CN117084238A - 一种山羊精子生物膜保护剂及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山羊精子生物膜保护剂及其应用方法，山羊精子生物膜保护剂包括以下组分：0.036g/ml Tris、0.01g/ml葡萄糖、0.02g/ml柠檬酸、体积分数6%甘油、体积分数1%青链霉素合剂、20μg/ml过氧化物酶‑6、10‑30μg/ml谷胱甘肽过氧化物酶5及超纯水。本发明可以抵抗精子生物膜在冷冻恢复过程中受到的氧化损伤，使精子发挥正常的生理功能。采用本发明保存精液较用常规稀释液，在同等条件下，精子质膜完整性提高27.63%，顶体膜完整性提高15.3%，线粒体膜电位提高47.2%。本发明的山羊精子生物膜保护剂能充分提高种公羊的利用率，有利于开展家畜改良育种工作。

Description

一种山羊精子生物膜保护剂及其应用方法

技术领域

本发明涉及山羊精液保存液技术领域，具体涉及一种山羊精子生物膜保护剂及其应用方法。

背景技术

现代养羊业向集约化、规模化发展，优秀种公畜的缺乏成为羊生产的重要限制。精液冷冻保存技术能够长期保存精子，是提高优秀种质资源利用率主要措施之一，为生产带来更高的经济价值。

生物膜结构的完整性对精子十分重要，它关乎着精子的细胞间通讯、代谢、精卵融合和调节性死亡等。在精液冷冻恢复过程中，精子会受到活性氧诱导的氧化损伤，造成精子生物膜结构（包括质膜、顶体膜和线粒体膜）不可逆的损害。精子生物膜含有大量的多不饱和脂肪酸，极易受到活性氧的攻击，由于精子缺乏胞质抗氧化剂，并且精子高度致密的染色质无法产生基因组抗氧化反应，故研究一种保护精子生物膜结构完整性的保护剂成为必然。

目前，关于精子的稀释液、保护剂的研究，大多是与精子的活力、营养物质需求、抗菌和渗透压等相关，而针对精子生物膜结构完整性的保护剂研究至今未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种山羊精子生物膜保护剂，旨在抵抗羊精子质膜、顶体膜和线粒体膜在冷冻恢复过程中造成的氧化损伤。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种山羊精子生物膜保护剂，包括以下组分：0.036g/ml Tris（三羟甲基氨基甲烷）、0.01g/ml葡萄糖、0.02g/ml柠檬酸、体积分数6%甘油、体积分数1%青链霉素合剂、20μg/ml过氧化物酶-6、10-30μg/ml谷胱甘肽过氧化物酶5及超纯水。

所述谷胱甘肽过氧化物酶5含有20μg/ml。

本发明的另一目的在于提供一种山羊精子生物膜保护剂的应用方法，包括如下步骤：

1）配制保护剂：0.036g/ml Tris、0.01g/ml葡萄糖、0.02g/ml柠檬酸、体积分数6%甘油、体积分数1%青链霉素合剂、20μg/ml过氧化物酶-6、10-30μg/ml谷胱甘肽过氧化物酶5，依次加入超纯水中溶解，并定容，配制成山羊精子生物膜保护剂，通过针头式过滤器转移到试剂瓶中密封，4℃储存；

2）精液采集：采用假阴道采集法，全程无菌操作，完成采精后，马上竖立假阴道，避免精液倒流，将采集的新鲜精液进行 37℃保温，并送至实验室；

3）精液稀释：取按无菌操作要求采集的精液，鲜精活力达到 75%以上，快速直线运动在50%以上的精液供使用；取山羊精子生物膜保护剂，使山羊精子生物膜保护剂升温至37℃，将精液加入到山羊精子生物膜保护剂中，按照精液与山羊精子生物膜保护剂体积比1：10稀释，稀释后混匀；

4）精液冷冻：在4℃恒温冰箱中降温2h，降温后，将精液装入0.25ml细管中，在平衡1h后，移到距离液氮面4cm处，熏蒸7min后，迅速投入到液氮中，进行冷冻保存；

5）精液解冻：从液氮中取出冷冻细管后，投入到37℃水浴锅中，解冻30s，待使用。

本发明的有益效果是：本发明可以抵抗精子生物膜在冷冻恢复过程中受到的氧化损伤，使精子发挥正常的生理功能。采用本发明保存精液较用常规稀释液，在同等条件下，精子质膜完整性提高27.6%，顶体膜完整性提高15.3%，线粒体膜电位提高47.2%。本发明的山羊精子生物膜保护剂能充分提高种公羊的利用率，有利于开展家畜改良育种工作。

附图说明

图1为山羊精子生物膜保护剂对精子质膜完整性的影响；

图2为山羊精子生物膜保护剂对精子顶体膜完整性的影响；

图3为山羊精子生物膜保护剂对线粒体膜电位的影响。

实施方式

下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。

实施例 山羊精子生物膜保护剂在绒山羊精液冷冻恢复过程中对精子生物膜结构的影响

试验动物

本试验所用绒山羊精液来自内蒙古金莱牧业科技有限责任公司，选用2岁成年公羊4只，要求身体健康、无疾病、饲养管理统一。

试验方法

1）保护剂配制：

对照组：取Tris1.8g、葡糖糖0.5g、柠檬酸1g、甘油3ml、青链霉素合剂0.5ml，用超纯水分别溶解，并定容至50ml，通过0.22 μm滤器转移到试剂瓶中密封，4℃冰箱中储存，一周内使用。

实验组1：取Tris1.8g、葡糖糖0.5g、柠檬酸1g、甘油3ml、青链霉素合剂0.5ml、过氧化物酶-6 0.5mg和谷胱甘肽过氧化物酶0.5mg，用超纯水分别溶解，并定容至50ml，通过0.22 μm滤器转移到试剂瓶中密封，4℃冰箱中储存，一周内使用。

实验组2：取Tris1.8g、葡糖糖0.5g、柠檬酸1g、甘油3ml、青链霉素合剂0.5ml、过氧化物酶-6 1mg和谷胱甘肽过氧化物酶0.5mg，用超纯水分别溶解，并定容至50ml，通过0.22μm滤器转移到试剂瓶中密封，4℃冰箱中储存，一周内使用。

实验组3：取Tris1.8g、葡糖糖0.5g、柠檬酸1g、甘油3ml、青链霉素合剂0.5ml、过氧化物酶-6 1.5mg和谷胱甘肽过氧化物酶0.5mg，用超纯水分别溶解，并定容至50ml，通过0.22 μm滤器转移到试剂瓶中密封，4℃冰箱中储存，一周内使用。

2）精液采集：采用假阴道采精法，两天采精一次，以长柄镊子夹取75%酒精棉球涂擦假阴道内胎进行消毒，然后用灭菌生理盐水涂擦2-3次，用经灭菌的Tris-柠檬酸-葡萄糖基础液冲洗假阴道内胎，自然风干假阴道内残留液体。在假阴道外壳的注水孔注入占假阴道夹层腔体积2/3左右的热水，水温一般为45-50℃，用胶塞塞住注水口。注水量应因畜种和个体的不同而异，用温度计测量内胎温度，保持在38-40℃。用灭菌的玻璃棒蘸取灭菌的润滑剂（医用凡士林）涂至假阴道前段1/3-1/2处，以润滑其内腔。将经高压灭菌烘干的集精杯插入未涂抹凡士林的另一端，根据集精杯插入深度调节假阴道内腔压力。采精时，采精者在采精台的右后方。当公畜爬跨时，迅速将阴茎导入假阴道。完成采精后，马上竖立假阴道，避免精液倒流，将采集的新鲜精液进行 37℃保温处理，并送至实验室处理。鲜精品质检测和处理。吸取5μl新鲜精液经Tris-柠檬酸-葡萄糖基础液稀释，取5μl稀释后精液于载玻片上，盖玻片压片，利用计算机辅助精液分析系统检测至少5个视野，检测系统至少捕捉1000个精子细胞。鲜精活力达到75%以上，快速直线运动精子在50%以上的精液样品用于后续试验。

3）精子冷冻与解冻：将新鲜绒山羊精液和保护剂在37℃下稀释，调整精子密度为2×10⁸个/ml，将稀释后的精液放置37℃水浴中，置于4℃冰柜中进行降温平衡3h，待水浴温度降为5℃后，用移液器吸取200μl至0.25ml冻精细管中，封口粉封口，等距放置在冷冻架上，在距离液氮液面上方4cm处液氮熏蒸7min后，投入液氮储存。冷冻后精液在三天后进行水浴解冻，水浴温度37℃解冻30s。

4）质膜完整性检测：利用低渗透肿胀试验检测质膜完整率。首先从各实验组中抽取20μl的精液，分别与200μl低渗溶液(0.49g柠檬酸钠和0.9g果糖定容在100ml蒸馏水中)混合，充分摇匀后，在37℃的培养箱中孵育30min，使用光学显微镜观察，随机选取5个视野，每个视野中精子数量在200以上，统计尾部卷曲精子数量占总精子数量的比例。

低渗透肿胀试验检测质膜完整率结果所示（参见图1），实验组1、实验组2和实验组3的精子质膜完整率都显著高于对照组(P＜0.05)，实验组2的精子质膜完整率最高，为72.05%，而对照组为44.42%，提高了27.6%。

5）顶体膜完整性检测：利用花生凝集素荧光标记(PNA-FITC)检测试剂盒，流式细胞仪进行检测。将解冻后的精液在37℃的条件下孵育30min，600g离心5min去上清液，加入GENMED保存液调整精子浓度为2×10⁷个精子/ml，抽取100μl悬液，加入500μl的GENMED清理液混匀精子，离心取上清(同上述离心方法)，然后加入200μl的GENMED染色液B，混匀精子群，室温避光孵育20min后，离心去上清(同上述离心方法)，在加入200μl的自备碘化丙啶(0.4μl /mg)，室温避光5min，离心取上清(同上述离心方法)后，加入1ml的GENMED清理液，最后流式细胞仪进行检测。

流式细胞仪检测精子顶体膜完整率结果所示（参见图2），实验组1和实验组2的精子顶体膜完整率显著高于实验组3和对照组(P＜0.05)，实验组1顶体完整率为77.30%，实验组2的精子顶体膜完整率为80.27%，而对照组为64.97%，实验组2较对照组顶体膜完整性提高15.3%。

6）线粒体膜电位检测：利用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)，流式细胞仪进行检测。精液解冻之后，取1×10⁶个精子，加入0.5ml PBS，再加入0.5ml的JC-1染色工作液，颠倒数次混匀，在37℃条件下孵育20min，孵育结束后，600g离心5分钟弃上清，然后加入1ml的JC-1染色缓冲液(1x)重悬精子，离心弃上清(同上述离心方法)，在重复一次上述操作，最后加入500μl的 JC-1染色缓冲液(1x)，重悬精子后，用流式细胞仪进行检测。

流式细胞仪检测线粒体膜电位结果所示（参见图3），实验组1、实验组2和实验组3的线粒体膜电位均显著高于对照组(P＜0.05)。实验组2线粒体膜电位最高，为1.84ΔΨm，而对照组为1.25ΔΨm，实验组2较对照组线粒体膜电位提高47.2%。

以上结果表明，实验组2：0.036g/ml Tris、0.01g/ml葡萄糖、0.02g/ml柠檬酸、体积分数6%甘油、体积分数1%青链霉素合剂、20μg/ml过氧化物酶-6、10-30μg/ml谷胱甘肽过氧化物酶5及超纯水的组合，能够显著有效保护山羊精子在冷冻恢复过程中受到的氧化损伤，提高精子生物膜结构的完整性，使精子发挥正常的生理功能。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种山羊精子生物膜保护剂，其特征在于包括以下组分：0.036g/ml Tris、0.01g/ml葡萄糖、0.02g/ml柠檬酸、体积分数6%甘油、体积分数1%青链霉素合剂、20μg/ml过氧化物酶-6、10-30μg/ml谷胱甘肽过氧化物酶5及超纯水。

2.根据权利要求1所述的一种山羊精子生物膜保护剂，其特征在于：所述谷胱甘肽过氧化物酶5含有20μg/ml。

3.根据权利要求2所述的一种山羊精子生物膜保护剂的应用方法，其特征在于包括如下步骤：

1）配制保护剂：0.036g/ml Tris、0.01g/ml葡萄糖、0.02g/ml柠檬酸、体积分数6%甘油、体积分数1%青链霉素合剂、20μg/ml过氧化物酶-6、10-30μg/ml谷胱甘肽过氧化物酶5，依次加入超纯水中溶解，并定容，配制成山羊精子生物膜保护剂，通过针头式过滤器转移到试剂瓶中密封，4℃储存；

2）精液采集：采用假阴道采集法，全程无菌操作，完成采精后，马上竖立假阴道，避免精液倒流，将采集的新鲜精液进行 37℃保温，并送至实验室；

3）精液稀释：取按无菌操作要求采集的精液，鲜精活力达到 75%以上，快速直线运动在50%以上的精液供使用；取山羊精子生物膜保护剂，使山羊精子生物膜保护剂升温至37℃，将精液加入到山羊精子生物膜保护剂中，按照精液与山羊精子生物膜保护剂体积比1：10稀释，稀释后混匀；

4）精液冷冻：在4℃恒温冰箱中降温2h，降温后，将精液装入0.25ml细管中，在平衡1h后，移到距离液氮面4cm处，熏蒸7min后，迅速投入到液氮中，进行冷冻保存；

5）精液解冻：从液氮中取出冷冻细管后，投入到37℃水浴锅中，解冻，待使用。