CN117084936A - 多萜类化合物作为激肽释放酶抑制剂在化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多萜类化合物作为激肽释放酶抑制剂在化妆品中的应用，所述的多萜类化合物选自维生素K2、辅酶Q或类胡萝卜素。所述的多萜类化合物具有对激肽释放酶KLKs的抑制作用。所述的多萜类化合物作为小分子激肽释放酶抑制剂添加到化妆品中，能有效抑制激肽释放酶的活性，促进蛋白酶及其抑制剂的平衡，修复受损的皮肤屏障，从而保持皮肤屏障的动态平衡。

Description

多萜类化合物作为激肽释放酶抑制剂在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，特别是涉及多萜类化合物作为一种有效修复皮肤屏障的激肽释放酶靶向小分子抑制剂在化妆品中的应用。

背景技术

皮肤位于人体体表最外层，具有屏障、吸收、分泌、排泄、代谢、体温调节及感觉功能。其中，皮肤屏障(skin barrier)功能是基础。皮肤屏障一方面可保护皮肤不被外界不利因素入侵，另一方面可防止皮肤和机体内的水分、营养成分和电解质等物质的流失，帮助维持机体内环境的相对稳定。

皮肤屏障功能受损会引起皮肤干燥、抗氧化和抗辐射功能减弱，因而加重皮肤老化，造成特应性皮炎、湿疹、日光性皮炎、敏感、痤疮等。

皮肤的物理屏障主要由角质层相关结构以及紧密连接所构成，角质层位于皮肤最外层，形成“砖墙结构”，是皮肤屏障的主要组成部分，而紧密连接对于维持皮肤屏障的完整性也至关重要。角质形成细胞具有物理屏障作用，可减少机械性损伤及外界物质的入侵，同时其所含成分与结构是皮肤屏障的重要成分，包括丝聚合蛋白、角质化包膜、角质桥粒、蛋白酶、细胞间脂质等。

角质细胞不断从角质层表面脱落，对于维持角质层的稳态具有重要意义。角质细胞的脱落主要受激肽释放酶(kallikreins，KLKs)相关肽酶的调控，如KLK5、KLK7和KLK14等(Brattsand M,Stefansson K,Lundh C,et al.A proteolytic cascade of kallikreinsin the stratumcorneum[J].J Invest Dermatol,2005,124(1):198-203.)。KLKs属于丝氨酸蛋白酶家族，在颗粒层表达。KLKs可裂解角质桥粒，KLK5和KLK14具有胰蛋白酶活性，可裂解桥粒芯糖蛋白，KLK7具有糜蛋白酶活性，可裂解桥粒芯胶蛋白和角质桥粒蛋白。特别是，KLK5和KLK7与脱皮高度相关，能诱导炎症因子。其中KLK5可以降解角质桥粒、破坏角质层完整性，抑制板层小体释放、阻碍渗透屏障功能修复，还能诱导炎症因子表达，在皮肤病炎症反应中发挥了重要作用。

皮肤屏障的稳定依赖于颗粒层的角质形成细胞分化为角质细胞和皮肤表层角质细胞脱落(即脱屑)之间的平衡，皮肤的脱屑过程包括由(激肽释放酶)KLKs参与的桥粒的降解，由于桥粒是角质细胞的粘连蛋白，桥粒的降解则会导致角质细胞脱落而致皮肤脱屑。证据显示，局部或暂时性的KLKs活性控制的失调，是特应性皮炎病人皮肤屏障稳定缺失的主要原因之一。

在化妆品领域，韩丹等(修复皮肤屏障功能的方法及应用，用化学品科学，Jul.2020.VOL.43NO.7)围绕着皮肤屏障的构成及损伤因素等展开讨论，就脂质、天然保湿因子、保湿剂、活性成分、pH值等几方面对皮肤屏障修复提出了解决方案。该文献并未涉及或考虑到激肽释放酶KLKs的失调或异常表达引起的受损，因此可能影响其屏障修复的效果。目前，在皮肤护理的化妆品领域有关KLKs的抑制剂比较少见。

激肽释放酶参与调控心血管、肾脏、神经系统等的生理功能，与心脏病、肾病、炎症反应、癌症等疾病的发生有着密切关系。医药领域中有关激肽释放酶抑制剂，在心血管系统方面的研究进展较快。对于皮肤病的防治，CN201580005402.3公开了一种新的激肽释放酶7抑制剂，以及KLK7抑制剂用于皮肤病预防和治疗的用途。该抑制剂主要针对KLK7，而角质细胞的代谢主要受KLK5、KLK7、KLK14等相关蛋白酶的水解级联调节。针对皮肤特异性皮炎的预防和治疗，KLKs调节正成为发展的一个方向。

因此，在化妆品应用领域，开发对KLKs(KLK5、KLK7和KLK14)有活性的激肽释放酶小分子抑制剂对于皮肤屏障修复非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多萜类化合物作为激肽释放酶抑制剂在化妆品中的应用。

本发明发现，多萜类化合物中存在部分化合物具有对激肽释放酶KLKs的抑制作用，因此提供一种多萜类化合物作为激肽释放酶抑制剂在化妆品中的应用，其中所述的多萜类化合物选自维生素K2、辅酶Q或类胡萝卜素。

进一步地，所述的维生素K2选自维生素K2(MK-4)、维生素K2(MK-7)、维生素K2(MK-8)、DMK-7或DMK-8。

进一步地，所述的辅酶Q包括辅酶Q6、辅酶Q7、辅酶Q8、辅酶Q9、辅酶Q10。

进一步地，所述的类胡萝卜素选自番茄红素、β-胡萝卜素、角黄素、玉米黄素、虾青素、叶黄素、辣椒红素、链孢红素、花药黄质、隐黄质。

优选地，所述的多萜类化合物选自维生素K2(MK-7)或虾青素。

所述的多萜类化合物被证明对激肽释放酶KLK5、KLK7、KLK14，特别是KLK5的活性具有较高的靶向抑制率，作为一种小分子激肽释放酶抑制剂，对KLK5、KLK7、KLK14能同时抑制、调节其活性。

所述的多萜类化合物作为小分子激肽释放酶抑制剂添加到化妆品(乳液、膏霜等)中，能快速有效抑制激肽释放酶的活性，促进蛋白酶及其抑制剂的平衡，帮助角质细胞正常从角质层表面脱落，修复受损的皮肤屏障，从而保持皮肤屏障的动态平衡。

所述的多萜类化合物绿色安全，多来源于食品、药品或应用于食品、药品中，可以作为一种高度安全的皮肤屏障修复剂。典型的如维生素K2(MK-7)，该抑制剂性质温和、安全。

有益效果：本发明根据发现的选自维生素K2、辅酶Q或类胡萝卜素的多萜类化合物所具有的激肽释放酶KLKs的抑制作用，提供了的所述化合物作为激肽释放酶小分子抑制剂在化妆品中的用途，对激肽释放酶KLKs同时抑制、调节其活性，特别是对于KLK5具有显著的活性。用于化妆品中能快速有效抑制激肽释放酶的过度表达，促进蛋白酶及其抑制剂的平衡，长期使用具有淡化黑眼圈，减少红血丝，增加皮肤弹性，消除细小皱纹，减缓法令纹加深，对皮肤有紧致、抗衰、抗炎、修复屏障功能的功效。

附图说明

图1加入MK-7的激肽释放酶KLK5的酶活性曲线；

图2加入虾青素的激肽释放酶KLK5的酶活性曲线；

图3加入四氢嘧啶的激肽释放酶KLK5的酶活性曲线；

图4加入人参皂苷的激肽释放酶KLK5的酶活性曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明具有激肽释放酶KLKs的抑制作用的部分多萜类化合物，选自维生素K2、辅酶Q或类胡萝卜素，具体化合物如表1所示。这些多萜类化合物被证实对激肽释放酶KLKs具有抑制作用，而化妆品中大部分活性物质，如四氢嘧啶、人参、α-常春藤皂苷、七叶皂苷钠、黄芪、人参皂苷等则对激肽释放酶KLKs无抑制作用。

表1具有激肽释放酶抑制作用的多萜类化合物

以下实施例中，通过测定选自多萜类化合物的不同物质对激肽释放酶KLK5、KLK7和KLK14活性的靶向抑制率，以期筛选出可用于化妆品中的安全高效的激肽释放酶小分子抑制剂。

结果表明，表1中的多萜类化合物作不小分子抑制剂对KLK5、KLK7、KLK14同时能抑制、调节。其中维生素K2(MK-7)、虾青素性质温和、安全，且对激肽释放酶KLKs抑制效果更为显著。

以下实施例中以维生素K2(MK-7)、虾青素和激肽释放酶KLK5为例，说明本发明中的多萜类化合物对其活性的抑制作用。

实施例中，KLK5蛋白酶活性检测的方法如下：

(1)材料：

Recombinant Human Kallikrein 5Protein,购买于R&D system,Catalog#:1108-SE；

Boc-VPR-AMC Fluorogenic Peptide Substrate，购买于R&D system,Catalog#:ES011，原液10mM stock in DMSO(避光保存)

分析液：0.1M NaH₂PO₄，pH 8.0

96孔板：Nunc,Catalog，475515

(2)实验方法：

1.分装的底物为10mM，10ul每管；

2.将分装好的底物10ul稀释为1mL，100uM；

3.KLK5分装0.1ug/每管，10ul每管，每管配置成200ul，每孔加10ul，即每孔0.05ug；

4.96孔板配制体系：添加一定浓度体积的测试液、酶、底物；

5.酶标仪上380nm到460nm，读数；

6.实验结果分析。

实施例1

维生素K2(MK-7)(以下简记为MK-7)对激肽释放酶KLK5(简记为KLK5)的抑制作用，通过KLK5中加入MK-7后，KLK5蛋白酶活性的变化来表示。实验方法如上，样品分为组A到组F的6个组，组A只包含KLK5，为空白对照组，组B到组F除KLK5与组A相同外，加入分别为50uM、40uM、25.6uM、12.8uM、6.4uM的MK-7。每组设置2个样品，将测试样品、底物分别加入96孔板中与KLK5进行反应，每45秒取样一次，用酶标仪测定酶活性，两个平行样品测得结果进行平均。

活性曲线如图1所示，图中从上到下分别是组A、组F、组E、组D、组C和组B的活性曲线。每隔3min采样得到的部分数据如表2所示。

表2

时间(min)	组A	组B	组C	组D	组E	组F
							0	4300	790	1095	1273	2108	2989
3	8946	1186	1944	2420	4232	6346
							6	13992	1710	2774	3392	6767	10049
9	19353	2211	3697	4674	9757	14230
							12	24704	2752	4672	5953	12573	19539
15	30091	3211	5438	6962	14594	23005
							18	34110	3556	6179	8015	16311	25895
21	37971	3786	6638	8675	17675	28442
							24	41397	3911	7024	9332	18811	30086
27	43681	4079	7585	9790	20115	31683
							30	46136	4210	7769	10222	20893	33191
33	48292	4273	8014	10459	21445	34096
							36	49911	4378	8146	10825	22072	34839
40	52084	4504	8437	11081	22709	36750

由图可见，组A中KLK5酶活性最高(曲线在最上端)，加入6.4uM的MK-7已对酶活性有明显的抑制作用。随着加入MK-7的浓度的增加，对KLK5酶活性产生更强烈的抑制作用，组C和组B中KLK5酶活性受到很强抑制。经计算，其IC50＝11.78uM。

实施例2

按照与实施例1相同的方法测定虾青素对KLK5的抑制作用。样品分为组A到组G的7个组，组A只包含KLK5，为空白对照组，组B到组G除KLK5与组A相同外，加入分别为50uM、25uM、12.5uM、6.25uM、3.125uM、1.562uM的虾青素。每组设置2个样品，将测试样品、底物分别加入96孔板中与KLK5进行反应，每45秒取样一次，用酶标仪测定酶活性，两个平行样品测得结果进行平均。

活性曲线如图2所示，图中从上到下分别是组A、组G、组F、组E、组D、组C和组B的活性曲线。每隔3min采样得到的部分数据如表3所示。

表3

由图可见，组A中KLK5酶活性最高(曲线在最上端)，加入1.562uM的虾青素已对酶活性有明显的抑制作用。随着加入虾青素的浓度的增加，对KLK5酶活性产生更强烈的抑制作用，组C和组B中KLK5酶活性受到很强抑制。经计算，其IC50＝28.78uM。

对比例1

按照与实施例1相同的方法测定四氢嘧啶(依克多因)对KLK5的抑制作用。样品分为组A到组F的6个组，组A只包含KLK5，为空白对照组，组B到组F除KLK5与组A相同外，加入分别为5mM、500uM、50uM、5uM、0.5uM的四氢嘧啶。每45秒取样一次，测定酶活性。活性曲线如图3所示，图中从上到下分别是组B、组E、组A、组D、组C和组F的活性曲线。

由KLK5蛋白酶活性的变化的图3可见，四氢嘧啶(依克多因)对KLK5完全没有抑制作用。

对比例2

按照与实施例1相同的方法测定人参皂苷对KLK5的抑制作用。样品分为组A到组D的4个组，组A只包含KLK5，为空白对照组，组B到组D除KLK5与组A相同外，加入分别为10uM、100nM、1nM的人参皂苷。每45秒取样一次，测定酶活性。活性曲线如图4所示，图中从上到下分别是组B、组C、组D和组A的活性曲线。

由KLK5蛋白酶活性的变化的图4可见，人参皂苷对KLK5完全没有抑制作用。

实施例3

所述的MK-7作为小分子激肽释放酶抑制剂添加乳液中，配方如表4，该乳液能快速有效抑制激肽释放酶的过度表达，促进蛋白酶及其抑制剂的平衡，修复受损的皮肤屏障。

表4乳液1

实施例4

虾青素作为小分子激肽释放酶抑制剂添加乳液中，配方如表5，该乳液具有修复受损的皮肤屏障的功能。

表5乳液2

Claims (5)

1.多萜类化合物作为激肽释放酶抑制剂在化妆品中的应用，其中所述的多萜类化合物选自维生素K2、辅酶Q或类胡萝卜素。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的维生素K2选自维生素K2(MK-4)、维生素K2(MK-7)、维生素K2(MK-8)、DMK-7或DMK-8。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的辅酶Q为辅酶Q6、辅酶Q7、辅酶Q8、辅酶Q9或辅酶Q10。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的类胡萝卜素选自番茄红素、β-胡萝卜素、角黄素、玉米黄素、虾青素、叶黄素、辣椒红素、链孢红素、花药黄质或隐黄质。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多萜类化合物选自维生素K2(MK-7)或虾青素。