CN117106074A - 抗狂犬病毒糖蛋白抗体或其片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于识别和鉴定狂犬病毒或其糖蛋白(RVG)的抗体或其结合活性片段。本发明还提供了编码所述抗体或其结合活性片段的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还提供了所述抗体或其结合活性片段、多核苷酸、载体和宿主细胞其在诊断或治疗狂犬病或鉴定狂犬病毒的用途。
Description
技术领域
本发明涉及抗体和疾病和诊断领域。具体的，本发明涉及新的结合狂犬病毒糖蛋白(RVG)特异性的抗体及其片段、衍生物和变体，以及包含这些抗体及其片段的药物组合物和诊断组合物。
背景技术
狂犬病毒糖蛋白(RVG)是唯一暴露在狂犬病毒膜外的一种结构蛋白，成熟糖蛋白由505个氨基酸组成，长约8-10nm，相对分子质量为67ku，分为3个区域：膜外区(C1-C439)、跨膜区(C440-C461)和膜内区(C462-C505)。RVG作为病毒与宿主细胞结合的配体，介导病毒膜与细胞内囊膜融合,从而使病毒侵入细胞。同时，它也是病毒主要的神经性致病因子，在狂犬病毒的神经嗜性、神经侵袭性及神经功能损伤中发挥重要作用。已有研究表明，RVG不仅可以使狂犬病毒侵入神经细胞，还能够携带其他病毒经突触逆行转移进入中枢神经系统)。RVG与其内源性受体结合后，通过受体介导的转胞吞(receptor-mediatedtranscytosis,RMT)机制进入神经细胞。基于RVG肽及衍生肽的嗜神经性，被用于生物大分子神经选择性摄取及脑靶向载体已经展开了深入的研究。例如，可依照狂犬病毒能够进入神经系统的这一策略，将其用于转运治疗分子进入大脑。
RVG在狂犬病毒的致病和免疫中起着关键作用，是狂犬病毒主要的保护性抗原，能够刺激机体产生中和抗体，引发机体抵抗病毒感染。
针对狂犬病毒的天然存在的抗体以及多克隆抗体已经被用于人类的健康监测。多克隆抗体存在异质性和其它不希望的副作用，例如有其它狂犬病毒结合分子污染的风险。另外，抗体组合物的变异性影响多克隆抗体总体特异性和反应性。
本领域还需要更好的针对狂犬病毒的治疗性和诊断性结合抗体或其活性片段。
发明内容
本发明利用小鼠对狂犬病毒糖蛋白(RVG)的特异性免疫应答，用于出高特异性的RVG单克隆抗体。本发明由此提供了用于识别和鉴定狂犬病毒或其糖蛋白(RVG)的抗体或其结合活性片段，以及其在诊断或治疗狂犬病或鉴定狂犬病毒的用途。
具体的，本发明提供了一种抗狂犬病毒糖蛋白(RVG)抗体或其结合活性片段。
抗狂犬病毒糖蛋白(RVG)是狂犬病毒膜外的一种结构蛋白，成熟糖蛋白由505个氨基酸组成，长约8～10nm，相对分子质量为67ku，分为3个区域：膜外区(C1-C439)、跨膜区(C440-C461)和膜内区(C462-C505)。RVG的氨基酸序列可源自文献和相关数据库，例如，其在Genebank的编号为NC_077827。
本发明中使用的术语抗体也可称为免疫球蛋白，其为抗狂犬病毒糖蛋白(RVG)的结合分子，通常包含重链和轻链。在本发明中，结合活性片段也可成为抗原结合片段。
抗体包括多种类别，例如为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。抗体的重链被分类成γ，μ，α，δ，ε。在本发明的其中一个方面，本发明中涉及的抗体主要为IgG。一般而言，IgG包括分子量大约23000道尔顿的两个相同的轻链多肽和分子量53,000-70,000的两个相同重链多肽。四个链通常通过二硫键以“Y”构型结合，其中轻链在“Y”口处包括重链并经可变区。轻链被分类为κ或λ(κ，λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。抗体的轻链(VL)和重链(VH)包括恒定区和可变区。轻链和重链部分的可变结构域决定抗原识别和特异性，允许抗体选择性识别和特异性结合抗原表位。轻链和重链的恒定结构域也具有重要的生物性质，例如Fc受体结合、互补结合等。抗体包含互补决定区即CDR，其存在于每个抗原结合结构域中。CDR形成的抗原结合结构域确定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面，促进抗体与其同源表位的非共价结合。本领域普通技术人员可以根据现有的知识鉴定任何给定抗体的重链或轻链可变区的分别包含CDR和构架区的结构、位置和具体的氨基酸序列。
在本发明的其中一个方面，提供的抗狂犬病毒糖蛋白(RVG)抗体或其结合活性片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中所述VH包含互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，并且所述VL包含互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在本发明的其中一种实施方式中，提供的抗狂犬病毒糖蛋白(RVG)抗体或其结合活性片段包含以下互补决定区中的一个或多个：
VH CDR1：NYWMH；
VH CDR2：EX1NPX2NGRTSYNX3KFKX4，其中X1为非极性侧链氨基酸；X2为非中性侧链氨基酸；X3为酸性侧链氨基酸；X4为不带电的极性侧链氨基酸；
VH CDR3：YGYFDY；
VL CDR1：RSSQX5LX6HSYGDTFLH，其中X5为不带电的极性侧链氨基酸；X6为非极性侧链氨基酸；
VL CDR2：KVSNRFX7，其中X7为不带电的极性侧链氨基酸；
VL CDR3：SQSTX8VPPT，其中X8为非极性侧链氨基酸。
在本发明中，碱性侧链氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸；酸性侧链氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸；不带电的极性侧链氨基酸包括甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸；非极性侧链包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸。在本发明中，非中性侧链氨基酸包括碱性侧链氨基酸和酸性侧链氨基酸。
在本发明提供的抗狂犬病毒糖蛋白抗体或其结合活性片段中，VH CDR2的氨基酸序列为EX1NPX2NGRTSYNX3KFKX4。在本发明的其中一种实施方式中，X1为非极性侧链氨基酸，优选为I或V。在本发明的其中一种实施方式中，X2为非中性侧链氨基酸，优选为N或R。在本发明的其中一种实施方式中，X3为酸性侧链氨基酸，优选为D或E。在本发明的其中一种实施方式中，X4为不带电的极性侧链氨基酸，优选为N或T。
在本发明提供的抗狂犬病毒糖蛋白抗体或其结合活性片段中，VL CDR1的氨基酸序列为RSSQX5LX6HSYGDTFLH。在本发明的其中一种实施方式中，X5为不带电的极性侧链氨基酸，优选为G或S。在本发明的其中一种实施方式中，X6为非极性侧链氨基酸，优选为F或V。
在本发明提供的抗狂犬病毒糖蛋白抗体或其结合活性片段中，VL CDR2的氨基酸序列为KVSNRFX7，其中X7为不带电的极性侧链氨基酸。在本发明的其中一种实施方式中，X7优选为Y或S。
在本发明提供的抗狂犬病毒糖蛋白抗体或其结合活性片段中，VL CDR3的氨基酸序列为SQSTX8VPPT，其中X8为非极性侧链氨基酸，优选为Q或Y。
在本发明的其中一种实施方式中，提供的抗狂犬病毒糖蛋白抗体或其结合活性片段中，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由以下序列构成:
VH CDR1：NYWMH；
VH CDR2：EX1NPX2NGRTSYNX3KFKX4，其中X1-X4如前文定义；和
VH CDR3：YGYFDY。
在本发明的其中一种实施方式中，提供的抗狂犬病毒糖蛋白抗体或其结合活性片段中，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别由以下序列构成:
VL CDR1：RSSQX5LX6HSYGDTFLH，其中X5-X6如前文定义；
VL CDR2：KVSNRFX7，其中X7如前文定义；和
VL CDR3：SQSTX8VPPT，其中X8如前文定义。
在本发明的其中一种实施方式中，提供的抗狂犬病毒糖蛋白抗体或其结合活性片段包括：
VH CDR1：NYWMH；
VH CDR2：EX1NPX2NGRTSYNX3KFKX4，其中X1-X4如前文定义；
VH CDR3：YGYFDY；
VL CDR1：RSSQX5LX6HSYGDTFLH，其中X5-X6如前文定义；
VL CDR2：KVSNRFX7，其中X7如前文定义；和
VL CDR3：SQSTX8VPPT，其中X8如前文定义。
在本发明的其中一种实施方式中，前述抗体或其结合活性片段的重链可变区VH和轻链可变区VL为：
VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO:1、2和3所示氨基酸序列构成；和/或
VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别由SEQ ID NO:4、5和6所示氨基酸序列构成。
在本发明的其中一种实施方式中，前述抗体或其结合活性片段的重链可变区VH和轻链可变区VL为：
VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO:7、8和9所示氨基酸序列构成；和/或
VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别由SEQ ID NO:10、11和12所示氨基酸序列构成。
在本发明的其中一种实施方式中，前述抗体或其结合活性片段中，所述VH由SEQID NO:13所示的氨基酸序列构成，并且所述VL由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列构成。
在本发明的其中一种实施方式中，前述抗体或其结合活性片段中：所述VH由SEQID NO:15所示的氨基酸序列构成，并且所述VL由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列构成。
在本发明的其中一个实施方案中，本发明的抗体或其结合活性片段包含恒定区。在本发明的其中一个实施方案中，所述抗体中一个或多个恒定区被部分或完全缺失，即为结构域缺失的抗体。在某些实施方案中，所述抗体或其结合活性片段为其中完整CH2结构域已被去除的变体(ΔCH2构建体)。在本发明的其中一个实施方案，短连接肽可以取代缺失结构域以提供可变区的柔性和运动自由。
在本发明的其中一个方面，前述抗体或其结合活性片段为源自小鼠的抗体。
在本发明的其中一个方面，前述抗体或其结合活性片段识别RVG蛋白的具有SEQID NO:25所示氨基酸序列的表位。
在本发明的其中一个方面，所述结合活性片段是单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段或F(ab')2片段，或任何其他抗原结合片段。在本发明中，提供包括本文所述抗体的部分(例如VH区和/或VL区)组成的抗体结合活性片段，即抗原结合片段。所述抗体或其片段免疫特异性结合狂犬病毒糖蛋白。本发明还提供所述抗体或活性结合片段的变体。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码抗体的核酸序列中引入突变，来引起氨基酸取代。优选地，变体(包括衍生物)编码相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3的氨基酸取代。氨基酸取代包括保守氨基酸取代，即其中氨基酸残基被具有相似电荷的侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有相似电荷的侧链的氨基酸残基家族已经在本领域定义。这些家族包括具有如下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)。一般而言，带碱性侧链和酸性侧链的氨基酸也称为非中性侧链氨基酸。本领域技术人员能够设计并测试具有希望性质的突变分子，例如为改进抗原结合活性的或减少非特异性结合。
在本发明的其中一个方面，前述抗体或其结合活性片段的重链和/或轻链包括信号肽。在本发明的其中一种实施方式中，前述抗体或其结合活性片段的重链信号肽由SEQID NO:17或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列构成。在本发明的其中一种实施方式中，前述抗体或其结合活性片段的轻链信号肽由SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列构成。
在本发明的其中一个方面，所述抗体或其结合活性片段具有可检测的标记，以用于检测分析中。在本发明的其中一种实施方式中，所述可检测的标记选自酶、放射性同位素、荧光团和重金属。可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属(利用各种正电子发射断层扫描仪)和非放射性顺磁金属离子等。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。适合的荧光材料的实例包括荧光素。发生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母素等。检测还可使用其他免疫分析的任何一种来实现。例如，放射性标记抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，通过使用放射性免疫分析(RIA)来检测抗体。
在本发明的其中一个方面，所述抗体或其结合活性片段与药物连接，其可用于将药物导向所述抗体或活性片段特异性结合的靶生物目标。药物包括但不限于抗代谢药(如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶)、DNA交联剂(如丝裂霉素)、微管蛋白抑制剂(如长春花碱及其类似物、紫杉烷及其类似物、奥瑞他汀、美登素)、拓扑异构酶抑制剂(如govitecan)、翻译延伸因子2抑制剂(如pasudotox)等。在本发明的其中一个方面，所述抗体或其结合活性片段通过连接子与药物连接。连接子包括但不限于不可切割连接子，如N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)；化学依赖性连接子，如含有二硫键的连接子；酶依赖性连接子，如Val-Cit二肽、Val-Ala二肽、Val-Cit-PABA、含葡萄糖醛酸的连接子；以及聚糖等。
本发明还提供了一种细胞，其分泌所述抗体或其结合活性片段。优选的，所述细胞来源于小鼠。
本发明还提供了一种多核苷酸，其编码前述抗体或其结合活性片段。编码本发明的抗体或其抗原结合片段、变体的多核苷酸可以是RNA或DNA，包括单链和双链DNA、单链和双链区混合的DNA、单链和双链RNA、单链和双链区混合的RNA。
在本发明的一个实施方案中，提供了分离的多核苷酸，包括编码免疫球蛋白重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的核酸或所述VH和VL的CDR的任意组合的核酸。
本发明还提供了一种载体，其包含前述多核苷酸。所述载体用作在宿主宿主细胞中引入并表达希望基因的运载体。载体可选自由质粒、噬菌体、病毒。载体一般包含选择标记、促进希望基因克隆和进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力的适当的限制位点。载体一般包含还包括有助于多核苷酸表达的调控元件，例如信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
本发明还提供了一种宿主细胞，包含前述多核苷酸或载体。用于本发明的蛋白表达的宿主细胞系优选为哺乳动物来源。编码本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因也可以在非哺乳动物细胞中表达，例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞中。
本发明还提供了一种组合物，包含前述抗体或其结合活性片段、多核苷酸、载体或宿主细胞。
在本发明的其中一个方面，所述组合物为药物组合物，还包含药学上可接受的载体。适合的药物载体的实例是本领域公知的，包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，例如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物可以通过公知的常规方法配制。这些药物组合物可以适合的剂施用给受试者。适合组合物的施用可以通过不同方式实现，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、局部或皮内施用或者脊髓或脑递送。
在本发明一个优选实施方案中，药物组合物可以配制为疫苗，本发明药物组合物包含用于被动免疫的抗狂犬病毒糖蛋白抗体或其结合片段或变体。
在本发明的其中一个方面，所述组合物为诊断组合物，还包含基于免疫或核酸的诊断试剂。
本发明还提供了用于诊断狂犬病或鉴定狂犬病毒的试剂盒，所述试剂盒包括前述抗体或其结合活性片段、细胞、多核苷酸、载体或宿主细胞。试剂盒还可包括用于适当诊断分析的试剂和/或说明书。
本发明提供的抗体或其活性结合片段尤其适合用于免疫分析，其中可以液相使用或结合至固相载体。例如可用于直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫分析。此类免疫分析的实例是放射性免疫分析(RIA)、ELISA、流式细胞术和Western印迹分析。本发明抗原和抗体可结合至许多不同的载体并用于分离与其特异性结合的细胞。公知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、直链淀粉、纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石等。可用于本发明的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物。
本发明的其中一种实施方式还提供了基于抗体的阵列(array)，其例如载有特异性识别狂犬病毒糖蛋白的本发明抗体或抗原结合片段。
本发明还提供了前述抗体或其结合活性片段、细胞、多核苷酸、载体或宿主细胞在制备用于诊断狂犬病或鉴定狂犬病毒的药物或诊断试剂盒中的用途。
附图说明
图1显示本发明提供的狂犬病毒单克隆抗体的结构分析和各片段氨基酸序列。
图2显示采用本发明提供的狂犬病毒单克隆抗体对抗狂犬病毒糖蛋白的定量检测分析曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体的特异性杂交瘤细胞株的筛选
包括以下步骤：
1)合成氨基酸序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG(SEQ ID NO:27)的狂犬病毒糖蛋白片段多肽，并与KLH蛋白进行偶联(由江苏金斯瑞蓬勃生物科技有限公司提供)；
2)免疫动物为Balb/c小鼠(购自维通利华实验动物技术有限公司)，免疫7次，每次间隔14天，前5次采用多点皮下免疫方式，第6次和第7次采取腹腔注射的免疫方式，每只小鼠注射1mg抗原；
3)第六次免疫后3天，取小鼠尾血分离血清，用间接ELISA进行检测其抗体，
其中编号7549小鼠的血清抗体检测结果如下表1所示。
表1.ELISA
其中，ELISA铺板抗原：A：检测多肽-氨基BSA(+)；B：检测多肽-巯基BSA(+)；C：全长蛋白药物ER2001-P1(多肽+人蛋白)；D：人Lamp2蛋白(阴性对照反筛)(-)。
4)从编号7549小鼠分离浆细胞，将其与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，用2×HT替代饲养细胞培养基筛选获得杂交瘤细胞；
5)对杂交瘤细胞上清用ELISA方法进行筛选特异性阳性克隆，最终获得2个特异性阳性克隆；
具体操作步骤：用狂犬病毒灭活抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液稀释，然后加到96孔板，每孔100μl，2～8℃下放置8～12小时，然后加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，置4℃保存备用。
取细胞培养上清加入包被有病毒抗原的酶标板中，37℃反应30分钟，用含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗板，向每孔加入1:5000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP标记物(美国Jackson公司)，37℃反应30分钟，清洗拍干后，向每孔加入底物工作液，25℃避光反应15分钟。终止反应后测定每孔的OD450nm值。以吸光度值＞阴性对照(即洗板培养液)×2.1倍为阳性判定标准，测定细胞培养上清中特异性单克隆抗体效价。
获得2株特异性细胞克隆，编号分别为11H5和12H9，其抗体的ELISA结合活性检测结果如下表2所示：
表2.ELISA
其中，ELISA抗原：A：检测多肽-氨基BSA(+)；B：检测多肽-巯基BSA(+)；C：全长蛋白药物ER2001-P1(多肽+人蛋白)；D：人Lamp2蛋白(阴性对照反筛)(-)。
结果显示11H5和12H9只与狂犬病毒有强烈信号反应，而与阴性对照不反应。
6)对母克隆11H5和12H9进行亚克隆筛选。筛选结果如下表3所示。得到11H5B12和12H9F6两株亚克隆。
表3.ELISA
ELISA抗原：A：检测多肽-氨基BSA(+)；B：检测多肽-巯基BSA(+)；C：全长蛋白药物ER2001-P1(多肽+人蛋白)；D：人Lamp2蛋白(阴性对照反筛)(-)。
6)测定11H5和12H9是否存在交叉反应。结果显示11H5和12H9只与狂犬病毒有强烈信号反应，而与阴性对照不反应。
实施例2狂犬病毒单克隆抗体测序和序列分析
对克隆株抗体11H5B12和12H9F6进行测序。
11H5B12的VH(包含信号肽)的核酸序列为如SEQ ID NO:21所示。
11H5B12的VL(包含信号肽)的核酸序列为如SEQ ID NO:22所示。
12H9F6的VH(包含信号肽)的核酸序列为如SEQ ID NO:23所示。
12H9F6的VL(包含信号肽)的核酸序列为如SEQ ID NO:24所示。
对得到的抗体序列的结构和氨基酸进行分析，结果如图1所示。
其中，
11H5B12的VH的全长(不包含信号肽)的氨基酸序列为如SEQ ID NO:13所示；其VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示。
11H5B12的全长VL(不包含信号肽)的氨基酸序列为如SEQ ID NO:14所示；其VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示。
12H9F6的全长VH(不包含信号肽)的氨基酸序列为如SEQ ID NO:15所示；其VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8和9所示。
12H9F6的全长VL(不包含信号肽)的氨基酸序列为如SEQ ID NO:16所示；其VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11和12所示。
以及，
11H5B12的VH的信号肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO:17所示。
11H5B12的VL的信号肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO:18所示。
12H9F6的VH的信号肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO:19所示。
12H9F6的VL的信号肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO:20所示。
实施例3狂犬病毒单克隆抗体对RVG的定量
使用克隆株抗体12H9F6作为捕获抗体，生物标记的克隆株抗体11H5B12作为检测抗体，加入合成的RVG-Lamp2融合蛋白作为标准品，将标准品梯度稀释至下述浓度作为标准曲线：12800.00、6400.00、3200.00、1600.00、800.00、400.00、200.00、100.00、50.00ng/mL，使用SA-HRP加入TMB底物进行显色。检测得到标准曲线如图2所示。
结果显示，检测结果与检测样品在100ng/mL以上具有良好的线性关系，11H5B12和12H9F6可以作为抗体对检测RVG浓度进行定量检测。
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。
Claims (11)
1.一种抗狂犬病毒糖蛋白(RVG)抗体或其结合活性片段，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中所述VH包含互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VL包含互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，
其中，所述抗体或其结合活性片段具有以下互补决定区中的一个或多个：
VH CDR1：NYWMH；
VH CDR2：EX1NPX2NGRTSYNX3KFKX4，其中X1为非极性侧链氨基酸；X2为非中性侧链氨基酸；X3为酸性侧链氨基酸；X4为不带电的极性侧链氨基酸；
VH CDR3：YGYFDY；
VL CDR1：RSSQX5LX6HSYGDTFLH，其中X5为不带电的极性侧链氨基酸；X6为非极性侧链氨基酸；
VL CDR2：KVSNRFX7，其中X7为不带电的极性侧链氨基酸；
VL CDR3：SQSTX8VPPT，其中X8为非极性侧链氨基酸。
2.根据权利要求1所述的抗体或其结合活性片段，其重链可变区VH包括：
VH CDR1：NYWMH；
VH CDR2：EX1NPX2NGRTSYNX3KFKX4，其中X1为非极性侧链氨基酸；X2为非中性侧链氨基酸；X3为酸性侧链氨基酸；X4为不带电的极性侧链氨基酸；和
VH CDR3：YGYFDY。
3.根据权利要求1所述的抗体或其结合活性片段，其轻链可变区VL包括：
VL CDR1：RSSQX5LX6HSYGDTFLH，其中X5为不带电的极性侧链氨基酸；X6为非极性侧链氨基酸；
VL CDR2：KVSNRFX7，其中X7为不带电的极性侧链氨基酸；和
VL CDR3：SQSTX8VPPT，其中X8为非极性侧链氨基酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其结合活性片段，其重链可变区VH和轻链可变区VL为：
(i)VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO:1、2和3所示氨基酸序列构成；和/或
VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别由SEQ ID NO:4、5和6所示氨基酸序列构成；
或
(ii)VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO:7、8和9所示氨基酸序列构成；和/或
VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别由SEQ ID NO:10、11和12所示氨基酸序列构成。
5.根据权利要求4所述的抗体或其结合活性片段，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中：
(i)所述VH由SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列构成，并且所述VL由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列构成；或
(ii)所述VH由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列构成，并且所述VL由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列构成。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其结合活性片段，其识别RVG蛋白的具有SEQID NO:25所示氨基酸序列的表位。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其结合活性片段，其中，所述结合活性片段是单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段或F(ab')2片段。
8.根据权利要求1所述的抗体或其结合活性片段，其重链和/或轻链包括信号肽，例如，其重链信号肽由SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列构成，或其轻链信号肽由SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列构成。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其结合活性片段，其具有可检测的标记，例如为选自酶、放射性同位素、荧光团和重金属。
10.一种细胞，其分泌权利要求1-9中任一项所述的抗体。
11.一种用于诊断狂犬病或鉴定狂犬病毒的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-9任一项所述的抗体或其结合活性片段、权利要求10所述的细胞、编码权利要求1-9中任一项所述的抗体或其结合活性片段的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体或宿主细胞。
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