CN117069836B - 一种抗人t细胞兔免疫球蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法。所述方法是利用经人外周血T淋巴细胞和/或胸腺细胞免疫的兔血浆或血清先经过醛化人红细胞和醛化人胎盘进行杂抗体的吸收后，再依次经过第一次离子交换层析、亲和层析和第二次离子交换层析制备得到，采用该方法可以成功地制备得到满足现行版《中国药典》各论“抗人T细胞兔免疫球蛋白”标准的抗人T细胞兔免疫球蛋白，且最终成品的分子大小纯度检测结果(单体加二聚体)可达100％，基本无显著性杂质，远高于现行版《中国药典》大于90％的标准。该纯化方法既不会引入铝等易于引起临床副反应的杂质，且工艺连续性好，能较好地实现数字化、自动化控制，用于放大生产。

Description

一种抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法。

背景技术

抗人T细胞免疫球蛋白(Anti-human T-lymphocyte Globulin，ATG)为强免疫抑制剂，可抑制经抗原识别后的淋巴细胞激活过程，特异性的破坏淋巴细胞，其在医疗上主要用于防治器官抑制的排异反应、治疗激素耐受及移植物抗宿主病以及治疗再生障碍性贫血。

已有的抗人T细胞免疫球蛋白主要有两种，分别是抗人T细胞猪免疫球蛋白和抗人T细胞兔免疫球蛋白。目前，国内关于抗人T细胞免疫球蛋白的研究主要集中在抗人T细胞猪免疫球蛋白上，而关于抗人T细胞兔免疫球蛋白的研究则甚少，市面上的抗人T细胞兔免疫球蛋白主要依靠进口、价格极高。而近年来的研究表明，抗人T细胞兔免疫球蛋白在预防骨髓移植的移植物抗宿主反应中应用效果更佳，因此，独立开发一种抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备工艺具有重要意义。

公开号为CN112111004A的发明专利公开了一种免疫球蛋白的生产工艺，其是用SPF兔血清灭活补体后，经辛酸沉淀得到澄清液，并将澄清液依次通过以下层析：亲和层析、阴离子交换层析、抗A/抗B层析，最终获得收率和纯度均较高的免疫球蛋白产品。该方法至少存在以下问题：(1)辛酸沉淀对人体易产生伤害，助滤剂(如硅藻土)的使用，会存在铝离子等残留，此类物质在临床中易于引起不良反应；(2)抗A/抗B层析填料中的配基存在易脱落的问题，同样可能存在导致临床不良反应的潜在风险；(3)不便于自动化控制和产业化实施。

发明内容

基于此，本发明提供了一种新的抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法，采用该方法可以克服上述现有技术存在的问题，并成功制备得到满足现行版《中国药典》各论“抗人T细胞兔免疫球蛋白”标准要求的抗人T细胞兔免疫球白蛋，且该方法便于产业化实施。

本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：一种抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：

S1，获取经人外周血T淋巴细胞和/或胸腺细胞免疫的兔血浆/血清；

S2，置于不高于37℃的条件下，融浆；

S3，向融浆后的兔血浆或血清中加入健康人血浆，得料液A；向料液A中加入醛化人红细胞，调整pH至7.0±1.0，保持反应温度在0～8℃，充分反应后，分离红细胞，收集上清液B；向上清液B中加入醛化人胎盘，调整pH至7.0±1.0，保持反应温度在0～8℃，充分反应后，分离胎盘渣，收集上清液C；

S4，调整上清液C的pH至6.0±1.0，并经深层过滤后，采用pH6.0±1.0的磷酸盐缓冲系统进行第一次离子交换层析，收集流穿液D；

S5，将流穿液D经过滤，并将浓度调整至10～30mg/mL，上亲和层析柱，用pH4.0±1.0的醋酸盐缓冲液系统洗涤，收集洗脱液E；

S6，将洗脱液E过滤除菌，置于24±2℃孵育后，得溶液F；

S7，将溶液F调节pH至6.0±1.0，进行第二次离子交换层析，收集流穿液G，即得包含抗人T细胞兔免疫球蛋白的产物。

作为一种优选的实施方式，还包括如下步骤：

S8，采用生理氯化钠溶液对流穿液G进行超滤置换，调整pH至4.0±0.5，并加入甘氨酸，得蛋白质量浓度为1～3％，甘氨酸浓度为10～30g/L的半成品，采用20nm除病毒滤膜过滤除病毒，随后对除病毒料液进行除菌；

S9，将半成品分装，即得。

作为一种优选的实施方式，步骤S3中，健康人血浆的添加量为兔血浆投入量的1～5％；步骤S3中，醛化人红细胞的添加量为投浆量的15～30％，醛化人胎盘的添加量为投浆量的15～30％。

作为一种优选的实施方式，步骤S3中醛化人胎盘为采用甲醛含量0.8％～3％的醛化液醛化反应3～7h所制备的醛化人胎盘。

作为一种优选的实施方式，所述醛化人胎盘的制备方法如下：获取内毒素检测为阴性的人胎盘渣，解冻；将解冻后的人胎盘渣置于胎盘醛化液中进行醛化反应3～7h，所述胎盘醛化液为含0.8％～3％甲醛的磷酸盐缓冲液；将醛化胎盘转移至生理浓度的氯化钠溶液中洗涤，再转入中和液中进行中和反应，所述中和液为含甘氨酸的氯化钠溶液，再次洗涤，控干，即得醛化人胎盘。

作为一种优选的实施方式，所述胎盘醛化液为含1％甲醛的磷酸盐缓冲液。

作为一种优选的实施方式，步骤S4、S5中过滤时所用的滤膜的孔径为0.45μm。

作为一种优选的实施方式，步骤S1中获取兔血浆的方法为：采用胸腺细胞和淋巴细胞混合免疫兔后采血获得；其中，免疫程序为：采用背部皮下多点注射的方式进行首次免疫，之后间隔14天采用静脉注射或皮下免疫的方式进行第二次加强免疫，第二次免疫后21天取血浆，即得。

本发明的目的还在于提供一种上述方法制备得到的抗人T细胞兔免疫球蛋白，其蛋白质含量为10～30g/L，pH值为4.0±0.2，P-ATG的纯度不低于蛋白质总量的95％，IgG单体与二聚体含量之和不低于95.0％，多聚体含量不高于5.0％，E玫瑰花环形成抑制试验效价不低于1:4000，淋巴细胞毒试验效价不低于1:2000，抗A、抗B血凝素不高于1:64，人血小板抗体不高于1:4，人血浆蛋白抗体与人血浆无沉淀线，蛋白质A残留量不高于蛋白质总量的0.001％。

本发明所提供的抗人T细胞兔免疫球蛋白制备方法，先向兔免疫血浆中加入健康人血，再利用醛化人红细胞和醛化人胎盘进行杂抗体的吸收，最后再依次经过离子交换层析、亲和层析、低pH孵放、离子交换层析、超滤透析、以及除病毒等处理，最终制备得到的抗人T细胞兔免疫球蛋白，上述制备方法至少具有以下优点：

(1)采用三步层析工艺，不采用低温乙醇工艺，无需低温环境、能耗低、安全且环境污染风险小，工艺连续性好，可较好地实现数字化、自动化控制，能够放大生产；

(2)杂抗体吸收工艺更全面，能够全面降低抗红细胞抗体、抗基底膜抗体、抗血浆蛋白抗体等临床影响较大的杂质，临床安全性更优；

(3)低pH孵放灭活病毒的工艺更严格，可有效灭活多种病毒，降低病毒的生物负载；

(4)无辛酸沉淀等对人体易产生潜在上海的操作，对人员保护性更好，且无助滤剂(硅藻土)等使用，避免铝离子等杂质的残留，从而避免该类物质再临床中引起的不良反应；

(5)该方法既可以用于血浆的分离提取，也可用于血清的分离提取，分离涵盖范围更广；

(6)制备得到的抗人T细胞兔免疫球蛋白能够满足现行版《中国药典》各论“抗人T细胞兔免疫球蛋白”标准要求，且最终成品的纯度(单体加二聚体)可达100％，基本无显著性杂质，远高于现行版《中国药典》大于90％的标准，每2-3ml免疫兔血浆即可制备得到1瓶抗人T细胞兔免疫球蛋白(25mg/瓶)。

附图说明

图1为实施例1中补体介导的淋巴细胞平均死亡率分析图；

图2为实施例1中补体介导的淋巴细胞毒合格率分析图；

图3为实施例2中第一批样品亲和洗脱液分子大小分析图；

图4为实施例2中第二批样品亲和洗脱液分子大小分析图；

图5为实施例2中第三批样品亲和洗脱液分子大小分析图；

图6为实施例2中第一批样品第二次离子交换层析流穿液分子大小分析图；

图7为实施例2中第二批样品第二次离子交换层析流穿液分子大小分析图；

图8为实施例2中第三批样品第二次离子交换层析流穿液分子大小分析图；

图9为实施例2中蛋白质A检测标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(NewYork:ColdSpring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例提供一种获得抗人T细胞兔免疫球蛋白血浆的方法，包括以下步骤：

(1)抗原的制备：

胸腺细胞免疫原的制备：取外科手术的废弃物胸腺细胞，在生物安全柜中进行研磨洗涤后用生理盐水制备成7～10×10⁷/mL细胞悬液，用流式检测分析仪进行抗原表位检测后，进行后续的免疫，按照7～10×10⁷/只的免疫细胞量备用。

外周T淋巴细胞免疫原的制备：取医疗废弃物白细胞滤盘，在生物安全柜中用0.9％的生理盐水对白细胞滤盘进行反冲，用无菌瓶收集反冲含有白细胞的盐水，再用淋巴细胞分离液对单核细胞进行分离，获得纯度较高的单个核细胞，按照1×10⁷/mL密度进行培养，用商品化的淋巴细胞无血清培养基进行培养。将增殖培养的淋巴细胞1500rpm离心5min收集，用0.9％的NaCl生理盐水洗涤2～3次，用细胞计数板进行计数，同时进行抗原表位的流式检测分析。按照健康兔的体重进行配置抗原细胞量，按照7～10×10⁷/只的免疫细胞量备用。

分别向以上两种细胞抗原中加入矿物油分子佐剂，在无菌条件下取出矿物油佐剂与抗原按质量比1:1迅速混匀，震荡10～20分钟即可，形成水包油抗原。

(2)动物实验：

将上述制备得到的抗原免疫新西兰白兔，在兔的颈背部两侧进行多点皮下注射。免疫程序设定了8个实验组和1个空白对照组，每组5只，空白对照组10只，同时设定不同的免疫抗原进行对比研究，具体如下表1所示。其中第7组和第8组是首次采用胸腺细胞进行免疫，加强免疫采用外周T淋巴细胞进行免疫。首次免疫间隔14天和21天后进行第2次加强免疫，加强免疫分别采用静脉注射和皮下免疫，最后一次加强免疫在第二次免疫后21天进行皮下多点注射。基础免疫和二次免疫前后均采血检测效价，最后一次加强免疫后每3天采血一次连续监测12天内的抗体效价波动水平，14天进行全部采血处理。

表1免疫方案制定

(3)效价检测

对上述采集的兔血清用淋巴细胞毒实验进行抗体效价的分析。淋巴细胞毒实验详细方法介绍参见2020版中国药典四部(通则3516)。对二免后14天、21天，以及三免后3天、6天、9天、12天的效价进行检测和分析，结果如表2、3和图1、2所示：

表2补体介导的淋巴细胞毒平均死亡率分析

表3补体介导的淋巴细胞毒合格率分析

由上述结果可知：淋巴细胞免疫组胸腺和细胞混合免疫组(即实验组7和8)，效价持续时间较长，相对也比较稳定，其中在二免后21天效价最高。

(4)免疫血浆的制备

按照实验组7、8的免疫方式进行免疫，并获取免疫血浆。

实施例2

本实施例提供一种兔抗人T细胞免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤如下：

S1，制备免疫兔血浆：经人胸腺细胞或健康人血液分离的人淋巴细胞按照实施例1中实验组7、8的免疫方式免疫健康兔，经检验合格后采集、分离出免疫兔血浆。

S2，血浆合并及融浆：将解冻的免疫兔血浆按投浆所需进行混合，并置于不高于37℃的条件下融浆，得混合兔血浆。

S3，健康人血浆吸收杂抗体：向混合兔血浆中加入健康人血浆，健康人血浆的添加量为兔血浆投入量的1～5％，得料液A；向料液A中加入醛化人红细胞，调整pH至7.0±1.0，保持反应温度在0～8℃，搅拌时间不少于6h，压滤分离红细胞，收集上清液B；向上清液B中加入醛化人胎盘，调整pH至7.0±1.0，调整pH至7.0±1.0，保持反应温度在0～8℃，搅拌时间不少于6h，压滤分离胎盘渣，收集上清液C；

其中，醛化人胎盘的制备方法如下：获取经处理且内毒素检测为阴性的人胎盘渣，解冻；将解冻后的人胎盘渣沥干，置于胎盘醛化液中，胎盘醛化液为含0.8％～3％甲醛的磷酸盐缓冲液，料液比为1:2～1:5，进行醛化反应3～7h；将醛化反应完毕的胎盘转移至生理浓度的氯化钠溶液中，搅拌10～30min，控干；将清洗完毕的醛化后胎盘转入中和液中，中和液为含0.5％～2％甘氨酸的氯化钠溶液，料液比为1:2～1:5，进行中和反应1～3h；将中和后的胎盘转移至生理浓度的氯化钠溶液中，搅拌10～30min，控干，即得醛化胎盘。

S4，第一次离子交换层析：调整上清液C pH至6.0±1.0，并经深层过滤(0.45μm)后，采用磷酸盐缓冲系统，进行第一次离子交换层析，加pH6.0±1.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤，收集流穿液D。

S5，亲和层析：将流穿液D经过滤(0.45μm)后，并将浓度调整至10～30mg/mL，上亲和层析柱，用pH4.0±1.0的醋酸盐缓冲液系统，并收集洗脱液E。

S6，病毒灭活和去除：将洗脱液F过滤除菌，置于24±2℃孵育24天，得溶液F。

S7，第二次离子交换层析：将溶液F调节pH至6.0±1.0，上离子交换层析柱，加pH6.0±1.0的磷酸盐缓冲液洗涤，收集流穿液H。

S8，半成品配制：采用生理氯化钠溶液对流穿液H进行超滤置换，调整pH至4.0±0.5，并加入甘氨酸，得蛋白浓度为1～3％，甘氨酸含量为10～30g/L的半成品，并采用20nm除病毒滤膜过滤除病毒，随后对除病毒料液进行除菌操作。

S9，检定及分装：取样做半成品鉴定，将半成品分装至中硼硅西林瓶，分装装量为1mL/瓶，即得R-ATG成品。

2.1按现行版《中国药典》各论“抗人T细胞兔免疫球蛋白”成品相应检测项目及标准，对按照上述方法制备得到的抗人T细胞兔免疫球蛋白制剂成品进行检测，结果如下：

蛋白质含量为10～30g/L，pH值为4.0±0.2，P-ATG的纯度不低于蛋白质总量的95％，IgG单体与二聚体含量之和不低于95.0％，多聚体含量不高于5.0％，E玫瑰花环形成抑制试验效价不低于1:4000，淋巴细胞毒试验效价不低于1:2000，抗A、抗B血凝素不高于1:64，人血小板抗体不高于1:4，人血浆蛋白抗体与人血浆无沉淀线，蛋白质A残留量不高于蛋白质总量的0.001％。

2.1工艺研究

(1)小试实验中某批样品第一次离子交换层析结果

表4某一批样品第一次离子交换层析结果

(2)中试实验中不同的上样量研究了亲和层析和第二次离子交换层析收率及纯化情况，结果如图3～8及下表5所示：

表5不同上样量条件下亲和层析和离子交换层析收率及纯化结果

由上述结果可知：本发明所述工艺稳定性较好，最终成品的纯度(单体加二聚体)可达100％，基本无显著性杂质，远高于现行版《中国药典》大于90％的标准。

(3)蛋白质A残留检测：对中试实验中亲和及第二次离子交换层析所收获料液进行蛋白质A残留检测，结果如图9及下表6、7所示：

表6各纯化工艺阶段样品中蛋白质A残留检测分析结果

表7蛋白质A残留检测拟合标准曲线方程

由此可知，采用本发明所述的方法，在第二次离子交换层析处理后，其最终成品(离子流穿液)中均未检出脱落的蛋白质A，完全满足《中国药典》中规定其残留量应不高于蛋白质总量的0.001％(10ppm)的要求，说明本发明所述的方法可靠且重复性好。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，获取经人外周血T淋巴细胞和胸腺细胞免疫的兔血浆；

S2，置于不高于37℃的条件下，融浆；

S3，向融浆后的兔血浆中加入健康人血浆，健康人血浆的添加量为兔血浆投入量的1～5％，得料液A；向料液A中加入醛化人红细胞，调整pH至7.0±1.0，保持反应温度在0～8℃，充分反应后，分离红细胞，收集上清液B，其中，醛化人红细胞的添加量为投浆量的15～30％；向上清液B中加入醛化人胎盘渣，调整pH至7.0±1.0，保持反应温度在0～8℃，充分反应后，分离胎盘渣，收集上清液C，其中，醛化人胎盘的添加量为投浆量的15～30％；

S4，调整上清液C的pH至6.0±1.0，并经深层过滤后，采用pH 6.0±1.0磷酸盐缓冲液进行第一次阴离子交换层析，收集流穿液D；

S5，将流穿液D经过滤，并将蛋白浓度调整至10～30mg/mL，上亲和层析柱，用pH4.0±1.0的醋酸盐缓冲液系统洗涤，收集洗脱液E；

S6，将洗脱液E过滤除菌，置于24±2℃孵育后，得溶液F；

S7，将溶液F调节pH至6.0±1.0，进行第二次阴离子交换层析，收集流穿液G，即得包含抗人T细胞兔免疫球蛋白的产物。

2.根据权利要求1所述的抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：

S8，采用生理氯化钠溶液对流穿液G进行超滤置换，调整pH至4.0±0.5，并加入甘氨酸，得蛋白质量浓度为1～3％，甘氨酸浓度为10～30g/L的半成品，采用20nm除病毒滤膜过滤除病毒，随后对除病毒料液进行除菌；

S9，将半成品分装，即得。

3.根据权利要求1所述的抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S3中醛化人胎盘为采用甲醛含量0.8％～3％的醛化液醛化反应3～7h所制备的醛化人胎盘。

4.根据权利要求3所述的抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述醛化人胎盘的制备方法如下：获取内毒素检测为阴性的人胎盘渣，解冻；将解冻后的人胎盘渣置于胎盘醛化液中进行醛化反应3～7h，所述胎盘醛化液为含0.8％～3％甲醛的磷酸盐缓冲液；将醛化胎盘转移至生理浓度的氯化钠溶液中洗涤，再转入中和液中进行中和反应，所述中和液为含甘氨酸的氯化钠溶液，再次洗涤，控干，即得醛化人胎盘。

5.根据权利要求4所述的抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述胎盘醛化液为含1％甲醛的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1所述的抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S4、S5中过滤时所用的滤膜的孔径为0.45μm。

7.根据权利要求1所述的抗人T细胞兔免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，免疫程序为：采用背部皮下多点注射的方式进行首次免疫，之后间隔14天采用静脉注射或皮下免疫的方式进行第二次加强免疫，第二次免疫后21天取血浆，即得。