CN117083303A - 具有高亲和力和/或特异性的结合物分子及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

在一些方面，本文提供了结合分子，包括对靶具有高亲和力和/或高特异性的共结合物。在其他方面，本文提供了本文教导的结合分子的组合物、制备方法和使用方法，诸如涉及本文教导的共结合物的诊断性和治疗性使用方法。

Description

具有高亲和力和/或特异性的结合物分子及其制备和使用 方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年12月31日提交的美国临时专利申请号63/133,005和2020年12月31日提交的美国临时专利申请号63/133,020的优先权和权益，所述申请各自以引用方式整体并入本文。

技术领域

在一些方面，本申请涉及对靶分子具有高亲和力和/或高特异性的结合物分子，诸如共结合物。在其他方面，还提供了制备结合物分子诸如共结合物的方法，使用所述结合物分子诸如共结合物的方法，例如诊断和治疗方法，以及包含所述结合物分子诸如共结合物的组合物。

背景技术

抗体和其他结合分子可用于许多领域，包括涉及分子检测、诊断和治疗方法的领域。生产具有所需特征(诸如大小和免疫原性，更不用说所需的结合亲和力和特异性)的此类结合分子，仍然是本领域的一个挑战。

发明内容

在一些方面，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中任选地，第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分，并且其中第一结合部分任选地经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分。在一些实施方案中，共结合物包含接头。在一些实施方案中，共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分，并且其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。

在一些实施方案中，共结合物与第二靶位点结合的亲和力是对照共结合物的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，对照共结合物包含不具有N末端截短的抗体可变结构域(例如，本文所述的共结合物的第二结合部分的N末端截短的抗体可变结构域)。

在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。在一些实施方案中，共结合物与靶分子结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物的亲和力的至少约3倍。

在一些实施方案中，第一结合部分是第一抗体部分。在一些实施方案中，第一抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，第一抗体部分是单结构域抗体。

在一些实施方案中，第二抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域是截短的VH或截短的VL结构域。在一些实施方案中，第二抗体部分是单结构域抗体。在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域是截短的V_HH结构域。

在一些实施方案中，第一结合部分包含第一V_HH结构域；其中第二结合部分包含具有N末端截短的第二V_HH结构域(“截短的V_HH结构域”)，其中第一V_HH结构域的C末端经由接头与第二V_HH结构域的N末端连接。

在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域的N末端截短为约1至约25个氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域的N末端截短为1个氨基酸。

在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些实施方案中，与N末端截短的抗体可变结构域直接连接的肽接头的C末端氨基酸是G。

在一些实施方案中，与N末端截短的抗体可变结构域直接连接的肽接头的C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。在一些实施方案中，与N末端截短的抗体可变结构域直接连接的肽接头的三个C端氨基酸选自由以下各项组成的组：GVG、DSG、LLG、VSG、PPG、SCG、TLG和NPG。

在一些实施方案中，接头包含(G_xS_y)_n，其中x为1至5，y为0至5，并且n为1或更大。在一些实施方案中，接头包含[EAAAK]_n，其中n为1或更大。在一些实施方案中，接头长度不超过约40个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含[EEEEKKKK]_n，其中n为1或更大。在一些实施方案中，接头包含[AP]_n，其中n为1或更大。

在一些实施方案中，截短的可变结构域来自IgG、IgA、IgE、IgM或IgD类型中任一者的抗体可变结构域。

在一些实施方案中，共结合物还包含特异性识别第三靶位点的第三结合部分。在一些实施方案中，第三结合部分是第三抗体部分。在一些实施方案中，第三抗体部分包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)。在一些实施方案中，第三抗体部分经由接头通过第三抗体部分的N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二抗体部分连接。

在一些实施方案中，第三抗体部分经由接头通过第三抗体部分的N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第四结合部分连接。

在一些实施方案中，共结合物是包含Fc区的抗体。

在一些实施方案中，共结合物是嵌合抗原受体(“CAR”)。

在其他方面，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分；其中第一结合部分经由肽接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接；其中与第二结合部分的抗体可变结构域直接连接的肽接头的C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是任何氨基酸；X₂是K、R、Y、M、G或N；并且X₃是R、G、Y或P。

在一些实施方案中，共结合物与第二靶位点结合的亲和力是接头对照共结合物的亲和力的至少约3倍。

在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。

在一些实施方案中，共结合物与靶分子结合的亲和力是接头对照共结合物的亲和力的至少约3倍。

在一些实施方案中，第一结合部分是第一抗体部分。在一些实施方案中，第一抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，第一抗体部分是单结构域抗体。

在一些实施方案中，第二抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，抗体可变结构域是VH或VL结构域。在一些实施方案中，第二抗体部分是单结构域抗体。在一些实施方案中，抗体可变结构域是V_HH结构域。

在一些实施方案中，第一结合部分包含第一V_HH结构域；其中所述第二结合部分包含第二V_HH结构域，其中所述第一V_HH结构域的C末端经由肽接头与所述第二V_HH结构域的N末端连接。

在一些实施方案中，与N末端截短的抗体可变结构域直接连接的肽接头的三个C末端氨基酸选自由以下各项组成的组：GVG、DSG、LLG、VSG、PPG、SCG、TLG和NPG。

在一些实施方案中，接头包含(G_xS_y)_n，其中x为1至5，y为0至5，并且n为1或更大。在一些实施方案中，接头包含[EAAAK]_n，其中n为1或更大。在一些实施方案中，接头长度不超过约40个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含[EEEEKKKK]_n，其中n为1或更大。在一些实施方案中，接头包含[AP]_n，其中n为1或更大。

在一些实施方案中，共结合物还包含特异性识别第三靶位点的第三结合部分。在一些实施方案中，第三结合部分是第三抗体部分。在一些实施方案中，第三抗体部分包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)。在一些实施方案中，第三抗体部分经由接头通过第三抗体部分的N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二抗体部分连接。在一些实施方案中，第三抗体部分经由接头通过第三抗体部分的N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第四结合部分连接。

在一些实施方案中，共结合物是包含Fc区的抗体。

在一些实施方案中，共结合物是嵌合抗原受体(“CAR”)。

在其他方面，提供了一种文库，其包含多个共结合物或编码多个共结合物的多个多核苷酸，每个共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分，其中所述第一结合部分经由肽接头通过抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接，其中所述库中至少两种共结合物在肽接头序列上彼此不同。

在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。

在一些实施方案中，抗体可变结构域具有N末端截短(“N末端截短的抗体可变结构域”)。在一些实施方案中，文库中至少两种共结合物在抗体可变结构域的N末端截短方面彼此不同。

在一些实施方案中，文库的多样性为至少约5000。

在一些实施方案中，多种共结合物中的基本上所有共结合物都包含相同的第一结合部分和第二结合部分。

在一些实施方案中，多种共结合物中的至少两种包含不同的第一结合部分和/或第二结合部分。

在其他方面，提供了筛选以所需亲和力特异性结合第二靶位点的共结合物的方法，所述方法包括：(1)将本文所述的文库与包含第二靶位点的靶分子接触，以在特异性结合靶分子的共结合物与靶分子之间形成复合物，和(2)鉴定以所需亲和力结合第二靶位点的共结合物。

在其他方面，提供了筛选以所需亲和力特异性结合靶分子的共结合物的方法，所述方法包括：(1)将本文所述的文库与靶分子接触，以在特异性结合靶分子的共结合物与靶分子之间形成复合物，和(2)鉴定以所需亲和力结合靶分子的共结合物。

在其他方面，提供了增加对照共结合物特异性结合靶分子的结合亲和力的方法，其中对照共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二结合靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分，其中第一结合部分经由接头通过抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接，其中对照共结合物包含全长抗体可变结构域，其中对照共结合物对第二靶位点的结合亲和力低于游离状态下第二抗体部分的亲和力，所述方法包括获得与对照共结合物相比在第二抗体部分的抗体可变结构域处具有N末端截短的共结合物。

在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。

本文引用的所有申请、出版物、专利和其他参考文献、GenBank引文均以引用的方式整体并入本文。如有冲突，以说明书(包括定义)为准。

附图说明

图1描绘了用于确定抗体可变区中N末端残基的截短或缺失的示例性算法。

图2描绘了用于确定抗体可变区中N末端残基的截短或缺失的另一种示例性算法。

图3A-3D描绘了当将两个结合部分连接在一起时结合能损失的示例性来源。图3E描绘了与EGFR结合的7D12和9G8 V_HH的晶体结构，其中西妥昔单抗晶体结构重叠用于比较。

图4A描绘了通过修饰接头与抗原之间的接头附接点来改善共结合物的结合特性的策略。图4B-4C描绘了来自在7D12的N末端具有截短的(4B)HuL6-7D12变体和在9G8的N末端具有截短的(4C)HuL6-9G8变体的纯化蛋白质的SDS-PAGE凝胶。图4B和4C中的所有变体，除了非截短的共结合物之外，都以相同的方式表达和纯化。

图5描绘了在有或没有第二结合物的第一氨基酸的情况下，在接头的C末端具有3个氨基酸随机化的共结合物文库设计。

图6A描绘了每个文库的共有序列，如表15和所附文本中所述，使用WebLogo软件对前20种最丰富的序列进行基序分析(Crooks等人,Genome Res.2004年6月；14(6):1188-90)。图6B描绘了具有接头末端修饰的所选构建体与人EGFR之间亲和力(K_D)的酵母展示和SPR测量。

图7A描绘了在接头的N末端处具有3个氨基酸随机化且在C末端处具有2个氨基酸随机化的共结合物文库设计，其中接头的最后一个C末端氨基酸是甘氨酸。文库利用4种不同的接头基序：EAAAK和E4K4重复、AP重复和G3-4S重复。图7B描绘了每个文库的共有序列，如表16和所附文本中所述，使用WebLogo软件对前20种最丰富的序列进行基序分析(Crooks等人,Genome Res.2004年6月；14(6):1188-90)。图7C描绘了如表16和所附文本中所述的筛选中的接头长度富集。

图8描绘了工程化共结合物对鼠EGFR-Fc和人EGFR-Fc突变体(L325V、S340A)的SPR亲和力测量。

图9描绘了用于发现具有协同共结合的共结合物的方法的示意图。

图10A显示构建了抗EGFR VHH酵母表面展示文库SB0，并用FACS进行了单结合物选择。图10B描绘了使用FACS从CB0共结合物文库中选择高亲和力共结合物。

图11示出了共结合物对EGF诱导的EGFR信号传导的下调。

图12A示出了在固定的EGFR-Fc上注入81nM 1E10 EGFR结合物，然后注入81nM15E2 EGFR结合物的传感图。图12B示出了在固定的EGFR-Fc上注入81nM 7D12-9G8 EGFR结合物，然后注入81nM 15E2 EGFR结合物的传感图。图12C示出了在固定的EGFR-Fc上注入81nM 7D12-9G8 EGFR共结合物，随后注入81nM 1E10 EGFR结合物的传感图。

图13示出了VHH和Fab结构域的N末端与抗原表面之间的距离的图。每个单独的点表示选自PDB的独特结构。

图14示出了抗EGFR(实心圆)和抗HIV p24(空心方)共结合物和单结合物的亲和力的图。

图15示出了共结合物对14种不同靶的亲和力和常规抗体对所述靶的亲和力的图。

具体实施方式

本文提供了包含特异性识别靶位点的第二结合部分的结合物分子，其中第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分。本申请的公开内容基于本发明人的意外发现，即包含具有N末端截短的抗体可变结构域的第二结合部分的此类结合物分子，诸如共结合物，为具有高亲和力和特异性的结合物分子提供了平台技术。此外，具有N末端截短的抗体可变结构域的第二结合部分可以与各种其他特征，包括接头、第一结合部分、标记和/或药物组合，以产生期望的结合物分子。此外，本文所涵盖的结合物分子的设计使得能够例如经由多肽表达进行产生，而无需通常导致产量损失和污染的产生后合成步骤。

因此，在一些方面，本文提供了一种结合物分子，例如靶多肽，其包含特异性识别靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分。

在其他方面，本文提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分，其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。

在其他方面，本文提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分；其中第一结合部分经由肽接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接；其中与第二结合部分的抗体可变结构域直接连接的肽接头的C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是任何氨基酸；X₂是K、R、Y、M、G或N；并且X₃是R、G、Y或P。在一些实施方案中，X₁-X₂-X₃中的X₃为G。

在其他方面，本文提供了一种文库，其包含多个共结合物或编码多个共结合物的多个多核苷酸，每个共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分，其中所述第一结合部分经由肽接头通过抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接，其中文库中至少两种共结合物在肽接头序列上彼此不同。

在其他方面，本文提供了筛选以所需亲和力特异性结合第二靶位点的共结合物的方法，所述方法包括：(1)将本文所述的文库与包含第二靶位点的靶分子接触，以在特异性结合靶分子的共结合物与靶分子之间形成复合物，和(2)鉴定以所需亲和力结合第二靶位点的共结合物。

在其他方面，本文提供了筛选以所需亲和力特异性结合靶分子的共结合物的方法，所述方法包括：(1)将本文所述的文库与靶分子接触，以在特异性结合靶分子的共结合物与靶分子之间形成复合物，和(2)鉴定以所需亲和力结合靶分子的共结合物。

在其他方面，本文提供了增加对照共结合物特异性结合靶分子的结合亲和力的方法，其中对照共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二结合靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分，其中第一结合部分经由接头通过抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接，其中对照共结合物包含全长抗体可变结构域，其中对照共结合物对第二靶位点的结合亲和力低于游离状态下第二抗体部分的亲和力，所述方法包括获得与对照共结合物相比在第二抗体部分的抗体可变结构域处具有N末端截短的共结合物。

I.定义

除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。为了解释本说明书，将适用以下术语描述，并且只要适当，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。所有专利、申请、公开的申请和其他出版物都以引用的方式整体并入本文。如果所陈述术语的任何描述与以引用的方式并入本文的任何文件相冲突，则以下文所陈述术语的描述为准。

本文描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员使用常规方法通常很好理解和/或通常使用的那些技术和程序，诸如例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第3版2001)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编,2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编2010)；和AntibodyEngineering第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编,第2版2010)中所述的广泛利用的方法。

术语“共结合物(co-binder/co-binders/cobinder/cobinders)”意指具有至少两个结合部分的分子(即，包含第一互补位的第一结合部分和包含第二互补位的第二结合部分)，其结合一个靶分子或一个靶复合物(例如，蛋白质复合物)的非重叠表位。在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分同时结合一个靶分子或一个靶复合物(例如，蛋白质复合物)的非重叠表位。在一些实施方案中，至少两个结合部分同时结合一个靶分子或一个靶复合物(例如蛋白质复合物)的非重叠表位。本文所述的共结合物包含至少两个结合部分，例如2、3、4、5、6或7个或更多结合部分中的任一个。在一些实施方案中，一个结合分子上的两个或更多个结合部分是相同的。在一些实施方案中，一个结合分子上的两个或更多个结合部分是不同的。在一些实施方案中，共结合物具有两个结合部分，并且共结合物识别的两个表位是不重叠且不同的。在一些实施方案中，共结合物具有两个结合部分，并且共结合物识别的两个表位彼此靠近地定位，但仍然允许足够的空间来容纳共结合物的接头。在一些实施方案中，共结合物具有两个结合部分，并且第一表位和第二表位具有不超过150埃的距离。在一些实施方案中，共结合物具有两个结合部分，并且第一表位和第二表位具有不超过100埃、不超过50埃、不超过40埃、不超过30埃、不超过20埃、不超过15埃、不超过10埃或不超过5埃的距离。对于靶肽或靶蛋白上的线性表位，任何两个表位之间的距离可以在彼此200个氨基酸以内。在一些实施方案中，共结合物具有两个结合部分，并且两个表位之间的距离可以在彼此200个氨基酸以内、150个氨基酸以内、100个氨基酸以内、50个氨基酸以内、40个氨基酸以内、30个氨基酸以内、20个氨基酸以内、15个氨基酸以内或10个氨基酸以内。在一些实施方案中，共结合物具有两个结合部分，并且选择共结合物识别的两个表位，使得两个结合相互作用是协作的和协同的，并且不相互干扰。与典型的二价抗体相比，共结合物具有更高的结合亲和力和更高的结合特异性，因为例如两个互补位-表位结合相互作用存在叠加效应。

如本文所用，术语“结合部分”是指结合特异性靶分子的分子或分子的一部分。结合部分可以包括蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质或小分子量化合物。在一些实施方案中，结合部分包含抗体。在一些实施方案中，结合部分包含抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，结合部分包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合部分包含抗体的重链可变区。在一些实施方案中，结合部分包含抗体的轻链可变区。在一些实施方案中，结合部分包含抗体的可变区。在一些实施方案中，结合部分包含抗体模拟物。在一些实施方案中，结合部分包含小分子量组分。在一些实施方案中，结合分子仅具有一个结合部分。在一些实施方案中，结合分子具有两个结合部分。在一些实施方案中，结合分子具有三个或更多个结合部分。在一些实施方案中，一个结合分子上的两个或更多个结合部分是相同的。在一些实施方案中，一个结合分子上的两个或更多个结合部分是不同的。例如，结合分子可以具有两个结合部分，两者都是抗原结合片段，例如VHH。又例如，结合分子也可以有两个结合部分，一个是VHH，并且另一个是scFv。

如本文所用，术语“互补位”是识别并结合靶分子的结合部分的一部分。抗体的互补位也称为“抗原结合位点”给定靶分子/结合分子对(例如，Ag/Ab)的表位和互补位可通过常规方法鉴定。例如，靶分子和结合分子可以结合以形成复合物，所述复合物可以结晶。复合物的晶体结构可以通过例如X射线衍射来确定，并用于鉴定靶分子/结合分子，即表位/互补位之间的特定相互作用位点。

“表位”是单个抗体分子结合的抗原分子表面，例如抗原表面的局部区域(例如EGFR)上的位点，其能够与抗体的一个或多个抗原结合区结合，并且在动物诸如哺乳动物(诸如人)中具有抗原或免疫原性活性，能够引发免疫响应。具有免疫原性活性的表位是在动物中引发抗体响应的多肽的一部分。具有抗原活性的表位是抗体结合的多肽的一部分，如通过本领域熟知的任何方法，包括例如通过免疫测定来确定。抗原表位不一定是免疫原性的。表位通常由分子的化学活性表面基团诸如氨基酸或糖侧链组成，并具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中的连续氨基酸序列形成。构象表位由蛋白质序列中的不连续氨基酸形成，但它们在将蛋白质折叠成其三维结构时聚集在一起。在蛋白质的三维结构处于改变的构象时，例如在另一种蛋白质或配体活化或结合后形成诱导的表位。通常，抗原有几个或许多不同的表位，并且可能与许多不同的抗体响应。

术语“结合蛋白”是指包含以下的蛋白质：与靶抗原(例如EGFR)结合的部分(例如，一个或多个结合区诸如CDR)和任选的支架或框架部分(例如，一个或多个支架或框架区域)，其允许结合部分采用促进结合蛋白与靶多肽、片段或其表位结合的构象。此类结合蛋白的实例包括抗体，诸如人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体及其片段。结合蛋白可包含例如具有移植CDR或CDR衍生物的替代蛋白支架或人工支架。此类支架包括但不限于包含突变的抗体衍生支架，所述突变被引入以例如稳定结合蛋白的三维结构，以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。参见例如Korndorfer等人,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics 53(1):121-29；以及Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-54。此外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)，以及基于利用纤连蛋白组分作为支架的抗体模拟物的支架。在本公开的上下文中，结合蛋白被认为特异性结合或选择性结合靶，例如当解离常数(K_D)为≤10^-5M时。在一些实施方案中，结合蛋白(例如，共结合物和抗体)可以约10^-7M至约10^-12M的K_D特异性结合靶。在某些实施方案中，当K_D为≤10^-8M或K_D为≤10^-9M时，结合蛋白(例如，共结合物和抗体)可以高亲和力特异性结合靶。在一个实施方案中，如通过测量的，结合蛋白(例如共结合物和抗体)可以1x10^-9M至10x10^-9M的K_D特异性结合到纯化的人靶。在另一个实施方案中，结合蛋白(例如，共结合物和抗体)可以特异性结合纯化的人靶，其K_D为0.1×10^-9M至1×10^{- 9}M，如通过KinExA^TM(Sapidyne,Boise,ID)测量的。在又一个实施方案中，结合蛋白(例如，共结合物和抗体)特异性结合在细胞上表达的靶，其K_D为0.1×10^-9M至10×10^-9M。在某些实施方案中，结合部分(例如，共结合物和抗体)特异性结合在细胞上表达的靶，其K_D为0.1×10^{- 9}M至1×10^-9M。在一些实施方案中，结合蛋白(例如，共结合物和抗体)特异性结合在细胞上表达的靶，其K_D为1×10^-9M至10×10^-9M。在某些实施方案中，结合蛋白(例如，共结合物和抗体)特异性结合在细胞上表达的靶，其K_D为约0.1×10^-9M、约0.5×10^-9M、约1×10^-9M、约5×10^-9M、约10×10^-9M或其任何范围或间隔。

术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用，并且以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖例如单个单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物活性)，所述多特异性抗体由至少两个完整抗体、单链抗体和抗体片段形成，如下所述。抗体可以是人、人源化、嵌合和/或亲和成熟的，以及来自其他物种例如小鼠和兔等的抗体。因此，术语“抗体”包括各种抗体结构，包括但不限于多克隆抗体、重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双抗原位点抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体、单链Fv(scFv)抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白类多肽内的B细胞的多肽产物，其能够结合特异性分子抗原，并由两对相同的多肽链构成，其中每对多肽链具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如Antibody Engineering(Borrebaeck编,第2版1995)；以及Kuby,Immunology(第3版1997)。术语“完整抗体”或“全长抗体”是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。这包括例如包含两条轻链和两条重链的抗体，每条轻链包含可变区和轻链恒定区(CL)，每条重链包含可变区和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3。在具体实施方案中，特异性分子抗原可以被本文提供的抗体结合。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、骆驼化抗体、胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体和上述任一者的功能片段(例如，抗原结合片段)，所述功能片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分，其保留了该片段所来源的抗体的部分或全部结合活性。功能片段的非限制性实例(例如，抗原结合片段)包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab)₂片段、F(ab’)₂片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、二硫键连接的scFv(dsscFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和迷你抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如抗原结合结构域或含有结合抗原的抗原结合位点的分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference(Myers编,1995)；Huston等人,1993,Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；以及Day,Advanced Immunochemistry(第2d版1990)中。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。本文提供了针对靶抗原诸如EGFR的拮抗抗体。

“抗原”是抗体可以选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原是多肽。

术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区”、“抗体片段”和类似术语是指抗体的一部分，其包含与抗原相互作用并赋予结合剂对抗原(例如，CDR)的特异性和亲和力的氨基酸残基。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链抗体分子(例如，scFv)、二硫键连接的Fv(dsFv)、二硫键连接的scFv(dsscFv)、Fd片段、双抗体、三抗体、四抗体、迷你抗体、双可变结构域抗体(DVD)、单可变结构域抗体(例如，骆驼抗体、羊驼抗体)、重链抗体的单可变结构域(VHH)和由抗体片段形成的多特异性抗体。

除非本文另有具体说明，否则如本文所用的轻链可变区(VLAb)涵盖所有轻链可变区亚型，包括例如卡帕(κ)轻链可变区(κVLAb)和/或兰姆达(λ)轻链可变区(λVLAb)。除非本文另有具体说明，否则如本文所用的重链可变区(VHAb)涵盖所有重链可变区亚型，包括例如γ、δ、α、μ和/或ε重链可变区。在一些实施方案中，VLAb之后为阿拉伯数字，以标记不同的VLAb。在一些实施方案中，VHAb之后为阿拉伯数字，以标记不同的VHAb。

如本文所用，术语“抗体模拟物”是指像抗体一样可以特异性结合抗原，但在结构上与抗体无关的分子。抗体模拟物通常是分子量为约2至20kDa的人工肽。核酸和小分子有时也被认为是抗体模拟物。本领域已知的抗体模拟物包括亲和体(affibody)、affilin、affimer、affitin、α体(alphabody)、anticalin、适体、亲合体(avimer)、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单体(monobody)和nanoCLAMP。

如本文所用，术语“拮抗剂”在用于提及抗原的功能时，旨在意指能够抑制、降低、减弱、减少或完全阻断抗原的一种或多种生物活性或功能的分子。抗原功能的拮抗剂包括可阻断、抑制、减弱或减少表达抗原的细胞中抗原介导或抗原依赖的信号传导的分子。抗原功能的拮抗剂还包括可阻断、抑制、减弱或减少抗原信号传导的分子，包括由抗原与其配体之间的连接或接合诱导的下游信号传导。在一些实例中，抗原的拮抗剂还包括可阻断、抑制、减弱或减少抗原与天然抗原结合分子的结合的分子。在其他实例中，抗原的拮抗剂另外包括可阻断、抑制或减少抗原与抗原配体的结合的分子。抗原的“拮抗剂”是对抗原功能具有“拮抗性”。在一些实施方案中，本文提供了拮抗共结合物。在一些实施方案中，本文提供了作为EGFR拮抗剂的共结合物。

当用于提及抗原的功能时,“阻断”共结合物、“中和”共结合物或“拮抗”共结合物旨在意指与抗原结合并充当抗原活性或功能的拮抗剂的共结合物。例如，阻断性共结合物或拮抗剂共结合物可以基本上或完全抑制抗原的生物活性或抗原与其配体的结合。在一些实施方案中，本文提供了阻断性共结合物。在一些实施方案中，本文提供了EGFR阻断性共结合物。

术语“结合(binds/binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如结合分子(例如共结合物或结合部分)和靶分子之间的相互作用，以形成复合物。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华(van der Waals)相互作用。复合物也可以包括通过共价键或非共价键、相互作用或作用力结合在一起的两个或更多个分子。单个结合分子与靶分子的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是结合分子或结合部分对该表位的亲和力。结合分子对单价抗原的解离速率(k_off)与结合速率(k_on)之比(k_off/k_on)是解离常数K_D，其与亲和力成反比。K_D值越低，抗体的亲和力越高。K_D的值因结合分子和靶分子的不同复合物而异，并且取决于k_on和k_off。本文提供的结合分子的解离常数K_D可以使用本文提供的任何方法或本领域技术人员熟知的任何其他方法来确定。在一个结合位点的亲和力并不总是反映结合分子与靶分子之间的真实相互作用强度。当含有多个表位的靶分子与含有多个结合靶分子的结合部分的结合分子接触时，结合分子与靶分子在一个位点处的相互作用将增加在第二个位点处发生反应的可能性。多价结合分子与靶分子之间的此类多重相互作用的强度被称为亲和力。与单个结合位点的亲和力相比，结合分子的亲合力可以更好地衡量其结合能力。例如，高亲合力可以补偿低亲和力，如有时在五聚体IgM抗体中发现的那样，所述五聚体IgM抗体可由于其多价性而具有比IgG更低的亲和力，但具有IgM的高亲合力，使其能够有效地结合抗原。

如本文所用，术语“特异性结合”是指与替代性物质相比，结合分子或结合部分与特定表位或靶分子的相互作用更频繁、相互作用更迅速、相互作用持续时间更长、相互作用亲和力更大、相互作用强度更大、解离频率更低、解离速度更慢或解离持续时间更短或者上述的一些组合或排列。特异性结合靶分子(例如抗原)的结合分子(例如共结合物、结合部分、抗体或其抗原结合片段)可通过例如免疫测定、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、SPR(例如Biacore)或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定。通常，特异性反应将是背景信号或噪声的至少两倍并且可以是背景的超过10倍。关于抗体特异性的论述，参见例如Paul编,1989,Fundamental Immunology Second Edition,Raven Press,New York，第332-336页。特异性结合靶分子的结合分子(例如共结合物、结合部分、抗体或其抗原结合片段)结合靶分子的亲和力可以高于其对不同分子的亲和力。在一些实施方案中，特异性结合靶分子的结合分子(例如共结合物、结合部分、抗体或其抗原结合片段)结合靶分子的亲和力可以是比其对不同分子的亲和力大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍或大至少100倍。在一些实施方案中，特异性结合特定靶分子的结合剂以如此低的亲和力结合不同的分子，以至于使用本文所述或本领域已知的测定法不能检测结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比确定分子的结合来测量，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可以通过与类似于靶的对照分子(例如过量的未标记靶)竞争来确定。在这种情况下，如果标记的靶与探针的结合被过量的未标记靶竞争性抑制，则表明特异性结合。如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定靶分子或特定靶分子上的表位，可表现为例如分子对靶的K_D为至少约10^-5M、替代地至少约10^-6M、替代地至少约10^-7M、替代地至少约10^-8M、替代地至少约10^-9M、替代地至少约10^-10M、替代地至少约10^-11M、替代地至少约10^-12M、替代地至少约10^-13M、替代地至少约10^-14M、替代地至少约10^-15M或更低。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指以下结合：结合分子与特定靶分子或特定靶分子上的表位结合，而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合。

如本文所用，术语“双特异性抗体”是指至少双特异性的抗体，即能够结合两种不同的抗原或靶分子。双特异性抗体具有至少两个不同的抗原结合位点，其中第一抗原结合位点结合第一抗原或靶分子，并且第二抗原结合位点结合第二抗原或靶分子。除其他外，双特异性抗体可以结合两种不同细胞的不同表面分子，使这些细胞非常邻近。例如，识别靶细胞上的抗原(例如白血病细胞上的FLT3或CD19、黑色素瘤细胞上的CSPG4-抗原或胶质母细胞瘤细胞上的EGFR)和抗原特异性T细胞受体(TCR)/CD3-复合物的双特异性抗体可以靶向肿瘤细胞以进行T细胞介导的裂解。

如本文所用，术语“接头”是指通过共价键或非共价结合连接两个结合部分的分子。这样，肽接头是间插肽序列，其不包括来自第一结合部分的可变区(例如可变轻链或可变重链)的C末端或第二结合部分的可变区(例如可变轻链或可变重链)的N末端的氨基酸残基。作为“连接”两个结合部分的接头，与每个结合部分的连接可以是共价键或非共价结合。具体地，接头与两个结合部分的两个连接可以是共价和共价的、共价和非共价的、或非共价和非共价的。在一些实施方案中，共结合物的接头促进共结合物实现与其靶分子的结合相互作用。在一些实施方案中，接头不干扰第一结合部分和第二结合部分与它们在抗原中的对应表位的结合相互作用。在一些实施方案中，接头的长度被最小化以减少结合时的熵损失或使其最小化。在一些实施方案中，接头的刚性被增强或最大化，以降低结合时的熵损失或使其最小化。接头可以是“不可裂解的”接头。接头可以是“可裂解接头”，它可以在各种生理或非生理条件下裂解。此类可裂解接头包括但不限于酸不稳定接头(例如，腙接头)、含二硫化物的接头、肽酶敏感性接头(例如，包含氨基酸的肽接头，例如缬氨酸和/或瓜氨酸，例如瓜氨酸-缬氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸)、光不稳定接头、二甲基接头(参见例如,Chari等人,1992,Cancer Res.52:127-31；和美国专利号5,208,020)、硫醚接头或设计用于逃避多药物转运蛋白介导的抗性的亲水性接头(参见例如Kovtun等人,2010,Cancer Res.70:2528-37)。接头可以由不同的组成或化学组成制成。在一些实施方案中，接头是多肽接头、核酸接头和/或化学接头。在一些实施方案中，接头不是抗原性的，并且不会引发免疫响应。接头可以通过共价键连接作为第一结合部分的一部分的第一抗体的可变区和作为第二结合部分的一部分的第二抗体的可变区。接头也可以通过非共价结合连接作为第一结合部分的一部分的第一抗体的可变区和作为第二结合部分的一部分的第二抗体的可变区。多肽接头的一些实例描述于Chen等人,Adv Drug Deliv Rev.2013年10月15日；65(10):1357-1369，所述文献以引用方式整体并入本文。

“分离的”抗体基本上不含来自细胞或组织来源的细胞物质或其他污染蛋白质和/或衍生出抗体的其他污染成分，或者化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。语言“基本上不含细胞物质”包括抗体制剂，其中抗体从分离或重组产生它的细胞的细胞成分中分离。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括具有小于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(按干重计)的异源蛋白质(本文中也称为“污染蛋白质”)的抗体制剂。在某些实施方案中，当重组产生抗体时，其基本上不含培养基，例如培养基占蛋白质制品体积的小于约20％、15％、10％、5％或1％。在某些实施方案中，当通过化学合成产生抗体时，其基本上不含化学前体或其他化学品，例如其与参与蛋白质合成的化学前体或其他化学品分离。因此，此类抗体制剂具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(按干重计)的化学前体或化合物，而不是感兴趣的抗体。污染组分还可以包括但不限于会干扰抗体治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在某些实施方案中，抗体将被纯化为(1)按抗体的重量计大于95％，如通过Lowry方法(Lowry等人,1951,J.Bio.Chem.193:265-75)所测定的，例如96％、97％、98％或99％；(2)通过使用旋转杯测序仪达到足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或银染色达到均一性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。在具体实施方案中，本文提供的抗体是分离的。

4链抗体单位是一种异源四聚糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每个H链在N末端具有可变结构域(VH)，随后是α和γ链的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链的N末端都具有可变结构域(VL)，随后在另一端具有恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定区(CH1)对齐。特定氨基酸残基被认为形成轻链可变结构域与重链可变结构域之间的界面。VH和VL配对一起形成单个抗原结合位点。关于不同类别的抗体的结构和性质，参见例如Basic andClinical Immunology 71(Stites等人编,第8版1994)。

术语“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端，并且重链长度为约110至140个氨基酸切轻链长度为约100至110个氨基酸，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可被称为“VH”轻链的可变区可被称为“VL”术语“可变”是指可变区的某些区段在抗体之间的序列差异很大的事实。V区介导抗原结合并定义了特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，在可变区的110个氨基酸跨度上，可变性并不是均匀分布的。相反，V区由约15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的可变性较小(例如，相对不变)的片段组成，这些片段被称为“高变区”的可变性更大(例如，极端可变性)的较短区域分开，每个高变区长约9-12个氨基酸。重链和轻链的可变区各自包含四个FR，主要采用β折叠构型，由三个高变区连接，所述高变区形成连接β折叠结构的环，并且在某些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(参见例如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。不同抗体之间的可变区序列差异很大。在具体实施方案中，可变区是人可变区。

术语“如Kabat中的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指Kabat等人,同上中用于抗体汇编的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用这种编号系统，实际线性氨基酸序列可以含有更少或额外氨基酸，其对应于可变区FR或CDR的缩短或其中的插入。例如，重链可变结构域可包含残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和残基82之后的三个插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定的抗体，残基的Kabat编号可以通过将抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定。当提及可变结构域中的残基(轻链的大约残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如Kabat等人,同上)。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如Kabat等人,同上中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG 1EU抗体的残基编号。其他编号系统已由例如AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHo描述。

“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方案中，完整抗体具有一种或多种效应子功能。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，诸如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段；双抗体和双-双抗体(参见例如Holliger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.90:6444-48；Lu等人,2005,J.Biol.Chem.280:19665-72；Hudson等人,2003,Nat.Med.9:129-34；WO 93/11161；和美国专利号5,837,242和6,492,123)；单链抗体分子(参见例如美国专利号4,946,778；5,260,203；5,482,858；和5,476,786)；双可变结构域抗体(参见例如美国专利号7,612,181)；单可变结构域抗体(sdAb)(参见例如Woolven等人,1999,Immunogenetics 50:98-101；和Streltsov等人,2004,ProcNatl Acad Sci USA.101:12444-49)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

治疗性抗体的“功能片段”、“结合片段”或“抗原结合片段”将表现出完整抗体所具有的至少一种(如果不是一些或全部的话)生物功能，所述功能至少包括与靶抗原的结合。

当用于提及抗体时，术语“重链”指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约120-130个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包含恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是五种不同类型之一(例如，同种型)，称为阿尔法(α)、德尔塔(δ)、艾普斯龙(ε)、伽马(γ)和谬(μ)。不同重链的大小不同：α、δ和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链产生五种熟知的抗体类别(例如，同种型)，分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人重链。

当用于提及抗体时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约100至约110个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包含恒定区。轻链的近似长度为211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，存在两种不同的类型，称为卡帕(κ)或兰姆达(λ)。轻链氨基酸序列是本领域熟知的。轻链可以是人轻链。

如本文所用，术语“宿主”指动物，例如哺乳动物(例如，人)。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以用核酸分子转染的特定受试者细胞以及这种细胞的后代或潜在后代。这种细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲代细胞不同，这是由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响或核酸分子整合到宿主细胞基因组中。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，例如构成该群体的单个抗体是相同的，除了可能少量存在的可能天然存在的突变，并且每种单克隆抗体通常识别抗原上的单个表位。在具体实施方案中，如本文所用，“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体，其中抗体仅结合靶的表位，如通过例如ELISA或本领域已知的其他抗原结合或竞争性结合测定所确定的。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，可用于本公开中的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人,1975,Nature 256:495描述的杂交瘤方法制备，或者可以在细菌或真核动物或植物细胞中使用重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人,1991,Nature 352:624-28和Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581-97中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域熟知的。参见例如Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编,第5版2002)。本文实施例中提供了产生单克隆抗体的示例性方法。

当与生物材料诸如核酸分子、多肽、宿主细胞等结合使用时，术语“天然的”是指在自然界中发现并且没有被人类操纵、修饰和/或改变(例如，分离、纯化、选择)的那些物质。

本文提供的抗体可包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性(参见美国专利号4,816,567；以及Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-55)。

非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是包含人免疫球蛋白(例如，受体抗体)的嵌合抗体，其中天然CDR残基被来自非人物种(例如，供体抗体)的具有所需特异性、亲和力和能力的相应CDR残基置换，所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物。在某些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含不存在于受体抗体中或供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。人源化抗体重链或轻链可包含至少一个或多个可变区中的基本上所有可变区，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些。在某些实施方案中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步详情，参见Jones等人,1986,Nature 321:522-25；Riechmann等人,1988,Nature 332:323-29；Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96；Carter等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；美国专利号6,800,738；6,719,971；6,639,055；6,407,213；和6,054,297。

“人抗体”是指具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体，和/或使用如本文公开的任何用于制备人抗体的技术制备的抗体。人抗体的这个定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381；Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581)和酵母展示文库(Chao等人,2006,Nature Protocols 1:755-68)。也可用于制备人单克隆抗体的方法描述于Cole等人,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy 77(1985)；Boerner等人,1991,J.Immunol.147(1):86-95；以及van Dijk和van deWinkel,2001,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74。人抗体可通过将抗原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已被禁用，所述转基因动物例如小鼠(参见例如Jakobovits,1995,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66；Brüggemann和Taussing,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58；以及关于XENOMOUSE^TM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如Li等人,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-62。

“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VLβ折叠框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。CDR区是本领域技术人员熟知的，并已由例如Kabat定义为抗体可变(V)结构域内的高变区(Kabat等人,1997,J.Biol.Chem.252:6609-16；Kabat,1978,Adv.Prot.Chem.32:1-75)。CDR区序列也由Chothia在结构上定义为不属于保守性β折叠框架的一部分的那些残基，并且因此能够适应不同的构象(Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。这两个术语都是本领域公认的。CDR区序列也已由AbM、Contact和IMGT定义。CDR在标准抗体可变区内的位置已通过多种结构的比较来确定(Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.273:927-48；Morea等人,2000,Methods 20:267-79)。因为在不同的抗体中，高变区内的残基数量不同，相对于标准位置的额外残基通常在标准可变区编号方案中的残基编号旁边用a、b、c等进行编号(Al-Lazikani等人,同上)。这种命名同样为本领域技术人员所熟知的。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”当在本文中使用时，是指抗体可变区中在序列上高变和/或形成结构上确定的环的区域。通常，抗体包含六个高变区，三个在VH中(H1、H2、H3)并且三个在VL中(L1、L2、L3)。许多高变区的描述正在使用中，并且包括在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性，并且是最常用的(参见例如Kabat等人,同上)。反之，Chothia是指结构环的位置(参见例如Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入放在H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则环在32结束；如果仅35A存在，环在33结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。AbM高变区表示Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用(参见例如Antibody Engineering Vol.2(Kontermann和Dübel编,第2版2010))。“接触”高变区基于对现有复杂晶体结构的分析。这些高变区或CDR中每一者的残基如下所示。

最近，开发一种通用编号系统并被广泛采用，ImMunoGeneTics(IMGT)Information(Lafranc等人,2003,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77)。IMGT是集成的信息系统，专门研究人类和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHC)。在本文中，CDR是指氨基酸序列和在轻链或重链中的位置。由于在免疫球蛋白可变结构域结构内CDR的“位置”在物种之间是保守的，并且存在于被称为环的结构中，通过使用根据结构特征比对可变结构域序列的编号系统，很容易识别CDR和框架残基。该信息可用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和置换到通常来自人抗体的受体框架中。Honegger和Plückthun,2001,J.Mol.Biol.309:657-70开发了一种额外编号系统(AHo)。编号系统(包括例如Kabat编号和IMGT唯一编号系统)之间的对应关系是本领域技术人员所熟知的(参见例如Kabat,同上；Chothia和Lesk,同上；Martin,同上；Lefranc等人,同上)。

	IMGT	Kabat	AbM	Chothia	Contact
						VH CDR1	27-38	31-35	26-35	26-32	30-35
VH CDR2	56-65	50-65	50-58	53-55	47-58
						VH CDR3	105-117	95-102	95-102	96-101	93-101
VL CDR1	27-38	24-34	24-34	26-32	30-36
						VL CDR2	56-65	50-56	50-56	50-52	46-55
VL CDR3	105-117	89-97	89-97	91-96	89-96

高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。如本文所用，术语“HVR”和“CDR”可互换使用。

术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如与Fc受体的相互作用。所述术语是指免疫球蛋白分子的一部分，其相对于免疫球蛋白的另一部分，即含有抗原结合位点的可变区，具有更保守的氨基酸序列。恒定区可以含有重链的CH1、CH2和CH3区和轻链的CL区。

术语“框架”或“FR”是指侧接CDR的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体、双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是除高变区残基或CDR残基以外的可变结构域残基。

“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变(例如氨基酸序列变异，包括改变、添加和/或缺失)的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，这导致抗体对抗原的亲和力改善。亲和力成熟的抗体可以对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序产生。关于综述，参见Hudson和Souriau,2003,Nature Medicine 9:129-34；Hoogenboom,2005,Nature Biotechnol.23:1105-16；Quiroz和Sinclair,2010,Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51。

“结合亲和力”通常是指分子的单个结合位点(例如，结合蛋白，诸如抗体)与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另外说明，本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。结合分子X对其结合配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(K_D)表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法(包括本文中描述的那些方法)进行测量。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原，并倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快结合抗原，并且倾向于保持结合时间更长。本领域已知多种测量结合亲和力的方法，其中任一种都可以用于本公开的目的。具体的说明性实施方案包括以下内容。在一个实施方案中，“K_D”或“K_D值”可以通过本领域已知的测定法，例如通过结合测定法来测量。K_D可以在RIA中测量，例如用感兴趣的抗体及其抗原的Fab形式进行(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865-81)。K_D或K_D值也可以通过使用的表面等离子共振测定法，使用例如或或通过使用例如系统的生物层干涉测量法来测量。“缔合速率(on-rate/rateof association/association rate/k_on)”也可以用上文所述的相同表面等离子共振或生物层干涉测量技术，例如使用或 或系统来测定。“解离速率(off-rate/rate of dissociation/dissociation rate/k_off)”也可以用上文所述的相同表面等离子共振或生物层干涉测量技术，例如使用或或系统来测定。

如本文所用，术语“有效量”是指本文提供的共结合物或药物组合物足以产生有益或期望结果的量。可通过一次或多次施用、应用或给药来施用有效量。这种递送取决于许多变量，包括使用单个剂量单位的时间、药剂的生物利用度、施用途径等。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指治疗剂(例如，本文提供的共结合物)足以减轻和/或改善给定疾病和/或与其相关的症状的严重性和/或持续时间的量。治疗剂的治疗有效量可以是减少或改善给定疾病的发展或进程，减少或改善给定疾病的复发、发展或发作，和/或改善或增强另一种疗法(例如，除了施用本文提供的共结合物之外的疗法)的预防或治疗效果所必需的量。

当与多肽结合使用时，术语“变体”是指与多肽的天然或未修饰序列相比，包含一个或多个(例如，约1至约50个、约1至约45个、约1至约40个、约1至约35个、约1至约30个、约1至约25个、约1至约20个、约1至约18个、约1至约15个、约1至约10个或约1至约5个)氨基酸序列取代、缺失和/或添加的多肽。例如，共结合物的变体可由天然或先前未修饰的共结合物的氨基酸序列的一个或多个(例如，约1至约25个、约1至约20个、约1至约18个、约1至约15个、约1至约10个或约1至约5个)改变产生。变体可以通过本领域普通技术人员已知的分子克隆技术，例如随机诱变或定点诱变来构建。变体可以由编码所述变体的相应核酸分子制备。在具体实施方案中，共结合物的变体保留共结合物的功能性质或活性(例如结合、激动剂、拮抗剂、阻断、中和和/或活化活性/性质)。在具体实施方案中，变体由在共结合物的一个或多个区域或亚区域，例如一个或多个CDR中包含一个或多个单核苷酸多态性(SNP)的核酸分子编码。

术语“载体”是指用于携带或包含核酸序列，包括例如编码如本文所述的共结合物的核酸序列，以便将核酸序列引入宿主细胞的物质。适于使用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、额外体和人工染色体，其可包含可操作用于稳定整合到宿主细胞染色体中的选择序列或标记。此外，载体可以包含一个或多个选择标记基因和适当的表达控制序列。例如，可包含的选择标记基因提供对抗生素或毒素的抗性，补充营养缺陷型缺陷，或供应培养基中不存在的关键营养物。表达控制序列可包括本领域熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两种或更多种核酸分子共表达(例如抗体重链和轻链或抗体VH和VL)时，两种核酸分子可被插入到例如单一表达载体或单独的表达载体中。对于单载体表达，编码核酸可以可操作地连接至一个共同的表达控制序列或连接至不同的表达控制序列，例如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。将核酸分子引入到宿主细胞中可使用本领域熟知的方法来证实。此类方法包括例如核酸分析，诸如mRNA的RNA印迹或聚合酶链式反应(PCR)扩增、基因产物表达的免疫印迹、或测试所引入的核酸序列或其相应基因产物的表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员应理解，核酸分子以足以产生所需产物(例如，如本文所述的共结合物)的量表达，并且进一步理解，可以使用本领域熟知的方法优化表达水平以获得足够的表达。

如本文所用，术语“保守取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，并且通常可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，一般来说，多肽非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物活性(参见例如Watson等人,MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页(第4版1987))。此类示例性取代可以根据表1和以下描述中列出的那些来进行。在保守氨基酸取代中，氨基酸残基被包含具有相似电荷的侧链或具有相似性质的侧链的氨基酸残基置换。在本领域中已定义包含具有相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。氨基酸也可以根据它们侧链性质的相似性进行分组(参见例如Lehninger,Biochemistry 73-75(第2版1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。替代地，天然存在的残基可以根据共同的侧链性质分成几组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

例如，不参与维持抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基也可以被例如另一种氨基酸诸如丙氨酸或丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。在某些实施方案中，保守取代包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任一者取代这些疏水性氨基酸中的任一者；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)并且反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)并且反之亦然；用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)并且反之亦然。根据特定氨基酸的环境及其在蛋白质三维结构中的作用，其他取代也可以被认为是保守的。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可以是可互换，丙氨酸(A)和缬氨酸(V)也可以是可互换的。相对疏水的甲硫氨酸(M)可以与亮氨酸和异亮氨酸互换，并且有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)可以在氨基酸残基的显著特征是其电荷并且这两个氨基酸残基的不同pK不显著的位置中是可互换的。还有其他改变可以在特定环境中被认为是“保守的”(参见例如本文中的表1；第13-15页“Biochemistry”第2版Lubert Stryer编(Stanford University)；Henikoff等人,PNAS1992第89卷10915-10919；Lei等人,J Biol Chem 1995年5月19日；270(20):11882-11886)。其他取代也是允许的，并且可以凭经验或根据已知的保守取代来确定。

表1：氨基酸替代或相似性矩阵

改编自GCG软件9.0BLOSUM62氨基酸取代矩阵(块取代矩阵)。

所述值越高，在相关的天然蛋白质中发现取代的可能性越大。

术语“同源性”或“同源的”是指两个多核苷酸之间或两个多肽之间的序列相似性。相似性可以通过比较出于比较目的而比对的每个序列中的位置来确定。如果两个多肽序列的给定位置不相同，则该位置的相似性或保守性可以通过评定该位置的氨基酸的相似性，例如根据表1、根据如上所述的侧链电荷的相似性或根据如上所述的侧链性质的相似性来确定。序列之间的相似性程度是序列共有的匹配(相同)或同源位置数量的函数。可以使用本领域已知的软件程序，诸如例如Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)中所述的那些软件程序来进行两个序列的比对，以确定它们的序列相似性百分比。优选地，使用默认参数进行比对，其实例如下所述。可以使用的本领域熟知的一种比对程序是设置为默认参数的BLAST。具体地，程序是使用以下默认参数BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；预期值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；分选依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详情可以在国家生物技术信息中心找到。

术语给定氨基酸序列或核酸序列的“同源物”旨在指示“同源物”的相应序列与给定氨基酸序列或核酸序列具有基本同一性或同源性。

术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列来确定。关于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并引入空位(如果需要的话)以实现最大百分比的序列同一性之后，并在不将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了测定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNAStar,Inc.)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

两个序列(例如氨基酸序列或核酸序列)之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:22642268的算法，如Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877中改编。这种算法被并入Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序参数集(例如分数＝100，字长＝12)来进行，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序参数集(例如至得分50，字长＝3)来进行，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以利用如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389 3402中所述的缺口BLAST。替代地，PSI BLAST可用于进行迭代搜索，从而检测分子之间的距离关系(Id.)。当使用BLAST、缺口BLAST和PSI Blast程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如XBLAST和NBLAST的默认参数)(参见例如万维网ncbi.nlm.nih.gov上的国家生物技术信息中心(NCBI))。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是Myers和Miller,1988,CABIOS 4:11 17的算法。这种算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，所述程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。

两个序列之间的同一性百分比可以使用类似于上述技术的技术来确定，允许或不允许有缺口。在计算同一性百分比时，通常仅计算精确匹配。

如本文所用，术语“截短”当用于多肽/蛋白质的上下文中时，是指多肽的氨基酸序列从多肽序列的任一端缩短，用于确定缩短的算法在下文中进一步提供，并且在以句子“[i]在本文提供的共结合物的某些实施方案中，本公开表明VR2、VLAb2、VHAb2或第二结合部分的截短或缺失是通过例如以下示例性方法确定的”开始的段落之后的几个段落中提供。类似地，术语“截短”当用于核酸的上下文中时，是指核酸的核苷酸序列从核苷酸序列的5’端或3’端缩短。多肽/蛋白质截短的N末端截短或从N末端截短是指从多肽/蛋白质的N端(即N末端)缩短多肽/蛋白质序列。类似地，多肽/蛋白质截短的C末端截短或从C末端截短是指从多肽/蛋白质的C端(即C末端)缩短多肽/蛋白质序列。截短可以是多肽/蛋白质的任一端或两端的一个或多个氨基酸的缩短。例如，截短可以是从多肽/蛋白质的N端或C端缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。例如，截短可以是从多肽/蛋白质的N端和C端缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。蛋白质截短可能是编码蛋白质的核酸序列截短、产生过早终止密码子而不缩短核酸序列的取代或其他突变的结果，或者来自RNA的交替剪接，其中本身不引起截短的取代或其他突变导致异常RNA加工。“截短突变体”或“截短突变”是指在多肽/蛋白质的情况下具有一个或多个氨基酸截短或在核酸的情况下具有一个或多个核苷酸截短的变体。

如本文所用，术语“缺失”当用于多肽/蛋白质的上下文中时，是指从多肽/蛋白质的序列中移除一个或多个氨基酸。去除的一个或多个氨基酸可以是多肽/蛋白质的连续序列，即连续部分，或者可以散布在多肽/蛋白质的序列中。缺失可以是内部缺失，其中移除的一个或多个氨基酸都不是多肽/蛋白质序列的N末端或C末端氨基酸。缺失也可以是从N端的缺失(N末端缺失)或从C端的缺失(C末端缺失)，其中从多肽/蛋白质的N端或C端连续的一个或多个氨基酸序列被移除。缺失也可以是包括内部缺失、N末端缺失和/或C末端缺失的缺失。从描述中可以清楚地看出，N末端缺失也是N末端截短，并且C末端缺失也是C末端截短。如果通过应用本文所述的算法满足N末端截短的标准，则满足内部缺失定义的序列也可被认为是本文所述的N末端截短。

氨基酸残基/位置的“修饰”是指与起始氨基酸序列相比一级氨基酸序列的改变，其中所述改变是由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变引起的。例如，典型的修饰包括用另一种氨基酸取代残基(例如，保守或非保守取代)、在所述残基/位置附近插入一个或多个(例如，通常少于5、4或3个)氨基酸、和/或所述残基/位置缺失。

当两种抗体识别三维空间中相同的、重叠的或相邻的表位时，抗体结合“表位”、与参考抗体“基本上相同的表位”或“相同的表位”。用于确定两种抗体是否与三维空间中相同的、重叠的或相邻的表位结合的最广泛使用且快速的方法是竞争测定，其可以以许多不同的形式配置，例如使用标记的抗原或标记的抗体。在一些测定中，抗原被固定在96孔板上，或在细胞表面上表达，并且使用放射性标记、荧光标记或酶标记来测量未标记抗体阻断标记抗体的结合的能力。

“表位作图”是鉴定抗体在其靶抗原上的结合位点或表位的过程。“表位聚类(Epitope binning)”是根据抗体识别的表位对抗体进行分组的过程。更具体而言，表位聚类包括用于使用竞争测定法区分不同抗体的表位识别性质的方法和系统，与用于基于抗体的表位识别性质对抗体进行聚类并鉴定具有不同结合特异性的抗体的计算方法组合。

如本文所用，“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。术语“载体”也可以指稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全或不完全))、赋形剂或媒介物。此类载体，包括药物载体，可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当组合物(例如药物组合物)静脉内施用时，水是示例性载体。也可采用盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液作为液体载剂，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂(例如，药物赋形剂)包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可呈溶液剂、混悬剂、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等形式。包括制剂在内的口服组合物可以包含标准载体，诸如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于Remington和Gennaro,Remington’sPharmaceutical Sciences(第18版1990)。组合物，包括药物化合物，可以含有例如呈分离或纯化形式的共结合物以及适量的载体。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指被联邦政府或州政府的管理机构批准，或被列入美国药典、欧洲药典或其他公认的用于动物(以及更具体地人类)的药典。

如本文所用，“多克隆抗体”是指在对具有许多表位的蛋白质的免疫原性响应中产生的抗体群，并且因此包括针对蛋白质内相同或不同表位的多种不同抗体。用于产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见例如Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编,第5版2002))。

“分离的核酸”是基本上与其他基因组DNA序列以及天然伴随天然序列的蛋白质或复合物诸如核糖体和聚合酶分离的核酸，例如RNA、DNA或混合核酸。“分离的”核酸分子是与存在于核酸分子天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，可以当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。在一个具体实施方案中，分离或纯化一种或多种编码如本文所述的抗体的核酸分子。所述术语包括已从其天然存在的环境中取出的核酸序列，并包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可以包括分子的分离形式。

如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如本文所用，“寡核苷酸”是指短的、通常为单链的合成多核苷酸，其长度通常但不一定少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非相互排斥的。对于多核苷酸的以上描述同样地并且完全地适用于寡核苷酸。产生本公开的共结合物的细胞可以包括亲代杂交瘤细胞，以及其中已经引入编码抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。下文公开合适的宿主细胞。

除非另有说明，否则本文公开的任何单链多核苷酸序列的左手端是5’端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5’方向。新生RNA转录物5’到3’添加的方向被称为转录方向；DNA链上与RNA转录物，即RNA转录物5’至5’端的区域具有相同序列的序列区域，被称为“上游序列”；DNA链上与RNA转录物，即RNA转录物的3’至3’端具有相同序列的序列区域被称为“下游序列”

术语“重组抗体”、“重组共结合物”或“重组多肽/蛋白质”是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体、共结合物、多肽/蛋白质。例如，重组共结合物可以是使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的共结合物；从重组组合文库中分离的共结合物；或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的共结合物。对于另一个实例，重组多肽/蛋白质可以是使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽/蛋白质；从重组组合文库中分离的多肽/蛋白质；或者通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的多肽/蛋白质。对于另一个实例，重组抗体可以是使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组组合抗体文库中分离的抗体；从转基因的和/或跨染色体的人免疫球蛋白基因的动物(例如，小鼠或牛)中分离的抗体(参见例如Taylor等人,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-95)；或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体可以具有可变区和恒定区，包括衍生自人种系免疫球蛋白序列的那些(参见Kabat等人,同上)。然而，在某些实施方案中，此类重组抗体可以经受体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是如下序列，虽然其衍生自人种系VH和VL序列并与之相关，但可能并不天然存在于人体内抗体种系库中。

如本文所用，术语“治疗剂”是指可用于治疗、管理或改善疾病和/或与其相关的症状的药剂。在某些实施方案中，治疗剂包括如本文所述的共结合物。

如本文所用，术语“诊断剂”是指有助于诊断疾病的物质。诊断剂可以在体外或体内使用。在一些实施方案中，诊断剂用于体外测定。在一些实施方案中，向受试者施用诊断剂。此类药剂可用于揭示、查明和/或确定致病过程的位置。在一些实施方案中，诊断剂当向受试者施用或与来自受试者的样品接触时，有助于诊断癌症或肿瘤形成。在某些实施方案中，诊断剂包括本文所述的共结合物。

术语“受试者”和“患者”可以可互换使用。如本文所用，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴和人)。在具体实施方案中，受试者是人。

“基本上全部”是指至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。

术语“可检测剂”或“可检测分子”在本文中可互换使用，并且是指可用于确定样品或受试者中所需分子存在与否的物质，例如如本文所述的共结合物。可检测剂可以是能够被可视化的物质或者能够被测定和/或测量(例如，通过定量)的物质。

当用于提及核酸分子时，术语“编码核酸”或其语法等同物是指处于天然状态或通过本领域技术人员熟知的方法操纵时的核酸分子，其可被转录以产生mRNA，然后被翻译成多肽和/或其片段。反义链是这种核酸分子的互补链，并且编码序列可以由此推导出来。

术语“赋形剂”是指通常用作稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂或稳定剂的惰性物质，并且包括但不限于蛋白质(例如血清白蛋白等)、氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸等)、脂肪酸和磷脂(例如烷基磺酸酯、辛酸酯等)、表面活性剂(例如SDS、聚山梨醇酯、非离子表面活性剂等)、糖类(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖等)和多元醇(例如甘露醇、山梨醇等)。还参见Remington和Gennaro,Remington’s PharmaceuticalSciences(第18版1990)，其以引用的方式整体并入本文。

如本文所用，术语“化合物”包括分子量小于约5kD、小于约4kD、小于约3kD、小于约2kD、小于约1kD或小于约0.5kD的有机小分子和无机化学品，包括但不限于其所有类似物、衍生物、盐和溶剂化物(例如水合物)。在一些实例中，化合物可以包括核酸、肽、肽模拟物、类肽、其他小有机化合物或药物等。化学和/或生物混合物(诸如真菌、细菌或藻类提取物)的文库是本领域已知的，并且可以用本文提供的任何测定法进行筛选。化合物库合成方法的实例可见于：(Carell等人,1994a；Carell等人,1994b；Cho等人,1993；DeWitt等人,1993；Gallop等人,1994；Zuckermann等人,1994)。

在肽或多肽的上下文中，如本文所用，术语“片段”指包含少于全长氨基酸序列的肽或多肽。这种片段可能来自例如氨基末端的截短、羧基末端的截短和/或氨基酸序列残基的内部缺失。

术语“约”和“大约”意指给定值或范围的20％内、15％内、10％内、9％内、8％内、7％内、6％内、5％内、4％内、3％内、2％内、1％内或更少。

“施用(Administer/administration)”是指将存在于体外的物质(例如，如本文所述的共结合物)注入或以其他方式物理递送至患者体内的行为，诸如通过粘膜、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。

术语“组合物”旨在包括含有任选地特定量的指定成分(例如，本文所提供的抗体)的产品。

如本文在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括多个指示物。因此，例如，提及“肽序列”包括多个此类序列等等。

如本文所用，在整个文件中，数值通常以范围格式表示。范围格式的使用仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本公开范围的不可改变的限制，除非上下文另外明确指示。因此，范围的使用明确地包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值以及所有数值或数值范围，包括此类范围内的整数以及范围内的数值或整数的分数，除非上下文中另有明确说明。无论范围的宽度如何，这种结构都适用于本专利文件的所有上下文。

为了简明起见，本文使用了某些缩写。一个实例是代表氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸及其相应三字母和单字母缩写如下：

丙氨酸 Ala (A)

精氨酸 Arg (R)

天冬酰胺 Asn (N)

天冬氨酸 Asp (D)

半胱氨酸 Cys (C)

谷氨酸 Glu (E)

谷氨酰胺 Gln (Q)

甘氨酸 Gly (G)

组氨酸 His (H)

异亮氨酸 Ile (I)

亮氨酸 Leu (L)

赖氨酸 Lys (K)

甲硫氨酸 Met (M)

苯丙氨酸 Phe (F)

脯氨酸 Pro (P)

丝氨酸 Ser (S)

苏氨酸 Thr (T)

色氨酸 Trp (W)

酪氨酸 Tyr (Y)

缬氨酸 Val (V)

II.结合物分子—其组分和构型

在一些方面，本文提供了一种结合物分子，例如靶多肽，其包含特异性识别靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分。如本文所述，本文所述的结合物分子的第二结合部分使得高亲和力结合平台成为可能，所述平台可以包含各种其他组分，以提供对各种应用有用的多种构型。应当理解，术语“第二结合部分”并不意味着存在单独的第一结合部分。换言之，结合物分子可以包含：1)作为第二结合部分的单一结合部分，2)不是结合部分的第一部分和第二结合部分；或者它可以包含第一结合部分和第二结合部分。类似的推理适用于本文提供的描述的其他方面，例如将共结合物描述为包含第二抗体部分并不意味着存在单独的第一抗体部分。

例如，在一些实施方案中，结合物分子包含共结合物，所述共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分，其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，第一结合部分包含第一V_HH结构域，其中第二结合部分包含具有N末端截短的第二V_HH结构域(“截短的V_HH结构域”)，并且其中第一V_HH结构域的C末端经由接头与第二V_HH结构域的N末端连接。

在一些实施方案中，结合物分子包含第一部分，例如酶、药物或毒素，其中第一部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。

在一些实施方案中，结合物分子包含接头，其中第二结合部分通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与接头连接。在一些实施方案中，结合物分子不包含接头。

在以下部分中，提供了结合物分子的各个方面的额外描述。以模块方式进行的这种描述并不旨在限制本公开的范围，并且基于本文提供的教导，本领域普通技术人员将容易理解，某些模块可以被集成，至少部分地被集成。本文所用的小节标题仅出于组织性目的并且不解释为限制所描述的主题。

在一些实施方案中，结合物分子的一个或多个特征，诸如FR1、CDR1、VH或VL中的一个或多个，根据IMGT编号方案或Kabat编号方案来确定。

A.第二结合部分

本文提供的结合物分子例如共结合物包含第二结合部分，所述第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分。如本文所提供的，第二抗体部分可以采取多种形式，并且包括确定其N末端截短的描述。在一些实施方案中，第二结合部分还包含另一部分，例如缀合标记或药物。

1.第二结合部分的抗体部分

本文提供了包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的抗体部分。第二结合部分的抗体部分特异性识别靶位点，例如多肽表位。

在一些实施方案中，第二结合部分的抗体部分是可变区(在一些实施方案中，在本文中称为VR，并且任选地，具有其数字标识，例如VR2)。在一些实施方案中，第二结合部分的抗体部分是重链可变区(在一些实施方案中，在本文中称为VHAb或VH结构域)。在一些实施方案中，重链可变区与轻链可变区缔合。在一些实施方案中，其中与轻链可变区缔合的重链可变区是单链，诸如scFv。在一些实施方案中，重链可变区连接至至少一个恒定区和/或轻链可变区连接至至少一个恒定区，例如Fab或scFab。在一些实施方案中，其中重链可变区与轻链可变区缔合，重链可变区和轻链可变区来自相同的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，与轻链可变区缔合的重链可变区形成稳定的复合物。在一些实施方案中，重链可变区和轻链可变区相互缔合以形成抗原结合结构域。

在一些实施方案中，第二结合部分的抗体部分是轻链可变区(在一些实施方案中，在本文中称为VLAb或VL结构域)。在一些实施方案中，轻链可变区是人兰姆达(λ)轻链的轻链可变区。在一些实施方案中，轻链可变区是人卡帕(κ)轻链的轻链可变区。在一些实施方案中，轻链可变区与重链可变区缔合。在一些实施方案中，其中与重链可变区缔合的轻链可变区是单链，例如scFv。在一些实施方案中，轻链可变区连接至至少一个恒定区和/或重链可变区连接至至少一个恒定区，例如Fab或scFab。在一些实施方案中，其中轻链可变区与重链可变区缔合，轻链可变区和重链可变区来自相同的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，与重链可变区缔合的轻链可变区形成稳定的复合物。在一些实施方案中，轻链可变区和重链可变区相互缔合以形成抗原结合结构域。

在一些实施方案中，第二结合部分的抗体部分还包含一个或多个恒定结构域，例如CH1、CH2、CH3或CL中的任一个或多个。

在一些实施方案中，第二结合部分的抗体部分是V_HH结构域。在一些实施方案中，第二结合部分的抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’和(Fab’)2片段。在一些实施方案中，第二结合部分的抗体部分是单结构域抗体。

在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短的抗体可变区是截短的可变区。在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短的抗体可变区是截短的重链可变区。在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短的抗体可变区是与轻链可变区缔合的截短的重链可变区。在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短的抗体可变区是截短的轻链可变区。在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短的抗体可变区是与重链可变区缔合的截短的轻链可变区。在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短的抗体可变结构域是截短的V_HH结构域。在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短的抗体可变结构域是截短的Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短的抗体可变结构域是截短的单结构域抗体。

本文提供的第二结合部分或其至少一部分可以从多种来源获得或衍生。例如，在一些实施方案中，第二结合部分或其至少一部分从骆驼科动物获得或衍生，诸如骆驼科动物单链V_HH。

在一些实施方案中，第二结合部分或其至少一部分从亲和体、affilin、affimer、affitin、α体、anticalin、适体、亲合体、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单体、纳米抗体(也称为单结构域抗体、sdAb)或nanoCLAMP获得或衍生。在一些实施方案中，第二结合部分或其至少一部分从IgG、IgA、IgE、IgM或IgD获得或衍生。

在一些实施方案中，第二结合部分或其至少一部分从哺乳动物获得或衍生，所述哺乳动物包括骆驼、人、非人灵长类动物(诸如猴)、家畜、农场或动物园动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠或猫。在一些实施方案中，第二结合部分或其至少一部分从合成来源获得或衍生。

本文提供的第二结合部分的抗体部分特异性识别靶位点。所述靶位点包括多种表位，包括多肽、核酸和小分子上的表位。

2.截短及其确定

在某些方面，本文所述的第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分。

在一些实施方案中，第二结合部分的截短是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的截短。在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短是第二结合部分的框架区1(FR1)中的截短。在一些实施方案中，第二结合部分包含V_HH，其包含第二结合部分的框架区1(FR1)中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的N末端截短。

在一些实施方案中，第二抗体部分(或第二抗体部分的N末端氨基酸)的多肽接头的X₃氨基酸和互补决定区1(CDR1)的起点(如由CDR1的N末端氨基酸侧的CDR1的第一氨基酸表征)相隔不超过25个氨基酸，诸如不超过24个氨基酸、23个氨基酸、22个氨基酸、21个氨基酸、20个氨基酸、19个氨基酸、18个氨基酸、17个氨基酸、16个氨基酸、15个氨基酸、14个氨基酸、13个氨基酸、12个氨基酸、11个氨基酸、10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸或3个氨基酸中的任一者。

多肽/蛋白质的N末端截短或从N末端的截短是指从多肽/蛋白质的N端(即N末端)缩短多肽/蛋白质序列。对于结合物分子中包含的抗体可变结构域(例如，第二抗体部分)，基于与全长抗体可变结构域的比较来确定抗体可变结构域的N末端截短。抗体可变区的FR1区是非常保守的，并且多肽是否包含具有N末端截短的抗体可变区可以通过本领域已知的方法容易地确定。例如，包含抗体可变结构域的多肽中氨基酸(“编号的氨基酸”)的相应位置可以首先通过将多肽序列与全长抗体可变区进行比对来确定，或者根据任何建立的可变区残基编号系统，诸如Kabat、IMGT、EU编号系统、AbM、Chothia、Contact和AHo来确定。已开发了许多计算机算法，并且本领域普通技术人员可从因特网上获得这些算法，以输入序列并获得根据本文提供的任一种特定编号方案编号的序列。此类示例性工具包括：抗原受体编号和受体分类(ANARCI，opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/anarci/；描述于Dunbar等人,Bioinformatics.2016年1月15日；32(2):298-300，其以引用的方式整体并入本文中)；由Prof.Andrew C.R.Martin(bioinf.org.uk/abs/；abysis.org/)开发的Ysis在线或独立工具；AHo's Amazing Atlas of Antibody Anatomy(AAAAA；bioc.uzh.ch/antibody；描述于A.Honegger和A.Plückthun.J.Mol.Biol,309(2001)657-670，其以引用的方式整体并入本文中)。其次，将共结合物(包含抗体可变结构域序列和可能的接头序列的一部分)的每个编号的氨基酸与在相同编号方案下在相应编号位置以一定频率天然存在的氨基酸相比较。如果共结合物的编号氨基酸中1号位置的氨基酸出现的频率不超过天然存在的抗体可变区的约3％，则认为共结合物中的抗体可变区具有在第一N末端氨基酸处的截短，并且编号氨基酸中1号位置的氨基酸将被认为是接头序列的一部分。类似地，如果共结合物的编号氨基酸中1号和2号位置的氨基酸出现的频率不超过天然存在的抗体可变区的约3％，则认为共结合物中的抗体可变区具有在第一N末端氨基酸和第二N末端氨基酸处的截短(即N末端截短的抗体可变区的N末端截短为2个氨基酸)，并且编号氨基酸中1号和2号位置的氨基酸将被认为是接头序列的一部分。如果共结合物的编号氨基酸中1、2和3号位置的氨基酸出现的频率不超过天然存在的抗体可变区的约3％，则认为共结合物中的抗体可变区具有在第一N末端氨基酸、第二N末端氨基酸和第三N末端氨基酸处的截短(即N末端截短的抗体可变区的N末端截短为3个氨基酸)，并且编号氨基酸中1、2和3号位置的氨基酸将被认为是接头序列的一部分。对氨基酸的N末端N个位置反复进行这种比较。如果共结合物的编号氨基酸中1、2、3……和N号位置的氨基酸出现的频率不超过天然存在的抗体可变区的约3％，则认为共结合物中的抗体可变区具有在第一N末端氨基酸、第二N末端氨基酸、第三N末端氨基酸和第N个N末端氨基酸处的截短(即N末端截短的抗体可变区的N末端截短是N个氨基酸)，并且编号氨基酸中1-N号位置的氨基酸将被认为是接头序列的一部分。在一些实施方案中，使用ANARCI程序确定N末端截短(参见Dunbar等人,Nucleic Acids Res,44,2016)。在一些实施方案中，使用abYsis程序确定N末端截短(例如，3.4.1版；还参见Swindells等人,J Mol Biol,429,2017)。在一些实施方案中，使用AAAAA程序确定N末端截短(参见Honegger和Plückthun,J Mol Biol,309,2001)。替代地或另外地，结合物分子中包含的抗体可变结构域(例如，第二抗体部分)的N末端截短可以通过模拟第二结合部分和任选的相邻残基的三级结构来确定(或证实)。相对于野生型抗体部分中的相应全长FR1区域(例如，V_HH)缩短的β折叠结构指示存在N末端截短。用于模拟抗体三级结构的各种计算机程序是本领域熟知的，例如Alphafold(参见Jumper等人,Nature,596,2021)。

因为第二结合部分通常位于其他氨基酸序列(例如接头序列)之前，所以通过目测检查氨基酸序列比对，第二结合部分中N末端截短的存在可能不太明显。在此类情形下，第二结合部分中的截短可以通过例如以下示例性方法来确定。首先，将结合物分子的氨基酸序列(或其包含第二结合部分和相邻氨基酸残基的部分)与免疫球蛋白的氨基酸序列(诸如第二结合部分所属的免疫球蛋白(Ig)家族的同种型)进行比对。其次，然后根据与第二结合部分比对的Ig同种型氨基酸的位置编号，对第二结合部分序列的每个氨基酸进行编号(图1)。然后将每个编号的氨基酸与在该编号位置天然存在或以一定频率天然存在的Ig家族的氨基酸相比较。在一些实施方案中，这种比较是在Ig家族的相同编号位置处用以一定频率天然存在的氨基酸进行，所述频率超过1％，诸如超过2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％中的任一者。对结合物分子的第二结合部分中氨基酸的N末端N个位置反复进行这种比较(图1)。在一些实施方案中，N是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者。

基于为了确定截短而完成的比较，如果编号位置的氨基酸不同于Ig家族相应位置的天然氨基酸，则该编号位置是结合物分子的第二结合部分中的错配，并且错配的氨基酸被定义为结合物分子的第二结合部分中缺失或缺少的氨基酸(因为天然氨基酸在该位置缺少)。前N个氨基酸中错配或缺失的数量计算为M＝前N个氨基酸中与天然存在的残基不匹配的位置的数量。错配百分比(“错配％”)计算为(M/N)×100％，这是由前N个氨基酸内与天然存在的氨基酸不匹配的位置数目与数目N的比率转换的百分比。当N末端N个氨基酸的错配％超过某一阈值时，根据本文提供的公开内容，N末端N个氨基酸已被截短。在一些实施方案中，错配％的特定阈值为至少约50％，例如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％中的任一者。在一些实施方案中，当N末端N个氨基酸的错配％为至少50％，例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％中的任一者时，本公开表明N末端N个氨基酸已被截短。在一些实施方案中，当N末端N个氨基酸的错配％为100％时，本公开表明N末端N个氨基酸已被截短。在一些实施方案中，当N末端N个氨基酸的错配％为50％或更多时，N末端N个氨基酸已被截短。不受理论束缚，本发明人认为50％或更多的N末端N个氨基酸的错配与第二结合部分的N末端N氨基酸处β折叠结构的破坏有关。因此，通过结构分析，相对于野生型抗体部分中的相应全长FR1区域，N末端截短的存在可以通过缩短的β折叠进一步证实。

图1中的流程图示出了确定从结合物分子的第二结合部分缺少、缺失和/或截短的氨基酸总数的迭代过程。在一些实施方案中，为了确定氨基酸截短，在结合物分子的序列或其一部分(例如第二结合部分的序列)与如表3、表4和表5中列出的同种型Ig的框架1区(FR1，框架区1)的一个或多个序列之间进行比对(其可见于题为某些表的部分中)。在一些实施方案中，为了确定氨基酸截短，在结合物分子的序列或其一部分(例如第二结合部分的序列)与一个或多个同种型Ig的序列之间进行比对，所述序列根据表3、表4和表5左栏中列出的数据库标识符在数据库中公开，并且所述序列以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，为了确定氨基酸截短，基于结合物分子或其部分的同种型，在结合物分子或其部分的序列(例如第二结合部分的序列)与表3、表4和表5中列出的同种型Ig的框架1区(FR1，框架区1)的一个或多个序列之间进行比对。

第二结合部分中的N末端截短也可以例如通过以下额外示例性方法来确定。首先，根据任一种已知的抗体编号方案对第二结合部分的序列进行编号，包括例如本领域普通技术人员已知的和本文提供的Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT或AHo编号(图2)。已开发了许多计算机算法，并且本领域普通技术人员可从因特网上获得这些算法，以输入序列并获得根据本文提供的任一种特定编号方案编号的序列。此类示例性工具包括：抗原受体编号和受体分类(ANARCI，opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/anarci/；描述于Dunbar等人,Bioinformatics.2016年1月15日；32(2):298-300，其以引用的方式整体并入本文中)；由Prof.Andrew C.R.Martin(bioinf.org.uk/abs/；abysis.org/)开发的Ysis在线或独立工具；AHo's Amazing Atlas ofAntibody Anatomy(AAAAA；bioc.uzh.ch/antibody；描述于A.Honegger和A.Plückthun.J.Mol.Biol,309(2001)657-670，其以引用的方式整体并入本文中)。其次，将第二结合部分序列的每个编号的氨基酸与第二结合部分所属的相同Ig家族中编号位置(在相同编号方案下)天然存在或以一定频率天然存在的氨基酸进行比较。在一些实施方案中，这种比较是用在第二结合部分所属的相同Ig家族的相同编号位置以一定频率天然存在的氨基酸进行的，所述频率超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％中的任一者。对第二结合部分中氨基酸的N末端N个位置重复进行这种比较(图1)。在一些实施方案中，N是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任一者。

基于本文所述的比较，如果编号位置的第二结合部分不同于Ig家族相应位置的天然氨基酸，则该编号位置是第二结合部分中的错配，并且错配氨基酸被定义为第二结合部分中缺失或缺少的氨基酸(因为天然氨基酸在该位置缺失)。前N个氨基酸内错配或缺失的数目计算为M＝前N个a.a.内与天然存在的残基不匹配的位置数目。错配百分比(“错配％”)计算为(M/N)×100％，这是由前N个氨基酸内与天然存在的氨基酸不匹配的位置数目与数目N的比率转换的百分比。当N末端N个氨基酸的错配％超过某一阈值时，本公开表明N末端N个氨基酸已被截短。在一个实施方案中，当N末端N个氨基酸的错配％为至少20％，诸如至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者时，本公开表明N末端N个氨基酸已被截短。

因此，可以如本文所述确定缺少、缺失和/或截短的氨基酸总数。图2中的流程图示出了用于确定从第二结合部分缺少、缺失和/或截短的氨基酸总数以将第二结合部分分类为具有“N末端截短的抗体可变结构域”的迭代过程。

在一些实施方案中，基于表3、表4和表5中提供的任一个或多个序列来确定氨基酸的天然出现频率，诸如在第二结合部分中。在一些实施方案中，基于表7、表9和/或表11确定氨基酸的天然出现频率，例如在第二结合部分中。

在一些实施方案中，根据抗体编号方案，例如根据IMGT编号方案，在可变重链中每个位置以超过1％的频率天然存在的氨基酸列出于表6中。

表6：可变重链中天然存在的氨基酸(频率>1％)。

在一些实施方案中，根据抗体编号方案，例如根据IMGT编号方案，天然存在于可变重链的每个位置的氨基酸及其出现频率列出于表7中。

表7：可变重链框架1(FR1)区中天然存在的氨基酸及其出现频率。

在一些实施方案中，根据抗体编号方案，例如根据IMGT编号方案，在可变κ轻链的每个位置以超过2％的频率天然存在的氨基酸列出于表8中。

表8：可变κ轻链中天然存在的氨基酸(频率>2％)。

在一些实施方案中，根据抗体编号方案，例如根据IMGT编号方案，在可变κ轻链的每个位置天然存在的氨基酸及其出现频率列出于表9中。

表9：可变κ轻链框架1(FR1)区中天然存在的氨基酸及其出现频率。

在一些实施方案中，根据抗体编号方案，例如根据IMGT编号方案，在可变λ轻链的每个位置以超过2％的频率天然存在的氨基酸列出于表10中。

表10：可变λ轻链中天然存在的氨基酸(频率>2％)。

在一些实施方案中，根据抗体编号方案，例如根据IMGT编号方案，在可变λ轻链的每个位置天然存在的氨基酸及其出现频率列出于表11中。

表11：可变λ轻链框架1(FR1)区中天然存在的氨基酸及其出现频率。

在一些实施方案中，第二结合部分可被认为包含“内部”缺失和/或插入。此类内部缺失和/或插入也可以基于本文描述的N末端截短确定过程被认为是N末端截短的。在这种情形下，“内部”缺失和/或截短的N末端序列将被认为是接头序列的一部分，而不是第二结合部分的一部分。第二结合部分中N末端截短的存在可以通过模拟结合物分子的三级结构来进一步证实。

在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第1氨基酸不是E或Q。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第1氨基酸不是E、Q或R。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第2氨基酸不是I、L、M或V。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第3氨基酸不是Q或T。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第3氨基酸不是Q、T、H或R。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第4氨基酸不是L或V。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第4氨基酸不是L、V或R。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第5氨基酸不是K、L、Q、R或V。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第6氨基酸不是E或Q。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第6氨基酸不是E、K、Q或D。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第7氨基酸不是P、S或W。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第7氨基酸不是P、S、W、L或T。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第8氨基酸不是G。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第8氨基酸不是G、A或V。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第9氨基酸不是A、E、G、P或S。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第11氨基酸不是A、E、G、T或V。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第12氨基酸不是L或V。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第13氨基酸不是I、K、L、R或V。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第14氨基酸不是K、Q或R。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第14氨基酸不是K、Q、R或N。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第15氨基酸不是A或P。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第15氨基酸不是A、P、D、L或T。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第16氨基酸不是G、P、S或T。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第17氨基酸不是A、D、E、G、Q、R或S。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第17氨基酸不是A、D、E、G、Q、R、S、P、T或V。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第18氨基酸不是S或T。在一些实施方案中，截短的第二结合部分例如VHAb2的N末端第18氨基酸不是S、T、A、L或M。

在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短的抗体可变结构域还包含1至18个氨基酸取代，例如在框架1(FR1)区中。

在一些实施方案中，包含第二结合部分的结合物分子包含N末端氨基酸A₁，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，包含第二结合部分的结合物分子包含N末端氨基酸A₁-A₂，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，并且其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，包含第二结合部分的结合物分子包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，并且其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，包含第二结合部分的结合物分子包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，并且其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，包含第二结合部分的结合物分子包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄-A₅，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸，并且其中A₅是除K、L、Q、R或V以外的任何氨基酸。

3.与第二结合部分缔合的其他特征

在一些实施方案中，第二结合部分与对本文提供的描述有用的另一特征缔合。在一些实施方案中，第二结合部分与药物缔合，这种第二结合部分与药物共价缀合。在一些实施方案中，第二结合部分与标记缔合，诸如第二结合部分与亲和标记(例如，生物素)或可视标记(诸如荧光标记)共价缀合。在一些实施方案中，第二结合部分与酶缔合，例如第二结合部分与酶共价缀合。在一些实施方案中，第二结合部分与毒素缔合，例如第二结合部分与毒素共价缀合。在一些实施方案中，第二结合部分与核酸缔合，例如第二结合部分与核酸共价缀合。在一些实施方案中，第二结合部分与白蛋白，例如人血清白蛋白缔合。

B.共结合物

在某些方面，本文提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分的，其中任选地，第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分，并且其中第一结合部分任选地经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分。在一些实施方案中，第一结合部分经由接头(例如多肽接头)通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分，并且其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，共结合物是单个氨基酸链。

在一些实施方案中，共结合物特异性识别单个靶抗原诸如多肽上的两个靶位点(表位)。如本文所述，共结合物被配置成通过特异性识别两个靶位点(表位)来增加对靶抗原的亲和力和特异性。在一些实施方案中，共结合物是多特异性共结合物，诸如双特异性共结合物。在一些实施方案中，双特异性共结合物识别空间邻近的两种靶抗原，例如在复合物中。在一些实施方案中，双特异性共结合物识别相同靶抗原中的两者，例如存在于同源二聚体中的靶抗原。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分包含含有N末端截短的第二V_HH结构域(“N末端截短的V_HH结构域”)，其中第一结合部分包含第一V_HH结构域，其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含V_HH结构域的FR1区中的截短。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的截短。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，并且其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，并且其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，并且其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄-A₅，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸，并且其中A₅是除K、L、Q、R或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，接头是多肽接头。在一些实施方案中，接头从N末端到C末端方向包含形成多肽接头的C端的连续系列的三个氨基酸X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分包含在V_HH结构域的FR1区中包含N末端截短的第二V_HH结构域(“N末端截短的V_HH结构域”)，其中第一结合部分包含第一V_HH结构域，其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的截短。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，并且其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，并且其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，并且其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄-A₅，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸，并且其中A₅是除K、L、Q、R或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，接头是多肽接头。在一些实施方案中，接头从N末端到C末端方向包含形成多肽接头的C端的连续系列的三个氨基酸X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分包含在V_HH结构域的FR1区中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的N末端截短的第二V_HH结构域(“N末端截短的V_HH结构域”)，其中第一结合部分包含第一V_HH结构域，其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，并且其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，并且其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，并且其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄-A₅，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸，并且其中A₅是除K、L、Q、R或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，接头是多肽接头。在一些实施方案中，接头从N末端到C末端方向包含形成多肽接头的C端的连续系列的三个氨基酸X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分包含在V_HH结构域的FR1区中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的N末端截短的第二V_HH结构域(“N末端截短的V_HH结构域”)，其中第一结合部分包含第一V_HH结构域，其中N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，并且其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，并且其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，并且其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，并且其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄-A₅，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸，并且其中A₅是除K、L、Q、R或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，接头是多肽接头。在一些实施方案中，接头从N末端到C末端方向包含形成多肽接头的C端的连续系列的三个氨基酸X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分包含在V_HH结构域的FR1区中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的N末端截短的第二V_HH结构域(“N末端截短的V_HH结构域”)，其中第一结合部分包含第一V_HH结构域，其中N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接，并且其中接头从N末端到C末端方向包含形成多肽接头的C端的连续系列的三个氨基酸X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，并且其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，并且其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，并且其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄-A₅，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸，并且其中A₅是除K、L、Q、R或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，接头是多肽接头。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分的，其中任选地，第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分，其中第一结合部分任选地经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，共结合物与第二靶位点结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物结合的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。在一些实施方案中，共结合物与靶分子结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域是截短的VH或截短的VL结构域。在一些实施方案中，第二抗体部分是单结构域抗体。在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域的N末端截短为约1至约25个氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域的N末端截短为1个氨基酸。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分的，其中任选地，第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分，其中第一结合部分是第一抗体部分，并且其中第一结合部分任选地经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，共结合物与第二靶位点结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物结合的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。在一些实施方案中，共结合物与靶分子结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域是截短的VH或截短的VL结构域。在一些实施方案中，第二抗体部分是单结构域抗体。在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域的N末端截短为约1至约25个氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域的N末端截短为1个氨基酸。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分包含具有N末端截短的第二V_HH结构域(“N末端截短的V_HH结构域”)，其中第一结合部分包含第一V_HH结构域，并且其中第一V_HH结构域的C末端经由接头与第二V_HH结构域的N末端连接。在一些实施方案中，共结合物与第二靶位点结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物结合的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。在一些实施方案中，共结合物与靶分子结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，N末端截短的抗体可变结构域的N末端截短为约1至约25个氨基酸。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分包含具有N末端截短的第二V_HH结构域(“N末端截短的V_HH结构域”)，其中N末端截短的V_HH的N末端截短是1个氨基酸，其中第一结合部分包含第一V_HH结构域，并且其中第一V_HH结构域的C末端经由接头与第二V_HH结构域的N末端连接。在一些实施方案中，共结合物与第二靶位点结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物结合的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。在一些实施方案中，共结合物与靶分子结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，与N末端截短的抗体可变结构域直接连接的肽接头的C末端氨基酸是G。在一些实施方案中，与N末端截短的抗体可变结构域直接连接的肽接头的C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分；其中第一结合部分经由肽接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接；其中与第二结合部分的抗体可变结构域直接连接的肽接头的C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是任何氨基酸；X₂是K、R、Y、M、G或N；并且X₃是R、G、Y或P。在一些实施方案中，共结合物与第二靶位点结合的亲和力是接头对照共结合物的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。在一些实施方案中，共结合物与靶分子结合的亲和力是接头对照共结合物的亲和力的至少约3倍。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分；其中第一结合部分经由肽接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接；其中与第二结合部分的抗体可变结构域直接连接的肽接头的C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是任何氨基酸；X₂是K、R、Y、M、G或N；并且X₃是R、G、Y或P，并且其中第一结合部分是第一抗体部分。在一些实施方案中，共结合物与第二靶位点结合的亲和力是接头对照共结合物的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。在一些实施方案中，共结合物与靶分子结合的亲和力是接头对照共结合物的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，抗体可变结构域是VH或VL结构域。在一些实施方案中，第二抗体部分是单结构域抗体。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第一结合部分包含第一V_HH结构域；其中第二结合部分包含第二V_HH结构域，其中第一V_HH结构域的C末端经由肽接头与第二V_HH结构域的N末端连接，其中与第二结合部分的抗体可变结构域直接连接的肽接头的C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是任何氨基酸；X₂是K、R、Y、M、G或N；并且X₃是R、G、Y或P。在一些实施方案中，共结合物与第二靶位点结合的亲和力是接头对照共结合物的亲和力的至少约3倍。在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。在一些实施方案中，共结合物与靶分子结合的亲和力是接头对照共结合物的亲和力的至少约3倍。

在一些实施方案中，提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分包含不含N末端截短的第二V_HH结构域，其中第一结合部分包含第一V_HH结构域，其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接，并且其中第二结合部分的三个N末端氨基酸选自由以下各项组成的组：HKR、FKR、MKR、CKR、QKR、VKR、RKR、LKR、KKR、WKR、SKR、KRG、EKR、YKR、IKR、TKR、NKR、FRR、YRR、AKR、ZLE、ZHQ、MZL、AMV、EHY、TYP、WAP、YMY、IYK、YTY、YYP、QNY、DKR和SGY。

在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含V_HH结构域的FR1区中的截短。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的截短。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，并且其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，并且其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，并且其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，N末端截短的V_HH结构域包含N末端氨基酸A₁-A₂-A₃-A₄-A₅，其中A₁是除E或Q以外的任何氨基酸，其中A₂是除I、L、M或V以外的任何氨基酸，其中A₃是除Q或T以外的任何氨基酸，其中A₄是除L或V以外的任何氨基酸，并且其中A₅是除K、L、Q、R或V以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，接头是多肽接头。在一些实施方案中，接头从N末端到C末端方向包含形成多肽接头的C端的连续系列的三个氨基酸X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。

在一些实施方案中，共结合物与第二靶位点结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物的亲和力的至少约3倍，例如至少约4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍或50倍。在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。在一些实施方案中，第一抗体部分和第二抗体部分特异性结合不同靶，诸如第一抗体部分特异性结合第一多肽靶并且第二抗体部分特异性结合不同于第一多肽靶的第二多肽靶。在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是在不同靶分子上，包括同源靶和异源靶复合物。在一些实施方案中，共结合物与靶分子结合的亲和力是包含不具有N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物的亲和力的至少约3倍，例如至少约4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍或50倍。

在一些方面，本文提供了特异性结合靶的共结合物(诸如高亲和力和/或高特异性共结合物)及其与靶的复合物。在一些实施方案中，共结合物具有第一结合部分、第二结合部分和连接第一结合部分和第二结合部分的接头。在一些实施方案中，复合物包含共结合物和靶诸如靶分子，其中共结合物包含第一结合部分、第二结合部分和连接第一结合部分和第二结合部分的接头。在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分结合靶上的非重叠表位，例如多肽或多肽复合物。在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分同时结合靶上的非重叠表位，例如多肽或多肽复合物。在一些实施方案中，共结合物对靶的亲和力比第一结合部分和/或第二结合部分的亲和力大至少50倍，诸如至少大100倍、大200倍、大500倍、大1000倍、大2000倍、大5000倍或大10000倍中的任一者。在一些实施方案中，接头是多肽接头。在一些实施方案中，接头是核酸接头。在一些实施方案中，接头是化学接头。

1.第一结合部分

本文提供的共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分。第二结合部分的详情在以上章节中提供。

在一些实施方案中，第一结合部分是第一抗体部分。在一些实施方案中，第一结合部分是非截短的抗体部分，例如具有本文所述的N末端截短的第二结合部分的非截短形式。在一些实施方案中，第一结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第一抗体部分。在一些实施方案中，第一结合部分是包含具有C末端截短的抗体可变结构域的第一抗体部分。在一些实施方案中，第一结合部分是对靶位点提供亲和力的另一分子。例如，在一些实施方案中，第一结合部分是识别受体或其一部分的配体。在一些实施方案中，第一结合部分是识别配体的受体或其一部分，诸如受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，第一结合部分是适体。在一些实施方案中，第一结合部分是非蛋白质结合部分，诸如生物素或核酸。在一些实施方案中，第一结合部分是非免疫球蛋白结合剂。

在一些实施方案中，第一结合部分的抗体部分包含可变区(在一些实施方案中，在本文中称为VR，并且任选地，具有其数字标识，例如VR1或VR2)。在一些实施方案中，第一结合部分的抗体部分包含重链可变区(在一些实施方案中，在本文中称为VHAb或VH结构域)。在一些实施方案中，重链可变区与轻链可变区缔合。在一些实施方案中，其中重链可变区与轻链可变区缔合，重链可变区和轻链可变区来自相同的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，与轻链可变区缔合的重链可变区形成稳定的复合物。

在一些实施方案中，第一结合部分的抗体部分包含轻链可变区(在一些实施方案中，在本文中称为VLAb或VL结构域)。在一些实施方案中，轻链可变区是人兰姆达(λ)轻链的轻链可变区。在一些实施方案中，轻链可变区是人卡帕(κ)轻链的轻链可变区。在一些实施方案中，轻链可变区与重链可变区缔合。在一些实施方案中，其中轻链可变区与重链可变区缔合，轻链可变区和重链可变区来自相同的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，与重链可变区缔合的轻链可变区形成稳定的复合物。

在一些实施方案中，第一结合部分的抗体部分还包含一个或多个恒定结构域，例如CH1、CH2、CH3或CL中的任一者或多者。

在一些实施方案中，第一结合部分的抗体部分包含V_HH结构域。在一些实施方案中，第一结合部分的抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’和(Fab’)2片段。在一些实施方案中，第一结合部分的抗体部分是单结构域抗体。

在一些实施方案中，第一结合部分是截短的第一结合部分，例如包含N末端和/或C末端截短。在一些实施方案中，第一结合部分的截短的抗体可变区是截短的可变区。在一些实施方案中，第一结合部分的截短的抗体可变区是截短的重链可变区。在一些实施方案中，第一结合部分的截短的抗体可变区是与轻链可变区缔合的截短的重链可变区。在一些实施方案中，第一结合部分的截短的抗体可变区是截短的轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合部分的截短的抗体可变区是与重链可变区缔合的截短的轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合部分的截短的抗体可变结构域是截短的V_HH结构域。在一些实施方案中，第一结合部分的截短的抗体可变结构域是截短的Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，第一结合部分的截短的抗体可变结构域是截短的单结构域抗体。

本文提供的第一结合部分或其至少一部分可以从多种来源获得或衍生。例如，在一些实施方案中，第一结合部分或其至少一部分从骆驼科动物获得或衍生，例如骆驼科动物单链V_HH。

在一些实施方案中，第一结合部分或其至少一部分从亲和体、affilin、affimer、affitin、α体、anticalin、适体、亲合体、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单体、纳米抗体(也称为单结构域抗体、sdAb)或nanoCLAMP获得或衍生。在一些实施方案中，第一结合部分或其至少一部分从IgG、IgA、IgE、IgM或IgD获得或衍生。

在一些实施方案中，第一结合部分的截短，例如N末端截短是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的截短。在一些实施方案中，第一结合部分的N末端截短是第二结合部分的框架区1(FR1)中的截短。在一些实施方案中，第一结合部分包含V_HH，其包含第一结合部分的框架区1(FR1)中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的N末端截短。

在一些实施方案中，第一结合部分或其至少一部分从哺乳动物获得或衍生，所述哺乳动物包括骆驼、人、非人灵长类动物(诸如猴)、家畜、农场或动物园动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠或猫。在一些实施方案中，第一结合部分或其至少一部分从合成来源获得或衍生。

本文提供的第一结合部分的抗体部分特异性识别靶位点。所述靶位点包括多种表位，包括多肽、核酸和小分子上的表位。

2.某些共结合物构型

在某些方面，本文所述的共结合物包含第一结合部分的第一抗体部分和第二结合部分的第二抗体部分，其中第一抗体部分和第二抗体部分独立地包含以下之一：可变区(VR)、重链可变区(VH或VHAb)或轻链可变区(VL或VLAb)。本领域普通技术人员将容易理解，第一结合部分和第二抗体部分配对的许多组合是可能的，包括但不限于任何以下第一抗体和第二抗体部分配对：(i)VR1和VR2；(ii)VHAb1和VHAb2；(iii)VHAb1和VLAb2；(iv)VLAb1和VHAb2；(v)VLAb1和VLAb2；(vi)VR1和VHAb2；(vii)VHAb1和VR2；(viii)VR1和VLAb2；以及(vii)VLAb1和VR2。在一些实施方案中，重链可变区(例如，VHAb1或VHAb2)与轻链可变区缔合。在一些实施方案中，轻链可变区(例如，VLAb1或VLAb2)与重链可变区缔合。

在一方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中该共结合物包含：(i)包含第一抗体的第一可变区(VR1)的第一结合部分；(ii)包含第二抗体的第二可变区(VR2)的第二结合部分，所述第二可变区包含N末端截短；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头。

在一方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中共结合物包含：(i)包含第一抗体的第一可变区(VR1)的第一结合部分；(ii)包含第二抗体的第二可变区(VR2)的第二结合部分，所述第二可变区包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。

在一方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中共结合物包含：(i)包含第一抗体的第一可变区(VR1)的第一结合部分；(ii)包含第二抗体的第二可变区(VR2)的第二结合部分，所述第二抗体包含框架1(FR1)区中1至18个氨基酸的截短；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。

在一些方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)包含第一抗体的第一可变区(VR1)的第一结合部分；(ii)包含第二抗体的第二可变区(VR2)的第二结合部分，所述第二可变区包含框架1(FR1)区中的N末端截短；和(iii)将VR1C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。

在一些实施方案中，本文提供了一种共结合物，其包含：(i)第一结合部分，所述第一结合部分包含特异性识别第一靶位点的第一抗体部分；(ii)第二结合部分，所述第二结合部分包含特异性识别第二靶位点的第二抗体部分，其中第二抗体部分包含具有1至18个氨基酸的N末端截短的抗体可变结构域；和(iii)多肽接头，所述多肽接头将第一抗体部分的C末端氨基酸与第二抗体部分的N末端氨基酸连接。

在一些实施方案中，第二抗体部分的1至18个氨基酸的N末端截短位于第二抗体部分的框架1(FR1)区中。在一些实施方案中，第二抗体部分的多肽接头的X₃氨基酸和互补决定区1(CDR1)的起点(如由CDR1的N末端氨基酸侧的CDR1的第一氨基酸表征)相隔5至25个氨基酸。在一些实施方案中，第二抗体部分的多肽接头的X₃氨基酸和互补性决定区1(CDR1)的起点相隔不超过25个氨基酸。

在本文提供的题为“接头”的章节中更详细地描述了接头。在一些实施方案中，多肽接头从N末端到C末端方向包含形成多肽接头的C端的连续系列的三个氨基酸X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。

在一方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中共结合物包含：(i)第一抗体的第一可变区(VR1)；(ii)第二抗体的第二可变区(VR2)；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头。在一些实施方案中，多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。在一些实施方案中，VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。在一些实施方案中，VR2包含1至18个氨基酸的N末端截短。

在一方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中共结合物包含：(i)第一抗体的第一可变区(VR1)；(ii)第二抗体的第二可变区(VR2)，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头。在一些实施方案中，多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。在一些实施方案中，VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。

在一些方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中共结合物包含：(i)第一抗体的第一可变区(VR1)；(ii)第二抗体的第二可变区(VR2)，其包含框架1(FR1)区中1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。

在一些方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中共结合物包含：(i)第一抗体的第一可变区(VR1)；(ii)第二抗体的第二可变区(VR2)，其包含框架1(FR1)区中1至18个氨基酸的截短；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。

另一方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中共结合物包含：(i)第一抗体的第一可变区(VR1)；(ii)第二抗体的第二可变区(VR2)，其包含构架1(FR1)区中的截短；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；其中多肽接头的X₃氨基酸和VR2互补决定区1(CDR1)相隔5至25个氨基酸；并且其中VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。

另一方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中共结合物包含：(i)第一抗体的第一可变区(VR1)；(ii)第二抗体的第二可变区(VR2)，其包含构架1(FR1)区中的截短；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；其中多肽接头的X₃氨基酸和VR2互补决定区1(CDR1)相隔不超过25个氨基酸；并且其中VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。

另一方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中共结合物包含：(i)第一抗体的第一可变区(VR1)；(ii)第二抗体的第二可变区(VR2)，其包含框架1(FR1)区中1至18个氨基酸的截短；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；其中多肽接头的X₃氨基酸和VR2互补决定区1(CDR1)相隔5至25个氨基酸；并且其中VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。

另一方面，本文提供了一种特异性结合靶的共结合物，其中共结合物包含：(i)第一抗体的第一可变区(VR1)；(ii)第二抗体的第二可变区(VR2)，其包含框架1(FR1)区中1至18个氨基酸的截短；和(iii)将VR1 C末端氨基酸与截短的VR2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；其中多肽接头的X₃氨基酸和VR2互补决定区1(CDR1)相隔不超过25个氨基酸；并且其中VR1和VR2结合靶上的非重叠表位。

在一些实施方案中，VR1是轻链可变区。在一些实施方案中，VR1是重链可变区。在一些实施方案中，VR2是轻链可变区。在一些实施方案中，VR2是重链可变区。在一些实施方案中，VR1是轻链可变区并且VR2是轻链可变区。在一些实施方案中，VR1是轻链可变区并且VR2是重链可变区。在一些实施方案中，VR1是重链可变区并且VR2是轻链可变区。在一些实施方案中，VR1是重链可变区并且VR2是重链可变区。在一些实施方案中，VR1是V_HH。在一些实施方案中，VR2是V_HH。在一些实施方案中，VR1是V_HH并且VR2是V_HH

在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的截短。在一些实施方案中，第二结合部分的多肽接头的X₃氨基酸和CDR1相隔不超过25个氨基酸，诸如不超过24个氨基酸、23个氨基酸、22个氨基酸、21个氨基酸、20个氨基酸、19个氨基酸、18个氨基酸、17个氨基酸、16个氨基酸、15个氨基酸、14个氨基酸、13个氨基酸、12个氨基酸、11个氨基酸、10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸或3个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，第二结合部分的多肽接头的X₃氨基酸和CDR1相隔5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、20个氨基酸、21个氨基酸、22个氨基酸、23个氨基酸、24个氨基酸或25个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短是第二结合部分的框架区1(FR1)中的截短。

在一些实施方案中，可变区，例如第二结合部分的N末端截短的抗体可变结构域，是V_HH。在一些实施方案中，第一结合部分包含第一V_HH结构域；其中第二结合部分包含具有N末端截短的第二V_HH结构域(“截短的V_HH结构域”)，其中第一V_HH结构域的C末端经由接头与第二V_HH结构域的N末端连接。

因此，在一些方面，本文提供了一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是具有N末端截短的第二V_HH结构域(“截短的V_HH结构域”)，其中第一结合部分包含第一V_HH结构域，并且其中第一结合部分经由接头通过N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接。在一些实施方案中，第二结合部分的截短的V_HH结构域是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中任一者的截短。在一些实施方案中，第二结合部分的多肽接头的X₃氨基酸和CDR1相隔不超过25个氨基酸，诸如不超过24个氨基酸、23个氨基酸、22个氨基酸、21个氨基酸、20个氨基酸、19个氨基酸、18个氨基酸、17个氨基酸、16个氨基酸、15个氨基酸、14个氨基酸、13个氨基酸、12个氨基酸、11个氨基酸、10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸或3个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，第二结合部分的多肽接头的X₃氨基酸和CDR1相隔5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、20个氨基酸、21个氨基酸、22个氨基酸、23个氨基酸、24个氨基酸或25个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，第二结合部分的N末端截短是第二结合部分的框架区1(FR1)中的截短。在一些实施方案中，接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G。

在一些实施方案中，共结合物仅具有第一结合部分和第二结合部分，其结合靶分子上不重叠且不同的表位。在一些实施方案中，共结合物还可以具有第三结合部分，其结合靶分子上第三不重叠且不同的表位。在一些实施方案中，共结合物还可以具有第三结合部分和第四结合部分，其各自结合靶分子上第三和第四不重叠且不同的表位。这些第三结合部分和/或第四结合部分可以是或不是如对于第二结合部分所述N末端截短的。

共结合物可以是单体分子或多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有一组结合部分的单体分子。在一些实施方案中，共结合物是具有一组第一结合部分和第二结合部分的单体分子。在一些实施方案中，共结合物是具有一组第一结合部分、第二结合部分和第三结合部分的单体分子。在一些实施方案中，共结合物是具有一组第一结合部分、第二结合部分、第三结合部分和第四结合部分的单体分子。

在一些实施方案中，共结合物是具有至少两组结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有至少三组结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有至少四组结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有两组结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有两组第一结合部分和第二结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有两组第一结合部分、第二结合部分和第三结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有两组第一结合部分、第二结合部分、第三结合部分和第四结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有三组结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有三组第一结合部分和第二结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有三组第一结合部分、第二结合部分和第三结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有三组第一结合部分、第二结合部分、第三结合部分和第四结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有四组结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有四组第一结合部分和第二结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有四组第一结合部分、第二结合部分和第三结合部分的多聚体复合物。在一些实施方案中，共结合物是具有四组第一结合部分、第二结合部分、第三结合部分和第四结合部分的多聚体复合物。

在一些实施方案中，作为多聚体复合物的共结合物可以具有各组结合部分的不同取向。在一些实施方案中，各组结合部分依次排列。例如，两组第一结合部分(含有互补位P1)和第二结合部分(含有互补位P2)可以排列为P1-P2-P1-P2。对于另一个实例，两组第一结合部分(含有互补位P1)、第二结合部分(含有互补位P2)和它们的结合部分(含有互补位P3)可以排列为P1-P2-P3-P1-P2-P3。在一些实施方案中，各组结合部分反向排列。例如，两组第一结合部分(含有互补位P1)和第二结合部分(含有互补位P2)可以排列为P1-P2-P2-P1。对于另一个实例，两组第一结合部分(含有互补位P1)、第二结合部分(含有互补位P2)和它们的结合部分(含有互补位P3)可以排列为P1-P2-P3-P3-P2-P1。在一些实施方案中，各组结合部分以交错方式排列。例如，两组第一结合部分(含有互补位P1)和第二结合部分(含有互补位P2)可以排列为P1-P1-P2-P2。对于另一个实例，两组第一结合部分(含有互补位P1)、第二结合部分(含有互补位P2)和它们的结合部分(含有互补位P3)可以排列为P1-P1-P2-P2-P3-P3。如本领域普通技术人员所理解的，本文所述的多聚体共结合物的结合部分可以任何顺序排列。在一些实施方案中，优化多聚体共结合物的结合部分的排列顺序以使对靶分子的结合亲和力最大化和/或使任何非特异性结合最小化。

在一些实施方案中，本文公开的共结合物具有第一结合部分和第二结合部分，其结合靶分子中两个不同且不重叠的表位。靶分子中两个不同且不重叠的表位可以彼此相对接近。在一些实施方案中，共结合物所识别的两个表位彼此靠近，但仍有足够的空间容纳共结合物的接头。在一些实施方案中，第一表位和第二表位具有不超过150埃，例如不超过约120埃、100埃、80埃、50埃、40埃、30埃、15埃、10埃或5埃中任一者的距离。

对于靶肽或靶蛋白上的线性表位，两个表位之间的距离可以在彼此200个氨基酸内，例如在约彼此150个氨基酸、彼此120个氨基酸、彼此100个氨基酸、彼此80个氨基酸、彼此50个氨基酸、彼此40个氨基酸、彼此30个氨基酸、彼此20个氨基酸、彼此15个氨基酸、彼此10个氨基酸或彼此5个氨基酸中任一者内。在一些实施方案中，选择由共结合物识别的两个表位，使得两个结合相互作用是协作的和协同的，并且不相互干扰。

在一些实施方案中，共结合物包含作为可变区的第一抗体部分(VR1)和作为可变区的第二抗体部分(VR2)。在一些实施方案中，VR1结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但与靶的结合亲和力不足以供VR1本身用于治疗或诊断用途；VR2以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VR2结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但结合靶的亲和力不足以供VR2本身用于治疗或诊断用途；VR1以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，第一结合部分结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但结合靶的亲和力不足以供第一结合部分本身用于治疗或诊断用途；第二结合部分以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，第二结合部分结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但结合靶的亲和力不足以供第二结合部分本身用于治疗或诊断用途；第一结合部分以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。

在一些实施方案中，共结合物包含第一抗体部分和第二抗体部分，第一抗体部分是第一抗体的重链可变区(VHAb1)，第二抗体部分是第二抗体的重链可变区(VHAb2)。在一些实施方案中，VHAb1结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但结合靶的亲和力不足以供VHAb1本身用于治疗或诊断用途；VHAb2以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VHAb2结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但结合靶的亲和力不足以供VHAb2本身用于治疗或诊断用途；VHAb1以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。

在一些实施方案中，共结合物包含第一抗体部分和第二抗体部分，第一抗体部分是第一抗体的轻链可变区(VLAb1)，第二抗体部分是第二抗体的重链可变区(VHAb2)。在一些实施方案中，VLAb1结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但结合靶的亲和力不足以供VLAb1本身用于治疗或诊断用途；VHAb2以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VHAb2结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但结合靶的亲和力不足以供VHAb2本身用于治疗或诊断用途；VLAb1以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。

在一些实施方案中，共结合物包含第一抗体部分和第二抗体部分，第一抗体部分是第一抗体的重链可变区(VHAb1)，第二抗体部分是第二抗体的轻链可变区(VLAb2)。在一些情况下，VHAb1结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但与靶结合的亲和力不足以用于VHAb1本身的治疗或诊断用途；VLAb2以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VLAb2结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但结合靶的亲和力不足以供VLAb2本身用于治疗或诊断用途；VHAb1以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。

在一些实施方案中，共结合物包含第一抗体部分和第二抗体部分，第一抗体部分是第一抗体的轻链可变区(VLAb1)，第二抗体部分是第二抗体的轻链可变区(VLAb2)。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VLAb1结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但结合靶的亲和力不足以供VLAb1本身用于治疗或诊断用途；VLAb2以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VLAb2结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，但结合靶的亲和力不足以供VLAb2本身用于治疗或诊断用途；VLAb1以足够的亲和力结合靶的不同表位；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶，并产生所需生物功效。

在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VR1结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；VR2以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VR2结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；VR1以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。

在本文提供的共结合物的一些实施方案中，第一结合部分结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；第二结合部分以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，第二结合部分结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；第一结合部分以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。

在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VHAb1结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；VHAb2以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VHAb2结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；VHAb1以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。

在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VLAb1结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；VHAb2以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VHAb2结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；VLAb1以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。

在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VHAb1结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；VLAb2以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VLAb2结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；VHAb1以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。

在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VLAb1结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；VLAb2以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。在本文提供的共结合物的一些实施方案中，VLAb2结合靶的表位，从而对靶产生所需生物效应，而且也结合非靶的表位，从而产生不期望的副作用；VLAb1以高亲和力结合靶的不同表位，但不以足够的亲和力结合非靶；并且所得共结合物以足够的亲和力结合靶并产生所需生物功效，但是不能以足够的亲和力结合非靶而产生不期望的副作用。

本公开表明各种VH或VL可用于构建本文提供的共结合物，并获得为此类共结合物提供的亲和力和/或特异性改善。在一个实施方案中，用于本文所提供的共结合物的第二结合部分中所含有的抗原结合片段(例如VH和/或VL)可以基于抗原结合片段的互补位与抗原结合片段的N末端的邻近度来选择。在某些实施方案中，共结合物可以用VH构建，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，其中VH的互补位紧邻VH的N末端。在一些实施方案中，共结合物可以用VH作为第二结合部分的一部分来构建，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，其中VH的互补位紧邻VH的N末端。在其他实施方案中，共结合物可以用VHAb2构建，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，其中VHAb2的表位紧邻VHAb2的N末端。在某些实施方案中，共结合物可以用VL构建，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，其中VL的互补位紧邻VL的N末端。在一些实施方案中，共结合物可以用VL作为第二结合部分的一部分来构建，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，其中VL的互补位紧邻VL的N末端。在其他实施方案中，共结合物可以用VLAb2构建，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，其中VLAb2的互补位紧邻VLAb2的N末端。在一些实施方案中，共结合物可以用可变区(VR)构建，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，其中VR的互补位紧邻VR的N末端。在某些实施方案中，共结合物可以用可变区作为第二结合部分(VR2)的一部分来构建，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，其中VR2的互补位紧邻VR2的N末端。VH、作为第二结合部分的一部分的VH、VHAb、VHAb2、VL、作为第二结合部分的一部分的VL、VLAb、VLAb2、VR和本段落的VR2可以是本文所述的任何相应实施方案。

抗原结合片段(例如VH、VL、VHAb、VHAb2、VLAb、VLAb2、VR和VR2)的互补位与这种抗原结合片段的N末端之间的接近度可以基于抗原结合片段的结构和/或这种抗原结合片段与其靶抗原的复合物的结构来确定。在一些实施方案中，在这种抗原结合片段与其靶抗原的复合物的结构中，抗原表面上最近的非氢原子可以用作用于确定抗原结合片段的互补位与N末端的邻近度的互补位的代表。因此，可以基于在抗原结合片段与其靶抗原的复合物的结构中这种抗原结合片段的第一个Cα原子(N末端)与抗原表面上最近的非氢原子之间的距离来确定邻近度。在一个实施方案中，如果由抗原结合片段的第一个Cα原子(N末端)与抗原表面上最近的非氢原子之间的距离确定的接近度不超过某一阈值或为约某一阈值，如本文所述的抗原结合片段(例如VH、VL、VHAb、VHAb2、VLAb、VLAb2、VR和VR2)适合用于构建本文提供的共结合物，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，其中需要此种阈值来提供足够的空间以用于连接共结合物的两个结合部分而不干扰与靶抗原的结合。在另一个实施方案中，如果由抗原结合片段的第一个Cα原子(N末端)与抗原表面上最近的非氢原子之间的距离所确定的接近度不超过某一阈值或为约某一阈值，如本文所述的抗原结合片段(例如VH、VL、VHAb、VHAb2、VLAb、VLAb2、VR和VR2)适合用作第二结合部分或第二结合部分的一部分，以构建本文提供的共结合物，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，其中需要该阈值来提供足够的空间以用于连接共结合物的两个结合部分而不干扰与靶抗原的结合。在一个具体实施方案中，本文所提及的邻近度不超过约诸如不超过约 或

本公开进一步表明抗原结合片段的N末端与抗原结合片段的互补位之间的邻近度(例如使用结合抗原表面上最近的非氢原子)可以通过从数据库中的现有结构查看这种邻近度来确定(例如PDB)。如本领域技术人员所实践的，这种邻近度也可以经由使用结构数据库中可用的许多结构的同源结构建模来确定。此外，如本领域技术人员所实践的，这种邻近度可以通过由其他结构模拟软件或方法例如Molecular Dynamics或Molecular Mechanics(例如CHARMM、AMBER和NAMD)和从头算蛋白质建模(例如Rosetta)确定的其他结构来确定。因此，本公开表明并且本领域普通技术人员将理解，可以确定与抗原结合片段结合的抗原的结构以及抗原结合片段的N末端与互补位之间的邻近度(例如使用结合抗原表面上最近的非氢原子作为代表)，而不必通过实验确定任何结构。

替代地，抗原结合片段的N末端与互补位之间的邻近度(例如，例如使用结合抗原表面上最近的非氢原子作为代表)可以使用在抗原结合片段的N末端放置键联的功能效应作为这种邻近度的报告物来确定。如上所述，抗原结合片段的N末端与互补位之间的邻近度用于确定是否有足够的空间来连接共结合物的两个结合部分而不干扰与靶抗原的结合。本公开进一步表明，如果抗原结合片段的N末端与互补位之间的这种邻近度低于某个阈值，该阈值需要提供足够的空间来连接共结合物的两个结合部分而不干扰与靶抗原的结合，则抗原结合片段的亲和力将在将接头插入或连接至抗原结合片段的N末端时受到负面影响。因此，本公开表明，在将接头插入或连接至抗原结合片段的N末端后的亲和力变化可以与确定抗原结合片段的N末端与互补位之间的邻近度是否低于足以连接共结合物的两个结合部分而不干扰与靶抗原的结合的某个阈值相关。

因此，本公开表明，如果在将接头插入或连接至抗原结合片段的N末端时抗原结合片段对抗原的亲和力改变超过某个阈值，如本文所述的抗原结合片段(例如VH、VL、VHAb、VHAb2、VLAb、VLAb2、VR和VR2)适合用于构建本文提供的共结合物，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善。简言之，在一些实施方案中，靶的抗原结合片段(“ABF”)可以经由(GGGS)₄接头与不特异性结合靶的参考免疫球蛋白结构域(refIg)融合，以产生refIg-GS-ABF构建体。如果融合构建体refIg-GS-ABF对靶的亲和力比ABF对靶的亲和力弱某个阈值，则这种ABF适合用于构建本文提供的共结合物，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善。在一个具体实施方案中，融合构建体refIg-GS-ABF对靶标的亲和力比ABF对靶的亲和力至少弱2倍，例如至少弱以下倍中任一项：3、4、5、6、7、8、9、10、15或20。

类似地，由于亲和力可以通过解离平衡常数(K_D)测量，本公开表明，本文所述的抗原结合片段(例如VH、VL、VHAb、VHAb2、VLAb、VLAb2、VR和VR2)适合用于构建本文提供的共结合物，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善，如果抗原结合片段对抗原的K_D在将接头插入或连接至抗原结合片段的N末端时改变超过某个阈值。简言之，在一些实施方案中，靶的抗原结合片段(“ABF”)可以经由(GGGS)₄接头与不特异性结合靶的参考免疫球蛋白结构域(refIg)融合，以产生refIg-GS-ABF构建体。如果融合构建体refIg-GS-ABF对靶的K_D比ABF对靶的K_D大某个阈值，则这种ABF适合用于构建本文提供的共结合物，并产生对于本公开的共结合物所提供的亲和力和/或特异性改善。在一个具体实施方案中，融合构建体refIg-GS-ABF对靶的K_D比ABF对靶的K_D大至少2倍，例如至少大以下倍中任一个：3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍。

此外，在本文提供的一些具体实施方案中，靶的抗原结合片段(“ABF”)可经由(GGGS)x接头与不特异性结合靶的参考免疫球蛋白结构域(refIg)融合，以产生refIg-GS-ABF构建体，其中x可以是1、2、3、4、5、6、7或8。在一个实施方案中，靶的ABF可以经由GGGS接头与不特异性结合靶的refIg融合，以产生本文所述的refIg-GS-ABF构建体。在另一个实施方案中，靶的ABF可以经由(GGGS)2接头与不特异性结合靶的refIg融合，以产生本文所述的refIg-GS-ABF构建体。在另一个实施方案中，靶的ABF可以经由(GGGS)3接头与不特异性结合靶的refIg融合，以产生本文所述的refIg-GS-ABF构建体。在又一个实施方案中，靶的ABF可以经由(GGGS)4接头与不特异性结合靶的refIg融合，以产生本文所述的refIg-GS-ABF构建体。在一个实施方案中，靶的ABF可以经由(GGGS)5接头与不特异性结合靶的refIg融合，以产生本文所述的refIg-GS-ABF构建体。在另一个实施方案中，靶的ABF可以经由(GGGS)6接头与不特异性结合靶的refIg融合，以产生本文所述的refIg-GS-ABF构建体。在另一个实施方案中，靶的ABF可以经由(GGGS)7接头与不特异性结合靶的refIg融合，以产生本文所述的refIg-GS-ABF构建体。在又一个实施方案中，靶的ABF可以经由(GGGS)8接头与不特异性结合靶的refIg融合，以产生本文所述的refIg-GS-ABF构建体。

本公开表明，本文所述的refIg可以是任何免疫球蛋白结构域(，如VH、VL、scFv、VHH)，只要refIg不特异性结合与共结合物被特异性构建来结合的相同抗原。例如并且如本文所述，当构建共结合物以结合EGFR时，抗人溶菌酶VHH HuL6可用作这种refIg。类似地，在一些实施方案中，refIg可以是同种型免疫球蛋白的抗原结合结构域或片段(例如VH、VL、scFv或VHH)。在某些实施方案中，refIg可以是抗原结合结构域或片段(例如VH、VL、scFv或VHH)，其结合的抗原不同于共结合物被特异性构建来结合的抗原。

C.接头

在本文所述的结合物分子的某些方面，结合物分子包含接头。通常，本文所述的接头与本文所述的结合物分子的一种或多种组分缔合，例如共价缔合。例如，在一些实施方案中，共结合物包含第二结合部分和接头，其中接头经由第二结合部分的N末端与第二结合部分附接。在一些实施方案中，共结合物包含连接第一结合部分和第二结合部分的接头，其中接头经由第二结合部分的N末端与第二结合部分附接，并且其中接头经由第一结合部分的C末端与第一结合部分附接。在一些实施方案中，第二结合部分是N末端截短的抗体可变结构域。在一些实施方案中，接头经由共价键连接第一结合部分和第二结合部分。在一些实施方案中，接头经由共价键和非共价键的组合连接第一结合部分和第二结合部分，例如，接头与第二结合部分或第一结合部分共价结合，并与另一结合部分非共价结合。在一些实施方案中，共结合物的接头促进共结合物实现与其靶分子的协作和/或协同结合相互作用。如本文所述，接头可以采取多种形式，并且可以基于多种特征进行选择。

在一些实施方案中，接头包含多肽。在一些实施方案中，接头是多肽。在一些实施方案中，接头包含多肽复合物，诸如包含两个或更多个多肽亚基的多肽复合物。在一些实施方案中，接头包含多核苷酸。在一些实施方案中，接头是多核苷酸。在一些实施方案中，接头是多核苷酸复合物，诸如具有互补区的第一多核苷酸链和第二多核苷酸链。在一些实施方案中，接头是化学或合成接头，诸如基于聚合物的接头。

在一些实施方案中，接头共价附接到结合物分子的结合部分。例如，在一些实施方案中，结合物分子包含第二结合部分和接头，其中第二结合部分和接头是单一多肽。在一些实施方案中，接头与结合物分子的结合部分非共价缔合。

在一些实施方案中，接头与第二结合部分的N末端缔合，诸如共价附接。在一些实施方案中，与第二结合部分的N末端缔合(例如共价附接)的接头的末端部分包含三个氨基酸X₁-X₂-X₃。例如，在一些实施方案中，接头包含多肽，其中与第二结合部分的N末端缔合(例如共价附接)的接头的C末端部分在N末端至C末端方向包含三个氨基酸X₁-X₂-X₃。在一些实施方案中，X₃例如经由肽键共价附接至第二结合部分的N末端残基。

在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G、R或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G或R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是R或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G。在一些实施方案中，接头的C末端部分X₁-X₂-X₃的的X₃是R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是Y。

在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；并且接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G、R或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G或R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是R或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是Y。

在某些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G、R或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G或R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是R或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是Y。

在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G、R或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G或R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是R或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是Y。

在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₁是任何氨基酸；接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₂是任何氨基酸；并且接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G、R或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₁是任何氨基酸；接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₂是任何氨基酸；并且接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G或R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₁是任何氨基酸；接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₂是任何氨基酸；并且接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₁是任何氨基酸；接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₂是任何氨基酸；并且接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是R或Y。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₁是任何氨基酸；接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₂是任何氨基酸；并且接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是G。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₁是任何氨基酸；接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₂是任何氨基酸；并且接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是R。在一些实施方案中，接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₁是任何氨基酸；接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₂是任何氨基酸；并且接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃的X₃是Y。

在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是VVG、VAG、VLG、VSG、VGG、VRG、VKG、VMG、VCG、VFG、VTG、VPG或VEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是LVG、LAG、LLG、LSG、LGG、LRG、LKG、LMG、LCG、LFG、LTG、LPG或LEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是WVG、WAG、WLG、WSG、WGG、WRG、WKG、WMG、WCG、WFG、WTG、WPG或WEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是PVG、PAG、PLG、PSG、PGG、PRG、PKG、PMG、PCG、PFG、PTG、PPG或PEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是SVG、SAG、SLG、SSG、SGG、SRG、SKG、SMG、SCG、SFG、STG、SPG或SEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是GVG、GAG、GLG、GSG、GGG、GRG、GKG、GMG、GCG、GFG、GTG、GPG或GEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是KVG、KAG、KLG、KSG、KGG、KRG、KKG、KMG、KCG、KFG、KTG、KPG或KEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是DVG、DAG、DLG、DSG、DGG、DRG、DKG、DMG、DCG、DFG、DTG、DPG或DEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是FVG、FAG、FLG、FSG、FGG、FRG、FKG、FMG、FCG、FFG、FTG、FPG或FEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是MVG、MAG、MLG、MSG、MGG、MRG、MKG、MMG、MCG、MFG、MTG、MPG或MEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是TVG、TAG、TLG、TSG、TGG、TRG、TKG、TMG、TCG、TFG、TTG、TPG或TEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是NVG、NAG、NLG、NSG、NGG、NRG、NKG、NMG、NCG、NFG、NTG、NPG或NEG。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是RVG、RAG、RLG、RSG、RGG、RRG、RKG、RMG、RCG、RFG、RTG、RPG或REG。

在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是VVR、VAR、VLR、VSR、VGR、VRR、VKR、VMR、VCR、VFR、VTR、VPR或VER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是LVR、LAR、LLR、LSR、LGR、LRR、LKR、LMR、LCR、LFR、LTR、LPR或LER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是WVR、WAR、WLR、WSR、WGR、WRR、WKR、WMR、WCR、WFR、WTR、WPR或WER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是PVR、PAR、PLR、PSR、PGR、PRR、PKR、PMR、PCR、PFR、PTR、PPR或PER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是SVR、SAR、SLR、SSR、SGR、SRR、SKR、SMR、SCR、SFR、STR、SPR或SER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是GVR、GAR、GLR、GSR、GGR、GRR、GKR、GMR、GCR、GFR、GTR、GPR或GER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是KVR、KAR、KLR、KSR、KGR、KRR、KKR、KMR、KCR、KFR、KTR、KPR或KER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是DVR、DAR、DLR、DSR、DGR、DRR、DKR、DMR、DCR、DFR、DTR、DPR或DER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是FVR、FAR、FLR、FSR、FGR、FRR、FKR、FMR、FCR、FFR、FTR、FPR或FER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是MVR、MAR、MLR、MSR、MGR、MRR、MKR、MMR、MCR、MFR、MTR、MPR或MER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是TVR、TAR、TLR、TSR、TGR、TRR、TKR、TMR、TCR、TFR、TTR、TPR或TER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是NVR、NAR、NLR、NSR、NGR、NRR、NKR、NMR、NCR、NFR、NTR、NPR或NER。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是RVR、RAR、RLR、RSR、RGR、RRR、RKR、RMR、RCR、RFR、RTR、RPR或RER。

在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是VVY、VAY、VLY、VSY、VGY、VRY、VKY、VMY、VCY、VFY、VTY、VPY或VEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是LVY、LAY、LLY、LSY、LGY、LRY、LKY、LMY、LCY、LFY、LTY、LPY或LEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是WVY、WAY、WLY、WSY、WGY、WRY、WKY、WMY、WCY、WFY、WTY、WPY或WEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是PVY、PAY、PLY、PSY、PGY、PRY、PKY、PMY、PCY、PFY、PTY、PPY或PEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是SVY、SAY、SLY、SSY、SGY、SRY、SKY、SMY、SCY、SFY、STY、SPY或SEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是GVY、GAY、GLY、GSY、GGY、GRY、GKY、GMY、GCY、GFY、GTY、GPY或GEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是KVY、KAY、KLY、KSY、KGY、KRY、KKY、KMY、KCY、KFY、KTY、KPY或KEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是DVY、DAY、DLY、DSY、DGY、DRY、DKY、DMY、DCY、DFY、DTY、DPY或DEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是FVY、FAY、FLY、FSY、FGY、FRY、FKY、FMY、FCY、FFY、FTY、FPY或FEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是MVY、MAY、MLY、MSY、MGY、MRY、MKY、MMY、MCY、MFY、MTY、MPY或MEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是TVY、TAY、TLY、TSY、TGY、TRY、TKY、TMY、TCY、TFY、TTY、TPY或TEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是NVY、NAY、NLY、NSY、NGY、NRY、NKY、NMY、NCY、NFY、NTY、NPY或NEY。在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是RVY、RAY、RLY、RSY、RGY、RRY、RKY、RMY、RCY、RFY、RTY、RPY或REY。

在一些实施方案中，接头的C末端部分(X₁-X₂-X₃)是选自表2的任一者。

表2：接头的C端三个氨基酸的示例性序列。

在一些实施方案中，接头包含含有(EAAAK)_n的肽序列，其中n是1至25的整数(例如，1至20或1至10)，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者。在一些实施方案中，接头包含含有(XP)_n、(XPP)_n或(XPPP)_n的肽序列，其中X是任何氨基酸，并且其中n是1至25的整数(例如1至20或1至10)，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者。在一些实施方案中，接头包含含有(XP)_n、(XPP)_n或(XPPP)_n的肽序列，其中每个X是G、A、P或S，并且其中n是1至25的整数(例如1至20或1至10)，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者。在一些实施方案中，接头包含含有(AP)_n或(APAP)_n的肽序列，其中n是1至25的整数(例如1至20或1至10)，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者。在一些实施方案中，接头包含含有(EEEEKKKK)_n的肽序列，其中n是1至25的整数(例如1至20或1至10)，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者。在一些实施方案中，接头包含肽序列，该肽序列包含(G_xS_y)_n，其中x是1至5，其中y是1至5，并且其中n是1至25的整数(例如1至20或1至10)，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者。在一些实施方案中，接头包含含有(GGGGS)_n的肽序列，其中n是1至25的整数(例如，1至20或1至10)，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者。在一些实施方案中，接头包含本文公开的肽序列和本文公开的接头的C末端部分的X₁-X₂-X₃。

在一些实施方案中，接头是刚性接头。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头是可裂解接头。在一些实施方案中，接头是不可裂解接头。

在一些实施方案中，刚性接头的刚性被最大化以增加共结合部分的亲和力。在一些实施方案中，刚性接头仅能弯曲或挠曲不超过90度，例如不超过75度、60度、45度、30度、15度或5度中的任一者。在一些实施方案中，刚性接头仅能弯曲或挠曲不超过45度，并且可以扭曲不超过30度。在一些实施方案中，接头仅能扭曲小于360度，例如小于300度、240度、180度、150度、120度、90度、60度、30度、15度或5度中的任一者。在一些实施方案中，接头仅能扭曲小于5度。在一些实施方案中，刚性接头仅能弯曲或挠曲不超过90度，例如不超过75度、60度、45度、30度、15度或5度中的任一者，并且可以扭曲小于360度、300度、240度、180度、150度、120度、90度、60度、30度、15度或5度中的任一者。

在一些实施方案中，刚性接头具有刚性中间部分和在一个或多个端上刚性较小的连接至结合部分的尖端。在一些实施方案中，刚性接头具有刚性中间部分和在一个或多个端上刚性较小的连接至结合部分的尖端。例如，此类刚性接头可以促进结合部分与靶分子上非重叠表位的同时结合。

在一些实施方案中，接头经由非共价相互作用将第一结合部分和第二结合部分缔合。在此类实施方案中，第一结合部分和/或第二结合部分包含参与非共价相互作用的部分。例如，在一些实施方案中，接头包含亮氨酸拉链，其中第一结合部分包含亮氨酸拉链的第一部分，并且其中第二结合部分包含亮氨酸拉链的第二部分。在一些实施方案中，接头包含双链核酸，其包含具有互补区的两条链，其中第一结合部分包含核酸链，并且其中第二结合部分包含第二核酸链。

在一些实施方案中，核酸接头包含多核苷酸，诸如寡核苷酸、双链DNA、单链DNA、双链RNA或单链RNA。在一些实施方案中，核酸接头包含200个核苷酸或更少，例如180个核苷酸或更少、160个核苷酸或更少、140个核苷酸或更少、120个核苷酸或更少、100个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、20个核苷酸或更少或10个核苷酸或更少中的任一者。

在一些实施方案中，接头具有长度，诸如基于接头的一级结构，例如氨基酸的线性链。在一些实施方案中，接头的长度基于一级结构，例如氨基酸的线性链来评估。在一些实施方案中，接头的长度不超过250埃，例如不超过240埃、230埃、220埃、210埃、200埃、190埃、180埃、170埃、160埃、150埃、140埃、130埃、120埃、110埃、100埃、90埃、80埃、70埃、60埃、50埃、40埃、30埃、20埃、15埃、10埃或5埃中的任一者。在一些实施方案中，接头的长度为约250埃、240埃、230埃、220埃、210埃、200埃、190埃、180埃、170埃、160埃、150埃、140埃、130埃、120埃、110埃、100埃、90埃、80埃、70埃、60埃、50埃、40埃、30埃、20埃、15埃、10埃或5埃中的任一者。在一些实施方案中，接头的长度被减小到提供至少第一结合部分和第二结合部分的连接而不干扰相应结合分子与靶分子的结合所需的最小长度。在一些实施方案中，接头的长度被配置以实现最小熵损失和最小的对结合分子与靶分子的结合的干扰。

在一些实施方案中，接头的长度不超过120个氨基酸，例如不超过115个氨基酸、110个氨基酸、105个氨基酸、100个氨基酸、95个氨基酸、90个氨基酸、85个氨基酸、80个氨基酸、75个氨基酸、70个氨基酸、65个氨基酸、60个氨基酸、55个氨基酸、50个氨基酸、45个氨基酸、40个氨基酸、35个氨基酸、30个氨基酸、25个氨基酸、20个氨基酸、15个氨基酸、10个氨基酸或5个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，接头的长度为约120个氨基酸、115个氨基酸、110个氨基酸、105个氨基酸、100个氨基酸、95个氨基酸、90个氨基酸、85个氨基酸、80个氨基酸、75个氨基酸、70个氨基酸、65个氨基酸、60个氨基酸、55个氨基酸、50个氨基酸、45个氨基酸、40个氨基酸、35个氨基酸、30个氨基酸、25个氨基酸、20个氨基酸、15个氨基酸、10个氨基酸或5个氨基酸中的任一者。

在一些实施方案中，接头是化学接头，诸如合成化学结构或聚合物。在一些实施方案中，接头包含多个聚乙二醇亚基。在一些实施方案中，接头是非肽基聚合物。

D.结合物分子的其他构型、替代物和变体

本文提供了包含特异性识别靶位点的第二结合部分的结合物分子的各种构型，其中第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分。在一些实施方案中，结合物分子包含接头。在一些实施方案中，结合物分子不包含接头。在一些实施方案中，结合物分子包含不是结合部分的第一部分，诸如酶、药物或毒素。在一些实施方案中，结合物分子是多特异性结合物分子，诸如双特异性共结合物。在一些实施方案中，结合物分子诸如共结合物是包含至少第三结合部分的多聚体结合物分子。在一些实施方案中，结合物分子是CAR，包括多特异性CAR，例如双特异性CAR。在一些实施方案中，结合物分子是缀合物，诸如与药物或标记缀合的共结合物，包括双特异性缀合物。

在一些实施方案中，结合物分子包含第一部分，其为特异性结合靶的非免疫球蛋白结合物分子。这些替代性结合物分子可以包括例如本领域已知的任何工程化蛋白质支架。此类支架可以包含一个或多个针对靶的抗体的CDR。此类支架包括例如anticalin，其基于脂质运载蛋白支架，是特征在于支持形成配体结合位点的四个高变环的刚性β-桶的蛋白质结构。新的结合特异性可通过环区中的定向随机诱变与功能展示和指导选择来工程化(参见例如Skerra,2008,FEBS J.275:2677-83)。其他合适的支架可包括例如基于人纤连蛋白III的第十个细胞外结构域的阿德奈汀(adnectin)或单体(参见例如Koide和Koide,2007,Methods Mol.Biol.352:95-109)；亲和体，基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域(参见例如Nygren等人,2008,FEBS J.275:2668-76))；DARPin，基于锚蛋白重复蛋白(参见例如Stumpp等人,2008,Drug.Discov.Today 13:695-701)；fynomer，基于人Fyn蛋白激酶的SH3结构域(参见例如Grabulovski等人,2007,J.Biol.Chem.282:3196-204)；affitin，基于来自嗜酸硫化叶菌的Sac7d(参见例如Krehenbrink等人,2008,J.Mol.Biol.383:1058-68)；affilin，基于人类y-B-晶体蛋白(参见例如Ebersbach等人,2007,J.Mol.Biol.372:172-85)；亲合体，基于膜受体蛋白的A结构域(参见例如Silverman等人,2005,Biotechnol.23:1556-61)；富含半胱氨酸的打结素肽(参见例如Kolmar,2008,FEBS J.275:2684-90)；以及工程化Kunitz型抑制剂(参见例如Nixon和Wood,2006,Curr.Opin.Drug.Discov.Dev.9:261-68)。关于综述，参见例如Gebauer和Skerra,2009,Curr.Opin.Chem.Biol.13:245-55。

在一些实施方案中，本公开包括结合物分子，诸如共结合物的氨基酸序列修饰。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列修饰。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解性。因此，预期可以制备结合物分子，诸如共结合物、变体。例如，可以通过将适当的核苷酸改变引入到编码DNA中和/或通过合成所需抗体或多肽来制备共结合物变体。本领域技术人员理解氨基酸改变可以改变共结合物或作为共结合物的一部分的抗体或其抗原结合片段的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置或改变膜锚定特征。

在一些实施方案中，本文提供的结合物分子诸如共结合物例如通过将任何类型的分子共价附接到结合物分子诸如共结合物或其抗体或抗原结合片段来进行化学修饰。此类衍生物可以包括例如已被化学修饰的共结合物，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白质的连接等来化学修饰。许多化学修饰中的任一种可以通过已知技术进行，包括但不限于衣霉素的特定化学裂解、乙酰化、配制、代谢合成等。此外，抗体可含有一个或多个非经典氨基酸。

变异可以是一个或多个编码多肽(共结合物或作为共结合物一部分的抗体或其抗原结合片段)的密码子的取代、缺失或插入，其导致与多肽的天然序列相比氨基酸序列发生改变。氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸置换一个氨基酸的结果，例如用丝氨酸置换亮氨酸，例如保守性氨基酸置换。插入或缺失可以任选地在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施方案中，取代、缺失或插入包括相对于原始分子不超过25个氨基酸取代，例如不超过20个氨基酸取代、18个氨基酸取代、15个氨基酸取代、10个氨基酸取代、5个氨基酸取代、4个氨基酸取代、3个氨基酸取代或2个氨基酸取代中的任一者。在一个具体实施方案中，取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守性氨基酸取代。允许的变异可以通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代，并测试所得变体的全长或成熟天然序列所表现出的活性来确定。

氨基酸序列插入包括长度在一个残基至包含一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N末端或C末端与增加抗体血清半衰期的酶(例如，用于抗体导向的酶前药疗法)或多肽的融合。

结合物分子诸如共结合物或抗体或其抗原结合片段的生物学性质的实质性修饰是通过选择在以下情况下其作用显著不同的取代来实现：保持(a)取代区域内多肽主链的结构，例如折叠或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)大部分侧链。替代地，可以进行保守性(例如，在具有相似性质和/或侧链的氨基酸基团内)取代，以便保持或不显着改变性质。氨基酸可以根据其侧链性质的相似性进行分类(参见例如Lehninger,Biochemistry 73-75(2d ed.1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。

替代地，天然存在的残基可以根据共同的侧链性质分成几组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族：Trp、Tyr、Phe

非保守性取代需要将这些类之一的成员与另一类交换。也可以将此类取代的残基引入保守取代位点或引入剩余的(非保守的)位点。可以使用本领域已知的方法，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来产生变异。可以对克隆的DNA进行定点诱变(参见例如Carter,1986,Biochem J.237:1-7；和Zoller等人,1982,Nucl.Acids Res.10:6487-500)、盒式诱变(参见例如Wells等人,1985,Gene34:315-23)或其他已知的技术以产生共结合物变体DNA。

任何不参与维持结合物分子诸如共结合物或抗体或其抗原结合片段的正确构象的半胱氨酸残基也可以被例如另一种氨基酸诸如丙氨酸或丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，例如，半胱氨酸键可以添加到共结合物或作为共结合物的一部分的抗体或其抗原结合片段中，以改善其稳定性(例如，其中抗体是抗体片段诸如Fv片段)。

在一些实施方案中，结合物分子诸如共结合物或抗体或其抗原结合片段是“去免疫的”。在一些实施方案中,“去免疫”的结合物分子诸如共结合物包含人源化抗体或嵌合抗体，与相应原始非去免疫的抗体相比，其氨基酸序列有一个或多个改变，从而导致抗体的免疫原性降低。用于产生此类抗体突变体的程序之一包括鉴定和去除抗体分子的T细胞表位。在第一步骤中，抗体分子的免疫原性可以通过几种方法来确定，例如通过体外确定T细胞表位或在计算机上预测此类表位，如本领域已知的。一旦确定T细胞表位功能的关键残基，就可以进行突变以去除免疫原性并保留抗体活性。关于综述，参见例如Jones等人,2009,Methods in Molecular Biology 525:405-23。

在某些方面，在本公开的范围内包括结合物分子诸如共结合物的共价修饰。共价修饰包括使结合物分子诸如共结合物的靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应，所述有机衍生剂能够与结合物分子的所选侧链或N末端或C末端残基反应。其他修饰包括将谷氨酰胺基和天冬酰胺基残基分别脱酰胺为相应谷氨酰基和天冬氨酰基残基；脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酸或苏氨酰残基的羟基磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(参见例如Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties 79-86(1983))；N末端胺的乙酰化；以及任何C末端羰基的酰胺化。

在本公开的范围内包括的结合物分子诸如共结合物的其他类型的共价修饰包括改变天然糖基化模式(参见例如Beck等人,2008,Curr.Pharm.Biotechnol.9:482-501；和Walsh,2010,Drug Discov.Today15:773-80)，并以例如美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337中陈述的方式将结合物分子连接至各种非蛋白聚合物例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯之一。

在一些实施方案中，本公开的结合物分子诸如共结合物也可以被修饰以形成嵌合分子，其包含共结合物与另一种异源多肽或氨基酸序列例如表位标签(参见例如,Terpe,2003,Appl.Microbiol.Biotechnol.60:523-33)或IgG分子的Fc区(参见例如Aruffo,Antibody Fusion Proteins 221-42(Chamow和Ashkenazi编,1999))的融合物。

在一些实施方案中，本文还提供了融合蛋白，其包含本文提供的结合物分子诸如共结合物和异源多肽。在一些实施方案中，与结合物分子诸如共结合物融合的异源多肽可用于将结合物分子靶向特定细胞。

本公开还提供了包含本公开的结合物分子诸如共结合物的缀合物，所述结合物分子诸如通过接头(例如合成接头)共价结合到一种或多种药剂。

在一些实施方案中，本文提供的结合物分子诸如共结合物例如与可检测分子缀合或重组融合。

这种检测可以通过例如将共结合物偶联到可检测物质来完成，所述可检测物质包括但不限于各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素或亲和素/生物素；荧光物质，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于荧光素酶、荧光素或水母发光蛋白；化学发光材料，例如但不限于基于吖啶鎓的化合物或HALOTAG；放射性材料，例如但不限于碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I和¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In和¹¹¹In)、锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga和⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn或¹¹⁷Sn；使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属；和非放射性顺磁性金属离子。

本文还提供了与异源蛋白质或多肽(或其片段，例如约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个氨基酸的多肽)重组融合或化学缀合(共价或非共价缀合)以产生融合蛋白的结合物分子诸如共结合物，以及其用途。特别地，本文提供了包含本文提供的共结合物和异源蛋白、多肽或肽的融合蛋白。在一个实施方案中，与抗体融合的异源蛋白质、多肽或肽可用于将共结合物靶向特定细胞类型。例如，与特定细胞类型表达的细胞表面受体结合的共结合物可以与细胞毒性抗体或肽融合或缀合。

此外，本文提供的结合物分子诸如共结合物可以与标记或“标签”序列例如肽融合，以促进纯化。在具体实施方案中，标记或标签氨基酸序列是六组氨酸肽，诸如pQE载体中提供的标签(参见例如QIAGEN,Inc.)，尤其其中许多是可商购获得的。例如，如Gentz等人1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-24中所述的，六组氨酸提供融合蛋白的方便的纯化。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,1984,Cell 37:767-78)和“FLAG”标签。

用于将部分(包括多肽)与结合物分子诸如共结合物融合或缀合的方法是已知的(参见例如Arnon等人,Monoclonal Antibodies for Immunotargeting的Drugs in CancerTherapy,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56(Reisfeld等人编,1985)；Hellstrom等人,Antibodies for Drug Delivery,in Controlled Drug Delivery623-53(Robinson等人编,第2版1987)；Thorpe,Antibody Carriers的Cytotoxic Agentsin Cancer Therapy:A Review,in Monoclonal Antibodies:Biological and ClinicalApplications 475-506(Pinchera等人编,1985)；Analysis,Results,and FutureProspective的therapeutic Use的Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy,inMonoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16(Baldwin等人编,1985)；Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.62:119-58；美国专利号5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,723,125；5,783,181；5,908,626；5,844,095；和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公布WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631和WO 99/04813；Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10535-39；Traunecker等人,1988,Nature,331:84-86；Zheng等人,1995,J.Immunol.154:5590-600；以及Vil等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-41)。

例如，可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)技术来产生融合蛋白。DNA改组可用于改变如本文提供的共结合物的活性，所述共结合物包括例如具有较高亲和力和较低解离速率的共结合物(参见例如美国专利号5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458；Patten等人,1997,Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等人,1999,J.Mol.Biol.287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-13)。共结合物或本文对于共结合物提供的抗体可以通过在重组前经由易错PCR进行随机诱变、进行随机核苷酸插入或其他方法来改变。编码本文提供的抗体的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一种或多种组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。

本文提供的结合物分子诸如共结合物也可以与第二抗体缀合以形成抗体缀合物，如例如美国专利号4,676,980中所述。

本文提供的结合物分子诸如共结合物也可以附接至固体支持物，这特别可用于免疫测定或可用于纯化靶抗原。此类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

抗体和药剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备，所述偶联剂例如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)。本公开进一步预期，可以使用如本领域公开的任何合适的方法制备共结合物和试剂的缀合物(参见例如Bioconjugate Techniques(Hermanson编,第2版2008))。

用于结合物分子诸如共结合物和药剂的常规缀合策略已基于随机缀合化学，其涉及Lys残基的ε-氨基或Cys残基的硫醇基，这产生异源缀合物。最近开发的技术允许与多肽发生位点特异性缀合，从而导致均质负载并避免抗原结合或药代动力学发生改变的缀合物亚群。这些包括“thiomab”的工程化，其在重链和轻链上的位置处包含半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代提供反应性巯基，并且不破坏免疫球蛋白的折叠和装配或改变抗原结合(参见例如Junutula等人,2008,J.Immunol.Meth.332:41-52；和Junutula等人,2008,NatureBiotechnol.26:925-32)。在另一种方法中，通过记录终止密码子UGA从终止到硒代半胱氨酸插入，将硒代半胱氨酸共翻译地插入到抗体序列中，从而允许在存在其他天然氨基酸的情况下，在硒代半胱氨酸的亲核硒醇基团处发生位点特异性共价缀合(参见例如,Hofer等人,2008,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:12451-56；和Hofer等人,2009,Biochemistry48(50):12047-57)。

1.嵌合抗原受体(CAR)

在一些方面，本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。在一些方面，本公开提供了一种细胞，其表达本文提供的CAR，诸如CAR效应细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，例如T细胞。本文提供的CAR包含(a)包含本文所述的结合物分子的细胞外结构域，和(b)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含存在于细胞外结构域和细胞内结构域之间的跨膜结构域。

在一些实施方案中，在细胞外结构域和跨膜结构域之间或者在细胞内结构域和跨膜结构域之间可以存在间隔区结构域。间隔区结构域可以是任何寡肽或多肽，其功能是将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或细胞内结构域。间隔区结构域可包含多至约300个氨基酸，包括例如约10至约100个或约25至约50个氨基酸。

跨膜结构域可以来自天然或合成来源。如果来源是天然的，所述结构域可以来自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中特别有用的跨膜区可以衍生自T细胞受体的α、β、δ或γ链、CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154(即至少包含其跨膜区)。在一些实施方案中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它可以主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，可以在合成跨膜结构域的每一端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，长度为例如约2至约10个氨基酸(例如约2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸中的任一者)的短寡肽或多肽接头可在CAR的跨膜域和细胞内信号传导结构域之间形成键联。在一些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。

在一些实施方案中，使用与CAR细胞内结构域中的序列之一天然缔合的跨膜结构域。在一些实施方案中，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。

CAR的细胞内信号传导结构域负责活化其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质中转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的部分。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于替代完整链，只要它转导效应子功能信号。因此，术语“细胞内信号传导序列”意味着包括细胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。

用于本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，它们协同作用以在抗原受体结合后启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。

已知仅通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，可以认为T细胞活化是由两种不同类别的细胞内信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的序列(初级信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级信号或共刺激信号的序列(共刺激信号传导序列)。

初级信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的主要信号传导序列可含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在一些实施方案中，CAR构建体包含一个或多个ITAM。

在本发明中特别有用的含ITAM的初级信号传导序列的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些序列。

在一些实施方案中，CAR包含衍生自CD3ζ的主要信号传导序列。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ细胞内信号传导序列本身，或者其与可用于本文所述的CAR的上下文中的任何其他所需细胞内信号传导序列组合。例如，CAR的细胞内结构域可以包含CD3ζ细胞内信号传导序列和共刺激信号传导序列。共刺激信号传导序列可以是共刺激分子的细胞内结构域的一部分，包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等。

在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞内信号传导序列和CD28的细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞内信号传导序列和4-1BB的细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞内信号传导序列和CD28和4-1BB的细胞内信号传导序列。

本文还提供了表达本文所述的CAR的效应细胞(诸如淋巴细胞，例如T细胞)。

还提供了一种产生表达本文所述的CAR的效应细胞的方法，所述方法包括将包含编码CAR的核酸的载体引入到效应细胞中。在一些实施方案中，将载体引入到效应细胞中包括用载体转导效应细胞。在一些实施方案中，将载体引入到效应细胞中包括用载体转染效应细胞。可以使用本领域已知的任何方法将载体转导或转染到效应细胞中。

2.免疫缀合物

在一些实施方案中，结合物分子包含免疫缀合物，所述免疫缀合物包含附接至效应分子的结合物分子诸如共结合物(在本文中也称为“免疫缀合物”)。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，例如癌症治疗剂，其是细胞毒性的、细胞抑制性的或以其他方式提供一些治疗益处。在一些实施方案中，效应分子是标记，其可以直接或间接产生可检测的信号。

在一些实施方案中，提供了包含结合物分子和治疗剂的免疫缀合物(在本文中也称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性、细胞抑制性或者预防或降低靶细胞分裂能力的毒素。ADC用于局部递送细胞毒性剂或细胞生长抑制剂，即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物的用途(Syrigos和Epenetos,AnticancerResearch 19:605-614(1999)；Niculescu-Duvaz和Springer,Adv.Drg.Del.Rev.26:151 -172(1997)；美国专利号4,975,278)允许将药物部分靶向递送至靶细胞，并在其中进行细胞内积累，其中全身施用这些未缀合的治疗剂可能导致对正常细胞以及寻求消除的靶细胞的毒性达到不可接受的水平(Baldwin等人,Lancet(1986年3月15日):603-605(1986)；Thorpe,(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview,”in Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(编),第475-506页)。由此寻求在毒性最小的情况下的最大功效。

免疫缀合物中使用的治疗剂包括例如柔红霉素、阿霉素、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland等人,Cancer Immunol.Immunother.21:183-187(1986))。免疫缀合物中使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素，植物毒素诸如蓖麻毒素，小分子毒素诸如格尔德霉素(Mandler等人,J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000)；Mandler等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000)；Mandler等人,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002))，美登素类化合物(EP 1391213；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996))，以及卡奇霉素(Lode等人,Cancer Res.58:2928(1998)；Hinman等人,CancerRes.53:3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制来发挥其细胞毒性和细胞抑制作用。当与大抗体或蛋白质受体配体结合时，一些细胞毒性药物往往是无活性的或活性较低的。

可使用的具有酶活性的毒素及其片段包括例如白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、莫德西菌素(modeccin)A链、α-八叠球菌、油桐树蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。

本文还考虑了结合物分子和一种或多种小分子毒素的免疫缀合物，所述小分子毒素例如卡奇霉素、美登素类化合物、尾海兔素、澳瑞他汀(aurostatin)、单端孢霉烯和CC1065，以及这些具有毒素活性的毒素的衍生物。

在一些实施方案中，提供了一种免疫缀合物，其包含具有细胞内活性的治疗剂。在一些实施方案中，免疫缀合物被内在化，并且治疗剂是阻断细胞蛋白质合成的细胞毒素，从而导致细胞死亡。在一些实施方案中，治疗剂是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素，所述多肽包括例如白树毒素、波苷素(bouganin)、皂草素、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、异株泻根毒蛋白(bryodin)、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞菌外毒素A及其变体。在一些实施方案中，当治疗剂是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素时，抗AMC免疫缀合物必须在与靶细胞结合后被内在化，以使蛋白质对细胞具有细胞毒性。

在一些实施方案中，提供了一种免疫缀合物，其包含用于破坏DNA的治疗剂。在一些实施方案中，用于破坏DNA的治疗剂例如选自由以下各项组成的组：烯二炔(例如，卡奇霉素和埃斯帕霉素(esperamicin))和非烯二炔小分子药剂(例如，博来霉素、甲锭丙基-EDTA-Fe(II))。根据本申请有用的其他癌症治疗剂包括但不限于柔红霉素、阿霉素、偏端霉素A、顺铂、丝裂霉素C、海鞘素、倍癌霉素(duocarmycin)/CC-1065和博莱霉素/培洛霉素(pepleomycin)。

本发明进一步考虑了一种免疫缀合物，其在结合物分子与具有核酸溶解活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成。

在一些实施方案中，免疫缀合物包含用于破坏微管蛋白的药剂。此类药剂药物可以包括例如根霉素/美登素、紫杉醇、长春新碱和长春碱、秋水仙碱、瑞奥西汀(auristatin)、尾海兔素10MMAE和佩洛鲁西德(peloruside)A。

在一些实施方案中，免疫缀合物包含烷化剂，包括例如Asaley NSC 167780、AZQNSC 182986、BCNU NSC 409962、白消安NSC 750、羧基邻苯二甲酸铂NSC 271674、CBDCA NSC241240、CCNU NSC 79037、CHIP NSC 256927、苯丁酸氮芥NSC 3088、氯脲霉素NSC 178248、顺铂NSC 119875、氯乙矾NSC 338947、氰基吗啉阿霉素NSC 357704、甲基二磺酸乙二醇脂(cyclodisone)NSC 348948、去水卫矛醇NSC 132313、氟多巴NSC 73754、亥舒凡(hepsulfam)NSC 329680、海蒽酮NSC 142982、美法仑NSC 8806、甲基CCNU NSC 95441、丝裂霉素C NSC 26980、米托唑胺NSC 353451、氮芥NSC 762、PCNU NSC 95466、哌嗪NSC 344007、哌嗪二酮NSC 135758、哌泊溴烷NSC 25154、泊菲霉素NSC 56410、螺乙内酰脲氮芥NSC172112、替罗昔隆NSC 296934、四铂NSC 363812、噻替派NSC 6396、三亚乙基三聚氰胺NSC9706、尿嘧啶氮芥NSC 34462和Yoshi-864 NSC 102627。

在一些实施方案中，本申请的免疫缀合物的癌症治疗剂部分可包含抗有丝分裂剂，包括但不限于别秋水仙碱NSC 406042、软海绵素B NSC 609395、秋水仙碱NSC 757、秋水仙碱衍生物NSC 33410、多司他丁10NSC 376128(NG-瑞奥西汀衍生的)、美登素NSC 153858、根霉素NSC 332598、紫杉醇NSC 125973、紫杉醇衍生物NSC 608832、硫代秋水仙碱NSC361792、三苯甲基半胱氨酸NSC 83265、硫酸长春碱NSC 49842和硫酸长春新碱NSC 67574。

在一些实施方案中，免疫缀合物包含拓扑异构酶I抑制剂，包括但不限于喜树碱NSC 94600、喜树碱、钠盐NSC 100880、氨基喜树碱NSC 603071、喜树碱衍生物NSC 95382、喜树碱衍生物NSC 107124、喜树碱衍生物NSC 643833、喜树碱衍生物NSC 629971、喜树碱衍生物NSC 295500、喜树碱衍生物NSC 249910、喜树碱衍生物NSC 606985、喜树碱衍生物NSC374028、喜树碱衍生物NSC 176323、喜树碱衍生物NSC 295501、喜树碱衍生物NSC 606172、喜树碱衍生物NSC 606173、喜树碱衍生物NSC 610458、喜树碱衍生物NSC 618939、喜树碱衍生物NSC 610457、喜树碱衍生物NSC 610459、喜树碱衍生物NSC 606499、喜树碱衍生物NSC610456、喜树碱衍生物NSC 364830、喜树碱衍生物NSC 606497和吗啉代阿霉素NSC 354646。

在一些实施方案中，免疫缀合物包含拓扑异构酶II抑制剂，包括但不限于阿霉素NSC 123127、氨萘非特NSC 308847、m-AMSA NSC 249992、蒽并三唑衍生物NSC 355644、吡唑并吖啶NSC 366140、盐酸比生群NSC 337766、道诺霉素NSC 82151、脱氧阿霉素NSC 267469、米托蒽醌NSC 301739、美诺立尔NSC 269148、N,N-二苄基道诺霉素NSC 268242、噁烷噻唑(oxanthrazole)NSC 349174、正定苯酰肼NSC 164011、VM-26NSC 122819和VP-16NSC141540。

在一些实施方案中，免疫缀合物包含RNA或DNA抗代谢物，包括但不限于L-丙氨菌素NSC 153353、5-氮杂胞苷NSC 102816、5-氟尿嘧啶NSC 19893、阿维菌素NSC 163501、氨基蝶呤衍生物NSC 132483、氨基蝶呤衍生物NSC 184692、氨基蝶呤衍生物NSC 134033、叶酸拮抗剂NSC 633713、叶酸拮抗剂NSC 623017、Baker氏可溶性叶酸拮抗剂NSC 139105、二氯烯丙基散沫花素NSC 126771、布喹那NSC 368390、替加氟(前药)NSC 148958、5,6-二氢-5-氮杂胞苷NSC 264880、甲氨蝶呤NSC 740、甲氨蝶呤衍生物NSC 174121、N-(膦酸乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)NSC 224131、吡唑呋喃菌素NSC 143095、曲美沙特NSC 352122、3-HP NSC95678、2'-脱氧-5-氟尿苷NSC 27640、5-HP NSC 107392、α-TGDR NSC 71851、阿非迪霉素甘氨酸盐NSC 303812、ara-C NSC 63878、5-氮杂-2'-脱氧胞苷NSC 127716、β-TGDR NSC71261、环胞苷NSC 145668、胍唑NSC 1895、羟基脲NSC 32065、肌苷羟乙醛NSC 118994、马克霉素(macbecin)Il NSC 330500、吡唑并咪唑NSC 51143、硫鸟嘌呤NSC 752和硫代嘌呤NSC755。

在一些实施方案中，免疫缀合物包含高放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合的抗体。实例包括²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P、²¹²Pb和Lu的放射性同位素。

在一些实施方案中，结合物分子可与“受体”(诸如链霉亲和素)缀合，用于肿瘤预靶向，其中向患者施用结合物分子-受体缀合物，随后使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性剂(诸如放射性核苷酸)缀合的“配体”(诸如亲和素)。

在一些实施方案中，免疫缀合物可包含与前药活化酶缀合的结合物分子。在一些这样的实施方案中，前药活化酶将前药(例如肽基化学治疗剂，参见WO 81/01145)转化为活性药物，诸如抗癌药物。可与抗体缀合的酶包括但不限于碱性磷酸酶，其可用于将含磷酸盐的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，其可用于将含硫酸盐的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱氨酶，其可用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，诸如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)，其可用于将含肽前药转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，其可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，其可用于将糖基化前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，其可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；和青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶，其可用于将在其胺氮上分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化成游离药物。在一些实施方案中，酶可以通过本领域熟知的重组DNA技术与抗体部分共价结合。参见例如Neuberger等人,Nature 312:604-608(1984)。

在一些实施方案中，免疫缀合物的治疗部分可以是核酸。可以使用的核酸包括但不限于反义RNA、基因或其他多核苷酸，包括核酸类似物诸如硫代鸟嘌呤和硫代嘌呤。

本申请进一步提供了包含附接至效应分子的结合物分子的免疫缀合物，其中效应分子是标记，其可以间接或直接产生可检测的信号。这些免疫缀合物可用于研究或诊断应用，例如用于体内检测癌症。标记优选能够直接或间接产生可检测的信号。例如，标记可以是不透射线的或放射性同位素，诸如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或者金属离子。在一些实施方案中，标记是用于闪烁成像研究的放射性原子，例如⁹⁹Tc或¹²³I，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，诸如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可以与各种金属螯合剂络合，并与抗体缀合，例如用于PET成像(WO 2011/056983)。

3.核酸

还考虑了编码结合物分子的核酸分子，包括其构建体。在一些实施方案中，提供了一种编码全长结合物分子诸如共结合物的核酸(或一组核酸)。在一些实施方案中，提供了一种编码多特异性结合物分子(例如，多特异性结合物分子、双特异性结合物分子或双特异性T细胞衔接子)或其多肽部分的核酸(或一组核酸)。在一些实施方案中，提供了一种编码CAR的核酸(或一组核酸)。在一些实施方案中，提供了一种编码免疫缀合物或其多肽部分的核酸(或一组核酸)。

本申请还包括这些核酸序列的变体。例如，变体包含在至少适度严格的杂交条件下与编码本申请的结合物分子的核酸序列(包括其构建体)杂交的核苷酸序列。

本发明还提供了其中插入本发明核酸的载体。

简言之，通过将编码结合物分子或其多肽部分的天然或合成核酸插入到合适的表达载体中，使得核酸可操作地连接至5’和3’调控元件，包括例如启动子(例如，淋巴细胞特异性启动子)和3’非翻译区(UTR)，可以实现所述核酸对结合物分子(包括其构建体(例如，CAR))或其多肽部分的表达。载体可以适合在真核宿主细胞中复制和整合。典型的克隆和表达载体包含转录和翻译终止子、起始序列和用于调控所需核酸序列表达的启动子。

使用标准基因递送方案，本发明的核酸也可用于核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，其以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，本发明提供了一种基因治疗载体。

核酸可被克隆到许多类型的载体中。例如，核酸可被克隆到载体(包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒)中。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

另外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域中熟知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体包含在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记(参见，例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。

已开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因传递系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将所选择的基因插入到载体中并包装在逆转录病毒粒子中。然后可以分离重组病毒并体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。来源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体相对于来源于肿瘤逆转录病毒诸如鼠白血病病毒的载体具有额外优势，因为它们可以转导非增殖细胞诸如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。

额外的启动子元件，例如增强子，调控转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至相隔50bp。

合适启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应局限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也设想为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要此种表达时，所述分子开关能够开启与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，当不需要表达时，所述分子开关能够关闭所述表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体也可以包含选择标记基因或报告基因或两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择标记和报告基因都可侧接适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素抗性基因，诸如neo等。

报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评价调控序列的功能性。一般来说，报告基因是受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，其编码其表达表现为一些易于检测的性质(例如，酶促活性)的多肽。在将DNA引入受体细胞后的合适时间检测报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tel等人，2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，具有显示报告基因最高表达水平的最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可以与报告基因连接，并用于评价剂的调节启动子驱动的转录的能力。

将基因引入到细胞中并表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York)。在一些实施方案中，通过磷酸钙转染将多核苷酸引入到宿主细胞中。

用于将感兴趣多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入到哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学方法包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用于用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入到宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以被包封在脂质体的含水内部，散布在脂质体的脂质双层中，通过与脂质体和寡核苷酸缔合的连接分子附接到脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“折叠”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不一致的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括细胞质中天然存在的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃及其衍生物的一类化合物，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

不管用于将外源核酸引入到宿主细胞中或将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了证实宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定法，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定法来鉴定属于本发明范围内的药剂。

E.关于结合物分子及其部分的额外特征和详情

在一些实施方案中，结合物分子，诸如共结合物或其组分的第二结合部分和/或第一结合部分来源于单克隆抗体、抗体片段、人源化抗体或人抗体。单克隆抗体是本领域熟知的，并且制备和筛选的方法在例如Kohler等人,1975,Nature 256:495-97；美国专利号4,816,567；Munson等人,1980,Anal.Biochem.107:220-39；Skerra等人,1993,Curr.Opinionin Immunol.5:256-62；Plückthun,1992,Immunol.Revs.130:151-88；Bass等人,1990,Proteins 8:309-14；WO 92/09690；以及Bowers等人,2011,Proc Natl Acad Sci USA.108:20455-60中举例说明。抗体片段是本领域中熟知的，并且制备和筛选的方法在例如Hudson等人,2003,Nature Med.9:129-34；Morimoto等人,1992,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-17；Brennan等人,1985,Science229:81-83；Carter等人,1992,Bio/Technology 10:163-67；美国专利号5,869,046；WO 93/16185；美国专利号5,571,894；美国专利号5,587,458；Woolven等人,1999,Immunogenetics 50:98-101；和Streltsov等人,2004,Proc NatlAcad Sci USA.101:12444-49中举例说明。人源化抗体和人抗体是本领域中熟知的，并且制备和筛选的方法在例如Jones等人,1986,Nature 321:522-25；Riechmann等人,1988,Nature 332:323-27；Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-36；Padlan等人,1995,FASEB J.9:133-39；Sims等人,1993,J.Immunol.151:2296-308；Chothia等人,1987,J.Mol.Biol.196:901-17；Carter等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；Presta等人,1993,J.Immunol.151:2623-32；Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-25；Lazar等人,2007,Mol.Immunol.44:1986-98；Hoogenboom,2005,Nat.Biotechnol.23:1105-16；Dufner等人,2006,Trends Biotechnol.24:523-29；Feldhaus等人,2003,Nat.Biotechnol.21:163-70；Schlapschy等人,2004,Protein Eng.Des.Sel.17:847-60；Foote和Winter,1992,J.Mol.Biol.224:487-99)；Dall’Acqua等人,2005,Methods 36:43-60；Studnicka等人,1994,Protein Engineering 7:805-14；美国专利号5,766,886；5,770,196；5,821,123；and 5,869,619；PCT公布WO 93/11794；Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001-05；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications 51-63(1987)；以及Boerner等人,1991,J.Immunol.147:86-95；Jakobovits,A.,1995,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66；Brüggemann和Taussing,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58；美国专利号6,075,181和6,150,584中举例说明。

III.靶

本文提供的结合物分子包含特异性识别包含靶位点(例如，表位)的一个或多个靶的元件，例如第一结合部分和第二结合部分。在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分特异性识别同一靶上的不同表位，例如第一结合部分识别靶诸如多肽上的第一表位，并且第二结合部分识别靶上的第二表位。在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分特异性识别同一靶上的相同表位，例如第一结合部分和第二结合部分特异性识别同源二聚体。在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分特异性识别不同靶上的不同表位，例如，第一结合部分识别第一靶如多肽上的第一表位并且第二结合部分识别第二靶如多肽上的第二表位。在此种实施方案中，第一靶和第二靶彼此邻近。在一些实施方案中，第一靶和第二靶形成单一复合物，例如蛋白质复合物。

在一些实施方案中，靶是多肽、多蛋白质复合物、核酸、碳水化合物、聚糖、脂质分子、生理代谢物或小分子化合物。在一些实施方案中，靶分子是多肽。在一些实施方案中，靶分子是蛋白质。在一些实施方案中，靶分子是多蛋白质复合物。在一些实施方案中，靶分子是核酸。在一些实施方案中，靶分子是DNA分子。在一些实施方案中，靶分子是RNA分子。在一些实施方案中，靶分子是脂质分子。在一些实施方案中，靶分子是糖。在一些实施方案中，靶分子是碳水化合物。在一些实施方案中，靶分子是聚糖。在一些实施方案中，靶分子是生理代谢物。在一些实施方案中，靶分子是小分子化合物。

在一些实施方案中，靶是多肽、多蛋白质复合物、核酸、碳水化合物、聚糖、脂质分子、生理代谢物或小分子化合物。在一些实施方案中，靶是细胞内分子、疾病标记、新抗原或细胞表面分子。在一些实施方案中，靶分子是癌症抗原或癌症标记。在一些实施方案中，靶是EGFR。在一些实施方案中，靶的表达水平为低于1×10⁶、低于1×10⁵、低于1×10⁴、低于1×10³或低于1×10²/细胞。

对靶分子具有高结合亲和力的结合部分(例如K_D为1×10^-12M)与对靶分子具有低结合亲和力的结合部分(例如K_D为1×10^-9M)相比，更可能对非特异性靶具有高结合亲和力(例如K_D为1×10^-9M)。在一些实施方案中，选择对靶分子具有低结合亲和力的结合部分来制备共结合物。在一些实施方案中，具有高结合亲和力的共结合物(例如K_D为1×10^-12M或更小)包含第一结合部分和第二结合部分，其中之一或两者的K_D为至少1×10^-10M、至少1×10^-9、至少1×10^-8、至少1×10^-7或至少1×10^-6M，使得可以减少非特异性结合或使其最小化。

在一些实施方案中，报告相对于对照结合物分子，例如对照共结合物的结合物分子的结合。如本文所述，在一些实施方案中，对照结合物分子(例如对照共结合物分子)包含在第二结合部分中不具有N末端截短的抗体可变结构域。在一些实施方案中，结合物分子诸如共结合物包含含有N末端截短的抗体可变结构域的第二抗体部分，所述第二抗体部分与第二靶位点结合的亲和力是包含不具有第二抗体部分的N末端截短的抗体可变结构域的对照结合物分子诸如对照共结合物的亲和力的至少约3倍，例如至少约5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍或1000倍中的任一者。在一些实施方案中，结合物分子和对照结合物分子包含相同接头，例如具有相同氨基酸序列。在一些实施方案中，结合物分子和对照结合物分子包含相同的第一结合部分。在一些实施方案中，本文提供了一种接头对照结合物分子，诸如共结合物，其中接头结合物分子与测试结合物分子相同，除了对照接头结合物分子的接头中的最后三个C末端氨基酸，例如对照接头结合物分子的接头中的最后三个C末端氨基酸是GGG。

在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分或第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-10M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分或第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-9M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分或第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-8M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分或第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-7M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分或第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-6M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分或第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-5M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。

在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分具有相对高的亲和力，并且结合靶的KD小于1×10^-10M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分结合靶的KD小于1×10^{- 11}M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分结合靶的KD小于1×10^-12M。这些共结合物可以具有结合亲和力较低的第二结合部分。在一些实施方案中，共结合物的第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-9M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-8M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-7M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-6M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第二结合部分结合靶的KD为至少1×10^-5M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^{- 16}M。

在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分和第二结合部分二者结合靶的KD为至少1×10^-10M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12M、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分和第二结合部分二者结合靶的KD为至少1×10^-9M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12M、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分和第二结合部分二者结合靶的KD为至少1×10^-8M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12M、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分和第二结合部分二者结合靶的KD为至少1×10^-7M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12M、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分和第二结合部分二者结合靶的KD为至少1×10^-6M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-10M、小于1×10^{- 11}M、小于1×10^-12M、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分和第二结合部分结合靶的KD为至少1×10-5M；并且共结合物结合靶的KD小于1×10^-9M、小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12M、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M或小于1×10^-16M。

第一结合部分或第二结合部分可以对非特异性分子具有高结合亲和力，所述亲和力可以在共结合物中被减小或最小化。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分或第二结合部分结合非特异性分子的KD小于1×10^-10M；并且共结合物结合非特异性分子的KD为至少1×10^-10M、至少1×10^-9M、至少1×10^-8M、至少1×10^-7M、至少1×10^-6M、至少1×10^-5M、至少1×10^-4M或至少1×10^-3M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分或第二结合部分结合非特异性分子的KD小于1×10^-9M；并且共结合物结合非特异性分子的KD为至少1×10^{- 9}M、至少1×10^-8M、至少1×10^-7M、至少1×10^-6M、至少1×10^-5M、至少1×10^-4M或至少1×10^{- 3}M。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分或第二结合部分结合非特异性分子的KD小于1×10^-8M；并且共结合物结合非特异性分子的KD为至少1×10^-8M、至少1×10^-7M、至少1×10^-6M、至少1×10^-5M、至少1×10^-4M或至少1×10^-3M。

IV.组合物和药盒

在一些方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文提供的结合物分子诸如共结合物，以及药学上可接受的载体。在一些方面，本公开提供了一种检测剂，其包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。在一方面，本发明提供了一种诊断剂，其包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。在一方面，本发明提供了一种治疗剂，其包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。

在一些方面，本公开提供了一种细胞，其表达本文提供的结合物分子，诸如共结合物。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。

在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。在一些实施方案中，组合物还包含第二药剂。在一些实施方案中，第二药剂是治疗剂。在一些实施方案中，第二药剂是治疗性抗体。在一些实施方案中，第二药剂是治疗化合物。在一些实施方案中，第二药剂是治疗性小分子化合物。

在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文提供的结合物分子诸如共结合物和药学上可接受的载体。可用于药物组合物中的药学上可接受的载体包括本领域已知的任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳液，例如油和水乳液，以及各种类型的湿润剂。这些药物组合物可以制备成液体单位剂量形式或足以将本公开的共结合物递送至需要治疗的受试者的靶区域的任何其他给药形式。例如，药物组合物可以以适于所选施用方式的任何方式制备，所述施用方式例如血管内、肌肉内、皮下或腹膜内施用。本领域技术人员可以容易地选择其他任选组分，例如药用级稳定剂、缓冲剂、防腐剂、赋形剂等。适当考虑pH、等渗性、稳定性等的药物组合物的制备是在本领域技术水平范围内。

通过将具有所需纯度的共结合物与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制备呈水溶液或冻干或其他干燥形式的包含共结合物的药物组合物用于储存(参见例如Remington,Remington’sPharmaceutical Sciences(第18版1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇。

本公开的结合物分子诸如共结合物可以配制成任何合适的形式，用于递送至靶细胞/组织，例如作为微胶囊或粗乳液(Remington,同上；Park等人,2005,Molecules 10:146-61；Malik等人,2007,Curr.Drug.Deliv.4:141-51)、作为持续释放制剂(Putney和Burke,1998,Nature Biotechnol.16:153-57)或呈脂质体形式(Maclean等人,1997,Int.J.Oncol.11:325-32；Kontermann,2006,Curr.Opin.Mol.Ther.8:39-45)。

本文提供的结合物分子诸如共结合物也可以被包埋在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊；在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术公开于例如Remington,同上。

各种组合物和递送系统是已知的，并且可以与本文所述的结合物分子诸如共结合物一起使用，包括但不限于包封在脂质体、微粒、微囊、能够表达抗体的重组细胞中；受体介导的胞吞作用(参见例如Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-32)；构建作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸等。在另一个实施方案中，组合物可以作为控制释放或持续释放系统提供。在一个实施方案中，可使用泵来实现控制释放或持续释放(参见例如Langer,同上；Sefton,1987,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40；Buchwald等人,1980,Surgery 88:507-16；和Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:569-74)。在另一个实施方案中，聚合材料可用于实现预防剂或治疗剂(例如，如本文所述的共结合物)或本公开的组合物的控制释放或持续释放(参见例如Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise编,1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen和Ball编,1984)；Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126；Levy等人,1985,Science 228:190-92；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351-56；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105-12；美国专利号5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463；和5,128,326；PCT公布号WO 99/15154和WO 99/20253)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙二醇(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，用于持续释放制剂中的聚合物是惰性的，不含可浸出杂质，储存稳定，无菌，并且可生物降解。

在另一个实施方案中，可将控制释放或持续释放系统置于特定靶组织附近，例如鼻腔或肺，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,Medical Applications ofControlled Release第2卷,115-38(1984))。例如，Langer,1990,Science 249:1527-33讨论了控制释放系统。本领域技术人员已知的任何技术可用于产生包含一种或多种如本文所述的共结合物的持续释放制剂(参见例如美国专利号4,526,938；PCT公布号WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等人,1996,Radiotherapy&Oncology 39:179-89；Song等人,1995,PDAJ.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97；Cleek等人,1997,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54；和Lam等人,1997,Proc.Int’l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-60)。

在一些实施方案中，本公开提供了一种检测剂，其包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。

在一些实施方案中，本公开提供了一种诊断剂，其包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含治疗剂的诊断剂，所述治疗剂包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。

本文提供的结合物分子诸如共结合物可以形成分子的功能结构域。例如，在一些实施方案中，本文还提供了具有本公开的结合物分子诸如共结合物诸如抗原识别结构域的抗体。在一些实施方案中，本文提供了具有本公开的结合物分子诸如共结合物，例如其抗原识别结构域之一的多特异性抗体。在一些实施方案中，本文还提供了具有本公开的共结合物，例如其抗原识别结构域之一的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文提供了具有本公开的结合物分子诸如共结合物，例如其抗原识别结构域的嵌合抗原受体。

在一些实施方案中，本公开提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。在一些实施方案中，CAR在细胞中表达。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞、T细胞前体、自然杀伤(NK)细胞或抗原呈递细胞(APC)。

在一些实施方案中，结合物分子诸如共结合物是肽或蛋白质。本文还提供了编码肽或蛋白质结合物分子诸如共结合物的核酸分子以及包含编码肽或蛋白质的核酸的载体。因此，“核酸”包括编码本文公开的结合物分子的核酸，以及编码它们的功能子序列、序列变体和修饰形式的核酸，只要前述核酸至少保留可检测或可测量的活性或功能。核酸，在本文中也可称为基因、多核苷酸、核苷酸序列、引物、寡核苷酸或探针，是指任何长度的天然或修饰的含嘌呤和嘧啶的聚合物，即多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸或混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸及其α-异头物形式。两种或更多种含嘌呤和嘧啶的聚合物通常通过磷酸酯键或其类似物连接。所述术语可以互换使用，是指所有形式的核酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸可以是单链、双链或三链、线性或环状的。核酸包括基因组DNA和cDNA。RNA核酸可以是剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA或反义核酸。核酸包括天然存在的核苷酸、合成的核苷酸以及核苷酸类似物和衍生物。

由于遗传密码的简并性，核酸分子包括相对于编码本公开的结合物分子的核酸分子而言为简并的序列。当用于提及核酸序列时，术语“互补”意指所提及的区域是100％互补的，即表现出100％碱基配对，没有错配。核酸可以使用多种已知标准克隆和化学合成方法中的任一种来产生，并且可以通过定点诱变或本领域技术人员已知的其他重组技术来有意地改变。多核苷酸的纯度可以通过测序、凝胶电泳、UV光谱法来确定。

可以将核酸插入到核酸构建体中，其中核酸的表达受到在本文中称为“表达盒”的“表达控制元件”的影响或调控。术语“表达控制元件”是指一种或多种调控或影响与其可操作地连接的核酸序列的表达的核酸序列元件。表达控制元件可以适当地包括启动子、增强子、转录终止子、基因沉默子、蛋白质编码基因前的起始密码子(例如ATG)等。

与核酸序列可操作地连接的表达控制元件控制核酸序列的转录，并在适当时控制其翻译。术语“可操作地连接”是指一种并列关系，其中所提及的组件处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。通常，表达控制元件并列在基因的5’端或3’端，但也可以是内含子。

表达控制元件包括组成型活化转录的元件，它们是可诱导的(即，需要外部信号或刺激来活化)，或不可抑制的(即，需要信号来关闭转录；当信号不再存在时，转录被活化或“去抑制”)。在本公开的表达盒中也包括足以使基因表达对特定细胞类型或组织为可控的控制元件(即，组织特异性控制元件)。通常，此类元件位于编码序列的上游或下游(即5’和3’)。启动子通常位于编码序列的5’。由重组DNA或合成技术产生的启动子可用于提供本公开的多核苷酸的转录。“启动子”通常是指足以指导转录的最小序列元件。

可以将核酸插入到质粒中，用于转化到宿主细胞中，并用于随后表达和/或遗传操纵。质粒是可以在宿主细胞中稳定增殖的核酸；质粒可以任选地含有表达控制元件，以便驱动核酸表达。如本文所用，载体与质粒同义。质粒和载体通常至少含有用于在细胞中增殖的复制起点和启动子。质粒和载体也可包含用于在宿主细胞中表达的表达控制元件，并且因此可用于例如表达和/或遗传操纵编码肽序列的核酸，从而在宿主细胞和生物体(例如需要治疗的受试者)中表达肽序列，或产生肽序列。

如本文所用，术语“转基因”是指通过人工手段引入到细胞或生物体中的多核苷酸。例如，具有转基因的细胞，所述转基因已通过细胞的遗传操纵或“转化”来引入。引入转基因的细胞或其后代被称为“转化细胞”或“转化体”。通常，转基因包含在转化体的后代中，或者成为从细胞发育而来的生物体的一部分。转基因可以被插入到染色体DNA中，或者作为自我复制的质粒、YAC、微型染色体等维持。

细菌系统启动子包括T7和诱导型启动子，诸如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)和四环素响应性启动子。昆虫细胞系统启动子包括组成型或诱导型启动子(例如蜕皮激素)。哺乳动物细胞组成型启动子包括SV40、RSV、牛乳头瘤病毒(BPV)和其他病毒启动子，或衍生自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白IIA启动子；热休克启动子)或衍生自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列)的诱导型启动子。替代地，可以对逆转录病毒基因组进行遗传修饰，以在适当的宿主细胞中引入肽序列并指导肽序列的表达。

本文还提供了被设计用于体内应用的载体，包括体内递送及其表达系统。具体非限制性实例包括腺病毒载体(美国专利号5,700,470和5,731,172)、腺相关载体(美国专利号5,604,090)、单纯疱疹病毒载体(美国专利号5,501,979)、逆转录病毒载体(美国专利号5,624,820、5,693,508和5,674,703)、BPV载体(美国专利号5,719,054)、CMV载体(美国专利号5,561,063)以及细小病毒、轮状病毒、诺沃克病毒和慢病毒载体(参见例如美国专利号6,013,516)。载体包括将基因递送至肠道细胞的载体，包括干细胞的那些载体(Croyle等人,Gene Ther.5:645(1998)；S.J.Henning,Adv.Drug Deliv.Rev.17:341(1997)；美国专利号5,821,235和6,110,456)。许多这些载体已被批准用于人类研究。

酵母载体包括组成型启动子和诱导型启动子(参见例如Ausubel等人,In:CurrentProtocols in Molecular Biology,第2卷,第13章,编辑Greene Publish.Assoc.&WileyInterscience,1988；Grant等人Methods in Enzymology,153:516(1987),编辑Wu&Grossman；BitterMethods in Enzymology,152:673(1987),编辑Berger&Kimmel,Acad.Press,N.Y.；以及Strathern等人,The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces(1982)eds.Cold Spring Harbor Press,第I和II卷)。可以使用组成型酵母启动子诸如ADH或LEU2或诱导型启动子诸如GAL(R.Rothstein In:DNA Cloning,APractical Approach,第11卷,第3章,编辑D.M.Glover,IRL Press,Wash.,D.C.,1986)。促进外源核酸序列整合到酵母染色体中的载体是本领域已知的，例如经由同源重组。酵母人工染色体(YAC)通常在插入的多核苷酸对于更常规的载体而言太大(例如，大于约12Kb)时使用。

表达载体还可以含有赋予对选择压力的抗性的选择标记或可识别标记(例如，β-半乳糖苷酶)，从而允许选择具有载体的细胞、使其生长和扩增。替代地，选择标记可以是在第二载体上，所述第二载体与含有编码肽序列的核酸的第一载体共转染到宿主细胞中。选择系统包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等人,Cell 11:223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Szybalska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:2026(1962))和可分别用于tk-、hgprt_或aprt_细胞的腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,Cell22:817(1980))基因。此外，抗代谢物抗性可用作以下的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(O’Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981))；gpt基因，其赋予对麦考酚酸的抗性(Mulligan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981))；新霉素基因，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等人,J.Mol.Biol.150:1(1981))；嘌呤霉素；和潮霉素基因，其赋予潮霉素抗性(Santerre等人,Gene 30:147(1984))。额外选择基因包括trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨酸代替组氨酸(Hartman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8047(1988))；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO的抗性(McConlogue(1987)In:Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory)。

因此，本文还提供了转化细胞或宿主细胞(体外、离体和体内)，其产生本文公开的结合物分子，诸如共结合物，其中结合物分子的表达由编码共结合物的核酸赋予。表达结合物分子诸如共结合物的转化细胞和宿主细胞通常包含编码结合物分子的核酸。在一些实施方案中，转化细胞或宿主细胞是原核细胞。在另一个实施方案中，转化细胞或宿主细胞是真核细胞。在各个方面，真核细胞是酵母或哺乳动物(例如人、灵长类动物等)细胞。

如本文所用,“转化”细胞或“宿主”细胞是引入核酸的细胞，所述核酸可被增殖和/或转录以表达编码的肽序列。所述术语还包括宿主细胞的任何后代或亚克隆。转化细胞和宿主细胞包括但不限于微生物，诸如细菌和酵母；以及植物、昆虫和哺乳动物细胞。例如，用重组噬菌体核酸、质粒核酸或粘粒核酸表达载体转化的细菌；用重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；和用重组病毒表达载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞系统或为瞬时或稳定增殖或表达而进行工程化的转化的动物细胞系统。

在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞，其表达本文提供的结合物分子，诸如共结合物。在一些实施方案中，表达结合物分子的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达结合物分子的细胞是T细胞、T细胞前体、自然杀伤(NK)细胞或抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，本公开提供了一种宿主细胞，其表达本文提供的结合物分子，诸如共结合物。在一些实施方案中，表达结合物分子的宿主细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达结合物分子的宿主细胞是T细胞、T细胞前体、自然杀伤(NK)细胞或抗原呈递细胞(APC)。

在一些实施方案中，本公开提供了一种复合物，所述复合物包含本文提供的结合物分子诸如共结合物和靶。

本文还提供了药盒，其包含包装在合适的包装材料中的本文提供的结合物分子诸如共结合物或其组合物(例如，药物组合物)。药盒任选地包括标签或包装插页，其包括组分的描述或其中组分的体外、体内或离体使用说明。

术语“包装材料”是指容纳药盒组分的物理结构。包装材料可以保持组分无菌，并且可以由通常用于此类目的的材料(例如纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。

本文提供的药盒可包括标签或插页。标签或插页包括“印刷品”，例如单独或粘附至组分的纸或纸板、药盒或包装材料(例如，盒子)，或附接至例如含有药盒组分的安瓿、管或小瓶。标签或插页可另外包括计算机可读介质，诸如磁盘(例如，硬盘、卡、存储盘)；光盘例如CD-ROM或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带；或电存储介质，诸如RAM和ROM或这些介质的杂合物，例如磁/光存储介质；闪存介质；或存储型卡。标签或插页可包括识别制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。

本文提供的药盒可另外包括其他组分。药盒的每种组分都可以封装在单独容器内，并且所有不同的容器都可以封装在单个包装中。药盒也可以被设计用于冷藏。药盒可进一步被设计成含有本文提供的结合物分子诸如共结合物或含有编码本文提供的结合物分子诸如共结合物的核酸的细胞。药盒中的细胞可以保存在适当的储存条件下，直到准备使用。

V.制备方法、文库和筛选技术

本文所述的结合物分子诸如共结合物可以通过本领域中已知用于肽、核酸或其他分子合成的任何方法产生，特别是通过化学合成或重组表达技术产生。除非另有说明，否则本公开的实践采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和本领域技术范围内的相关领域中的常规技术。这些技术在本文引用的参考文献中有描述，并在文献中有充分解释。参见例如Maniatis等人(1982)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook等人(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold SpringHarbor Laboratory Press；Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987和年度更新)；Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(1987和年度更新)Gait(编)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press；Eckstein(编)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press；Birren等人(编)(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Borrebaeck(编)(1995)Antibody Engineering,第二版,Oxford UniversityPress；Lo(编)(2006)Antibody Engineering:Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology)；第248卷,Humana Press,Inc；每个文献都以引用的方式整体并入本文。

可以使用本领域已知的方法产生和分离肽和肽模拟物。可以使用化学方法全部或部分合成肽(参见例如Caruthers(1980).Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215；Horn(1980)；以及Banga,A.K.,Therapeutic Peptides and Proteins,Formulation,Processing andDelivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.,Lancaster,PA)。肽合成可以使用各种固相技术进行(参见例如Roberge Science 269:202(1995)；Merrifield,MethodsEnzymol.289:3(1997))并且可以例如使用ABI 431A肽合成器(Perkin Elmer)根据制造商说明实现自动化合成。肽和肽模拟物也可以使用组合方法合成。合成残基和掺入模拟物的多肽可以使用本领域已知的各种程序和方法合成(参见例如Organic SynthesesCollective Volumes,Gilman等人(编)John Wiley&Sons,Inc.,NY)。修饰的肽可以通过化学修饰方法产生(参见例如Belousov,Nucleic Acids Res.25:3440(1997)；Frenkel,FreeRadic.Biol.Med.19:373(1995)；和Blommers,Biochemistry 33:7886(1994))。肽序列变异、衍生、取代和修饰也可以使用诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和基于PCR的诱变等方法来进行。定点诱变(Carter等人,Nucl.Acids Res.,13:4331(1986)；Zoller等人,Nucl.Acids Res.10:6487(1987))、盒式诱变(Wells等人,Gene 34:315(1985))、限制性选择诱变(Wells等人,Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317:415(1986))和其他技术可以在克隆的DNA上进行，以产生肽序列、变体、融合物和嵌合体以及其变异、衍生物、取代和修饰。

本文所述的包含抗体的抗原结合片段的结合物分子诸如共结合物可以使用本领域已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤和重组技术或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述杂交瘤技术包括本领域已知且在例如Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等人,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563 681(Elsevier,N.Y.,1981)中教导的技术，所述文献各自以引入方式整体并入本文。产生共结合物的其他方法也是本领域已知的。

在一些实施方案中，共结合物和本文提供的用于共结合物的抗体可以通过培养用含有编码共结合物或编码抗体的核酸的载体转化或转染的细胞来产生。编码本公开的共结合物或抗体的多肽组分的多核苷酸序列可以使用标准重组技术获得。所需多核苷酸序列可以从共结合物或抗体产生细胞诸如杂交瘤细胞中分离并测序。替代地，可以使用核苷酸合成器或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，将编码多肽的序列插入到能够在宿主细胞中复制并表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域中可用和已知的许多载体可用于本公开的目的。适当的载体的选择将主要取决于要插入载体的核酸的大小以及要用载体转化的特定宿主细胞。适用于表达本公开的抗体的宿主细胞包括原核生物诸如古细菌和真细菌，包括革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，真核微生物诸如丝状真菌或酵母，无脊椎动物细胞诸如昆虫或植物细胞，以及脊椎动物细胞诸如哺乳动物宿主细胞系。将宿主细胞用上述表达载体转化并在适当改良的用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中进行培养。使用如本领域已知的标准蛋白质纯化方法纯化宿主细胞产生的共结合物。

用于共结合物产生的方法，包括载体构建、表达和纯化，进一步描述于Plückthun等人,Antibody Engineering:Producing antibodies in Escherichia coli:From PCRto fermentation 203-52(McCafferty等人编,1996)；Kwong和Rader,E.coli Expressionand Purification of Fab Antibody Fragments,in Current Protocols in ProteinScience(2009)；Tachibana和Takekoshi,Production of Antibody Fab Fragments inEscherischia coli,in Antibody Expression and Production(Al-Rubeai编,2011)；以及Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编,2009)。

当然，可以考虑使用本领域熟知的替代性方法来制备共结合物。例如，合适的氨基酸序列或其部分可以通过使用固相技术的直接肽合成来产生(参见例如Stewart等人,Solid-Phase Peptide Synthesis(1969)；和Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149-54)。体外蛋白质合成可以使用手动技术或自动化来进行。共结合物的不同部分可以单独化学合成，并使用化学方法或酶方法组合以产生所需共结合物。

在某些方面，本文提供了一种组合文库(例如，共结合物文库)，其可用于开发本文所述的特异性识别靶的结合物分子，诸如共结合物。

在一些实施方案中，提供了一种文库，其包含多个共结合物或编码多个共结合物的多个多核苷酸，每个共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分，其中所述第一结合部分经由肽接头通过抗体可变结构域的N末端与第二结合部分连接，其中所述库中至少两种共结合物在肽接头序列上彼此不同。在一些实施方案中，第一靶位点和第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。在一些实施方案中，抗体可变结构域具有N末端截短(“N末端截短的抗体可变结构域”)。在一些实施方案中，文库中至少两种共结合物在第二抗体部分的抗体可变结构域的N末端截短方面彼此不同。

在一些实施方案中，文库的多样性为至少约5000，例如文库含有至少约5000个独特的共结合物序列。

在一些实施方案中，多种共结合物中的基本上所有共结合物都包含相同的第一结合部分和第二结合部分。在此种实施方案中，文库包含含有独特接头序列的共结合物。

在一些实施方案中，多种共结合物中的至少两种，例如至少约10、25、50、100、250、500和1,000中的任一者，包含不同的第一结合部分和/或第二结合部分。

在一些实施方案中，提供了筛选以所需亲和力特异性结合第二靶位点的共结合物的方法，所述方法包括：(1)将本文所述的文库与包含第二靶位点的靶分子接触，以在特异性结合靶分子的共结合物与靶分子之间形成复合物，和(2)鉴定以所需亲和力结合第二靶位点的共结合物。

在一些实施方案中，提供了筛选以所需亲和力特异性结合靶分子的共结合物的方法，所述方法包括：(1)将本文所述的文库与靶分子接触，以在特异性结合靶分子的共结合物与靶分子之间形成复合物，和(2)鉴定以所需亲和力结合靶分子的共结合物。

在一些实施方案中，组合文库包含以下任一种或多种的集合：(a)第二结合部分；(b)第一结合部分；(c)接头；和/或(d)本文所述的另一个特征，例如标签。

在一些实施方案中，文库包含来自多种抗体的本文所述的第二结合部分的至少2、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1×10³、至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、至少1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰或至少1×10¹¹个可变区，其中每个可变区包含1至18个氨基酸的截短。在一些实施方案中，文库包含来自多种抗体的本文所述的第二结合部分的约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1×10³、约1×10⁴、约1×10⁵、约1×10⁶、约1×10⁷、约1×10⁸、约1×10⁹、约1×10¹⁰或约1×10¹¹个可变区，其中每个可变区包含1至18个氨基酸的N末端截短。在一些实施方案中，截短是在可变区的FR1区中。

在一些实施方案中，文库包含来自多种抗体的本文所述的第一结合部分的至少2、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1×10³、至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、至少1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰或至少1×10¹¹个可变区。在一些实施方案中，文库包含来自多种抗体的本文所述的第一结合部分的约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1×10³、约1×10⁴、约1×10⁵、约1×10⁶、约1×10⁷、约1×10⁸、约1×10⁹、约1×10¹⁰或约1×10¹¹个可变区。

在一些实施方案中，文库包含至少2、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1×10³、至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、至少1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰或至少1×10¹¹个接头。在一些实施方案中，文库包含约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1×10³、约1×10⁴、约1×10⁵、约1×10⁶、约1×10⁷、约1×10⁸、约1×10⁹、约1×10¹⁰或约1×10¹¹个本文所述的接头。

在一些实施方案中，文库包含本文所述的结合物分子的部分形式，例如共价附接至接头的第二结合部分。文库中的多个成员各自可以包含不同的第二结合部分(例如，具有不同CDR序列或不同N末端截短的第二结合部分)和/或不同的接头序列。在此类实施方案中，此类文库特征可用于有效鉴定结合物分子，诸如共结合物。在一些实施方案中，文库每个成员中接头的N末端氨基酸进一步与第一结合部分的C末端氨基酸相连。

在一些实施方案中，与接头共价附接的单个第二结合部分可以与不同的第一结合部分融合，形成文库，用于鉴定合适的共结合物的目的。

在一些实施方案中，文库包含第一结合部分的第一可变区，其中接头的N末端氨基酸与第一可变区的C末端氨基酸连接。在一些实施方案中，文库包含第一结合部分的多个第一可变区，其中接头的N末端氨基酸与第一可变区的C末端氨基酸连接。在一些实施方案中，文库包含多个第一结合部分的多个第一可变区，其中接头的N末端氨基酸与第一可变区的C末端氨基酸连接。

因此，本领域普通技术人员基于以上描述将会理解，本公开提供了结合物分子诸如共结合物的文库，其包含：(i)选自由以下各项组成的组的文库的任何第一子部分：包含1至18个氨基酸的N末端截短的第二抗体部分的第二重链可变区；第二抗体部分的多个第二重链可变区，其中每个第二重链可变区包含1至18个氨基酸的N末端截短；多个第二抗体部分的多个第二重链可变区，其中每个第二重链可变区包含1至18个氨基酸的N末端截短；第二抗体部分的第二轻链可变区，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；第二抗体部分的多个第二轻链可变区，其中每个第二轻链可变区包含1至18个氨基酸的N末端截短；以及多个第二抗体部分的多个第二轻链可变区，其中每个第二轻链可变区包含1至18个氨基酸的N末端截短；(ii)选自由以下各项组成的组的文库的任何接头子部分：多肽接头；和多个多肽接头；和(iii)选自由以下各项组成的组的文库的任何第二子部分：第一抗体部分的第一重链可变区；第一抗体部分的多个第一重链可变区；多个第一抗体部分的多个第一重链可变区；第一抗体部分的第一轻链可变区；第一抗体部分的多个第一轻链可变区；和多个第一抗体部分的多个第一轻链可变区，其中接头的N末端氨基酸与第一轻链可变区的C末端氨基酸连接，并且其中接头的C末端氨基酸与截短的第一轻链可变区的N末端氨基酸连接。因此，本领域普通技术人员将理解，本文提供的共结合物文库包括本公开和具体地本段落中对于(i)、(ii)和(iii)提供的文库的子部分的任何和所有组合或排列。

在一些实施方案中，文库包含(i)结合同一靶上的不重叠表位的第一可变区和第二可变区，(ii)不结合同一靶的第一可变区和第二可变区，(iii)结合同一靶上的不重叠表位的第一可变区和第二可变区，或(iv)不结合同一靶的第一可变区和第二可变区。

在一些实施方案中，可以独立构建与靶抗原的表位结合的第一结合部分(互补位P1)的文库和第二结合部分(互补位P2)的文库。第一结合部分(互补位P1)的文库或第二结合部分(互补位P2)的文库可以在基因表达载体中构建，所述载体允许克隆基因转录和翻译成重组蛋白。

第一结合部分(互补位P1)的文库可以是编码骆驼VHH、scFv、Fab、亲和体、affilin、affimer、affitin、α体、anticalin、适体、亲合体、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单体或nanoCLAMP等的序列。类似地，第二结合部分(P2)的文库可以是编码骆驼VHH、scFv、Fab、亲和体、affilin、affimer、affitin、α体、anticalin、适体、亲合体、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单体或nanoCLAMP等的序列。本文考虑了第一结合部分(互补位P1)和第二结合部分(互补位P2)的不同文库的任何组合。

在一些实施方案中，表达载体中第一结合部分(互补位P1)的文库和第二结合部分(互补位P2)的文库都可以是编码骆驼VHH的序列。在一些实施方案中，表达载体中第一结合部分(互补位P1)的文库和第二结合部分(互补位P2)的文库都可以是编码scFv的序列。在另一个优选的实施方案中，表达载体中第一结合部分(互补位P1)的文库和第二结合部分(互补位P2)的文库可以是一个编码骆驼VHH且另一个编码scFv的序列。

例如，为了构建第一结合部分(互补位P1)的文库或第二结合部分(互补位P2)的文库，可以从针对靶分子免疫的羊驼中分离出编码重链抗体可变区(VHH)的mRNA，将其转录成cDNA，并克隆到噬菌粒载体中用于噬菌体展示文库构建。类似地，为了构建第一结合部分的文库(P1互补位)或第二结合部分的文库(P2互补位)，可以从针对靶抗原免疫的动物中分离出编码重链抗体可变结构域和轻链抗体可变结构域的mRNA，将其转录成cDNA，并克隆到噬菌粒载体中作为scFv用于噬菌体展示文库构建。虽然表达载体可以是噬菌体展示文库构建的一部分，但它也可以是酵母展示、细菌展示、哺乳动物细胞展示、核糖体展示或mRNA展示文库构建的一部分。

第一结合部分的文库(P1互补位)或第二结合部分的文库(P2互补位)可以是原始文库，并且它们也可以是初级响应或次级响应的免疫文库。第一结合部分的文库(P1互补位)或第二结合部分的文库(P2互补位)可以是合成文库。第一结合部分的文库(P1互补位)或第二结合部分的文库(P2互补位)可以是用于结合感兴趣的靶抗原的亲和力富集的原始文库、免疫文库或合成文库。例如，可以将第一结合部分的文库(P1互补位)或第二结合部分的文库(P2互补位)克隆到噬菌体展示文库构建体的噬菌粒中。然后使这些噬菌体展示文库与固定的靶抗原结合。与靶抗原相互作用的噬菌体展示蛋白将保持附接，而所有其他蛋白质被洗掉。然后可以洗脱附接的噬菌体，并用于通过感染合适的细菌宿主来产生更多的噬菌体。新的噬菌体构成富集的混合物，其含有的非结合噬菌体比初始混合物中存在的少得多。通过这一过程，第一结合部分(互补位P1)的文库或第二结合部分(互补位P2)的文库可以富集编码结合靶抗原的那些互补位的序列。第一结合部分的亲和富集文库(互补位P1)或第二结合部分的亲和富集文库(互补位P2)可能更适用于筛选。

在某些方面，本文提供了一种筛选与靶结合的结合物分子诸如共结合物的方法，其包括(i)获得本文提供的文库；和(ii)将来自步骤(i)的候选物文库与靶接触，以鉴定特异性结合靶的结合物分子，诸如共结合物。

在某些方面，本文提供了一种筛选与靶结合的结合物分子诸如共结合物的方法，其包括(i)表达编码本文提供的文库的表达载体文库；(ii)获得本文提供的文库；和(iii)将来自步骤(ii)的候选物文库与靶接触，以鉴定特异性结合靶的结合物分子，诸如共结合物。

在另一个方面，本文提供了一种筛选与靶结合的结合物分子诸如共结合物的方法，其包括(i)表达编码本文提供的共结合物文库的表达载体文库；(ii)获得本文提供的文库；(iii)将来自步骤(ii)的候选物文库与靶接触，以在特异性结合靶的结合物分子诸如共结合物之间形成复合物；(iv)富集特异性结合靶的结合物分子诸如共结合物之间的复合物；和(v)鉴定特异性结合靶的结合物分子，诸如共结合物。

在一些实施方案中，本文提供的筛选方法鉴定特异性结合靶的结合物分子诸如共结合物，其中结合物分子对靶的亲和力大于单独或不具有截短的单个可变区的亲和力不小于50倍、不小于60倍、不小于70倍、不小于80倍、不小于90倍、不小于100倍、不小于110倍、不小于120倍、不小于130倍、不小于140倍、不小于150倍、不小于160倍、不小于170倍、不小于180倍、不小于190倍、不小于200倍、不小于250倍、不小于300倍、不小于350倍、不小于400倍、不小于450倍、不小于500倍、不小于600倍、不小于700倍、不小于800倍、不小于900倍、不小于1000倍、不小于1100倍、不小于1200倍、不小于1300倍、不小于1400倍、不小于1500倍、不小于1600倍、不小于1700倍、不小于1800倍、不小于1900倍、不小于2000倍、不小于3000倍、不小于4000倍、或不小于5000倍、或不小于10000倍。

在本文提供的筛选方法的一些实施方案中，通过所述方法鉴定的结合物分子诸如共结合物结合靶的K_D小于1×10^-8M、小于1×10^-9M、小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12M、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M、小于1×10^-16M、小于1×10^-17M或小于1×10^-18M。

在一些实施方案中，本文提供了筛选共结合物的方法，其中可以构建表达载体，其含有第一结合部分(互补位P1)的文库的子部分的第一编码区、第二结合部分(互补位P2)的文库的子部分的第二编码区以及连接第一结合部分(互补位P1)和第二结合部分(互补位P2)的接头L文库的子部分的第三编码区。在噬菌体展示系统中，表达载体以与噬菌体外壳蛋白(例如pIII)的融合物的形式表达，使得它们被展示在病毒粒子表面上。所展示的融合蛋白对应于噬菌体内的遗传序列。通过这种方法，可以鉴定出那些展示的蛋白质，它们含有通过接头连接的第一结合部分(互补位P1)和第二结合部分(互补位P2)，对靶抗原具有高亲和力结合，并且它们是共结合物的候选物。类似地，可以使用酵母展示、细菌展示、哺乳动物细胞展示、核糖体展示或mRNA展示文库构建体来筛选候选共结合物。

本公开表明，特异性结合靶的共结合物的鉴定可以通过本领域普通技术人员可用的多种方法来实现。例如，编码特异性结合靶的共结合物的多核苷酸可以从如上所述的分选的宿主细胞或淘选的噬菌体中测序。可通过使用本领域熟知的遗传密码表翻译编码共结合物的多核苷酸序列来鉴定共结合物的相应多肽序列。或者，可通过对共结合物和/或共结合物与靶之间的蛋白质复合物进行氨基酸测序和/或质谱分析来鉴定共结合物。

在一些实施方案中，表达载体中的第一结合部分(互补位P1)含有编码多于一个不同的结合部分的序列。在一些实施方案中，表达载体中的第一结合部分(互补位P1)含有编码多于2、多于5、多于10、多于20、多于50、多于100、多于200、多于500、多于1000、多于1×10⁴、多于1×10⁵或多于1×10⁶个不同结合部分的序列。在一些实施方案中，表达载体中的第二结合部分(互补位P2)含有编码多于一个不同互补位的序列。在一些实施方案中，表达载体中的第二结合部分(互补位P2)含有编码至少2、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1×10³、至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、至少1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰或至少1×10¹¹个不同结合部分的序列。

表达载体中的接头L含有编码多于一个接头的序列。在一些实施方案中，表达载体中的接头L含有编码至少2、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1×10³、至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、至少1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰或至少1×10¹¹个不同接头的序列。在一些实施方案中，表达载体中的接头L含有编码至少2、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1×10³、至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、至少1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰或至少1×10¹¹个不同重组蛋白的序列。

在一些实施方案中，提供了共结合物的文库，每种共结合物含有结合同一靶分子的第一结合部分和第二结合部分，其中文库含有至少2、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1×10³、至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、至少1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰或至少1×10¹¹个不同接头，所述接头连接成对的第一结合部分和第二结合部分。

本公开表明，特异性结合靶的结合物分子诸如共结合物与靶之间的复合物的富集可以通过本领域普通技术人员可获得的多种方法来实现。例如，表达共结合物文库的宿主细胞可以通过合适的分选手段(例如荧光活化细胞分选、“FACS”或基于磁珠的分选)来分选，以阳性选择表达具有高亲和力的共结合物的细胞，从而获得富集多能细胞的细胞群体。在一个具体实施方案中，表达共结合物文库的宿主细胞可以基于使用标记靶的染色量进行分选，其中高亲和力共结合物的富集可以通过调节标记靶的浓度进行微调。在高亲和力共结合物富集的这种微调中，当使用低浓度的标记靶时，仅K_D高于可确定水平的共结合物才能被稳定染色和分选。浓度越低，结合严格性越高。高亲和力结合物在高严格性下可以保持良好靶接合，但较弱的结合物则不能。在某些实施方案中，用浓度小于1×10^-8M、小于1×10^-9M、小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12M、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M或小于1×10^-15M的标记靶对表达共结合物文库的宿主细胞进行染色。在某些实施方案中，用浓度为约1×10^-8M、约1×10^-9M、约1×10^-10M、约1×10^-11M、约1×10^-12M、约1×10^-13M、约1×10^-14M或约1×10^-15M的标记靶对表达共结合物文库的宿主细胞进行染色。

替代地，表达共结合物文库的宿主细胞可基于使用标记靶的染色量进行分选，其中与表达低亲和力共结合物的宿主细胞结合的标记靶已通过在各种严格条件下洗涤而被洗掉，从而富集表达高亲和力共结合物的宿主细胞。在此类实施方案中，洗涤的严格性可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法进行微调和控制。例如，表达共结合物文库的宿主细胞可以用与标记靶竞争的未标记靶分子进行洗涤。洗涤的严格性可以通过调节未标记靶与标记靶之间的比率来控制，使得仅表达高亲和力共结合物的宿主细胞将保持被标记靶染色并被阳性分选，从而富集表达高亲和力共结合物的宿主细胞。洗涤的严格性可以通过调节所用洗涤缓冲液的强度来控制，例如通过用不同的洗涤剂溶液洗涤。在某些实施方案中，用浓度大于1×10^-3M、大于1×10^-4M、或大于1×10^-5M、1×10^-6M、大于1×10^-6M、或大于1×10^-7M、大于1×10^-8M、大于1×10^-9M、大于1×10^-10M、大于1×10^-11M、或大于1×10^-12M的未标记靶洗涤表达共结合物文库的宿主细胞。在某些实施方案中，用浓度为约1×10^-3M、约1×10^-4M、或约1×10^-5M、1×10^-6M、约1×10^-6M或约1×10^-7M、约1×10^-8M、约1×10^-9M、约1×10^{- 10}M、约1×10^-11M或约1×10^-12M的未标记靶洗涤表达共结合物文库的宿主细胞。

此外，洗涤时间可以变化。在将文库成员与靶蛋白孵育后，需要洗去未结合的文库成员或蛋白质。洗涤时间越长，严格性越高。在洗涤步骤中，较弱的结合物可与靶蛋白解离，但高亲和力的结合物不会。类似地，靶蛋白孵育的时间也可以变化。强结合物倾向于比弱结合物更快地结合靶。通过限制孵育时间，高亲和力结合物比低亲和力结合物得到更好富集。

可以进行一轮或多轮富集，以富集对靶具有高亲和力的共结合物。在一些实施方案中，在3-4轮严格性增加的选择后，所得共结合物文库将富含高亲和力的共结合物。在一些实施方案中，将共结合物文库富集1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45或50轮，以获得具有高亲和力的共结合物的共结合物文库。

在本文所述的一些实施方案中，表达高亲和力共结合物的宿主细胞也可以通过阴性分选掉(去除)未被标记靶染色的细胞来富集。

也可以使用上文所述用于富集特异性结合靶的共结合物与靶之间的复合物的策略并且其可以与本文所述和本领域普通技术人员已知的其他技术组合。例如，SPR中测量的结合、ELISA中测量的结合、噬菌体展示的淘选、酵母展示中测量的结合、哺乳动物细胞展示中测量的结合可以通过降低用于结合的标记靶的浓度或通过如上所述调节洗涤的严格性来微调，使得仅高亲和力的共结合物将稳定地与标记靶结合，从而富集特异性结合靶的共结合物与靶之间的复合物。

在一些实施方案中，本文提供的结合物分子诸如共结合物、变体和/或抗体变体是通过体外亲和力成熟制备的，与亲本构建体相比，其性质诸如亲和力、稳定性或表达水平得到改善。与天然原型一样，体外亲和力成熟是基于突变和选择的原理。本文提供的结合物分子诸如共结合物、变体和/或抗体变体的文库展示在生物体(例如噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)表面上，或者与其编码mRNA或DNA缔合(例如共价或非共价)。展示的结合物分子诸如共结合物、变体和/或抗体变体的亲和力选择允许分离携带编码抗体的遗传信息的生物体或复合物。使用展示方法诸如噬菌体展示进行的两轮或三轮突变和选择通常产生亲和力在低纳摩尔范围内的抗体片段。亲和力成熟的结合物分子诸如共结合物、变体和/或抗体变体可以对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。

噬菌体展示是一种广泛用于展示和选择本文提供的结合物分子诸如共结合物、变体和/或抗体变体的方法。结合物分子诸如共结合物、变体和/或抗体变体作为与噬菌体外壳蛋白的融合物展示在Fd或M13噬菌体表面上。选择涉及暴露于抗原，以允许噬菌体展示的结合物分子诸如共结合物、变体和/或抗体变体结合它们的靶，所述过程被称为“淘选”回收与抗原结合的噬菌体，并用于感染细菌以产生用于进一步轮次选择的噬菌体。关于综述，参见例如Hoogenboom,2002,Methods.Mol.Biol.178:1-37；以及Bradbury和Marks,2004,J.Immunol.Methods 290:29-49。

在酵母展示系统中(参见例如Boder等人,1997,Nat.Biotech.15:553-57；以及Chao等人,2006,Nat.Protocols 1:755-68)，本文提供的结合物分子诸如共结合物的抗体变体可以展示为单链可变融合物(scFv)，其中重链和轻链通过柔性接头连接。scFv与酵母凝集素蛋白Aga2p的粘附亚基融合，所述粘附亚基通过与Aga1p的二硫键附接至酵母细胞壁。通过Aga2p展示蛋白质会将蛋白质从细胞表面投射出去，从而使与酵母细胞壁上的其他分子的潜在相互作用最小化。磁分离和流式细胞术用于筛选文库，以选择具有改善的亲和力或稳定性的抗体。与感兴趣的可溶性抗原的结合通过用生物素化抗原和二级试剂诸如与荧光团缀合的链霉亲和素标记酵母来确定。抗体表面表达的变化可以通过免疫荧光标记侧接scFv的血凝素或c-Myc表位标签来测量。表达已显示与所展示的蛋白质的稳定性相关，因此可以选择稳定性以及亲和力改善的抗体(参见例如Shusta等人,1999,J.Mol.Biol.292:949-56)。酵母展示的另一个优点在于，展示的蛋白质在真核酵母细胞的内质网中折叠，利用了内质网伴侣和质量控制机制。一旦成熟完成，抗体亲和力可以方便地“滴定”，同时展示在酵母表面上，从而消除了表达和纯化每个克隆的需要。酵母表面展示的理论限制是功能性文库大小可能比其他展示方法小；然而，最近的方法使用酵母细胞的交配系统来产生大小估计为10¹⁴的组合多样性(参见例如美国专利公布2003/0186374；以及Blaise等人,2004,Gene 342:211-18)。

在核糖体展示中，抗体-核糖体-mRNA(ARM)复合物在无细胞系统中产生以供选择。编码结合物分子诸如共结合物、变体或抗体变体的特定文库的DNA文库与缺少终止密码子的间隔序列遗传性融合。该间隔序列在翻译后仍与肽基tRNA附接并占据核糖体通道，从而使感兴趣蛋白质伸出核糖体并折叠。所得的mRNA、核糖体和蛋白质的复合物可以结合表面结合的配体，从而允许通过与配体的亲和捕获同时分离抗体及其编码mRNA。然后将核糖体结合的mRNA逆转录回到cDNA中，然后可以使其经历诱变并用于下一轮选择(参见例如Fukuda等人,2006,Nucleic Acids Res.34:e127)。在mRNA展示中，使用嘌呤霉素作为衔接分子建立抗体与mRNA之间的共价键(Wilson等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750-55)。

由于这些方法完全在体外进行，所以它们提供了优于其他选择技术的两个主要优势。首先，文库的多样性不受细菌细胞的转化效率限制，仅受试管内存在的核糖体数量和不同mRNA分子的限制。第二，在每一轮选择后，可以容易地引入随机突变，例如通过非校对聚合酶引入，因为在任何多样化步骤后没有文库必须被转化。

在哺乳动物细胞展示系统中(参见例如Bowers等人,2011,Proc Natl Acad SciUSA.108:20455-60)，基于与预重组D(J)区连接的种系序列V基因片段来构建完整的人IgG文库。重链和轻链的全长V区与人重链和轻链恒定区组装，并转染到哺乳动物细胞系(例如，HEK293)中。扩增转染的文库，并针对链霉亲和素(SA)偶合的磁珠进行几轮阴性选择，然后针对用生物素化靶蛋白、肽片段或表位包被的SA偶联的磁珠进行一轮阳性选择。对阳性选择的细胞进行扩增，然后通过多轮FACS分选，以分离展示特异性结合靶蛋白、肽片段或表位的抗体的单细胞克隆。来自这些单细胞克隆的重链和轻链对用AID再次转染以用于进一步成熟。几轮哺乳动物细胞展示加上AID触发的体细胞超突变，产生了高特异性、高亲和力的抗体。

多样性也可以靶向方式或通过随机引入来引入到抗体库的CDR或整个V基因中。前一种方法包括通过高水平或低水平的诱变依次靶向抗体的所有CDR，或靶向体细胞高突变的分离热点(参见例如Ho等人,2005,J.Biol.Chem.280:607-17)或基于实验基础或结构原因疑似影响亲和力的残基。在一个具体实施方案中，通过AID触发的体细胞超突变，例如使用SHM-XEL^TM平台(AnaptysBio,San Diego,CA)，进行体细胞超突变。使用大肠杆菌突变株，可以在整个V基因中引入随机突变，用DNA聚合酶(参见例如Hawkins等人,1992,J.Mol.Biol.226:889-96)或RNA复制酶进行易错复制。也可以经由DNA改组或类似技术替换天然多样性的区域来引入多样性(参见例如Lu等人,2003,J.Biol.Chem.278:43496-507；美国专利号5,565,332和6,989,250)。替代技术靶向延伸至框架区残基的高变环(参见例如Bond等人,2005,J.Mol.Biol.348:699-709)，在CDR中使用环缺失和插入，或者使用基于杂交的多样化(参见例如美国专利公布号2004/0005709)。在CDR中产生多样性的额外方法在例如美国专利号7,985,840中公开。可用于产生抗体文库和/或抗体亲和力成熟的其他方法例如在美国专利号8,685,897和8,603,930以及美国公布号2014/0170705、2014/0094392、2012/0028301、2011/0183855和2009/0075378中公开，所述专利各自以引用的方式并入本文。

文库的筛选可以通过本领域已知的各种技术来完成。例如，可以将靶固定在固体支持物、柱、针或纤维素/聚(偏二氟乙烯)膜/其他过滤器上，在粘附至吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选，或与生物素缀合以用链霉亲和素包被的珠粒捕获，或用于任何其他用于淘选展示文库的方法中。

关于体外亲和力成熟方法的综述，参见例如Hoogenboom,2005,NatureBiotechnology 23:1105-16；Quiroz和Sinclair,2010,Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51；以及其中的参考文献。

VI.使用方法

A.检测方法

本文所述的具有高亲和力和/或高特异性的结合物分子诸如共结合物可用作检测剂，用于检测靶。在一些实施方案中，所述靶是疾病标记，并且本文所述的结合物分子诸如共结合物可以用作诊断剂，用于通过检测作为靶分子的疾病标记来诊断疾病。在一些方面，本文提供了一种用于检测样品中的标记诸如靶的方法，其包括(i)在足以形成结合物分子和标记的复合物的条件下将样品与本文提供的结合物分子诸如共结合物接触，和(ii)检测样品中复合物的存在。在一些方面，本文提供了一种诊断受试者的疾病的方法，其包括(i)在足以形成结合物分子和疾病标记的复合物的条件下，将来自个体的样品与本文提供的结合物分子诸如共结合物接触，其中结合物分子特异性结合标记，和(ii)检测样品中复合物的存在。

疾病的早期检测对于多种疾病是重要的，包括癌症、感染性疾病、心血管疾病、脑损伤和阿尔茨海默病。通常，疾病诊断得越早，治愈或成功控制的可能性就越大。癌症筛查测试包括乳腺癌的乳房X光检查、宫颈癌的巴氏涂片或高危HPV检测、结肠癌的结肠镜检查等。癌症和其他疾病的早期诊断可以增加生存机会，并确保患者尽早接受最有效的治疗。

检测血液或其他体液中的疾病标记用于早期诊断是一种有吸引力的方法，因为其具有无创性、易于实施测试和成本效益。以癌症为例，疾病标记可以是基于蛋白质的(例如经由ELISA的检测)或基于DNA的(例如经由PCR或NGS的检测)，如在“液体活检”中。疾病标记鉴定中的主要问题是在疾病进展的最早阶段疾病标记的浓度非常低。例如，已知HER2扩增的肿瘤细胞表达约2×10⁶个HER2蛋白分子/细胞，并且HER2基因扩增约25拷贝/细胞(Kallioniemi等人PNAS 1992年6月,89(12)5321-5325)。因此，血液中循环的HER2肿瘤标记的一个肿瘤细胞当量仅为约4×10²个蛋白质分子/ml血液和约5×10^-3个DNA拷贝/ml血液。这个计算表明，为了早期诊断的目的，检测DNA标记比检测蛋白质标记困难得多。

据估计，典型的强抗体-抗原相互作用的K_D为约1×10^-10M(Foote和Eisen,ProcNatl Acad Sci U S A.1995Feb 28；92(5):1254-1256)。这意味着当蛋白质疾病标记以小于1×10^-12M(即小于6×10⁸个分子/ml血液)存在时，非常高亲和力的抗体与疾病标记结合在热力学上是不利的。因此，该计算表明，抗体通常不具有足够的结合亲和力来用于早期检测非常低浓度的疾病标记，诸如单个肿瘤细胞等效物HER2标记。已知生物素-链霉亲和素结合是最强的非共价结合相互作用之一，并且据报告K_D为约1×10^-15M(Foote和Eisen,ProcNatl Acad Sci U S A.1995Feb 28；92(5):1254-1256)。本文所述的具有高结合亲和力的结合物分子诸如共结合物特别适用于疾病标记检测。

除了结合亲和力不足的问题，抗体还缺乏用于检测非常低水平的疾病标记的特异性/选择性。已知血浆蛋白的浓度范围覆盖至少10个对数级，从约6×10⁷个分子/ml的IL-6基础水平到约3×10¹⁷个分子/ml的人血清白蛋白(例如Geyer等人Mol Syst Biol.2017年9月；13(9):942doi:10.15252/msb.20156297)。为了以约4×10²个分子/ml的单个肿瘤细胞当量水平检测HER2蛋白，抗HER2抗体不仅需要具有高结合亲和力，而且还需要对非预期血浆蛋白具有至少1×10⁵倍的特异性/选择性。例如，抗HER2抗体对HER2的KD应优选比其对非预期、非特异性血浆蛋白的KD低1×10⁵倍，以使非特异性背景最小化。如此高水平的抗体特异性难以实现，因为已知抗体在抗原结合位点具有相对有限的序列和结构多样性(例如Peng等人Proc Natl Acad Sci U S A.2014年7月1日；111(26):E2656-E2665.doi:10.1073/pnas.1401131111)。

如上所述，据估计，典型的强抗体-抗原相互作用的K_D为约1×10^-10M(Foote和Eisen,Proc Natl Acad Sci U S A.1995Feb 28；92(5):1254-1256)。因此得出结论，即使高亲和力抗体通常也不具有足够的结合亲和力和/或足够的特异性来在尽可能早地检测血液中的疾病标记。已知大多数抗体不与独特的表位结合，并且它们与非预期蛋白质交叉反应，尽管结合亲和力较低。此外，与预期靶无关的非特异性蛋白可以具有与特异性表位相似但不相同的表位。然后，抗体对相似表位的结合亲和力低于对特异性表位的结合亲和力，这导致与称为非特异性背景的相应较低信号交叉反应。正是这种非特异性背景干扰了特异性抗体-抗原结合相互作用，特别是当预期靶以非常低的浓度存在而非预期的非特异性蛋白靶以相对高的浓度存在时，例如在血液中疾病标记的早期检测的情况下。因此，为了尽可能早地检测疾病标记，疾病标记的结合物需要具有非常高的结合亲和力。结合物还需要能够使与非预期靶的非特异性结合最小化，即使这些非预期靶以相对高的浓度存在。在一些实施方案中，本文所述的具有明显更好的结合亲和力和更好的特异性的结合物分子诸如共结合物，特别适用于疾病标记检测和早期疾病诊断。

在一方面，本文提供了一种检测样品中的标记的方法，其包括(i)在足以形成结合物分子和标记的复合物的条件下，将样品与本文提供的结合物分子诸如共结合物接触，和(ii)检测样品中的复合物。

在本文提供的方法的一些实施方案中，通过测量与复合物缀合的标记试剂来检测复合物。在本文提供的方法的一些实施方案中，通过测量与结合物分子诸如共结合物缀合的标记试剂来检测复合物。

在检测标记的方法的一些具体实施方案中，样品是体液、组织或细胞。在检测标记的方法的一些具体实施方案中，样品是血液、骨髓、血浆、血清、尿液或脑脊液。在一些实施方案中，在体外形成复合物。在一些实施方案中，在体内形成复合物。在一些实施方案中，在体外检测复合物。在一些实施方案中，在体内检测复合物。在一些实施方案中，在体外形成复合物，并且在体外检测复合物。在一些实施方案中，在体内形成复合物，并且在体内检测复合物。在一些实施方案中，在生理条件下形成复合物。在一些实施方案中，在37℃下形成复合物。在一些实施方案中，在生理性血管剪切应力，例如10-70达因/厘米²(动脉中的剪切应力范围)或1-6达因/厘米²(静脉中的剪切应力范围)下形成复合物。在一些实施方案中，在37℃和生理性血管剪切应力，例如10-70达因/厘米²(动脉中的剪切应力范围)或1-6达因/厘米²(静脉中的剪切应力范围)下形成复合物。在一些实施方案中，在生理条件下检测复合物。在一些实施方案中，在37℃下检测复合物。在一些实施方案中，在生理性血管剪切应力，例如10-70达因/厘米²(动脉中剪切应力的范围)或1-6达因/厘米²(静脉中剪切应力的范围)下检测复合物。在一些实施方案中，在37℃和生理性血管剪切应力，例如10-70达因/厘米²(动脉中的剪切应力范围)或1-6达因/厘米²(静脉中的剪切应力范围)下检测复合物。在一些实施方案中，在正常实验室条件(例如，在室温或25℃)下形成复合物。在一些实施方案中，在正常实验室条件(例如，在室温或25℃)下检测复合物。在一些实施方案中，在正常实验室条件(例如，室温或25℃)下形成复合物，并在正常实验室条件(例如，室温或25℃)下检测复合物。

在本文提供的方法的一些实施方案中，通过测量与复合物缀合的标记试剂来检测复合物。在一些实施方案中，标记试剂可以是比色试剂、荧光试剂、化学发光试剂、放射性同位素、金属离子、酶、聚合物或亲和标签。比色试剂可以是例如PNPP(对硝基苯磷酸酯)、ABTS(2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或OPD(邻苯二胺)。荧光试剂可以是例如QuantaBluTM或QuantaRedTM(Thermo Scientific,Waltham,MA)。发光试剂可以是例如鲁米诺或荧光素。

在本文提供的方法的一些实施方案中，标记试剂是荧光分子、放射性同位素、金属离子、酶、生物素、聚合物或抗体。

在一些实施方案中，结合物分子诸如共结合物可以与用于检测的亲和标签缀合。在一些实施方案中，亲和标签可以是谷胱甘肽-S-转移酶、HA-标签、His-标签、FLAG-标签或生物素。

在一些实施方案中，具有结合物分子诸如共结合物和靶分子的复合物可以通过识别结合物分子的第二抗体来检测。第二抗体可以是例如抗人IgA、抗人IgD、抗人IgE、抗人IgG或抗人IgM抗体。第二抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。第二抗体可以来源于任何哺乳动物生物体，包括小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、骆驼、鸡、兔等。第二抗体也可以是重组的。第二抗体可与酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、荧光素酶等)或染料(例如比色染料、荧光染料、荧光共振能量转移(FRET)-染料、时间分辨(TR)-FRET染料等)缀合。在一些实施方案中，第二抗体可与基于荧光素(FITC)的染料，例如异硫氰酸荧光素缀合。在一些实施方案中，第二抗体可以与Alexa 488(Life technologies)缀合。

复合物的存在或不存在也可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)(包括多重ELISA)、免疫组织化学测定(IHC)、免疫荧光测定(IF)、蛋白质印迹(WB)、流式细胞术、荧光免疫吸附测定(FIA)、化学发光免疫测定(CIA)、放射免疫测定(RIA)、酶倍增免疫测定、固相放射免疫测定(SPROA)、荧光偏振(FP)测定、荧光共振能量转移(FRET)测定、时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定、表面等离子共振测定(SPR)或圆点印迹测定来检测。用于进行免疫测定和生物物理蛋白质相互作用测定的方法和方案是本领域熟知的。参见例如Wild D.,TheImmunoassay Handbook,Elsevier Science,第4版(2013)；Fu H.,Protein-ProteinInteractions,Humana Press,第4版(2004)。

如本领域普通技术人员所理解的，人样品中较高水平的疾病标记可表明人受试者患有该疾病的可能性较高。Schouwers S等人,Clin Chem Lab Med.(2014)52(4):547-51。在一些实施方案中，检测步骤可以还包括测定样品中的靶分子水平。确定靶分子水平可以包括将来自受试者的样品中的靶分子水平与来自健康个体的样品中的对照靶分子水平进行比较，其中与对照水平相比，来自受试者的样品中的靶分子水平增加表明受试者患有所述疾病。确定靶分子的水平可以包括将所述水平与受试者患有所述疾病的可能性相关联，其中较高水平表明患有所述疾病的可能性较高。

一个时间段内人样品中的靶分子水平可以指示在所述时间段内与所述靶分子相关的疾病的进展。所述时间段可以是治疗时间进程，其中靶分子水平的变化可以指示治疗功效。在一些实施方案中，本公开提供了一种在不同时间点监测患者体内靶分子水平的方法，其包括确定在不同时间点取自患者的两个或更多个样品中的靶分子水平并比较两个或更多个样品中的靶分子水平。在随后的时间点获得的样品中的靶分子水平相对于在第一时间点获得的样品中的靶分子水平降低可以指示患者的病状正在改善或者患者接受的治疗是有效的。在随后的时间点获得的样品中的靶分子水平相对于在第一时间点获得的样品中的靶分子水平增加可以指示人受试者的病状正在恶化。在一些实施方案中，在特定治疗进程开始时获得一个或多个样品，并且在整个治疗进程的稍后时间点获得一个或多个样品。

在一些实施方案中，检测和诊断可以例如通过将本文公开的结合物分子诸如共结合物缀合到可检测物质来完成，所述可检测物质包括但不限于放射性物质，例如但不限于锆(⁸⁹Zr)、碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²⁴I、¹²³I、and ¹²¹I,)、碳(¹⁴C、¹¹C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In和¹¹¹In)、锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵O、¹³N、⁶⁴Cu、⁹⁴mTc、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn和¹¹⁷Sn；和使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属，各种酶，诸如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质，诸如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，诸如但不限于鲁米诺；生物发光材料，诸如但不限于荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，以及非放射性顺磁性金属离子。

本文公开的具有结合物分子诸如共结合物的缀合物，其如本文提供的那样被可检测地标记，可用于诊断目的以检测、诊断或监测疾病，例如癌症、感染性疾病、心血管疾病、脑损伤和阿尔茨海默病。

因此，在一方面，本文提供了一种诊断受试者的疾病的方法，其包括(i)在足以形成结合物分子和疾病标记的复合物的条件下，将样品与本文提供的结合物分子诸如共结合物接触，其中结合物分子特异性结合标记，和(ii)检测样品中的复合物。

在本文提供的方法的某些实施方案中，通过测量与复合物缀合的标记试剂来检测复合物，如本部分上文进一步描述的。

在本文提供的方法的某些实施方案中，标记试剂是如本部分上文进一步描述的标记试剂。

在本文提供的方法的一些具体实施方案中，标记试剂是荧光分子、放射性同位素、金属离子、酶、生物素、聚合物或抗体。

在所述方法的一些具体实施方案中，样品是体液、组织或细胞。在所述方法的一些具体实施方案中，样品是血液、骨髓、血浆、血清、尿液或脑脊液。在一些实施方案中，在体外形成复合物。在一些实施方案中，在体内形成复合物。在一些实施方案中，在体外检测复合物。在一些实施方案中，在体内检测复合物。在一些实施方案中，在体外形成复合物，并且在体外检测复合物。在一些实施方案中，在体内形成复合物，并且在体内检测复合物。在一些实施方案中，在生理条件下形成复合物。在一些实施方案中，在37℃下形成复合物。在一些实施方案中，在生理性血管剪切应力，例如10-70达因/厘米²(动脉中的剪切应力范围)或1-6达因/厘米²(静脉中的剪切应力范围)下形成复合物。在一些实施方案中，在37℃和生理性血管剪切应力，例如10-70达因/厘米²(动脉中的剪切应力范围)或1-6达因/厘米²(静脉中的剪切应力范围)下形成复合物。在一些实施方案中，在生理条件下检测复合物。在一些实施方案中，在37℃下检测复合物。在一些实施方案中，在生理性血管剪切应力，例如10-70达因/厘米²(动脉中剪切应力的范围)或1-6达因/厘米²(静脉中剪切应力的范围)下检测复合物。在一些实施方案中，在37℃和生理性血管剪切应力，例如10-70达因/厘米²(动脉中的剪切应力范围)或1-6达因/厘米²(静脉中的剪切应力范围)下检测复合物。在一些实施方案中，在正常实验室条件(例如，在室温或25℃)下形成复合物。在一些实施方案中，在正常实验室条件(例如，在室温或25℃)下检测复合物。在一些实施方案中，在正常实验室条件(例如，室温或25℃)下形成复合物，并在正常实验室条件(例如，室温或25℃)下检测复合物。

在本文提供的方法的一些实施方案中，样品中存在的标记的浓度不超过1×10^-8M、不超过0.5×10^-8M、不超过1×10^-9M、不超过0.5×10^-9M、不超过1×10^-10M、不超过0.5×10^{- 10}M、不超过1×10^-11M、不超过0.5×10^-11M、不超过1×10^-12M、不超过0.5×10^-12M、不超过1×10^-13M、不超过0.5×10^-13M、不超过1×10^-14M、不超过0.5×10^-14M、不超过1×10^-15M、不超过0.5×10^-15M、不超过1×10^-16M、不超过0.5×10^-16M、不超过1×10^-17M、不超过0.5×10^-17M、不超过1×10^-18M、不超过0.5×10^-18M、不超过1×10^-19M、不超过0.5×10^-19M、不超过1×10^-20M、不超过0.5×10^-20M、不超过1×10^-21M或不超过0.5×10^-21M。

在本文提供的方法的一些实施方案中，样品中存在的标记的浓度小于1×10^-8M、小于0.5×10^-8M、小于1×10^-9M、小于0.5×10^-9M、小于1×10^-10M、小于0.5×10^-10M、小于1×10^-11M、小于0.5×10^-11M、小于1×10^-12M、小于0.5×10^-12M、小于1×10^-13M、小于0.5×10^-13M、小于1×10^-14M、小于0.5×10^-14M、小于1×10^-15M、小于0.5×10^-15M、小于1×10^-16M、小于0.5×10^-16M、小于1×10^-17M、小于0.5×10^-17M、小于1×10^-18M、小于0.5×10^-18M、小于1×10^-19M、小于0.5×10^-19M、小于1×10^-20M、小于0.5×10^-20M、小于1×10^-21M或小于0.5×10^-21M。

在本文提供的方法的一些实施方案中，样品中存在的标记的浓度约1×10^-8M、约0.5×10^-8M、约1×10^-9M、约0.5×10^-9M、约1×10^-10M、约0.5×10^-10M、约1×10^-11M、约0.5×10^-11M、约1×10^-12M、约0.5×10^-12M、约1×10^-13M、约0.5×10^-13M、约1×10^-14M、约0.5×10^{- 14}M、约1×10^-15M、约0.5×10^-15M、约1×10^-16M、约0.5×10^-16M、约1×10^-17M、约0.5×10^-17M、约1×10^-18M、约0.5×10^-18M、约1×10^-19M、约0.5×10^-19M、约1×10^-20M、约0.5×10^-20M、约1×10^-21M或约0.5×10^-21M。

在一些实施方案中，检测方法可以还包括使用本文公开的共结合物测定受试者的细胞或组织样品上疾病标记的表达；以及将疾病标记的水平与对照水平进行比较，所述对照水平例如正常组织样品(例如来自未患病的受试者或来自疾病发作前的同一受试者)中的水平，由此疾病标记的测定水平与对照水平相比的增加指示所述疾病。此类诊断方法可以使卫生专业人员比其他方法更早地采取预防措施或积极治疗，从而预防疾病的发展或进一步恶化。

本文公开的结合物分子诸如共结合物也可用于使用如本文提供的或本领域技术人员熟知的经典免疫组织学方法(例如参见Jalkanen等人,1985,J.Cell.Biol.101:976-985；和Jalkanen等人,1987,J.Cell.Biol.105:3087-3096)，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)来测定生物样品中的靶分子水平。合适的分析标记是本领域已知的，并且包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如诸如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹²¹In)、锝(⁹⁹Tc)；发光标记，诸如鲁米诺；和荧光标记，诸如荧光素和罗丹明，以及生物素。

在一方面，本公开提供了人疾病的检测和诊断。在一些实施方案中，诊断包括：a)向受试者施用(例如，胃肠外、皮下或腹膜内)有效量的具有本文公开的结合物分子诸如共结合物的缀合物；b)在施用后等待一定时间间隔，以允许缀合物优先集中在受试者中表达疾病标记的位点(并且在一些方面，未结合的缀合物或融合蛋白被清除至背景水平)；c)确定背景水平；和d)检测受试者中的缀合物，使得检测到高于背景水平的缀合物表明受试者患有疾病。背景水平可以通过各种方法确定，包括将检测到的缀合物的量与先前为特定系统确定的标准值进行比较。

应当理解，受试者的大小和所用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量，并且可以由本领域技术人员容易地确定。例如，在与本文所述的结合物分子缀合的放射性同位素的情况下，对于人受试者，注入的放射性剂量通常在约5至20毫居里的⁹⁹Tc的范围内。然后缀合物将优先在表达靶分子的细胞位置积累。体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel等人,“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and TheirFragments.”(Chapter 13in Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer,S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编,Masson Publishing Inc.(1982)中。

根据几个变量，包括使用的可检测剂的类型和施用方式，施用后允许结合物优先集中在受试者的位点并允许未结合的结合物被清除至背景水平的时间间隔是6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一个实施方案中，施用后的时间间隔是5至20天或5至10天。在一些实施方案中，通过重复本文提供的诊断方法来进行疾病监测，例如在初始诊断后一个月、初始诊断后六个月、初始诊断后一年或更长时间。

可以使用本领域已知用于体内扫描的方法检测受试者中缀合物或融合蛋白的存在。这些方法取决于使用的可检测剂的类型。技术人员将能够确定用于检测特定可检测剂的适当方法。可用于本公开的诊断方法中的方法和装置包括但不限于计算机断层扫描(CT)、全身扫描诸如位置发射断层扫描(PET)、磁共振成像(MRI)和超声波扫描。在一些实施方案中，本文公开的结合物分子诸如共结合物与放射性同位素缀合，并使用辐射响应外科器械在受试者中检测。在另一个实施方案中，本文公开的结合物分子诸如共结合物与荧光化合物缀合，并使用荧光响应扫描仪器在受试者中检测。在另一个实施方案中，本文公开的结合物分子诸如共结合物与正电子发射金属诸如锆(⁸⁹Zr)或本文提供的或本领域熟知可通过正电子发射断层扫描检测的任何其他正电子发射金属缀合，并使用正电子发射断层扫描在受试者中检测。在又一个实施方案中，本文公开的结合物分子诸如共结合物与顺磁性标记缀合，并使用磁共振成像(MRI)在受试者中检测。

本文还考虑了本文公开的结合物分子诸如共结合物代替抗体在诸如ELISA、IHC、IF、IP、WB、流式细胞术、流式细胞分选、成像、多重ELISA或多重抗体阵列的应用中的用途。本文还考虑了本文公开的结合物分子诸如共结合物在检测与食品和环境安全检测和监控相关的标记中的用途。

在本文提供的各种方法的某些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是选自由以下各项组成的组的哺乳动物：豚鼠(Caviinae/guinea pig)、猪(Sus/pig)、食蟹猴(Macaca Fascicularis)(猴，例如食蟹猴(cynomolgus monkey))、类人猿(长臂猿、猩猩、大猩猩、黑猩猩和人)、犬(狗)、鼠属(大鼠)和小家鼠(小鼠)。在一个具体实施方案中，受试者是人。

B.治疗方法

对于治疗应用，本文所述的结合物分子诸如共结合物也具有由于典型二价抗体的显著优势。许多药物靶诸如GPCR、离子通道、酪氨酸激酶受体、细胞因子受体在细胞表面的表达水平远低于HER2，并且它们需要高亲和力的结合物来阻断它们与其天然配体的结合或用作拮抗剂或激动剂。

因此，在一方面，本文提供了一种治疗受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的结合物分子诸如共结合物，其中所述疾病可通过活化或抑制与结合物分子诸如共结合物特异性结合的靶来治疗。如本文所述，本文提供的结合物分子诸如共结合物相对于共结合物中的单个结合部分或对照结合物分子诸如本文所述的对照共结合物，具有增加的结合亲和力和/或特异性。因此，在一方面，本文提供了一种增加第一结合部分对靶的结合亲和力或其用途的方法，其包括根据本文提供的配置或实施方案中的任一者或其任何组合构建第一结合部分与第二结合部分的共结合物。在一些方面，本文提供了一种增加结合部分的治疗或诊断功效或其用途的方法，所述方法通过将结合部分连接至另一结合部分，使得所得结合分子以足够的亲和力和特异性结合靶，以用于治疗或诊断，并产生所需生物功效。

在一些实施方案中，本文公开的结合物分子诸如共结合物是靶的激动剂，并且本文提供了治疗可通过活化受试者中靶的生物功能来治疗的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的特异性结合靶的结合物分子。在一些实施方案中，本文公开的结合物分子诸如共结合物是靶的拮抗剂，并且本文提供了治疗可通过抑制受试者中靶的生物功能来治疗的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的特异性结合靶的结合物分子。

在本文提供的方法的一些实施方案中，靶的表达水平为低于1×10⁷、低于0.5×10⁷、低于1×10⁶、低于0.5×10⁶、低于1×10⁵、低于0.5×10⁵、低于1×10⁴、低于0.5×10⁴、低于1×10³、低于0.5×10³、低于1×10²或低于0.5×10²/细胞。在本文提供的方法的一些实施方案中，靶的表达水平不超过1×10⁷、不超过0.5×10⁷、不超过1×10⁶、不超过0.5×10⁶、不超过1×10⁵、不超过0.5×10⁵、不超过1×10⁴、不超过0.5×10⁴、不超过1×10³、不超过0.5×10³、不超过1×10²或不超过0.5×10²/细胞。在本文提供的方法的一些实施方案中，靶的表达水平为约1×10⁷、约0.5×10⁷、约1×10⁶、约0.5×10⁶、约1×10⁵、约0.5×10⁵、约1×10⁴、约0.5×10⁴、约1×10³、约0.5×10³、约1×10²或约0.5×10²/细胞。

一类药物靶是体液(例如血液)中的分泌分子，例如生长因子、细胞因子、趋化因子，它们也可受益于本文公开的具有抑制或活化其生物功能的高亲和力的结合物分子，诸如共结合物。在本文提供的方法的一些实施方案中，在体液样品例如血液、血清、血浆、骨髓或脑脊液中分泌蛋白靶少于1×10¹⁰、少于0.5×10¹⁰、少于1×10⁹、少于0.5×10⁹、少于1×10⁸、少于0.5×10⁸、少于1×10⁷、少于0.5×10⁷、少于1×10⁶、少于0.5×10⁶、少于1×10⁵、少于0.5×10⁵、少于1×10⁴、少于0.5×10⁴、少于1×10³、少于0.5×10³、少于1×10²或少于0.5×10²个分子/ml。在本文提供的方法的一些实施方案中，在体液样品例如血液、血清、血浆、骨髓或脑脊液中分泌蛋白靶为约1×10¹⁰、约0.5×10¹⁰、约1×10⁹、约0.5×10⁹、约1×10⁸、约0.5×10⁸、约1×10⁷、约0.5×10⁷、约1×10⁶、约0.5×10⁶、约1×10⁵、约0.5×10⁵、约1×10⁴、约0.5×10⁴、约1×10³、约0.5×10³、约1×10²或约0.5×10²个分子/ml。

许多药物靶属于蛋白质家族，其成员在功能保守区(例如蛋白质结合相互作用区域或负责酶活性的区域)共有几乎相同的序列，因此很难产生能够特异性靶向特定家族成员的功能保守区而不影响蛋白质家族中其他成员的功能的治疗性抗体。当共结合物中的第二结合部分增强结合亲和力并稳定第一结合部分与功能保守区的结合时，具有以相对低亲和力结合功能保守区的第一结合部分的结合物分子诸如共结合物仍可抑制或活化蛋白靶的功能。如果第二结合部分与靶中不与所述蛋白质家族的其他成员共有的独特序列结合，则可以实现该特定靶分子功能的选择性抑制或活化。

因此，在一些实施方案中，本文提供了一种结合物分子诸如共结合物，其具有以低亲和力结合蛋白质家族的功能保守区或结合位点的第一结合部分，使得其不能单独稳定地结合蛋白靶或其家族成员；以及结合到靶分子中与所述家族的其他成员不同的独特序列或结合位点的第二结合部分。所得结合物分子诸如共结合物选择性抑制或活化靶分子的功能，而不影响所述家族的其他成员。在一些实施方案中，本文提供了具有第一结合部分、第二结合部分和连接第一结合部分和第二结合部分的接头的共结合物，其中第一结合部分和第二结合部分结合靶分子上的非重叠表位，并且其中第一结合部分优选以低结合亲和力结合靶分子的功能保守区或结合位点(例如KD为至少1×10^-9M)。在一些实施方案中，本文提供了具有第一结合部分、第二结合部分和连接第一结合部分和第二结合部分的接头的结合物分子诸如共结合物，其中第一结合部分和第二结合部分同时结合靶分子上的非重叠表位，并且其中第一结合部分优选以低结合亲和力结合靶分子的功能保守区或结合位点(例如KD为至少1×10^-9M)。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分结合靶分子的KD为至少1×10^-9M、至少1×10^-8M、至少1×10^-7M、至少1×10^-6。

原始B细胞文库或初级免疫响应文库比次级免疫响应文库含有更多种类的低亲和力结合部分，次级免疫响应中的结合部分由于亲和力成熟而更具选择性但亲和力更高。然而，具有快速解离速率的低亲和力结合部分的治疗效果通常不如具有较慢解离速率的那些高亲和力结合部分好。能够抑制或活化药物靶的功能的所需结合部分的结合亲和力可以用含有第二结合部分的共结合物极大地改善，所述第二结合部分与所需第一结合部分协作和协同起作用。在一些实施方案中，本文提供了具有同时结合药物靶上的非重叠表位的第一结合部分和第二结合部分的共结合物，其中第一结合部分具有在结合时抑制或活化药物靶的功能的能力，以及与药物靶的相对低的结合亲和力(例如KD为至少1x 10^-9M)，并且其中由于第二结合部分的存在，结合亲和力改善了至少超过50倍，所述第二结合部分同时且协同地结合药物靶上不同的不重叠的表位。在一些实施方案中，本文提供了具有结合药物靶上的非重叠表位的第一结合部分和第二结合部分的共结合物，其中第一结合部分具有在结合时抑制或活化药物靶的功能的能力，以及与药物靶的相对低的结合亲和力(例如KD为至少1x 10^-9M)，并且其中由于第二结合部分的存在，结合亲和力改善了至少超过50倍，所述第二结合部分结合药物靶上不同的不重叠的表位。在一些实施方案中，可抑制或活化药物靶的功能的第一结合部分在结合药物靶时的KD为至少1x 10^-9M。在一些实施方案中，可抑制或活化药物靶的功能的第一结合部分在结合药物靶时的KD为至少1x 10^-8M。在一些实施方案中，可抑制或活化药物靶的功能的第一结合部分在结合药物靶时的KD为至少1x 10^-7M。在一些实施方案中，可抑制或活化药物靶的功能的第一结合部分在结合药物靶时的KD为至少1x10^-6M。在一些实施方案中，结合亲和力改善超过100倍。在一些实施方案中，结合亲和力改善超过200倍。在一些实施方案中，结合亲和力改善超过500倍。在一些实施方案中，结合亲和力改善超过1000倍。在一些实施方案中，结合亲和力改善超过2000倍。在一些实施方案中，结合亲和力改善超过5000倍。在一些实施方案中，结合亲和力改善超过10,000倍。

此外，原始免疫响应或初级免疫响应的B细胞文库含有更多样的低亲和力结合部分，且它们的结合亲和力可以通过共结合物中的协同第二结合部分而极大改善。因此，本文提供的共结合物可以高亲和力和/或宽亲和力谱结合靶分子中的任何感兴趣区域，用于不同目的(亲和力微调)。在一些实施方案中，共结合物的第一结合部分结合靶分子的KD为至少1×10^-9M、至少1×10^-8M、至少1×10^-7M或至少1×10^-6M，并且由于存在与同一靶分子中不同的不重叠表位结合的第二结合部分，共结合物的结合亲和力改善超过10倍、超过20倍、超过50倍、超过100倍、超过200倍、超过500倍、超过1000倍、超过2000倍、超过5000倍或超过10,000倍。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗有需要的受试者的疾病的方法。所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的药物组合物。例如，药物组合物可以包含本文提供的结合物分子，诸如共结合物。可以使用本公开的方法治疗或预防的疾病包括癌症、感染性疾病、心血管疾病、脑损伤、自身免疫性疾病和神经退行性疾病如诸如阿尔茨海默病。在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的具有本文提供的结合物分子诸如共结合物的药物组合物。在本公开的一些实施方案中，结合物分子诸如共结合物用作CAR-T构建体的一部分，其以更高的亲和力和特异性结合靶分子，诸如肿瘤抗原或新抗原。

本文提供的结合物分子诸如共结合物也可用于将治疗剂特异性靶向患病细胞、组织或器官。在一些实施方案中，本文提供了与一种或多种治疗剂缀合(共价或非共价缀合)或重组融合的结合物分子诸如共结合物的治疗用途。在该上下文中，例如，结合物分子诸如共结合物可与治疗剂，诸如细胞毒素，例如细胞生长抑制剂或杀细胞剂，或放射性金属离子，例如α-发射体缀合或重组融合。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药剂。治疗剂可以是化学治疗剂，诸如但不限于蒽环类药物(例如阿霉素和道诺霉素(以前为柔红霉素))；紫杉烷(例如，紫杉醇(paclitaxel/Taxol)和多西他赛(泰素帝)；抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶和达卡巴嗪)；或烷化剂(例如氮芥、噻替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、顺二氯二胺铂(II)(DDP)和顺铂)；抗生素(例如放线菌素D、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))；瑞奥西汀分子(例如瑞奥西汀PHE、苔藓抑素1、索拉他汀(solastatin)10、单甲基瑞奥西汀E(MMAE)和单甲基瑞奥西汀F(MMAF))；激素(例如糖皮质激素、孕激素、雄激素和雌激素)；核苷类似物(例如吉西他滨)、DNA修复酶抑制剂(例如依托泊苷和拓扑替康)、激酶抑制剂(例如化合物ST1571，也称为格列卫(Gleevec)或甲磺酸伊马替尼)；细胞毒性剂(例如美登素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、道诺霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物或同系物；法尼基转移酶抑制剂(例如R115777、BMS-214662以及例如美国专利号6,458,935中公开的那些)；拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱、伊立替康、SN-38、拓扑替康、9-氨基喜树碱、GG-211(GI 147211)、DX-8951f、IST-622、卢比替康、吡唑并吖啶、XR-5000、塞恩托品(saintopin)、UCE6、UCE1022、TAN-1518A、TAN 1518B、KT6006、KT6528、ED-110、NB-506、ED-110、NB-506、法格罗宁(fagaronine)、甲氧檗因(coralyne)、β-拉帕醌和蝴蝶霉素)；DNA小沟结合物(例如，Hoescht染料33342和Hoechst染料33258)；腺苷脱氨酶抑制剂(例如磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷)；或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物或前药。治疗剂可以是免疫治疗剂，诸如但不限于西妥昔单抗、贝伐单抗、赫赛汀(heceptin)、利妥昔单抗。

此外，本文提供的结合物分子诸如共结合物可以与治疗剂缀合，所述治疗剂诸如放射性金属离子，例如α发射体诸如²¹³Bi或可用于缀合放射性金属离子的大环螯合剂，包括但不限于¹³¹In、¹³¹LU、¹³¹Y、¹³¹Ho、¹³¹Sm；或大环螯合剂，诸如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)。

此外，本文提供的结合物分子诸如共结合物可以与改变给定生物响应的治疗剂缀合(共价或非共价缀合)或重组融合。因此，治疗剂不应被解释为限于经典化学治疗剂。例如，治疗剂可以是具有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。此类蛋白质可以包括例如毒素(例如相思子毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素和白喉毒素)；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子、γ-干扰素、α-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原活化剂、凋亡剂(例如TNF-γ、AIM I、AIMII、Fas配体和VEGF)、抗血管生成剂(例如血管抑制素、内皮抑制素和凝血途径的组分诸如组织因子)；生物响应调节剂(例如细胞因子，诸如干扰素γ、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-23、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞集落刺激因子)；生长因子(例如生长激素)或凝血剂(例如钙、维生素K、组织因子，诸如但不限于哈格曼因子(因子XII)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽释放酶(PK)、凝血蛋白-因子II(凝血酶原)、因子V、XIIa、VIII、XIIIa、XI、XIa、IX、IXa、X、磷脂和纤维蛋白单体)。

可以选择与本文提供的共结合物缀合或重组融合的治疗剂，以实现所需预防或治疗效果。应当理解，临床医生或其他医务人员的技能水平能够考虑以下因素来决定将哪种治疗剂与本文提供的共结合物缀合或重组融合：疾病的性质、疾病的严重程度和受试者的病状。

本文所述的共结合物或药物组合物可以施用一次，或者可以分成多个较小剂量在一定时间间隔内施用。应当理解，治疗的精确剂量和持续时间是所治疗疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案或通过从体内或体外测试数据中推断来凭经验确定。需要注意的是，浓度和剂量值也可以随着待缓解的疾病的严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定受试者，可以根据个体需要和施用组合物或监督组合物施用的人的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文所述的浓度范围仅是示例性的，并不旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。

在一些实施方案中，本文所述的一种或多种共结合物是在上文第4.4节中所述的液体药物制剂中。

用于施用具有本文所述的共结合物的药物组合物的方法是本领域熟知的。应当理解，熟练的临床医生可以容易地确定药物组合物的合适施用途径。示例性施用途径包括静脉注射、肌肉注射、皮内注射或皮下注射。此外，应当理解，可以容易地调整药物组合物的制剂以适应施用途径。

本文提供的用于治疗疾病的方法意图包括(1)预防疾病，即使可能易患疾病但尚未经历或表现出疾病的症状的受试者不发展疾病的临床症状；(2)抑制疾病，即阻止或减少疾病或其临床症状的发展；或(3)缓解疾病，即引起疾病或其临床症状的消退。本文还提供了预防疾病的方法，其包括预先阻止指示疾病的临床症状。本公开的方法中所用的药物组合物的治疗有效量将根据所用药物组合物、疾病及其严重性以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化，所有这些都在主治临床医生的技能范围内。

示例性实施方案

实施方案1.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)第一抗体的重链可变区(VHAb1)；(ii)第二抗体的重链可变区(VHAb2)，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将VHAb1 C末端氨基酸与截短的VHAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中VHAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案2.如实施方案1所述的共结合物，其中所述VHAb2的N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案3.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VHAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含截短或缺失的VHAb2；和(iii)将所述VHAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VHAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中所述多肽接头的X₃氨基酸和所述VHAb2互补决定区1(CDR1)相隔8至25个氨基酸；并且其中VHAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案4.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VHAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含截短或缺失的VHAb2；和(iii)将所述VHAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VHAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中所述多肽接头的X₃氨基酸和所述VHAb2互补决定区1(CDR1)相隔不超过25个氨基酸；并且其中VHAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案5.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VHAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的N末端截短的VHAb2；和(iii)将VHAb1 C末端氨基酸与截短的VHAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中VHAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案6.如实施方案5所述的共结合物，其中所述FR1的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案7.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)第一抗体的重链可变区(VHAb1)；(ii)第二抗体的轻链可变区(VLAb2)，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将VHAb1 C末端氨基酸与截短的VLAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中VHAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案8.如实施方案7所述的共结合物，其中所述VLAb2的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案9.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VHAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含截短或缺失的VLAb2；和(iii)将所述VHAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VLAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中所述多肽接头的X₃氨基酸和所述VLAb2互补决定区1(CDR1)相隔5至22个氨基酸；并且其中VHAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案10.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VHAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含截短或缺失的VLAb2；和(iii)将所述VHAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VLAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中所述多肽接头的X₃氨基酸和所述VLAb2互补决定区1(CDR1)相隔不超过22个氨基酸；并且其中VHAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案11.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VHAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的N末端截短的VLAb2；和(iii)将VHAb1 C末端氨基酸与截短的VLAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中VHAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案12.如实施方案11所述的共结合物，其中所述FR1的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案13.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)第一抗体的轻链可变区(VLAb1)；(ii)第二抗体的轻链可变区(VLAb2)，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将VLAb1 C末端氨基酸与截短的VLAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中VLAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案14.如实施方案13所述的共结合物，其中所述VLAb2的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案15.一种特异性结合至靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VLAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含截短或缺失的VLAb2；和(iii)将所述VLAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VLAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中所述多肽接头的X₃氨基酸和所述VLAb2互补决定区1(CDR1)相隔5至22个氨基酸；并且其中VLAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案16.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VLAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含截短或缺失的VLAb2；和(iii)将所述VLAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VLAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中所述多肽接头的X₃氨基酸和所述VLAb2互补决定区1(CDR1)相隔不超过22个氨基酸；并且其中VLAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案17.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VLAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的N末端截短的VLAb2；和(iii)将VLAb1 C末端氨基酸与截短的VLAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中VLAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案18.如实施方案17所述的共结合物，其中所述FR1的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案19.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)第一抗体的轻链可变区(VLAb1)；(ii)第二抗体的重链可变区(VHAb2)，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将VLAb1 C末端氨基酸与截短的VHAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中VLAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案20.如实施方案19所述的共结合物，其中所述VHAb2的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案21.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VLAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含截短或缺失的VHAb2；和(iii)将所述VLAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VHAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中所述多肽接头的X₃氨基酸和所述VHAb2互补决定区1(CDR1)相隔8至25个氨基酸；并且其中VLAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案22.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VLAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含截短或缺失的VHAb2；和(iii)将所述VLAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VHAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中所述多肽接头的X₃氨基酸和所述VHAb2互补决定区1(CDR1)相隔不超过25个氨基酸；并且其中VLAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案23.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VLAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的N末端截短的VHAb2；和(iii)将VLAb1 C末端氨基酸与截短的VHAb2的N末端氨基酸连接的多肽接头；其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且X₃是G；并且其中VLAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案24.如实施方案23所述的共结合物，其中所述FR1的N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案25.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是VVG、VAG、VLG、VSG、VGG、VRG、VKG、VMG、VCG、VFG、VTG、VPG或VEG。

实施方案26.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是LVG、LAG、LLG、LSG、LGG、LRG、LKG、LMG、LCG、LFG、LTG、LPG或LEG。

实施方案27.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是WVG、WAG、WLG、WSG、WGG、WRG、WKG、WMG、WCG、WFG、WTG、WPG或WEG。

实施方案28.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是PVG、PAG、PLG、PSG、PGG、PRG、PKG、PMG、PCG、PFG、PTG、PPG或PEG。

实施方案29.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是SVG、SAG、SLG、SSG、SGG、SRG、SKG、SMG、SCG、SFG、STG、SPG或SEG。

实施方案30.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是GVG、GAG、GLG、GSG、GGG、GRG、GKG、GMG、GCG、GFG、GTG、GPG或GEG。

实施方案31.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是KVG、KAG、KLG、KSG、KGG、KRG、KKG、KMG、KCG、KFG、KTG、KPG或KEG。

实施方案32.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是DVG、DAG、DLG、DSG、DGG、DRG、DKG、DMG、DCG、DFG、DTG、DPG或DEG。

实施方案33.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是FVG、FAG、FLG、FSG、FGG、FRG、FKG、FMG、FCG、FFG、FTG、FPG或FEG。

实施方案34.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是MVG、MAG、MLG、MSG、MGG、MRG、MKG、MMG、MCG、MFG、MTG、MPG或MEG。

实施方案35.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是TVG、TAG、TLG、TSG、TGG、TRG、TKG、TMG、TCG、TFG、TTG、TPG或TEG。

实施方案36.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是NVG、NAG、NLG、NSG、NGG、NRG、NKG、NMG、NCG、NFG、NTG、NPG或NEG。

实施方案37.如实施方案1至24中任一项所述的共结合物，其中所述多肽接头C末端三个氨基酸是RVG、RAG、RLG、RSG、RGG、RRG、RKG、RMG、RCG、RFG、RTG、RPG或REG。

实施方案38.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)第一抗体的重链可变区(VHAb1)；(ii)第二抗体的重链可变区(VHAb2)，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将所述VHAb1C末端氨基酸与所述截短的VHAb2的所述N末端氨基酸连接的接头；其中VHAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案39.如实施方案38所述的共结合物，其中所述VHAb2的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案40.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VHAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的截短或缺失的VHAb2；和(iii)将VHAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VHAb2 N末端氨基酸连接的接头；其中VHAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案41.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VHAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的N末端截短的VHAb2；和(iii)将所述VHAb1 C末端氨基酸与所述截短的VHAb2的所述N末端氨基酸连接的接头；其中VHAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案42.如实施方案41所述的共结合物，其中所述FR1的N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案43.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)第一抗体的重链可变区(VHAb1)；(ii)第二抗体的轻链可变区(VLAb2)，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将所述VHAb1C末端氨基酸与所述截短的VLAb2的所述N末端氨基酸连接的接头；其中VHAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案44.如实施方案43所述的共结合物，其中所述VLAb2的N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案45.一种特异性结合至靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VHAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的截短或缺失的VLAb2；和(iii)将所述VHAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VLAb2的N末端氨基酸连接的接头；其中VHAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案46.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VHAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的N末端截短的VLAb2；和(iii)将所述VHAb1 C末端氨基酸与所述截短的VLAb2的所述N末端氨基酸连接的接头；其中VHAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案47.如实施方案46所述的共结合物，其中所述FR1的N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案48.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)第一抗体的轻链可变区(VLAb1)；(ii)第二抗体的轻链可变区(VLAb2)，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将所述VLAb1C末端氨基酸与所述截短的VLAb2的所述N末端氨基酸连接的接头；其中VLAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案49.如实施方案48所述的共结合物，其中所述VLAb2的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案50.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VLAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的截短或缺失的VLAb2；和(iii)将所述VLAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VLAb2的N末端氨基酸连接的接头；其中VLAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案51.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VLAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的N末端截短的VLAb2；和(iii)将所述VLAb1 C末端氨基酸与所述截短的VLAb2的所述N末端氨基酸连接的接头；其中VLAb1和VLAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案52.如实施方案51所述的共结合物，其中所述FR1的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案53.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)第一抗体的轻链可变区(VLAb1)；(ii)第二抗体的重链可变区(VHAb2)，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(iii)将所述VLAb1C末端氨基酸与所述截短的VHAb2的所述N末端氨基酸连接的接头；其中VLAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案54.如实施方案53所述的共结合物，其中所述VHAb2的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案55.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VLAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的截短或缺失的VHAb2；和(iii)将所述VLAb1 C末端氨基酸与包含所述截短或缺失的所述VHAb2的N末端氨基酸连接的接头；其中VLAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案56.一种特异性结合靶的共结合物，其中所述共结合物包含：(i)VLAb1；(ii)在框架1(FR1)区中包含1至18个氨基酸的N末端截短的VHAb2；和(iii)将所述VLAb1 C末端氨基酸与所述截短的VHAb2的所述N末端氨基酸连接的接头；其中VLAb1和VHAb2结合靶上的非重叠表位。

实施方案57.如实施方案56所述的共结合物，其中所述FR1的所述N末端截短为1至10个氨基酸。

实施方案58.如实施方案1至12和25至47中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb1进一步连接至轻链可变区(VL)。

实施方案59.如实施方案1至6、19至42和53至57中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb2进一步连接至VL。

实施方案60.如实施方案13至37、48至57和59中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb1进一步连接至重链可变区(VH)。

实施方案61.如实施方案7至18、25至37、43至52、58和60中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb2进一步连接至VH。

实施方案62.如实施方案1至6和25至42中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb1进一步连接至第一VL，并且所述VHAb2进一步连接至第二VL。

实施方案63.如实施方案7至12、25至37和43至47中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb1进一步连接至VL，并且所述VLAb2进一步连接至VH。

实施方案64.如实施方案13至18、25至37和48至52中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb1进一步连接至第一VH，并且所述VLAb2进一步连接至第二VH。

实施方案65.如实施方案19至37和53至57中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb1进一步连接至VH，并且所述VHAb2进一步连接至VL。

实施方案66.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2还包含取代从所述VHAb2截短的氨基酸的1至18个额外氨基酸。

实施方案67.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65中任一项所述的共结合物，其中包含缺失的所述VHAb2还包含取代从所述VHAb2缺失的氨基酸的1至18个氨基酸。

实施方案68.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至67中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第1氨基酸不是E或Q。

实施方案69.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至68中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第1氨基酸不是E、Q或R。

实施方案70.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至69中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第2氨基酸不是I、L、M或V。

实施方案71.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至70中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第3氨基酸不是Q或T。

实施方案72.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至70中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第3氨基酸不是Q、T、H或R。

实施方案73.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至72中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第4氨基酸不是L或V。

实施方案74.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至72中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第4氨基酸不是L、V或R。

实施方案75.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至74中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第5氨基酸不是K、L、Q、R或V。

实施方案76.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至75中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第6氨基酸不是E或Q。

实施方案77.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至75中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第6氨基酸不是E、K、Q或D。

实施方案78.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至77中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第7氨基酸不是P、S或W。

实施方案79.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至77中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第7氨基酸不是P、S、W、L或T。

实施方案80.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至79中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第8氨基酸不是G。

实施方案81.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至79中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第8氨基酸不是G、A或V。

实施方案82.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至81中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第9氨基酸不是A、E、G、P或S。

实施方案83.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至82中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第11氨基酸不是A、E、G、T或V。

实施方案84.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至83中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第12氨基酸不是L或V。

实施方案85.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至84中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第13氨基酸不是I、K、L、R或V。

实施方案86.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至85中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第14氨基酸不是K、Q或R。

实施方案87.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至85中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第14氨基酸不是K、Q、R或N。

实施方案88.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至87中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第15氨基酸不是A或P。

实施方案89.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至87中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第15氨基酸不是A、P、D、L或T。

实施方案90.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至89中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第16氨基酸不是G、P、S或T。

实施方案91.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至90中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第17氨基酸不是A、D、E、G、Q、R或S。

实施方案92.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至90中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第17氨基酸不是A、D、E、G、Q、R、S、P、T或V。

实施方案93.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至92中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第18氨基酸不是S或T。

实施方案94.如实施方案1至6、19至42、53至60、62和65至92中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VHAb2的N末端第18氨基酸不是S、T、A、L或M。

实施方案95.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61和63至64中任一项所述的共结合物，其中所述截短的VLAb2还包含取代从所述VLAb2截短的氨基酸的1至18个额外氨基酸。

实施方案96.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61和63至64中任一项所述的共结合物，其中包含缺失的所述VLAb2还包含取代从所述VLAb2缺失的氨基酸的1至18个氨基酸。

实施方案97.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至96中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb2是人兰姆达(λ)轻链的轻链可变区(λVLAb2)。

实施方案98.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至97中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第1氨基酸不是N、Q、R或S。

实施方案99.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至97中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第1氨基酸不是N、Q、R、S或L。

实施方案100.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至99中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第2氨基酸不是A、F、L、P、S、T或Y。

实施方案101.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至100中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第3氨基酸不是A、E、G、M或V。

实施方案102.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至101中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第4氨基酸不是L或V。

实施方案103.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至101中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第4氨基酸不是L、V或P。

实施方案104.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至103中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第5氨基酸不是T。

实施方案105.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至103中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第5氨基酸不是T或M。

实施方案106.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至105中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第6氨基酸不是Q。

实施方案107.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至106中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第7氨基酸不是E、P或S。

实施方案108.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至106中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第7氨基酸不是E、P、S、D、L或V。

实施方案109.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至108中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第8氨基酸不是A、H、L、P、R、S或T。

实施方案110.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至109中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第9氨基酸不是A、F或S。

实施方案111.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至110中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第11氨基酸不是A、F、L或V。

实施方案112.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至110中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第11氨基酸不是A、F、L、V、H或S。

实施方案113.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至112中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第12氨基酸不是S或T。

实施方案114.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至113中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第13氨基酸不是A、E、G、K或V。

实施方案115.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至113中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第13氨基酸不是A、E、G、K、V或R。

实施方案116.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至115中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第14氨基酸不是A、G、S或T。

实施方案117.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至115中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第14氨基酸不是A、G、S、T或L。

实施方案118.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至117中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第15氨基酸不是L、P或T。

实施方案119.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至117中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第15氨基酸不是L、P、T或S。

实施方案120.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至119中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第16氨基酸不是A、G或R。

实施方案121.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至120中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第17氨基酸不是A、G、K、Q或S。

实施方案122.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至120中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第17氨基酸不是A、G、K、Q、S或E。

实施方案123.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至122中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第18氨基酸不是K、M、R、S或T。

实施方案124.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95至122中任一项所述的共结合物，其中所述截短的λVLAb2的N末端第18氨基酸不是K、M、R、S、T或A。

实施方案125.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64和95中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb2是人卡帕(κ)轻链的轻链可变区(κVLAb2)。

实施方案126.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第1氨基酸不是A、D、E或V。

实施方案127.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第1氨基酸不是A、D、E或N。

实施方案128.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至127中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第2氨基酸不是I或V。

实施方案129.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至127中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第2氨基酸不是I、V或T。

实施方案130.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至129中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第3氨基酸不是Q、R、V或W。

实施方案131.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至129中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第3氨基酸不是Q、R、V、W或T。

实施方案132.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至129中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第4氨基酸不是L或M。

实施方案133.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至132中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第5氨基酸不是T。

实施方案134.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至133中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第6氨基酸不是Q。

实施方案135.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至134中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第7氨基酸不是S或T。

实施方案136.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至135中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第8氨基酸不是P。

实施方案137.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至136中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第9氨基酸不是A、D、L或S。

实施方案138.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至136中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第9氨基酸不是A、D、L、S、F或G。

实施方案139.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至138中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第10氨基酸不是A、F、L、S或T。

实施方案140.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至139中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第11氨基酸不是L、M、Q或V。

实施方案141.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至139中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第11氨基酸不是L、M、Q、V、F或S。

实施方案142.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至141中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第12氨基酸不是P或S。

实施方案143.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至141中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第12氨基酸不是P、S或A。

实施方案144.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至143中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第13氨基酸不是A、I、L或V。

实施方案145.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至144中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第14氨基酸不是S或T。

实施方案146.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至145中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第15氨基酸不是L、P、T或V。

实施方案147.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至146中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第16氨基酸不是G或K。

实施方案148.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至147中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第17氨基酸不是D、E或Q。

实施方案149.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60至61、63至64、95和125至148中任一项所述的共结合物，其中所述截短的κVLAb2的N末端第18氨基酸不是K、P、Q或R。

实施方案150.一种抗原结合蛋白，其包含抗体的重链可变区(VHAb)，其中所述VHAb包含1至18个氨基酸的N末端截短，并且其中所述VHAb经由接头与第二分子连接。

实施方案151.一种抗原结合蛋白，其包含抗体的轻链可变区(VLAb)，其中所述VLAb包含1至18个氨基酸的N末端截短，并且其中所述VLAb经由接头与第二分子连接。

实施方案152.如实施方案150所述的抗原结合蛋白，其中所述VHAb进一步连接至轻链可变区。

实施方案153.如实施方案151所述的抗原结合蛋白，其中所述VLAb进一步连接至重链可变区。

实施方案154.如实施方案150至153中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二分子是DNA分子或蛋白质分子。

实施方案155.如实施方案150至154中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二分子是抗体或其抗原结合片段。

实施方案156.如实施方案1至149中任一项所述的共结合物，其中根据IMGT编号方案确定所述FR1、CDR1或FR1和CDR1两者。

实施方案157.如实施方案1至149中任一项所述的共结合物，其中根据Kabat编号方案确定所述FR1、CDR1或FR1和CDR1两者。

实施方案158.如实施方案1至157中任一项所述的共结合物，其中根据IMGT编号方案确定所述VH、VL或VH和VL两者。

实施方案159.如实施方案1至157中任一项所述的共结合物，其中根据Kabat编号方案确定所述VH、VL或VH和VL两者。

实施方案160.如实施方案68至159中任一项所述的共结合物，其中根据IMGT编号方案确定氨基酸位置。

实施方案161.如实施方案68至159中任一项所述的共结合物，其中根据Kabat编号方案确定氨基酸位置。

实施方案162.如实施方案1至161中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb1、VHAb2或VHAb1和VHAb2两者来自骆驼科单链VHH。

实施方案163.如实施方案1至161中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb1、VHAb2或VHAb1和VHAb2两者来自IgG、IgA、IgE、IgM或IgD。

实施方案164.如实施方案1至161中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb1、VHAb2或VHAb1和VHAb2两者是骆驼科单链VHH。

实施方案165.如实施方案1至161中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb1、VHAb2或VHAb1和VHAb2两者是scFv的一部分。

实施方案166.如实施方案1至161中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb1、VHAb2或VHAb1和VHAb2两者是Fab的一部分。

实施方案167.如实施方案7至166中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb1、VLAb2或VLAb1和VLAb2两者来自IgG、IgA、IgE、IgM或IgD。

实施方案168.如实施方案7至166中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb1、VLAb2或VLAb1和VLAb2两者是scFv的一部分。

实施方案169.如实施方案7至166中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb1、VLAb2或VLAb1和VLAb2两者是Fab的一部分。

实施方案170.如实施方案1至169中任一项所述的共结合物，其中所述接头是刚性接头。

实施方案171.如实施方案1至169中任一项所述的共结合物，其中所述接头是柔性接头。

实施方案172.如实施方案1至169中任一项所述的共结合物，其中所述接头是可裂解接头。

实施方案173.如实施方案1至169中任一项所述的共结合物，其中所述接头是不可裂解接头。

实施方案174.如实施方案38至173中任一项所述的共结合物，其中所述接头是肽、核酸或化学接头。

实施方案175.如实施方案1至174中任一项所述的共结合物，其中所述接头通过共价键连接所述第一抗体的可变区和所述第二抗体的可变区。

实施方案176.如实施方案1至175中任一项所述的共结合物，其中所述接头是肽接头。

实施方案177.如实施方案176所述的共结合物，其中所述肽接头包含肽序列(EAAAK)_n，其中n是1至10的整数。

实施方案178.如实施方案176所述的共结合物，其中所述肽接头包含肽序列(XP)n、(XPP)n或(XPPP)n，其中X是任何氨基酸，并且其中n是1至20的整数。

实施方案179.如实施方案176所述的共结合物，其中所述肽接头包含肽序列(AP)_n，其中n是1至20的整数。

实施方案180.如实施方案176所述的共结合物，其中所述肽接头包含肽序列(EEEEKKKK)_n，其中n是1至10的整数。

实施方案181.如实施方案176所述的共结合物，其中所述肽接头包含肽序列(G_xS_y)_n，其中x为1至5，y为1至5，并且n为1至10的整数。

实施方案182.如实施方案38至175中任一项所述的共结合物，其中所述接头是化学接头。

实施方案183.如实施方案182所述的共结合物，其中化学接头包括聚乙二醇(“PEG”)。

实施方案184.如实施方案1至174中任一项所述的共结合物，其中所述接头通过非共价结合连接所述第一抗体的可变区和所述第二抗体的可变区。

实施方案185.如实施方案184所述的共结合物，其中所述接头包含亮氨酸拉链。

实施方案186.如实施方案184所述的共结合物，其中所述接头包含具有两条互补链的双链核酸，每条互补链分别共价连接至所述第一抗体的可变区和所述第二抗体的可变区。

实施方案187.如实施方案1至186中任一项所述的共结合物，其中所述接头的长度不超过150埃、不超过140埃、不超过130埃、不超过120埃、不超过110埃、不超过100埃、不超过90埃、不超过80埃、不超过70埃、不超过60埃、不超过50埃、不超过40埃、不超过30埃、不超过20埃、不超过15埃、不超过10埃或不超过5埃。

实施方案188.如实施方案1至186中任一项所述的共结合物，其中所述接头的长度为约150埃、约140埃、约130埃、约120埃、约110埃、约100埃、约90埃、约80埃、约70埃、约60埃、约50埃、约40埃、约30埃、约20埃、约15埃、约10埃或约5埃。

实施方案189.如实施方案1至181中任一项所述的共结合物，其中所述接头的长度不超过60个氨基酸、不超过55个氨基酸、不超过50个氨基酸、不超过45个氨基酸、不超过40个氨基酸、不超过35个氨基酸、不超过30个氨基酸、不超过25个氨基酸、不超过20个氨基酸、不超过15个氨基酸、不超过10个氨基酸或不超过5个氨基酸。

实施方案190.如实施方案1至181中任一项所述的共结合物，其中所述接头的长度为约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸或约5个氨基酸。

实施方案191.如实施方案1至190中任一项所述的共结合物，其中所述靶是多肽、多蛋白质复合物、核酸、碳水化合物、聚糖、脂质分子、生理代谢物或小分子化合物。

实施方案192.如实施方案1至190中任一项所述的共结合物，其中所述靶是细胞内分子、疾病标记、新抗原或细胞表面分子。

实施方案193.如实施方案192所述的共结合物，其中所述靶分子是癌症抗原或癌症标记。

实施方案194.如实施方案1至193中任一项所述的共结合物，其中所述靶是EGFR。

实施方案195.如实施方案1至194中任一项所述的共结合物，其中所述靶的表达水平为低于1×10⁶、低于1×10⁵、低于1×10⁴、低于1×10³或低于1×10²/细胞。

实施方案196.如实施方案1至193中任一项所述的共结合物，其中所述靶是分泌蛋白。

实施方案197.如实施方案196所述的共结合物，其中所述分泌蛋白是生长因子、细胞因子或趋化因子。

实施方案198.如实施方案196或197所述的共结合物，其中所述分泌蛋白在血液中低于1×10¹⁰、低于1×10⁹、低于1×10⁸、低于1×10⁷、低于1×10⁶、低于1×10⁵、低于1×10⁴、低于1×10³或低于1×10²个分子/ml。

实施方案199.如实施方案1至198中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物是所述靶的拮抗剂。

实施方案200.如实施方案1至198中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物是所述靶的激动剂。

实施方案201.如实施方案1至200中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物结合所述靶的K_D小于1×10^-8M、小于1×10^-9M、小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12M、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M、小于1×10^-16M、小于1×10^-17M或小于1×10^-18M。

实施方案202.如实施方案1至200中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物结合所述靶的K_D为约1×10^-8M、约1×10^-9M、约1×10^-10M、约1×10^-11M、约1×10^-12M、约1×10^{- 13}M、约1×10^-14M、约1×10^-15M、约1×10^-16M、约1×10^-17M或约1×10^-18M。

实施方案203.如实施方案1至200中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物对所述靶的亲和力大于仅单个可变区的亲和力不小于50倍、不小于100倍、不小于150倍、不小于200倍、不小于250倍、不小于300倍、不小于350倍、不小于400倍、不小于450倍、不小于500倍、不小于600倍、不小于700倍、不小于800倍、不小于900倍、不小于1000倍、不小于1100倍、不小于1200倍、不小于1300倍、不小于1400倍、不小于1500倍、不小于1600倍、不小于1700倍、不小于1800倍、不小于1900倍、不小于2000倍、不小于3000倍、不小于4000倍、或不小于5000倍、或不小于10000倍。

实施方案204.如实施方案1至6、19至42、53至60、62、65至94、156至166和170至203中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb2是重链可变区，使得如果经由包含(GGGS)4(refIg-VHAb2)的接头在所述VHAb2的N末端与参考Ig结构域缀合，则所述refIg-VHAb2与所述靶之间的解离常数(KD)比VHAb2与所述靶之间的KD大超过3倍。

实施方案205.如实施方案7至18、25至37、43至52、58、60、61、63、64、95至149、156至161和167至203中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb2是轻链可变区，使得如果经由包含(GGGS)4(refIg-VLAb2)的接头在所述VLAb2的N末端与参考Ig结构域缀合，则所述refIg-VLAb2与所述靶之间的解离常数(KD)比VLAb2与所述靶之间的KD大超过3倍。

实施方案206.如实施方案150、152、154至166和170至203中任一项所述的共结合物，其中所述VHAb是重链可变区，使得如果经由包含(GGGS)4(refIg-VHAb)的接头在所述VHAb的N末端与参考Ig结构域缀合，则所述refIg-VHAb与所述靶之间的解离常数(KD)比VHAb与所述靶之间的KD大超过3倍。

实施方案207.如实施方案151、153至161和167至203中任一项所述的共结合物，其中所述VLAb是轻链可变区，使得如果经由包含(GGGS)4(refIg-VLAb)的接头在所述VLAb的N末端与参考Ig结构域缀合，则所述refIg-VLAb与所述靶之间的解离常数(KD)比VLAb与所述靶之间的KD大超过3倍。

实施方案208.一种组合物，其包含如实施方案1至207中任一项所述的共结合物。

实施方案209.一种药物组合物，其包含如实施方案1至实施方案207中任一项所述的共结合物和药学上可接受的载体。

实施方案210.一种检测剂，其包含如实施方案1至207中任一项所述的共结合物。

实施方案211.一种诊断剂，其包含如实施方案1至207中任一项所述的共结合物。

实施方案212.一种治疗剂，其包含如实施方案1至207中任一项所述的共结合物。

实施方案213.一种嵌合抗原受体，其包含如实施方案1至207中任一项所述的共结合物。

实施方案214.一种细胞，其表达如实施方案1至207中任一项所述的共结合物。

实施方案215.如实施方案214所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。

实施方案216.一种复合物，其包含如实施方案1至207中任一项所述的共结合物和靶。

实施方案217.一种用于检测样品中的标记的方法，其包括(i)在足以形成共结合物和标记的复合物的条件下，使所述样品与如实施方案1至207中任一项所述的共结合物接触，和(ii)检测所述样品中的复合物。

实施方案218.如实施方案217所述的方法，其中通过测量与所述复合物缀合的标记试剂来检测所述复合物。

实施方案219.如实施方案217或218所述的方法，其中所述标记试剂是荧光分子、放射性同位素、金属离子、酶、生物素、聚合物或抗体。

实施方案220.如实施方案217至219中任一项所述的方法，其中所述样品中存在的所述标记的浓度不超过1×10^-10M、不超过1×10^-11M、不超过1×10^-12M、不超过1×10^-13M、不超过1×10^-14M、不超过1×10^-15M、不超过1×10^-16M、不超过1×10^-17M、不超过1×10^-18M、不超过1×10^-19M、不超过1×10^-20M或不超过1×10^-21M。

实施方案221.一种诊断受试者的疾病的方法，其包括(i)在足以形成共结合物和疾病标记的复合物的条件下，将样品与如实施方案1至207中任一项所述的共结合物接触，其中所述共结合物特异性结合所述标记，和(ii)检测所述样品中的所述复合物。

实施方案222.如实施方案221所述的方法，其中通过测量与所述复合物缀合的标记试剂来检测所述复合物。

实施方案223.如实施方案221或222所述的方法，其中所述标记试剂是荧光分子、放射性同位素、金属离子、酶、生物素、聚合物或抗体。

实施方案224.如实施方案221至223中任一项所述的方法，其中所述样品是体液、组织或细胞。

实施方案225.如实施方案221至224中任一项所述的方法，其中所述样品是血液、骨髓、血浆、血清、尿液或脑脊液。

实施方案226.如实施方案221至225中任一项所述的方法，其中所述样品中存在的所述疾病标记的浓度不超过1×10^-10M、不超过1×10^-11M、不超过1×10^-12M、不超过1×10^{- 13}M、不超过1×10^-14M、不超过1×10^-15M、不超过1×10^-16M、不超过1×10^-17M、不超过1×10^{- 18}M、不超过1×10^-19M、不超过1×10^-20M或不超过1×10^-21M。

实施方案227.一种治疗受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如实施方案1至207中任一项所述的共结合物，其中所述疾病可通过活化或抑制所述靶分子来治疗。

实施方案228.一种组合文库，其包含：(i)第一抗体的第一可变区，其包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(ii)多个多肽接头；其中所述接头的C末端氨基酸与所述截短的第一可变区的N末端氨基酸连接。

实施方案229.一种组合文库，其包含：(i)第一抗体的多个第一可变区，其中每个所述第一可变区包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(ii)多个多肽接头；其中所述接头的C末端氨基酸与所述截短的第一可变区的N末端氨基酸连接。

实施方案230.一种组合文库，其包含：(i)多种抗体的多个第一可变区，其中每个所述第一可变区包含1至18个氨基酸的N末端截短；和(ii)多个多肽接头；其中所述接头的C末端氨基酸与所述截短的第一可变区的N末端氨基酸连接。

实施方案231.如实施方案228所述的组合文库，其中所述第一可变区是重链可变区。

实施方案232.如实施方案229或230所述的组合文库，其中所述第一可变区是重链可变区。

实施方案233.如实施方案228所述的组合文库，其中所述第一可变区是轻链可变区。

实施方案234.如实施方案229或230所述的组合文库，其中所述第一可变区是轻链可变区。

实施方案235.如实施方案229至234中任一项所述的组合文库，其中所述文库包含多至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个第一可变区。

实施方案236.如实施方案230至234中任一项所述的组合库，其中所述文库包含至少2、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1×10³、至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、至少1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰或至少1×10¹¹个第一可变区。

实施方案237.如实施方案228至236中任一项所述的组合文库，其中所述接头在所述接头的C末端包含1至18个随机氨基酸。

实施方案238.如实施方案228至237中任一项所述的组合库，其中所述文库包含至少2、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1×10³、至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、至少1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰或至少1×10¹¹个接头。

实施方案239.如实施方案228至238中任一项所述的组合文库，其还包含第二抗体的第二可变区，其中所述接头的N末端氨基酸与所述第二可变区的C末端氨基酸连接。

实施方案240.如实施方案228至238中任一项所述的组合文库，其还包含第二抗体的多个第二可变区，其中所述接头的N末端氨基酸与所述第二可变区的C末端氨基酸连接。

实施方案241.如实施方案228至238中任一项所述的组合文库，其还包含多种抗体的多个第二可变区，其中所述接头的N末端氨基酸与所述第二可变区的C末端氨基酸连接。

实施方案242.如实施方案239所述的组合文库，其中所述第二可变区是重链可变区。

实施方案243.如实施方案240或241所述的组合文库，其中所述第二可变区是重链可变区。

实施方案244.如实施方案239所述的组合文库，其中所述第二可变区是轻链可变区

实施方案245.如实施方案240或241所述的组合文库，其中所述第二可变区是轻链可变区。

实施方案246.如实施方案239至245中任一项所述的组合文库，其中(i)所述第一可变区和所述第二可变区结合同一靶上的不重叠表位，(ii)所述第一可变区和所述第二可变区不结合同一靶，(iii)所述第一可变区和所述第二可变区结合同一靶上的不重叠表位，或(iv)所述第一可变区和所述第二可变区不结合同一靶。

实施方案247.一种筛选与靶结合的共结合物的方法，其包括(i)获得如实施方案228至246中任一项所述的文库；和(ii)将来自步骤(i)的共结合物候选物文库与所述靶接触，以鉴定特异性结合所述靶的共结合物。

实施方案248.一种筛选与靶结合的共结合物的方法，其包括(i)表达编码如实施方案228至246中任一项所述的文库的表达载体文库；(ii)获得如实施方案228至246中任一项所述的文库；和(iii)将来自步骤(ii)的共结合物候选物文库与所述靶接触，以鉴定特异性结合所述靶的共结合物。

实施方案249.一种筛选与靶结合的共结合物的方法，其包括(i)表达编码如实施方案228至246中任一项所述的文库的表达载体文库；(ii)获得如实施方案228至246中任一项所述的文库；(iii)将来自步骤(ii)的共结合物候选物文库与所述靶接触，以在特异性结合所述靶的共结合物与所述靶之间形成复合物；(iv)富集特异性结合所述靶的共结合物与所述靶之间的复合物；和(v)鉴定特异性结合所述靶的共结合物和所述靶。

实施方案250.如实施方案247至249中任一项所述的方法，其中所述共结合物结合所述靶的K_D小于1×10^-8M、小于1×10^-9M、小于1×10^-10M、小于1×10^-11M、小于1×10^-12M、小于1×10^-13M、小于1×10^-14M、小于1×10^-15M、小于1×10^-16M、小于1×10^-17M或小于1×10^-18M。

实施方案251.如实施方案247至249中任一项所述的方法，其中所述共结合物结合所述靶的K_D为约1×10^-8M、约1×10^-9M、约1×10^-10M、约1×10^-11M、约1×10^-12M、约1×10^-13M、约1×10^-14M、约1×10^-15M、约1×10^-16M、约1×10^-17M或约1×10^-18M。

实施方案252.如实施方案247至251中任一项所述的方法，其中所述共结合物对所述靶的亲和力大于仅单个可变区的亲和力不小于50倍、不小于100倍、不小于150倍、不小于200倍、不小于250倍、不小于300倍、不小于350倍、不小于400倍、不小于450倍、不小于500倍、不小于600倍、不小于700倍、不小于800倍、不小于900倍、不小于1000倍、不小于1100倍、不小于1200倍、不小于1300倍、不小于1400倍、不小于1500倍、不小于1600倍、不小于1700倍、不小于1800倍、不小于1900倍、不小于2000倍、不小于3000倍、不小于4000倍、或不小于5000倍、或不小于10000倍。

某些表

本节提供了本文描述的某些冗长的表格。

表3：同种型Ig重链可变区的框架1区(FR1，框架区1)的序列。左栏中的描述含有数据库标识符，基于该标识符，可以获得免疫球蛋白

序列记录的全长序列，其以引用的方式整体并入本文中。

表4：同种型Ig卡帕(κ)轻链可变区的框架1区(FR1，框架区1)的序列。左栏中的描述含有数据库标识符，基于该标识符，可以获得免疫球蛋白序列记录的全长序列，其以引用的方式整体并入本文中。

表5：同种型Ig兰姆达(λ)轻链可变区的框架1区(FR1，框架区1)的序列。左栏中的描述含有数据库标识符，基于该标识符，可以获得免疫球蛋白序列记录的全长序列，其以引用的方式整体并入本文中。

实施例

本节中的实施例是作为本文教导的发明的说明来提供的，并不旨在限制本申请的公开内容。已经描述了许多实施方案。然而，应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，以下实施例旨在说明而非限制权利要求中所述的范围。

实施例1：共结合物中的亲和力和特异性增加

为了确定共结合物中的亲和力和特异性增加，共结合物的亲和力表示为K_D＝K_D1×K_D2×K’，其中K_D是共结合物的亲和力，K_D1、K_D2是两个单独结合部分的相应结合亲和力(即解离常数)，并且K’是将由两个结合物连接在一起的结合能损失引起的因子。因此，共结合物相对于个别单结合物的亲和力增加取决于K’。根据热力学定律，此类亲和力项可以转化为能量项。共结合物的结合自由能可以表示为：ΔG_CB＝ΔG_B1+ΔG_B2+ΔG′，其中ΔG_CB是共结合物的结合自由能，ΔG_B1和ΔG_B2是两个连接的单独结合部分的相应结合自由能，并且ΔG’是经由将两个结合物连接在一起而引起的结合能损失。在连接期间使共结合物的共结合物亲和力(K_D)最大化的目标是使结合能损失ΔG′最小化，或者是使接头相关的能量损失最小化，即，使K′因子最小化。

结合物的特异性表示为：SP＝K_D，NT/K_D，T，其中K_D，NT是对非靶分子的亲和力，并且K_D，T是对靶分子的亲和力。特异性被描述为非靶结合与靶结合的比率，所述比率是大于1的数。对于共结合物，对非靶和靶的结合亲和力可以进一步表示为：K_D，CB，NT＝K_D，B1，NT·K_D，B2，NT·K′_NT；和K_D，CB，T＝K_D，B1，T·K_D，B2，T·K′_T，其中K_D，CB是共结合物的亲和力，K_D，B1和K_D，B2是两个连接的单个结合部分的相应结合亲和力(即解离常数)，K’是将两个结合物连接在一起的亲和力损失因子，T表示靶，并且NT表示非靶。共结合物的特异性则可以表示为：SP_CB＝SP_B1·SP_B2·(K′_NT/K′_T)。对于靶和同源非靶，由于结构相似，亲和力损失因子K_D，NT和K_D，T应该相似。因此，SP_CB≈SP_B1·SP_B2，它是单个结合部分特异性的乘积。基于这个等式，连接两个单结合物以形成共结合物导致特异性增加。

图3A-3D示出了可能发生能量损失的主要情况。在图3A中，即使没有接头，两个单结合物也可能干扰彼此的结合。这可能是由于结合部分的大小、两个表位的相对位置和/或方向等。在图3B中，一个或多个部分的结合可能被具有不适当长度和/或刚性的接头破坏。在图3C中，过长的接头长度可能会增加系统的熵。在图3D中，接头可以侵入和/或干扰一个或两个结合部分的结合。本公开为这些和其他情况提供了解决方案。

为了证实如本文教导的结合亲和力和特异性的改善，选择两种抗EGFR VHH作为单结合物作为示例性证明。7D12和9G8是先前从美洲驼免疫中发现的，并显示出对肿瘤生长的抑制活性(Roovers，Laeremans等人Cancer Immunol Immunother 56(3)：303-317；Roovers，Vosjan等人Int J Cancer.2011年10月15日；129(8):2013-24)。从它们与EGFR的共晶体结构来看，这两个VHH的结合表位彼此并不重叠(PDB代码4KRM和4KRP)，因此所述研究可以集中在所述连接对结合亲和力和特异性增加的影响上(图3E)(Schmitz,Bagchi等人Structure 21(7):1214-1224)。

通过在7D12的C末端与9G8的N末端之间插入柔性(GGGS)₄接头(称为7D12-GS-9G8或7D12-(GGGS)4-9G8)来产生共结合物7D12-GS-9G8。关于7D12和9G8的信息可以分别在<https://www.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/4krm/protein/2>和<https://www.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/4krp/protein/2>处找到。对共结合物进行克隆、表达和纯化，并通过Biacore测定其对人和小鼠EGFR的结合亲和力，如下表12所示。共结合物对人EGFR的亲和力(K_D)为0.4pM，相对于单结合物7D12(KD，0.5nM)或9G8(KD，1.1nM)改善超过1000倍。人EGFR的K’因子是727,000。相反，同一共结合物对小鼠EGFR的亲和力为(K_D)120nM，其弱于两种单结合物中较强的9G8。小鼠EGFR的K’因子是570,000。因此，该结果表明，如果接头相关的能量损失小于用额外结合物获得的结合能，则共结合物确实可以实现协同的共结合，从而改善亲和力，如在人EGFR的情况下。然而，如果能量损失大于用额外结合物获得的结合能，可能会有结合亲和力的净损失，如在小鼠EGFR的情况下。共结合物的特异性与7D12和9G8的特异性的倍增大致相同。当使用较低特异性结合物9G8进行比较时，特异性改善超过10,000倍。如果考虑人EGFR作为靶并考虑小鼠EGFR作为同源非靶，KD,NT和KD,T如上一段所示是相似的，这导致7D12-GS-9G8的共结合物特异性接近于7D12和9G8的特异性的乘积。因此，该结果表明，除了亲和力增加之外，共结合物确实也可以具有改善的特异性。

还在37℃下对野生型人EGFR和含有L325A和S340A双重取代的突变型人EGFR进行Biacore测量(表13)。温度越高导致动力学越快，但是对于相同共结合物和单结合物的亲和力更弱。对于野生型和突变型EGFR，共结合物显示出比单结合物更强的亲和力。野生型的K’因子被测量为130,000，并且突变型被测量为185,000。这里，野生型和突变型的K’因子也彼此相似，因为两者之间仅2个突变。共结合物对野生型的特异性是突变型EGFR的288倍，其接近7D12和9G8的特异性的乘积。该结果再次证明通过形成共结合物得到的亲和力和特异性增加。

表12.在25℃下通过SPR测量的游离7D12、9G8和共结合物7D12-(GGGS)₄-9G8的动力学参数、K_D、K'和其对人和小鼠EGFR-Fc的特异性。

表13.在37℃下通过Biacore测量的7D12、9G8和共结合物

7D12-GS-9G8的动力学参数、K_D、K'和其对人和突变型EGFR

(L325V、S340A)的特异性。

实施例2：影响共结合物中接头相关的能量损失的因子(K’)

有趣的是，观察到尽管7D12-GS-9G8与小鼠EGFR的结合强于7D12，但比9G8弱4倍(表12)。在这种情况下，将两种结合物连接在一起导致9G8的非最佳结合，这通过形成共结合物来显著抵消结合亲和力增加。

首先详细研究7D12和9G8的晶体结构，并且发现它们的N末端与EGFR蛋白表面紧密接触。9G8中第一残基的Cα原子到EGFR的最短距离为而7D12的最短距离为在这两种情况下，第一氨基酸与抗原EGFR直接接触。因此，在它们的N末端添加接头可能会削弱结合。为了研究失去亲和力的来源是否是接头，我们生成7D12和9G8变体，其具有通过(GGGS)₄接头附接至其N末端的抗人溶菌酶VHH HuL6。关于HuL6的信息可以在<https://www.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/1op9/protein/1>处找到。尽管接头被认为是柔性的，但HuL6-GS-7D12和HuL6-GS-9G8都显示出结合亲和力的显著损失。与游离VHH相比，N末端接头附接导致人EGFR的KD分别降低26倍和15倍(表14)。具有相反方向的构建体7D12-GS-HuL6显示出与游离7D12相似的结合亲和力，表明亲和力损失不是由于HuL6的任何干扰，而是源于其N末端处的接头。

表14.在25℃下如通过Biacore测量的游离7D12、9G8(作为个别单结合物)及其HuL6连接变体的结合亲和力。

在共结合物7D12-GS-9G8的情况下，由于小鼠EGFR结合比人EGFR结合弱得多，接头相关的亲和力损失变得更可辨别(表12和15)。与HuL6融合的构建体相似，该共结合物构建体中的9G8也因接头附接而丧失亲和力，这导致亲和力比单独的9G8弱。此外，还构建了反向共结合物9G8-GS-7D12，并测量了其对小鼠EGFR的亲和力(表15)。结合亲和力比单独的9G8弱2倍。在7D12作为第二结合物设置的这种情况下，其对结合的贡献可忽略不计，也可能是由于接头受损的结合，这与在HuL6-GS-7D12测量中看到的亲和力损失一致。

表15.在25℃下通过Biacore进行单结合物7D12、9G8和共结合物与人和小鼠EGFR的结合测量

构建体	KD(muEGFR(小鼠EGFR),M)
		7D12	7.2x10-6
9G8	2.9x10-8
		7D12-GS-9G8	1.6x10-7
9G8-GS-7D12	5.8x10-8

实施例3：用于限制共结合物中的能量(因此亲和力)损失(K’)的策略

探索了可以使接头相关的能量损失最小化(即使K’因子最小化)的各种接头设计，使得较低亲和力的结合物可以用于共结合物形成，并且仍获得最大亲和力增益。

为了解决接头邻近干扰的问题，本文设计了三种策略来解决接头相关的能量损失，其核心思想是将N末端接头附接点物理移动远离抗原结合界面。为了实现这一点，可以从通过N末端连接的结合物的N末端修剪氨基酸(图4A)；或者可以插入氨基酸基序，将产生结构元件，诸如发夹，将N末端从抗原结合界面移开；或者可以将两种前述策略组合，修剪原始结合氨基酸序列的一部分并插入氨基酸基序。

创建一系列HuL6-7D12和HuL6-9G8构建体，其具有在第二结合物的N末端处截短的1至15个残基。蛋白质由酵母分泌菌株表达，纯化，并然后通过SDS-PAGE分析(图4B和4C)。所有含有截短的共结合物的迁移率与未截短的共结合物相似，表明产生的蛋白质是完整的。

重要的是强调，在上述策略中，从结合物的N末端修剪的氨基酸的确切数目或插入基序的确切氨基酸序列不需要事先已知。相反，人们可以利用用于使接头附接点工程化的所述策略来创建解决方案的组合文库，其中最成功的结合物可以使用文库筛选方法诸如噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或相当方法来选择。这并不排除在同一类抗体支架内或在许多或所有类别的抗体支架中产生通用的、工程化的接头附接点的可能性。

为了进一步研究接头相关的亲和力损失，详细检查了7D12和9G8的晶体结构。发现7D12和9G8的N末端都非常靠近EGFR蛋白表面(图3E)。9G8中第一残基的Cα原子与EGFR的距离为而7D12的距离为类似于一个氨基酸的长度，没有留下自由连接接头肽的空间。因此，预期在它们的N末端添加接头会导致结合干扰和亲和力丧失。

在理解亲和力损失来源是接头邻近抗原的情况下，设计从第二结合物的N末端开始的截短，将接头锚定点移动远离抗原表面。

在第二结合物N末端的截短之上，可以在截短的第二结合物之前插入氨基酸基序，这将引入结构柔性，诸如甘氨酸残基，或者产生结构元件，诸如发夹，其将N末端从抗原表面移开。

为了证明这些策略可用于使接头相关的亲和力损失最小化，构建了相同的HuL6-融合物和第二结合物N末端修饰的共结合物，并比较了它们与未修饰构建体的亲和力。对于在第二位置处被修饰的每个单结合物，在与(GGGS)4接头的C末端连接之前，剪下第一残基并与Phe/Thr/Gly基序连接。对于7D12，与未修饰的HuL6-GS-7D12相比，修饰的HuL6融合物HuL6-GS-FTG-[-1AA]7D12具有7倍增加的结合亲和力(表16)。对于9G8，相对于HuL6-GS-9G8，修饰的HuL6融合物HuL6-GS-FTG-[-1AA]9G8具有31倍的改善(表16)。在共结合物的情况下，与未修饰的参考7D12-GS-9G8相比，N末端修饰的构建体7D12-GS-FTG-[-1AA]9G8对小鼠EGFR的亲和力表现出133倍改善(表16)。

表16.在25℃下通过Biacore进行N末端修饰和未修饰的HuL6融合物和共结合物对人或小鼠EGFR的结合测量

实施例4：有助于能量损失(K’)减少的接头

为了证明由接头邻近干扰引起的能量损失和因此的K’可以被最小化，从而创建四个独特的共结合物文库，其包括第一VHH结合物，特别为HuL6(Dumoulin等人,ProteinSci.2002年3月；11(3):500-15)，随后是四个GGGS重复的接头，随后是三个完全随机化的氨基酸，并以第二VHH结合物结束，其为9G8或7D12，其中第二结合物的第一氨基酸未改变或被去除(图5)。

第一和第二单结合物具有有意不同的特异性。HuL6对人溶菌酶具有特异性，并且不与EGFR可检测地结合。在该实施例中，HuL6用作非功能性结合物，以突出7D12和9G8的EGFR结合的亲和力改善。四个所得文库，每个具有8000的多样性，进行常规酵母展示筛选(Chao等人,Nat Protoc 1(2):755-768(2006))。使用下一代测序法读取经工程化接头的DNA序列，并翻译成氨基酸序列，并对独特的序列进行计数。随后，通过将最后一轮选择中各个独特序列的计数除以前一轮的计数来计算序列富集因子。表17列出了每个文库和文库组合中最富集的前20个序列。

表17：来自抗EGFR VHH(9G8或7D12)N末端的前20个三氨基酸基序，具有或没有VHH的第一氨基酸，通过(GGGS)₄接头与抗溶菌酶VHH(HuL6)连接，在筛选中富集以改善与EGFR的结合。

由于工程化接头序列与抗原的邻近度，有可能无意改善结合，不是通过减少接头相关的能量损失，而是通过增加单个结合物的结合能，即进行结合物的亲和力成熟。为了限制这种可能性，搜索并鉴定了不同结合物中共有的序列，因为相同的序列不太可能将特异性传递给不同的表位(表17，第9-14列)。在比较两个或更多个文库的情况下，使用最低富集成员的富集值。对每个文库的前20个结合物的基序分析发现，某些氨基酸的重复频率高于随机预期。此外，当比较两个或更多个文库时也是如此，诸如在文库1和2 9G8和7D12含有保留第一氨基酸的结合物(图6A)，文库4和5 9G8和7D12含有去除第一氨基酸的结合物(图6A)的情况下，以及在所有文库组合的情况下(图6A)。这些发现表明，选择策略已确定了接头连接位点的有限数量的解决方案。

实施例5：根据用于降低能量损失(K’)的策略工程化的共结合物的性质

为了进一步验证所鉴定的解决方案转化为改善的亲和力，使用酵母展示和SPR测量所选克隆的解离常数(图6B)。这些测量清楚地表明，将功能性结合物(9G8和7D12)与非功能性结合物(HuL6)连接会导致结合能损失(比较图6B中的红色条和绿色条)。此外，如果结合物通过其远离其抗原结合区域的C末端连接，则不会导致K_D减弱(比较图6B中的绿色条和灰色条)。最后，通过选择发现的大多数解决方案导致结合改善，最佳解决方案完全消除了观察到的归因于接头邻近干扰的能量损失(比较图6B中黄色条与红色条和绿色条)。

实施例6：共结合物的接头文库的定向进化

为了进一步证明接头连接序列的工程化可用于减轻接头引起的能量损失，将两种抗EGFR VHH结合物(7D12和9G8)连接以产生共结合物。为了减轻负接头效应，应用了图4中描述的相同策略。简言之，在第二结合物的N末端，去除第一氨基酸并插入XXG随机化序列，其中X表示任何氨基酸并且G表示甘氨酸。该位置中甘氨酸的选择由图6A中未发现的该位置处的该氨基酸的偏好决定。此外，研究接头长度和刚性对共结合物亲和力的作用。为此，选择了四种不同的接头：两种α-螺旋形成基序EAAAK和E₄K₄重复序列、AP重复序列和G_3-4S重复序列。正如图3B中所指出的，刚性接头(即EAAAK、E₄K₄和AP重复序列)需要具有正确的长度以不干扰结合，为此设计跨越的不同接头长度。7D12 VHH C末端与同EGFR结合的9G8VHH N末端的距离为约α螺旋的螺距为每个氨基酸约并且AP重复接头每个氨基酸柔性接头的长度似乎不影响共结合物的回转半径(Klein等人Protein Eng DesSel.2014年10月；27(10):325-30)，因此G_3-4S重复柔性接头被设计成足够长，但长度多样性有限(即24-25个氨基酸)。此外，在第一VHH的C末端插入另外三个完全随机化的氨基酸，以研究C末端接头连接对共结合物亲和力的影响(图7A)。总共创建4个文库，每个文库6×10⁶-1×10⁷个成员：文库7-7D12-XXX-(EAAAK)_5-8-XXG[-AA]9G8、文库8-7D12-XXX-(E₄K₄)_5-6-XXG[-AA]9G8、文库9-7D12-XXX-(AP)_11-13-XXG[-AA]9G8和文库11-7D12-XXX-(G_3-4S)_6-5-XXG[-AA]9G8。

对所得文库进行常规酵母展示选择(Chao等人,Nat Protoc 1(2):755-768(2006))。通过3-4轮连续选择进行最强结合物的筛选，在随后的每轮中降低EGFR抗原浓度。使用下一代测序读取工程化接头的DNA序列。修剪DNA序列，将其翻译成氨基酸序列，并对独特的序列进行计数。通过将上一轮的单个独特序列的计数除以上一轮的计数来计算序列富集因子。

表18：来自抗EGFR VHH 7D12-9G8共结合物的N末端和C末端的前20个三氨基酸基序，通过EAAAK、E₄K₄、AP和G_3-4S重复序列连接，在选择中富集以改善与EGFR的结合。

在表18中，列出了每个文库中最富集的前20条序列。对于所有文库，从N末端和C末端连接位点(图7B)(关于接头的N末端和C末端)、接头长度(图7C)和接头组成(图8)的角度来看，发现了大量不同的解决方案。在C末端连接位点处没有观察到任何特定序列的明显富集。

实施例7：由接头和第二结合部分的N末端的工程化验证亲和力和特异性的改善

为了验证观察到的富集转化为改善的结合特性，选择7D12-9G8共结合物进行表达，并使用SPR测量其动力学特性。因为这些共结合物对人EGFR的亲和力已超过SPR的检测限，所以使用结合强度显著降低的EGFR小鼠同源物来代替进行亲和力测量(比较图8绿色条与图6B绿色条)。为了建立基线，测量了具有不同接头但没有N末端或C末端接头连接工程化的几种7D12-9G8共结合物的解离常数(图8，红色条)。缺乏N末端或C末端接头连接位点的共结合物没有改善抗体的亲和力，相反相对于两种单结合物中较强的结合物(9G8)，结合被削弱2-21倍。这种损失很可能是由两种单结合物的顺序造成的。在7D12-9G8对中，较强结合物9G8通过其N末端连接，这增加了接头干扰结合的可能性。为了确定这个问题是否可以通过接头连接位点工程化来解决，表达了从所有四个文库中随机挑选的几个解决方案(图8，橙色条)。大多数工程化解决方案导致结合改善，其中最好的两种7D12-FAS-(AP)₁₁-VGG-[-AA]9G8和7D12-ITA-(E4K4)₄-IGG-[-AA]9G8相对于适当的共结合物实现300-900倍改善，并且相对于两种单结合物中更强的结合物(9G8)实现40-50倍改善。为了进一步测试N末端和C末端工程化连接位点的作用，选择并测试在所有4个文库中重复出现的单个N末端序列-VSG[-AA](表18)，并且还测试在图6A中鉴定的FTG[-AA]序列(图8，黄色条)。这些N末端工程化的7D12-9G8共结合物(图8，黄色条)的表现与表现最好的随机挑选的N末端和C末端工程化的共结合物(图8，橙色条)相当。此外，VSG[-AA]共结合物之间的结合能增加是相似的，并且与所用接头无关。从共结合物中观察到不同类型和长度的接头，其显示出结合亲和力改善(表19)。为了进一步验证结果，通过工程化产生了结合亲和力降低的突变型人EGFR，其可以通过Biacore更准确地测量。同样，相同的接头设计实现了与小鼠EGFR相似的结合亲和力增强。作为改善的接头设计的另一个指标，可以测量K’因子，并且它们在工程化接头的情况下显著降低。这些发现突出了使接头连接位点(特别是对于接近抗原结合口袋的位点)工程化的重要性，因为接头干扰可能是连接的共结合物能量损失的唯一最大来源。结果表明，本文对于共结合物提供的接头序列和第二结合部分的N末端序列的工程化可以产生结合能的优异改善，极大降低K’因子，并因此产生结合亲和力和特异性的优异改善。

表19.显示出结合亲和力改善的共结合物所使用的接头。

实施例8：筛选方法

工作流

一般工作流如图9所绘制。单结合物文库SB0是包含单一结合部分的未选择文库。SB0中的序列多样性很高，至少为10⁵的数量级，但是预期大多数成员不会与目标靶结合。因此，SB0将首先经历靶结合的选择，这产生富含结合物的单结合物文库SB1。通过在随机配对的单结合物之间插入接头(L)文库，随后使用SB1构建共结合物文库(CB0)。然后进一步筛选CB0以产生高亲和力的共结合物库CB1。然后可以通过NGS对CB1文库中的共结合物进行测序，并且可以选择顶部富集的共结合物用于蛋白质产生并通过SPR进行亲和力测定。

单结合物和分选的文库

最初的单结合物文库SB0可以是VHH或与展示技术一起使用的任何蛋白质结合物，包括但不限于熟知的抗体和抗体片段，诸如Fab和Fd、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(sdAb)/重链抗体(HCAb)/V_HH、亲和体、affilin、affimer、affitin、α体、anticalin、亲合体、DARPin、叉头相关结构域、Fynomer、Kunitz结构域肽、单体(Adnectin)、微型抗体、nanoCLAMP、任何肽、肽模拟物、抗体模拟物或其他结合支架。展示技术也可以在核糖体展示、细菌展示、酵母表面展示、昆虫细胞表面展示、哺乳动物细胞表面展示等之间变化。用于构建各种SB0文库的一般方法可以在出版物中找到(Akamatsu等人,J Immunol Methods327:40-52(2007)；Chao等人,Nat Protoc 1(2):755-768(2006)；Daugherty,Cur OpinStruc Biol 17:474-480(2007)；Ernst等人,Nucleic Acids Res 26:1718-1723(1998)；Ho等人,Proc National Acad Sci 103:9637-9642(2006)；Zahnd等人,Nat Methods 4:269:279(2007))。作为实例，按照所述方案(Pardon等人,Nat Protoc 9:674-693(2014))，从来自原始美洲驼或用EGFR免疫的美洲驼的外周血单核细胞(PBMC)中分离RNA并提取VHH基因。通过将VHH基因克隆到酵母表面展示载体中来构建SB0文库(Wang等人,Protein Eng DesSel 18(7):337-343(2005))。用例如通过荧光活化细胞分选(FACS)分选的抗原和单结合物对诱导的SB0酵母展示文库进行染色，如图10A所示。

除了基于FACS的分选方法之外，还可以使用其他方法来分离结合物与非结合物。例如，可以通过直接缀合、疏水吸附或通过蛋白质(诸如生物素、蛋白质或肽标签等)上的修饰进行捕获，将靶蛋白质固定到固体表面，例如ELISA板中的塑料表面或磁珠表面。识别靶蛋白的文库成员将保持与固体表面结合，直到非结合成员被洗掉。然后可以从固体表面洗脱结合成员。也可以使用磁活化细胞分选(MACS)进行分离。使用这些方法，识别靶蛋白的结合物可以与其他非结合物分离。分离的群体富含结合物，并且仅具有一小部分SB0多样性。为了进一步丰富结合物并减少多样性，往往必需对分离的群体进行增殖，进行多轮选择。由于预期通过利用所选择的单结合物来发现高亲和力的共结合物，2-3轮选择可能是优选的，以产生合理多样性的SB1文库。表20示出来自免疫的VHH文库的前32种富集的人EGFR结合物。

表20：SB1 VHH酵母表面展示文库中最丰富的CDR3序列的频率。

共结合物文库

可以由单结合物文库SB1和接头文库L构建共结合物文库CB0。提取编码SB1中的结合成员的DNA序列，并将其分别扩增成第一单结合物(B1)和第二单结合物(B2)。B1与接头的N末端连接，并且B2与C末端连接。B1和B2可以共有相同的结合物序列库，但在与酵母表面展示载体重叠的区域中不同，所述区域用于插入共结合物基因。

可以合理地设计L序列的接头文库，以减少接头相关的能量损失，并使K’因子最小化。在接头文库构建的第一实例中，通过去除第二结合物(B2)的多个N末端残基来应用通过上述模型系统研究所了解的一部分设计规则。此外，在文库L中使用具有不同长度的刚性接头和柔性接头。对于柔性接头，氨基酸的数量范围为6至34，具有GGS、GGGS和GGGGS的组合，之后为2个随机化位置(表21)。对于刚性接头，长度在12和32之间变化(表21)。不同类型的富含脯氨酸的序列被用作构建块，包括XP和XPP基序。构建块中散布有两个连接结合物B1和结合物B2的随机残基。随机化限于确定的氨基酸子集，以限制文库CB0的序列多样性。

表21：用于构建文库L的接头序列。

表21(续)

**随机化位置的氨基酸代码

用于CB0文库富集的方法类似于用于SB0文库选择的方法，但是需要控制选择的严格性，使得可以将高亲和力的共结合物与较弱的共结合物区分开。可以采用几种方式来控制选择严格性。首先，作为实例，靶蛋白质的浓度可以如图10B所示变化。浓度越低，严格性越高。高亲和力结合物在高严格性下可以保持良好靶接合，但较弱的结合物则不能。其次，洗涤时间可以变化。在将文库成员与靶蛋白孵育后，需要洗去未结合的文库成员或蛋白质。洗涤时间越长，严格性越高。通常，较弱结合物可以在洗涤步骤期间从靶蛋白上解离，但高亲和力的结合物不会。第三，靶蛋白孵育的时间也可以变化。强结合物倾向于比弱结合物更快地结合靶。通过限制孵育时间，高亲和力结合物比低亲和力结合物得到更好富集。在3-4轮更严格的选择后，所得文库CB1将富含高亲和力的共结合物。

可以使用两种方法来确定CB1中哪些共结合物将被选择用于进一步分析。首先，可以随机挑选CB1文库中的克隆，并确定它们的序列(例如，以下表22)。可通过FACS分析所选共结合物的亲和力。此外，可以产生共结合物蛋白，并且可以通过SPR分析它们的结合亲和力(例如，以下表23)。替代地，可以对最后两轮CB1选择进行NGS分析，并且可以计算序列富集因子。将选择最富集的序列用于共结合物蛋白产生和SPR分析，以确定它们的亲和力。

筛选出的共结合物的性质

通过sanger测序对从CB1文库中挑选的共结合物克隆进行测序。每个共结合物序列含有N末端的单一结合结构域和C末端的不同结合结构域，它们通过由表21中所示的接头文库设计的接头序列连接。发现共结合物不是由包含相同CDR区的两个单一结合结构域形成，这表明高亲和力共结合物最有可能由靶向不同表位的单结合物形成。表22：文库CB1中富集的独特共结合物克隆的单结合物B1 CDR序列、接头序列和单结合物B2 CDR序列的所选序列。

将共结合物基因及其组分单结合物基因亚克隆到酵母表达载体中。表达并纯化共结合物蛋白和组分单结合物蛋白。使用纯化的结合物蛋白，使用表面等离子体共振方法测量每种共结合物和组分单结合物的结合亲和力(表23)。挑选的克隆的亲和力范围为0.09至12nM，而组分单结合物的亲和力范围较弱，并且更广泛地为1.2至990nM，这表明本文提供的共结合物筛选方法有效于产生具有协同结合的共结合物。例如，KD为1.2nM的共结合物3B7由KD在100nM范围内的两种单结合物组成，表示亲和力改善100倍。KD在100pM范围内的几种共结合物包括KD在10nM范围内的单结合物。因此，在此提供的筛选方法确实可以利用低亲和力单结合物来产生具有适用于治疗和诊断应用的亲和力和特异性的共结合物。同样令人感兴趣的是，知道那些组分单结合物并不以非常高的频率存在于单结合物库中。因此，具有最高亲和力的单结合物不一定是最适合产生共结合物的结合物。这与先前的观察结果一致，即连接两种高亲和力的单结合物不一定会产生亲和力极大改善的共结合物。

表23：从文库CB1富集的所选共结合物及其组分单结合物的亲和力表征。

总之，本文提供并验证了能够稳健、可扩展和可预测地产生具有协同共结合的共结合物的筛选方法。

由于筛选方法并入了使接头相关的能量损失最小化的接头设计，它可以利用靶向抗原中的表位扩展库的低亲和力(例如100nM)单结合物。因此，与首先搜寻高亲和力单结合物并然后用GS接头将它们连接在一起的传统方法相比，所述方法在发现协同共结合物方面具有出乎意料的和更高的成功率。

实施例9：共结合物应用

具有协同共结合的共结合物比其组分单个结合物(例如抗体可变结构域)具有更高的结合亲和力和特异性。因此，共结合物可用于任何可应用单结合物的应用，包括本领域技术人员已知的治疗、诊断和研究应用。

缀合蛋白质

共结合物可以通过连接蛋白质结构域、肽标签和额外半胱氨酸残基来修饰，或者通过用人工合成来携带特殊化学基团的那些氨基酸置换氨基酸来修饰。这些修饰的共结合物与化学分子诸如染料、酶、细胞毒性剂、毒素、放射性同位素、核酸等缀合。

活性测定

可以通过本领域已知的各种测定来表征共结合物的物理或化学性质和生物功能。

诊断和成像

可以使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法，将共结合物用于测定生物样品中的蛋白质水平。还可以通过测量生物流体诸如血清、脑脊液、尿液、唾液或其他体液中的一种或多种抗原来研究一种或多种目标抗原的过表达。特别是，协同共结合物可以在夹心免疫测定中成对使用，用于检测生物流体中的疾病标记。标记的协同共结合物也可用于医学成像，诸如正电子发射断层扫描(PET)和磁共振成像(MRI)。

治疗用途

具有协同共结合的共结合物可用于治疗应用。例如，它们可用于治疗癌症、过敏性或炎性疾病、眼病、神经退行性疾病等。共结合物可用于增强治疗靶向的特异性，以减少脱靶结合。这广泛适用于任何治疗，并且当使用有效的治疗剂诸如嵌合抗原受体T细胞或NK细胞和抗体药物缀合物时尤其有用。共结合物可进一步与额外功能性结合物组合，从而通过穿过血脑屏障增强治疗活性向脑中的递送。

在示例性研究中，两种抗EGFR共结合物显示出对肿瘤细胞中EGF诱导的信号传导的抑制作用。将A431细胞在无血清培养基中培养24小时，然后用药物处理1小时。然后用EGF刺激细胞15分钟。随后将刺激的细胞用冷PBS洗涤并裂解，随后进行蛋白质印迹实验以探测总和磷酸化EGFR分子。在图11中示出示例性结果。结果证实本文鉴定的抗EGFR的共结合物可以抑制EGFR信号传导。

治疗功效的增强

可以使用共结合物来增强治疗功效。例如，单结合物可发挥微弱但活跃的生物学功能，但不超过有效或特异性阈值。将它们与其他非活性单结合物组合以形成共结合物，可以增强结合亲和力和特异性以及生物学功能，从而越过有效和特异性阈值。

共结合物的协同效应的消除

共结合物的协同效应是通过连接两种单结合物产生的。这种增强的结合协同作用可以通过特异性降解共结合物的接头部分来消除。例如，接头可含有被内肽酶识别的序列基序。用内肽酶处理共结合物来裂解接头肽，并将强共结合物转变成两个较弱的单结合物。这种治疗可用于需要调节共结合物活性的情况，例如嵌合抗原受体疗法、成像等。

实施例10：寻找非重叠表位对

可以使用任何常规方法筛选蛋白质结合物(包括单个结合部分和共结合物)的非干扰对。图12A-12C示出了蛋白结合物的非干扰对的筛选的实例。简言之，通过表面等离子体共振以它们的同源抗原EGFR作为配体对三种EGFR结合物进行筛选。EGFR结合物一个接一个地流动，并观察传感图的信号变化。图12A-12B示出了非干扰性EGFR结合物的两个实例。即1E10与15E2形成一对(图12A)，并且7D12-9G8与15E2形成一对(图12B)。然而，7D12-9G8和1E10蛋白结合物不形成如图12C所示的对，因为当注入第二种EGFR结合物时没有检测到额外结合(没有额外响应信号)。

实施例11：在抗体中广泛观察到N末端邻近

通常，抗原结合片段的互补位，包括Fab的VHH和VH或VL，靠近这种抗原结合片段的N末端。将接头肽与这种抗原结合片段的N末端连接会由于接头干扰抗体的结合位点而导致能量损失。为了确定接头干扰表位-互补位相互作用的可能性，测量了抗体N末端到抗原表面的距离。从蛋白质数据库中挑选出VHH抗原复合物的133个独特结构和Fab及其同源抗原的60个结构。测量从VHH或Fab(包括VH和VL)的第一个Cα原子(N末端)到抗原表面上最近的非氢原子的距离并绘制其图(图13)。值得注意的是，约25％的VHH的N末端距离抗原小于这被认为是进行了接触。假设接头在连接至第2单结合物的N末端时可以进行紧密的β或γ转角，则进行所述转角需要最小半径为因此，N末端与抗原之间需要最小间隙来连接第2单结合物，而不会受到接头的干扰。然而，42％的VHH(133个中的56个)由于N末端到抗原的距离小于而有冲突的风险。根据相同的阈值，Fab中9％的重链和15％的轻链与它们的抗原如此接近。由于结构保守，这个问题可以推广到所有免疫球蛋白(Ig)折叠。Ig折叠是用于抗原受体的常见且非常保守的支架，包括来自脊椎动物的标准抗体(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY、IgW等)、骆驼科动物重链抗体的VHH结构域(HCAb)、软骨鱼类免疫球蛋白新抗原受体的V-NAR结构域(IgNAR)以及T细胞受体(TCR)。

实施例12：抗HIV p24共结合物的产生

通过使用实施例8中的筛选方法，发现高亲和力的抗HIV p24共结合物。简言之，构建了初始的和免疫的单结合物酵母表面展示文库SB0，并将其用于选择p24结合克隆。基于所选择的单结合物文库SB1，通过在B1与N末端截短的B2之间插入相同接头文库L(表21)来构建共结合物文库CB0。为了避免结合干扰并因此增强亲和力改善，在与接头序列连接之前，B2的零至三个N末端残基被缺失。对共结合物库CB0进行多轮分选以富集高亲和力结合物。挑选并表征表达抗p24共结合物的单个酵母克隆(表24)。

表24：通过Biacore测量的抗HIV p24共结合物序列及其结合动力学和亲和力。

实施例13：含有N末端截短的共结合物的亲和力改善

将抗HIV p24共结合物基因及其组分单结合物B1和B2亚克隆到酵母表达载体中。表达并纯化共结合物蛋白和组分单结合物蛋白。使用纯化的结合物蛋白，使用表面等离子体共振方法测量每种共结合物和组分单结合物的结合亲和力(表25)。总之，用N末端截短方法产生的共结合物显示出比单结合物极大改善的亲和力(图14)。组合的抗EGFR和抗HIVp24共结合物的中值为215pM，亲和力比组合的单结合物的中值(48nM)强200倍。

表25：通过Biacore对所选的抗HIV p24共结合物及其组分单结合物进行亲和力测量。

实施例14：经由筛选方法发现的高亲和力共结合物的其他实例

基于N末端截短的共结合物文库和筛选方法是普遍适用的。通过应用所述方法，为14种不同靶产生高亲和力的共结合物，所述靶包括EGFR和HIV p24靶、癌症生物标记、神经疾病生物标记、细胞因子和一对用于治疗神经退行性疾病的治疗靶(图15)。通过Biacore测量的，最强的共结合物对每个靶的中值亲和力为4pM。需要注意的是，由于仪器的限制，这些测量受限于10^-6s^-1的解离率限度。因此，实际的亲和力可能高于测量的亲和力。当与来自结构抗体数据库(doi:10.1093/nar/gkt1043)的中值抗体亲和力比较时，共结合物比来自数据库的常规非工程化抗体强1,350倍，这证明了通过N末端截短机制以及相关的筛选方法产生高亲和力共结合物的有效性。

Claims (62)

1.一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，

其中所述第二结合部分是包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)的第二抗体部分，

其中所述第一结合部分经由接头通过所述N末端截短的抗体可变区的N末端与所述第二结合部分连接。

2.如权利要求1所述的共结合物，其中所述共结合物与所述第二靶位点结合的亲和力是包含不具有所述N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物的亲和力的至少约3倍。

3.如权利要求1或权利要求2所述的共结合物，其中所述第一靶位点和所述第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。

4.如权利要求3所述的共结合物，其中共结合物与所述靶分子结合的亲和力是包含不具有所述N末端截短的抗体可变结构域的对照共结合物的亲和力的至少约3倍。

5.如权利要求1-4中任一项所述的共结合物，其中所述第一结合部分是第一抗体部分。

6.如权利要求5所述的共结合物，其中所述第一抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。

7.如权利要求5所述的共结合物，其中所述第一抗体部分是单结构域抗体。

8.如权利要求1-7中任一项所述的共结合物，其中所述第二抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。

9.如权利要求8所述的共结合物，其中所述N末端截短的抗体可变结构域是截短的VH或截短的VL结构域。

10.如权利要求1-7中任一项所述的共结合物，其中所述第二抗体部分是单结构域抗体。

11.如权利要求10所述的共结合物，其中所述N末端截短的抗体可变结构域是截短的V_HH结构域。

12.如权利要求5-11中任一项所述的共结合物，其中所述第一结合部分包含第一V_HH结构域；其中所述第二结合部分包含具有N末端截短的第二V_HH结构域(“截短的V_HH结构域”)，

其中所述第一V_HH结构域的C末端经由接头与所述第二V_HH结构域的N末端连接。

13.如权利要求1-12中任一项所述的共结合物，其中所述N末端截短的抗体可变结构域的N末端截短为约1至约25个氨基酸。

14.如权利要求13所述的共结合物，其中所述N末端截短的抗体可变结构域的N末端截短为1个氨基酸。

15.如权利要求1-14中任一项所述的共结合物，其中所述接头是肽接头。

16.如权利要求15所述的共结合物，其中与所述N末端截短的抗体可变结构域直接连接的所述肽接头的C末端氨基酸是G。

17.如权利要求15或16所述的共结合物，其中与所述N末端截短的抗体可变结构域直接连接的所述肽接头的C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，

其中X₁是V、L、W、P、S、G、K、D、F、M、T、N或R；

X₂是V、A、L、S、G、R、K、M、C、F、T、P或E；并且

X₃是G。

18.如权利要求15-17中任一项所述的共结合物，其中所述接头包含(G_xS_y)_n，其中x为1至5，y为0至5，并且n为1或更大。

19.如权利要求15-17中任一项所述的共结合物，其中所述接头包含[EAAAK]_n或[EEEEKKKK]_n，其中n为1或更大。

20.如权利要求15-17中任一项所述的共结合物，其中所述接头包含[AP]_n，其中n为1或更大。

21.如权利要求15-20中任一项所述的共结合物，其中所述接头长度不超过约40个氨基酸。

22.如权利要求1-21中任一项所述的共结合物，其中所述截短的可变结构域来自IgG、IgA、IgE、IgM或IgD类型中任一者的抗体可变结构域。

23.如权利要求1-22中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物还包含特异性识别第三靶位点的第三结合部分。

24.如权利要求23所述的共结合物，其中所述第三结合部分是第三抗体部分。

25.如权利要求24所述的共结合物，其中所述第三抗体部分包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)。

26.如权利要求25所述的共结合物，其中所述第三抗体部分经由接头通过所述第三抗体部分的N末端截短的抗体可变结构域的N末端与所述第二抗体部分连接。

27.如权利要求25所述的共结合物，其中所述第三抗体部分经由接头通过所述第三抗体部分的N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第四结合部分连接。

28.如权利要求1-27中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物是包含Fc区的抗体。

29.如权利要求1-27中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物是嵌合抗原受体(“CAR”)。

30.一种共结合物，其包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，

其中所述第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分；

其中所述第一结合部分经由肽接头通过所述抗体可变结构域的N末端与所述第二结合部分连接；

其中与所述第二结合部分的抗体可变结构域直接连接的所述肽接头的C末端三个氨基酸是X₁-X₂-X₃，

其中X₁是任何氨基酸；

X₂是K、R、Y、M、G或N；并且

X₃是R、G、Y或P。

31.如权利要求30所述的共结合物，其中所述共结合物与所述第二靶位点结合的亲和力是接头对照共结合物的亲和力的至少约3倍。

32.如权利要求30或权利要求31所述的共结合物，其中所述第一靶位点和所述第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。

33.如权利要求32所述的共结合物，其中共结合物与所述靶分子结合的亲和力是接头对照共结合物的亲和力的至少约3倍。

34.如权利要求30-33中任一项所述的共结合物，其中所述第一结合部分是第一抗体部分。

35.如权利要求34所述的共结合物，其中所述第一抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。

36.如权利要求34所述的共结合物，其中所述第一抗体部分是单结构域抗体。

37.如权利要求30-36中任一项所述的共结合物，其中所述第二抗体部分选自由以下各项组成的组：Fab、Fv、scFv、dsFv、Fab’或(Fab’)2片段。

38.如权利要求37所述的共结合物，其中所述抗体可变结构域是VH或VL结构域。

39.如权利要求30-36中任一项所述的共结合物，其中所述第二抗体部分是单结构域抗体。

40.如权利要求39所述的共结合物，其中所述抗体可变结构域是V_HH结构域。

41.如权利要求30-40中任一项所述的共结合物，其中所述第一结合部分包含第一V_HH结构域；其中所述第二结合部分包含第二V_HH结构域，

其中所述第一V_HH结构域的C末端经由所述肽接头与所述第二V_HH结构域的N末端连接。

42.如权利要求30-41中任一项所述的共结合物，其中所述接头包含(G_xS_y)_n，其中x为1至5，y为0至5，并且n为1或更大。

43.如权利要求30-41中任一项所述的共结合物，其中所述接头包括[EAAAK]_n或[EEEEKKKK]_n，其中n为1或更大。

44.如权利要求30-41中任一项所述的共结合物，其中所述接头包含[AP]_n，其中n为1或更大。

45.如权利要求30-44中任一项所述的共结合物，其中所述接头长度不超过约40个氨基酸。

46.如权利要求30-45中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物还包含特异性识别第三靶位点的第三结合部分。

47.如权利要求46所述的共结合物，其中所述第三结合部分是第三抗体部分。

48.如权利要求47所述的共结合物，其中所述第三抗体部分包含具有N末端截短的抗体可变结构域(“N末端截短的抗体可变结构域”)。

49.如权利要求48所述的共结合物，其中所述第三抗体部分经由接头通过所述第三抗体部分的N末端截短的抗体可变结构域的N末端与所述第二抗体部分连接。

50.如权利要求48所述的共结合物，其中所述第三抗体部分经由接头通过所述第三抗体部分的N末端截短的抗体可变结构域的N末端与第四结合部分连接。

51.如权利要求1-50中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物是包含Fc区的抗体。

52.如权利要求1-50中任一项所述的共结合物，其中所述共结合物是嵌合抗原受体(“CAR”)。

53.一种文库，其包含多个共结合物或编码多个共结合物的多个多核苷酸，每个共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二靶位点的第二结合部分，其中所述第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分，其中所述第一结合部分经由肽接头通过所述抗体可变结构域的N末端与所述第二结合部分连接，其中所述文库中至少两个共结合物在肽接头序列上彼此不同。

54.如权利要求53所述的文库，其中所述第一结合部分是包含抗体可变结构域的第一抗体部分。

55.如权利要求53或权利要求54所述的文库，其中所述第二结合部分的多样性为至少约20。

56.如权利要求55所述的文库，其中所述第一结合部分的多样性为至少约20。

57.如权利要求56所述的文库，其中所述文库的多样性为至少约4000。

58.如权利要求53-57中任一项所述的文库，其中所述抗体可变结构域具有N末端截短(“N末端截短的抗体可变结构域”)。

59.一种筛选以所需亲和力特异性结合至第二靶位点的共结合物的方法，所述方法包括：

(1)将如权利要求53-58中任一项所述的文库与包含所述第二靶位点的靶分子接触，以在特异性结合至所述靶分子的共结合物与所述靶分子之间形成复合物，和

(2)鉴定以所需亲和力结合至所述第二靶位点的共结合物。

60.一种筛选以所需亲和力特异性结合至靶分子的共结合物的方法，所述方法包括：

(1)使如权利要求53-58中任一项所述的文库与所述靶分子接触，以在特异性结合至所述靶分子的所述共结合物与所述靶分子之间形成复合物，和

(2)鉴定以所需亲和力结合至所述靶分子的共结合物。

61.一种增加与靶分子特异性结合的对照共结合物的结合亲和力的方法，其中所述对照共结合物包含特异性识别第一靶位点的第一结合部分和特异性识别第二结合靶位点的第二结合部分，其中所述第二结合部分是包含抗体可变结构域的第二抗体部分，其中所述第一结合部分经由接头通过所述抗体可变结构域的N末端与所述第二结合部分连接，其中所述对照共结合物包含全长抗体可变结构域，其中所述对照共结合物对所述第二靶位点的结合亲和力低于游离状态下第二抗体部分的亲和力，所述方法包括获得与所述对照共结合物相比在所述第二抗体部分的抗体可变区具有N末端截短的共结合物。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述第一靶位点和所述第二靶位点是靶分子上的非重叠结合位点。