行。

本实施例中，发酵液的取出时间点、取出的发酵液的体积、以取出的发酵液为样品计算得到的鼠李糖脂的合成产率、取出的发酵液经乙酸乙酯萃取后得到的鼠李糖脂的纯度见表4。

鼠李糖脂的合成产率为48 g/L左右，第一次取出时底物转化率为55%，发酵过程产生大量泡沫，需要在补加食用油后持续补加消泡剂消泡。

表4

比较例3：氮源替换为硫酸铵

重复实施例1，区别仅在于将组分②（氮源）替换为含30 g/100ml硫酸铵的水溶液；并且在发酵168 h时，发酵液体积为40 L（达到初始发酵培养基体积的200%）时，放出1/3-2/3体积的发酵液，发酵罐中的发酵继续进行。

本实施例中，发酵液的取出时间点、取出的发酵液的体积、以取出的发酵液为样品计算得到的鼠李糖脂的合成产率、取出的发酵液经乙酸乙酯萃取后得到的鼠李糖脂的纯度见表5。

鼠李糖脂的合成产率为52 g/L左右，第一次取出时底物转化率为58%，发酵过程产生大量泡沫，需要在产生泡沫后补加消泡剂消泡。

表5

比较例4：发酵培养基中不添加硫酸亚铁和氯化钴

重复实施例1，区别仅在于在发酵培养基中不添加硫酸亚铁和氯化钴；并且在发酵168 h时，发酵液体积为40 L（达到初始发酵培养基体积的200%）时，放出1/3-2/3体积的发酵液，发酵罐中的发酵继续进行。

本实施例中，发酵液的取出时间点、取出的发酵液的体积、以取出的发酵液为样品计算得到的鼠李糖脂的合成产率、取出的发酵液经乙酸乙酯萃取后得到的鼠李糖脂的纯度见表6。

鼠李糖脂的合成产率为46 g/L左右，第一次取出时底物转化率为48%，发酵过程产生大量泡沫，需要在产生泡沫后补加消泡剂消泡。

表6

比较例5：碳氮比固定为150:1

重复实施例1，区别仅在于发酵全过程中控制碳氮比为150:1，碳源流速固定为6ml/min，根据碳氮比调节氮源流速；并且在发酵168 h时，发酵液体积为40 L（达到初始发酵培养基体积的200%）时，放出1/3-2/3体积的发酵液，发酵罐中的发酵继续进行。

本实施例中，发酵液的取出时间点、取出的发酵液的体积、以取出的发酵液为样品计算得到的鼠李糖脂的合成产率、取出的发酵液经乙酸乙酯萃取后得到的鼠李糖脂的纯度见表7。

鼠李糖脂的合成产率达到51 g/L左右，第一次取出时底物转化率为55%，发酵过程产生大量泡沫，需要在产生泡沫后补加消泡剂消泡。

表7

Claims (10)

1.一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法，包括如下步骤：

(1)将产鼠李糖脂的微生物在发酵培养基中进行发酵培养；

(2)发酵24-28 h时，流加碳源和氮源；开始流加碳源和氮源后至发酵48-52 h过程中控制碳氮比为200-400:1；之后，控制碳氮比为80-100:1；碳源流速固定为每分钟流加初始发酵体积的0.02-0.04%，根据碳氮比调节氮源流速；

(3)当发酵液体积达到初始发酵体积的150%-200%并且鼠李糖脂合成产率大于80 g/L时，取出1/3-2/3体积的发酵液，发酵罐中的发酵继续进行；将取出的发酵液进行固液分离，得到发酵液上清和菌体沉淀；将所述发酵液上清用于提取鼠李糖脂；将所述菌体沉淀经过破菌处理后制成菌体补料；

(4) 在步骤(3)取出发酵液4-6 h后，流加所述菌体补料，流速为每分钟流加初始发酵体积的0.01-0.03%；

(5) 继续发酵培养，重复步骤(3)-(4)至少一次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成为：甘油 2-3%、NaNO₃ 0.5-2%、KH₂PO₄ 0.05-0.1%、Na₂HPO₄·12H₂O 0.05-0.1%、MgSO₄·7H₂O 0.01-0.1%、CaCl₂·2H₂O 0.5-0.8%、FeSO₄ 0.01%-0.1%、CoCl₂ 0.01%-0.1%，余量为水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的初始pH 为6.8-7.4；

所述发酵培养的初始OD₆₀₀为0.8-4；和/或

所述发酵培养的发酵温度为25-40℃，通过搅拌和通气保证溶氧＞20%。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)中流加的所述碳源为含有10-30 g/100ml的甘油和10-30 g/100ml的丙烯-1,2-二醇的水溶液。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)中流加的所述氮源为含有1-5 g/100ml 的NaNO₃和0.1-1 g/100ml的谷氨酸的水溶液。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述提取鼠李糖脂包括如下步骤：将所述发酵液上清的pH调节至1.5-2.4，静置得到沉淀；在沉淀中加入1/5-1/10体积的乙酸乙酯萃取，得到下层萃取液；将下层萃取液在80-85℃下蒸馏出乙酸乙酯，得到红色糊状物；再在该糊状物中加入1/5-1/10体积的乙酸乙酯萃取2-3次，得到下层萃取液，再置于80-85℃下蒸馏出乙酸乙酯，即得到鼠李糖脂纯品。

7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述破菌处理包括如下步骤：在所述菌体沉淀中加入溶菌酶进行酶解，再进行低温高压破菌，在破菌后的均质液中加水配成20-50 g/100ml的菌体补料，灭菌。

8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：在步骤(1)之前还进行了种子培养步骤；

所述种子培养时的种子培养基组成为：葡萄糖1-3%、NaNO₃ 0.5-3%、酵母膏0.5-2%、胰蛋白胨1-3%，余量为水。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述种子培养包括两级种子培养步骤；

一级种子培养的条件为25-40℃、150-220 rpm培养26-30 h；

二级种子培养的条件为25-40℃、200-250 rpm培养30-38 h。

10.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述产鼠李糖脂的微生物是假单胞菌微生物，优选铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putica)中的一种或多种。