CN117015406A - 用于针对临床应用优化生殖组织衍生细胞产量和活力的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了用适合获得临床应用通常所需的多种治疗剂量的方式处理来自例如劁手术和阉割手术的生殖组织以优化细胞产量和活力的新颖方法。举例来说，本文公开了消化、搅拌和孵化生殖组织及其馏分的新颖方法，包括例如对细胞悬浮液和部分消化的组织进行交互和/或振动机械搅拌和共培养以增进细胞迁移。

Description

用于针对临床应用优化生殖组织衍生细胞产量和活力的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求在2021年1月19日提交的美国临时专利申请63/139,031号的优先权权益，所述美国临时专利申请特此明确地以全文引用方式并入。

技术领域

本公开的各方面通常涉及处理生殖组织以优化细胞产量和活力的方法。

发明背景

宠物和如人类的饲养动物随着年老而遭受众多疾病和病症。在兽医环境中给药细胞组合物以达到治疗目的已变得越来越盛行并且大有可为。然而，用于处理兽医样本的惯用方法导致显著的产量可变性。能够从最少量的来源可靠地产生多种临床剂量以在需要时递送给患者至关重要。本公开的各方面设法解决这些需求。

发明内容

本文公开了处理来自例如劁手术和阉割手术的生殖组织以优化细胞产量和活力的新颖方法，使得能够获得临床应用所需的生殖组织衍生细胞的多种治疗剂量。举例来说，本文公开了消化、搅拌和孵化生殖组织及其馏分的新颖方法，包括例如对细胞悬浮液和部分消化的组织进行交互和/或振动机械搅拌和共培养以增进细胞迁移。

本发明公开了处理生殖组织以优化细胞产量和活力的方法。本公开的实施方案以及所述实施方案的特征和优点将从本文中的描述显而易见。

具体地，本发明涉及一种处理生殖组织以获得生殖组织衍生细胞的方法，所述方法包括：例如从劁手术或阉割手术获得生殖组织；绞碎所述生殖组织；用酶溶液使所述绞碎的生殖组织消化以获得组织悬浮液；搅拌所述组织悬浮液，使得交互机械搅拌被施加到所述组织悬浮液；过滤所述组织悬浮液以得到细胞悬浮液馏分和部分消化的生殖组织馏分；对所述细胞悬浮液馏分进行离心以形成第一离心细胞团块并使所述第一离心细胞团块重悬成为单细胞悬浮液；在孵化培养基中孵化所述部分消化的生殖组织馏分，使得细胞从所述部分消化的生殖组织馏分迁移到所述孵化培养基中；对所述孵化培养基进行离心以形成第二离心细胞团块并使所述第二离心细胞团块重悬成为迁移细胞悬浮液；组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞。

本发明涵盖的生殖组织包括是来自雄性的精巢、输精管、外附睾或其任何组合和雌性的卵巢、输卵管或子宫或其任何组合的组织的组织。本发明涵盖的生殖组织包括来自犬科动物或猫科动物的组织。在一些实施方案中，所述生殖组织是从劁手术或阉割手术分离出来的。

在某些实施方案中，本发明的方法利用酶溶液来消化生殖组织。在一些实施方案中，所述酶溶液由胶原酶或中性蛋白酶或两者组成。在某些实施方案中，搅拌生殖组织，使得搅拌在设置在37℃的干式热孵化器中执行。在一些实施方案中，搅拌执行至少40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200分钟，或在由前述时间中的任意两者限定的范围内的任何时间。在某些实施方案中，搅拌执行至少四十分钟或更长时间。在一些实施方案中，搅拌执行最多5、10、15、20、25、30、35或40分钟，或在由前述时间中的任意两者限定的范围内的任何时间。在其他实施方案中，搅拌执行最多四十分钟。

在特定实施方案中，搅拌所述组织悬浮液，使得交互和振动机械搅拌都施加到所述组织悬浮液。在另外其他实施方案中，搅拌所述组织悬浮液，使得旋转机械搅拌不施加到所述组织悬浮液。在某些实施方案中，在平台上执行搅拌。

在具有过滤的实施方案中，过滤步骤包括使所述组织悬浮液通过一个或多个细胞粗滤器以将所述单细胞悬浮液馏分与所述部分消化的组织馏分分开。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞粗滤器包括300μm、100μm、70μm或40μm粗滤器，或其任何组合。可以将所述单细胞悬浮液馏分储存在4℃下。

在孵化所述部分消化的生殖组织馏分的实施方案中，孵化所述部分消化的生殖组织馏分持续不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或在由前述时间中的任意两者限定的范围内的任何时间。在一些实施方案中，孵化持续两小时或更少时间。

在某些实施方案中，将所述单细胞悬浮液馏分冷冻保存。

在其他实施方案中，将所述部分消化的生殖组织馏分冷冻保存。

在一些实施方案中，将所述单细胞悬浮液和所述部分消化的生殖组织分开冷冻保存。在另外其他实施方案中，将所述单细胞悬浮液和所述部分消化的生殖组织馏分一起冷冻保存在同一个小瓶中。

在某些治疗实施方案中，解冻所述单细胞悬浮液和所述部分消化的生殖组织馏分。在一些实施方案中，本文公开的方法还包括解冻所述单细胞悬浮液和所述部分消化的生殖组织馏分。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括将所述解冻的单细胞悬浮液和所述解冻的部分消化的生殖组织馏分一起孵化。在其他实施方案中，将所述解冻的单细胞悬浮液和所述解冻的部分消化的生殖组织馏分在同一个组织培养瓶中一起孵化。所述生殖组织衍生细胞可以从所述部分消化的生殖组织馏分迁移到所述孵化培养基中。生殖组织衍生生长因子也可以从所述部分消化的生殖组织馏分扩散到所述孵化培养基中。对所述孵化培养基进行离心以获得包括生殖组织衍生细胞的细胞团块。

在一些实施方案中，组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞使从所述生殖组织分离出的单细胞的总产量提高。在一些实施方案中，与仅在所述细胞悬浮液馏分中分离出的单细胞的总产量相比，组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞使从所述生殖组织分离出的单细胞的总产量提高至少50％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、220％、240％、260％、280％、300％、320％、340％、360％、380％或400％，或在由前述百分比中的任意两者限定的范围内的任何百分比。在一些实施方案中，组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞得到以下的从所述生殖组织分离出的单细胞的总产量：每克生殖组织约3x10^6、4x10^6、5x10^6、6x10^6、7x10^6、8x10^6、9x10^6或10^7个细胞，或在由前述细胞数中的任意两者限定的范围内的任何细胞数。

本文还公开了冷冻保存部分酶解消化的组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：获得组织；绞碎所述组织；将所述绞碎的组织与酶溶液混合以获得组织悬浮液；搅拌所述组织悬浮液，使得机械搅拌被施加到所述组织悬浮液；过滤所述组织悬浮液以得到细胞悬浮液馏分和部分消化的生殖组织馏分；以及冷冻保存所述部分消化的组织馏分。在一些实施方案中，所述酶溶液包括一种或多种解离酶和/或中性蛋白酶。在一些实施方案中，所述酶溶液包括胶原酶和/或中性蛋白酶。在一些实施方案中，不带所述细胞悬浮液馏分地冷冻保存所述部分消化的组织馏分。在一些实施方案中，将所述部分消化的组织馏分与所述细胞悬浮液馏分一起冷冻保存。

在本文提供的实施方案中的任何实施方案中，所述患者可以是狗、猫或马，或其他非人类哺乳动物。在一些实施方案中，所述输送可以是自体的。在一些实施方案中，所述输送可以是同种异体的。

具体实施方式

本文公开了优化生殖组织处理方法以获得可存活再生细胞的更高产量(即，适合临床应用的量)的新颖方法。在具体实施方式中将参考某些实施方案，并且将使用特定语言来描述所述实施方案。将理解，此描述旨在为说明性的。如本公开所涉及领域的技术人员通常会想到的，考虑了所描述实施方案的任何更改和进一步修改和所描述实施方案的原理的任何进一步应用。

定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有本主题所属领域的一般技术人员通常所理解的相同含义。本文中在描述主题时所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制主题。

冠词“一种”和“一个”在本文中用于指代所述冠词的语法宾语中的一个或多于一个(例如，至少一个)。举例说明，“一个元件”意味着一个元件或多于一个元件。

如本文所用，术语“约”或“左右”指的是对比参考数量、程度、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度改变多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、程度、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包括”和“包括”将理解为暗示包括所说明的步骤或元件或步骤或元件组，但是不排除任何其他的步骤或元件或步骤或元件组。“由……组成’意味着包括且限于在短语“由……组成”之后的内容。因此，短语“由……组成’指示列出的元件是所需的或强制性的，并且不可能存在其他元件。“基本上由……组成’意味着包括在短语之后列出的任何元件并且限于不干扰本公开关于列出的元件规定的活动或动作或对所述活动或动作有帮助的其他元件。因此，短语“基本上由……组成”指示列出的元件是所需的或强制性的，但是其他元件是任选的，并且视所述其他元件是否实质上影响列出的元件的活动或动作而可以或不可能存在。

在一些实施方案中，如本文公开的接受治疗的“个体”、“患者”或“受试者”是哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”包括但不限于人类、非人类动物，包括灵长目动物、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔子、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、猴子等。在一些实施方案中，个体、患者或受试者是家庭宠物或家畜动物。在一些实施方案中，个体、患者或受试者是猫(猫科)、狗(犬科)或马。受试者可以是“需要”本文公开的方法的受试者或者可以是正在经受疾病状态和/或预计要经受疾病状态的受试者，并且本发明的方法和组合物被用于治疗性和/或预防性治疗。受试者可以是患者，患者指的是为了诊断或治疗疾病而提供给医疗服务提供方的受试者。受试者可以患有或者容易患有疾病或病症，但是可能或不可能表现出疾病或病症的症状。

本文公开的一些实施方案涉及选择有需要的受试者或患者。在一些实施方案中，选择患有疾病、需要治疗或疾病疗法、有感染疾病的风险、先前得过疾病或目前未患病的受试者。在一些实施方案中，选择先前对另一种疗法没有反应的受试者。

如本文所用，术语“功能”和“功能性”指的是生物、酶或治疗功能。

如本文所用，术语“分离(isolated)”指的是已经(1)在最初生产物质和/或实体时(是否在自然中和/或在实验设置中)与物质和/或实体相关联的组分中的至少某种组分分离和/或(2)通过人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与所述物质和/或实体最初相关联的其他组分的等于或至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本上100％或100％(或包括和/或跨前述值的范围)。在一些实施方案中，分离的试剂大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本上100％或100％纯(或包括和/或跨前述值的范围)。如本文所用，“分离出”的物质可以是“纯的”(例如，基本上不含其他组分)。如本文所用，术语“分离出细胞”可以指的是多细胞生物或组织中不含的细胞。

术语“原代细胞馏分”或“PCF”指的是在培养步骤之前从为了从靶组织制备可存活单细胞悬浮液而进行的分离、解离和/或纯化步骤获得的细胞群体。PCF群体不同于在一个或多个培养步骤之后获得的细胞群体，因为群体内的某些细胞类型的相对分数(relativefraction)和所述细胞类型的性质随着一个或多个培养步骤改变。

术语“间充质干细胞(MSC)”指的是展现分化为成骨谱系、成软骨谱系和成脂谱系的潜力的纺锤状黏附细胞的群体。MSC也可以被称为“间充质基质细胞”、“间充质祖细胞(MPC)”或“基质细胞”。MSC主要是从骨髓中分离，但是也存在于脐带组织、脐带血、白色脂肪组织和胎盘组织以及其他组织中。在培养后，MSC通常表现CD105、CD73、CD90，而通常不表现CD14、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR(II类)。MSC能够分化为多个细胞类型以及缺少MHCII类已经激起用于自体或同种异体再生细胞疗法的研究。

如本文所用，“体内”以其一般含义给出并且指的是方法在通常是动物、哺乳动物(包括人类)以及植物的活生物体内执行，与组织提取物或死生物相反。

如本文所用，“体外”以其一般含义给出并且指的是方法在活生物体外执行而自然条件几乎没有变化。

如本文所用，“离体”以其一般含义给出并且指的是方法在生物条件外(例如，在培养皿或试管中)执行。

如本文所用，术语任何给定物质、化合物或材料的“纯度”指的是相对于预期丰度的物质、化合物或材料的实际丰度。举例来说，物质、化合物或材料的纯度可以是至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包括其间的所有小数。纯度可能受不需要的杂质影响，所述杂质包括但不限于细胞、核酸、DNA、RNA、核苷酸、蛋白质、多肽、肽、氨基酸、脂质、细胞膜、细胞碎片、小分子、降解产物、溶剂、运载体、载体或污染物，或其任何组合。在一些实施方案中，物质、化合物或材料基本上不含细胞蛋白质、细胞核酸、质粒DNA、污染病毒、蛋白酶体、细胞培养组分、处理相关组分、支原体、热原、细菌内毒素以及外源因子。纯度可以使用此项技术中理解的技术来测量，所述技术包括但不限于电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、PCR、rtPCR、qPCR、层析、液相层析、气相层析、薄层层析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、光谱法、UV可见光谱法、红外光谱法、质谱法、核磁共振、重力测量或滴定法，或其任何组合。

如本文所用，术语任何给定物质、化合物或材料的“产量”指的是相对于预期总量的物质、化合物或材料的实际总量。举例来说，物质、化合物或材料的产量可以是预期总量的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包括其间的所有小数。产量可以受反应或过程的效率、不想要的副反应、降解、输入的物质、化合物或材料的品质或需要的物质、化合物或材料在生产的任何步骤期间的损耗影响。

如本文所用，术语“％w/w”或“％重量/重量”具有如根据说明书所理解的一般含义并且指的是根据乘以100的成分或试剂的重量对组合物的总重量表示的百分比。如本文所用，术语“％v/v”或“％体积/体积”具有如根据说明书所理解的一般含义并且指的是根据乘以100的化合物、物质、成分或试剂的液体体积对组合物的总液体体积表示的百分比。

生殖组织衍生细胞

本发明的方法产生在治疗和预防伤处、疾病以及病症方面具有独特优点的生殖组织衍生的活细胞组合物。根据本发明的方法获得的生殖组织衍生的活细胞组合物可以包括例如一种或多种再生细胞、消炎细胞、抗凋亡细胞、免疫调节细胞以及营养细胞(包括但不限于间充质干细胞)等的生殖组织衍生细胞的分离或混合群体，这些生殖组织衍生细胞被从其天然组织环境去除并且与其原始组织环境相比集中。在某些实施方案中，活细胞存在的浓度是在细胞最初成团块时从组织中分离出的浓度的大约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍，或在由前述倍数浓度中的任意两者限定的范围内的任何倍数浓度。

在本公开的实施方案中可以使用广泛多种的生殖组织衍生细胞类型。举例来说，生殖组织衍生细胞可以是“再生细胞”，这些细胞在广义上使用并且包括以下各项中的任一者的任何一种或多种：传统干细胞、间充质干细胞、祖细胞、间充质祖细胞、前祖细胞、周细胞、内皮细胞、上皮细胞、胚系干细胞(包括精原祖细胞或卵原祖细胞)以及类似细胞。在一些实施方案中，给药生殖组织衍生细胞治疗遭受疾病、病症或状况的患者。举例来说，本发明的生殖组织衍生细胞可以降低疤痕形成率，或者提高生血管血管形成率以帮助伤口愈合。在一些实施方案中，生殖组织衍生细胞组合物也可以包括其他细胞类型，例如以下细胞中的一种或多种：红细胞、白细胞、血小板、中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞、成纤维样细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、周细胞或外周神经祖细胞等。

本文中的实施方案中所公开的生殖组织衍生细胞可以来自任何合适的动物物种，例如哺乳动物，例如人类、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、猪、绵羊、山羊或牛哺乳动物。本文中的实施方案中所公开的生殖组织衍生细胞可以从任何合适的生殖组织或器官，包括雄性或雌性生殖组织或器官，获得。仅举例说明，这些生殖组织衍生细胞包括衍生自睾丸组织、卵巢组织、子宫组织、输卵管、输精管或外附睾的细胞。举例来说，对于阉割手术期间来自雄性受试者的生殖组织样本，在切除或不切除输精管和外附睾的情况下，可以在本发明的某些方法中使用来自精巢的细胞。对于劁手术期间来自雌性受试者的生殖组织样本，在切除或不切除输卵管的情况下，可以在本发明的某些方法中使用来自子宫或卵巢的细胞。在一些实施方案中，生殖组织衍生细胞通常可以是表现出黏附细胞和非黏附细胞两者的标志物的细胞群体。这些标志物可以使用例如流式细胞术的惯用方法来检测。

在一些实施方案中，根据本发明的某些方法获得的生殖组织衍生的活细胞组合物还可以包括附加的非细胞组织组分。这样的非细胞组分可以是可溶因子或不可溶组分(例如脂质)或两者。这样的非细胞组织组分的实例包括但不限于细胞外基质蛋白、蛋白聚糖、分泌因子、细胞因子、生长因子、分化诱导因子、分化抑制因子或其片段。在一个实施方案中，非细胞组分群体包括但不限于胶原、血小板应答蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白，或其片段。在一个特定实施方案中，非细胞组分群体包括胶原或其片段。胶原包括但不限于I型、III型、IV型胶原或其异形体、层粘连蛋白或其他某些异形体、多能蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖或巢蛋白。特别地，IV型胶原和层粘连蛋白在血管和神经形成两者中扮演重要的角色。此外，这些附件的非细胞组分经常将以原始分离的细胞群体存在。然而，在某些实施方案中，在为患者给药之前，可以在培养扩增之前添加这些非细胞组分。在一些实施方案中，在为患者给药之前，从细胞组合物去除这些附加的非细胞组分。

获得生殖组织衍生细胞的方法

下文描述了用于针对临床应用处理生殖组织以优化细胞产量和活力的方法。特别地，描述了用于从在劁手术或阉割手术期间获得的生殖组织获得细胞组合物的优化方法。用本文描述的方法获得的活细胞组合物适合临床应用。

如按照惯例所理解的，阉割是一种从雄性去除精巢和输精管的外科手术(去势)。如按照惯例所理解的，劁是一种从雌性去除卵巢和输卵管和/或子宫的外科手术(卵巢子宫切除术)。

包括输卵管、附睾、输精管和脂肪组织的关联附属组织也可以在这些手术期间去除。

下面是示例性工作指示：

解离酶制备.酶被用于使细胞从细胞外基质解离和使细胞彼此解离，由此产生单细胞群体。在一些实施方案中，用于使细胞解离的酶可以包括胶原酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、果胶酶、胃蛋白酶，或其任何组合。在某些实施方案中，可以组合中性蛋白酶(例如分散酶)以提高效率。

组织处理.确保生物安全柜(BSC)在进行处理之前已经准备好了适当量的用于处理组织样本的用品。将(例如来自劁手术或阉割手术的)整个组织转移到适当大小的预称重无菌容器。获得整个组织的质量测量。获得新的试样容器并且使用无菌钳将组织样本小心地转移到新的试样容器中。将50mL到60mL之间的PBS添加到含有组织的无菌容器。将无菌容器的盖子盖紧并继续摇晃容器以从组织清洗出多余的碎片和/或血。使用无菌钳和培养皿，将组织小心地转移到培养皿内。使组织靠着试样容器的内部滑动以允许多余的流体从组织排出。

通过获得生殖组织的适当区域而将组织分成小块。对于从雄性分离的组织，使用无菌钳和小解剖剪，切除并丢弃输精管和外附睾。对于从雌性分离的组织，使用无菌钳和小解剖剪，从卵巢切除输卵管并丢弃。对于来自雌性受试者的也包括子宫和/或脂肪组织的生殖组织样本，子宫和/或脂肪组织可以为了附加处理分开地保存，以确保最终细胞制品中有足够的血管化组织质量。在所有情况下，将所需的已切除生殖组织样本(包括精巢或卵巢/子宫)切割成较小的可管理块。将组织块转移到预称重的标记50mL锥形管中。转移根据锥形管上的标记大致测量的不超过22.5mL的组织体积。获得生殖组织的质量。继续将生殖组织绞碎成大约2到3mm大小的块。获得解离酶储备溶液。获得绞碎组织的质量测量。将相等体积的酶储备溶液/PBS添加到观测质量的绞碎组织。如下所述地计算要添加到样本的酶储备溶液和PBS的量：每20克组织应当添加1mL酶储备溶液。将适当量的酶储备溶液和PBS添加到绞碎组织样本。盖紧50mL锥形管的盖子并倒置样本多次以确保组织样本的混合。

组织消化.通过观测验证温度计的温度来验证干式孵化器温度在36℃到40℃之间。将样本放置到孵化器区组(block)中并将搅拌速度设置成450+/-50rpm。应将组织样本孵化40+/-5分钟。在孵化之后，从孵化器去除组织样本。获得孵化培养基并且进行无菌转移以结束消化过程。

组织清洗.在将孵化培养基添加到样本管之后，用PBS使样本管的体积到达50mL。通过倒置使样本混合。在环境温度(18到25℃)下将混合后样本管放置到速度设置成1,400+/-100rpm的离心机并低速制动15分钟。在离心已经完成后将样本管取出(Retrieve)并将样本管无菌转移到BSC中。使用无菌锥形管或无菌容器，将上清液倒出。如果团块保持完整，则将上清液丢弃到废物容器中并继续。如果团块是松散的，则将上清液转移回到原始的样本管并再次进行离心。将5到10mL PBS添加到团块并且用血清移液管重悬。获得预标记50mL的锥形管并且继续用以下方法中的一种对重悬的细胞团块进行细胞粗滤：

非叠加式细胞粗滤器.小心地打开100μm细胞粗滤器的包装以确保过滤器部分保持无菌。将100μm细胞粗滤器布置到预标记50mL的锥形管上。使用血清移液管，使团块重悬并将重悬液转移到过滤器的顶部。允许流体通过过滤器排出。使用以下步骤以帮助过滤细胞悬浮液：使用血清移液管的尖端，将细胞粗滤器的内容物混合以帮助过滤重悬液。将附加的PBS添加到过滤器的顶部并将内容物混合以允许过滤。向上缓和提起细胞粗滤器，将细胞粗滤器放回到锥形管上以释放可能已经出现的气锁。

用5到10mL PBS冲洗原始的样本管并通过细胞粗滤器进行处理。一旦重悬液已完成过滤，即去除并抛弃细胞粗滤器。将第一过滤锥形管放到一边并准备下一个过滤管。获得新的预标记50mL的锥形管。小心地打开70μm过滤器以确保过滤器部分保持无菌。将70μm细胞粗滤器布置到新的预标记锥形管中的一个上。使用新的血清移液管，将细胞悬浮液转移到70μm过滤器的顶部。允许细胞悬浮液通过过滤器排出。用5mL PBS冲洗前一个管并将冲洗液转移到70μm过滤器的顶部。放到一边并准备下一个过滤管。获得另一个预标记50mL的锥形管。小心地打开40μm过滤器以确保过滤器部分保持无菌。将40μm细胞粗滤器布置到新的预标记锥形管上。使用新的血清移液管，将细胞悬浮液转移到40μm过滤器的顶部。允许细胞悬浮液通过过滤器排出。用5mL PBS冲洗前一个管并将冲洗液转移到40μm过滤器中。

可叠加的细胞粗滤器.小心地打开每个过滤器的包装，确保保持过滤器的无菌性。将40μm过滤器布置到预标记50mL的锥形管上。无菌地拆卸剩余两个过滤器的漏斗部分。仅握住过滤器部分的外部。不触摸过滤器网。继续将70μm过滤器叠加到40μm过滤器上。一旦70μm过滤器固定到40μm过滤器上，即继续将100μm过滤器叠加到70μm过滤器上。

使用血清移液管，使团块重悬并将重悬液转移到叠加的过滤器的顶部。允许重悬液通过过滤器系统排出。使用血清移液管将顶部过滤器的内容物混合，以帮助滤液通过过滤器。将附加的PBS添加到过滤器的顶部并将内容物混合以允许过滤。将5到10mL PBS添加到原始的样本管并用血清移液管冲洗管的侧面。将冲洗液添加到过滤器的顶部并允许通过过滤器系统排出。因为过滤器或过滤器系统会堵塞，因此使用附加的细胞粗滤器可能是必需的。如果是这种情况，则将过滤器的内容物转移回到样本管中并获得新的过滤器。如上文所指示地重复过滤步骤。

在用连续式细胞粗滤器或叠加式细胞粗滤器将重悬液过滤之后，添加一定体积的PBS以使含有过滤后细胞悬浮液的样本管的体积达到35到40mL之间并给样本管加盖。通过倒置进行混合。将样本管转移到离心机并在环境温度(18到25℃)下以1,400+/-100rpm对样本进行离心并低速制动7分钟。在清洗离心机之后将样本管取出(Retrieve)并无菌转移到BSC中。

使用无菌锥形管或无菌容器，将上清液倒出。如果团块保持完整，则将上清液丢弃到废物容器中并继续。如果团块是松散的，则将上清液转移回到原始的样本管并再次进行离心。缓和地轻弹团块到重悬并用PBS使样本管达到35到40mL的体积。给样本管加盖并通过倒置进行混合。将样本管转移到离心机并在环境温度(18到25℃)下以1,400+/-100rpm对样本进行离心并低速制动7分钟。

用于细胞计数的最终重悬液和制剂：当样本处于最后的离心清洗步骤时，使BSC具备附加的血清移液管和移液管尖端以及微量移液管。用样本的唯一识别码对微量离心管进行标记。取决于样本的外观(即看上去具有高RBC内容物)，可能需要稀释细胞计数样本。将制备好的计数样本放到一边。从离心机取出(Retrieve)样本管并无菌转移到BSC。使用无菌锥形管或无菌容器将上清液倒出。如果团块保持完整，则将上清液丢弃到废物容器中并继续如果团块是松散的，则将上清液转移回到原始的样本管并再次进行离心。

通过缓和地轻弹团块，将团块流体化。添加一定体积的PBS以使体积达到大约2.0mL。如果细胞团块大，则可能需要使体积达到更高的体积。用移液管缓和地使细胞悬浮液重悬并测量最终体积。

使用微量移液管，获得细胞悬浮液的细胞计数样本并放置到准备好的取样管。将细胞悬浮液存储在2到8℃下，同时执行细胞计数。执行细胞计数。

细胞孵化培养基制备将445mL具有4.5g/L葡萄糖、lx Glutamax和丙酮酸钠的DMEM添加到500mL的0.2微米培养基过滤系统。将50mL Equa胎血清和5mL青霉素/链霉素添加到过滤系统。

细胞培养.如果细胞数低于达到适当次数剂量所需的最小量，则可以对细胞进行细胞培养，以产生培养扩增自体细胞剂量。

用培养基稀释重悬的细胞以在无菌T75培养瓶表面上实现范围是15,000到50,000个细胞/cm²的平板接种密度。将细胞在37℃下的具有5％CO₂的加湿室中孵化6到10天，直到细胞变成80到90％汇流。在3天后置换培养基并视需要在另外3到4天后再次置换。这被称为初次(P＝0)培养。在达到80到90％汇流后，立即去除培养基，并用大约10mL PBS将黏附细胞清洗1次。从培养瓶抽出PBS。将7mL TrypLE添加到培养瓶，并将培养瓶在37℃下的具有5％CO₂的加湿室中孵化5到8分钟。添加相同体积的生长培养基以熄灭TrypLE活性。用手掌心不间断地轻拍培养瓶，以从培养瓶表面驱除细胞。使用10mL或25mL移液管将细胞转移到含有附加的15mL生长培养基的50mL锥形管。在环境温度下以1350rpm到1500rpm使细胞离心5到7分钟。在离心之后，通过倾倒或抽吸将培养基去除。在任一种情况下，要注意避免损失细胞团块。对团块进行轻弹团块以使细胞重悬，然后将30mL生长培养基添加到细胞。将15mL细胞悬浮液添加到两个T175培养瓶中的每一个。将附加的15mL培养基添加到每个培养瓶。将细胞培养瓶放置到具有5％CO₂的37℃加湿室中并允许细胞黏附并增殖。

每3到4天改变培养基，直到细胞达到80到90％汇流。当细胞达到80到90％汇流时，去除培养基，并用大约10mL PBS将黏附细胞清洗1次。从培养瓶抽出PBS。将15mL TrypLE添加到培养瓶，并在37℃下的具有5％CO₂的加湿室中将培养瓶孵化5到8分钟。添加相同体积的生长培养基以熄灭TrypLE活性。用手掌心不间断地轻拍培养瓶，以从培养瓶表面驱除细胞。使用10mL或25mL移液管将细胞转移到含有附加的15mL生长培养基的50mL锥形管。

在环境温度下以1350rpm到1500rpm使细胞离心5到7分钟。

在离心之后，通过倾倒或抽吸将培养基去除。在任一种情况下，要注意避免损失细胞团块。轻弹团块以使细胞重悬成大约2.5到3.0mL。去除200μl以用于细胞计数和活力测定。在计数后，将剩余的细胞稀释到附加的约17mL培养基中并在环境温度下以1350到1500rpm离心5到7分钟。在离心后，抽出培养基，通过轻弹使团块重悬，并用冷冻保存培养基将细胞重组成2到3mL的最终体积，并如本文所述地转移到预标记的冷冻小瓶并冷冻。

用于细胞培养的培养基添加剂

生长/回归因子—EGF、bFGF、TGF-B1或-B3、IGF-I、ITS(胰岛素，甲状腺素，硒)、非基本氨基酸补充、无血清培养基(细胞核生物学、生理学SF)

底料添加剂：对于骨修复：抗坏血酸盐、地塞米松、维生素D3，具有或没有BMP-2。对于软骨：BMP-6、TGF-B3、ITS。对于神经指示：FGF-10、BDNF、N₂培养基补充物(ThermoFisher)、来自其他细胞类型的条件培养液(即来自神经胶质细胞/干细胞培养物的神经元条件培养液)。

对于免疫调节指示：来自受促炎性激动剂(脂多糖，又称作LPS、伴刀豆球蛋白A)刺激的淋巴细胞的条件培养液。可以使用来自同种异体或自体来源的淋巴细胞。

对于血管生成：来自组织的脱细胞基质、VEGF+胎盘生长因子(P1GF)+血管生成蛋白或血管生成素A。可以使用来自同种异体或自体来源的脱细胞基质。

为了解冻细胞，在37℃水浴中温热选择的水性培养基。通过缓和地摇动小瓶，在37℃水浴中快速解冻细胞。允许解冻1.5到2分钟。不要淹没小瓶。当仅剩余小的冷冻细胞团块时，去除小瓶。不要使细胞形成漩涡。用适当量的温培养基来稀释细胞。在室温下将样本以1450±50rpm进行离心5分钟。从管去除上清液并重悬在2到5mL新的生长培养基中。测定细胞活力和数目。

处理生殖组织的替代性优化方法

在兽医诊所收集客户的宠物的劁或阉割组织并在特殊容器中运送到加伦特实验室(Gallant Laboratory)。根据标准化接收/收入规程对组织进行处理。一旦接受组织进行处理，就将组织转移到实验室，以开始原代细胞分数(PCF)剂量的产生，所述生产通过使用生物安全柜(BSC)以无菌方式进行。

在处于BSC中时，将组织绞碎成小块。在绞碎后，添加酶溶液以消化组织块。酶溶液由可购得的胶原酶和中性蛋白酶(例如，DE10、VitaCyte)组成。

在位于设置在37℃的干式热孵化器中的摇床平台上使组织保持在悬浮液中40分钟。一旦样本已消化了40分钟，即将样本返回到BSC。用含有胎牛血清的孵化培养基(10％，FBS)使反应停止，接着用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释。

使组织消化悬浮液通过一堆细胞粗滤器(300或100μm/70μm/40μm叠加的粗滤器(Coming))，以将释放的细胞与组织块分开。用PBS清洗过滤器中的剩余块，此后，丢弃细胞粗滤器。对收集到的细胞进行离心并用PBS清洗两次。在第二次清洗之前，获得等分试样并测定细胞计数和活力。在第二次离心之后，去除上清液并将细胞团块重悬在适当体积的冷冻保存流体中以产生PCF剂量。

为了优化处理生殖组织以获得本文描述的生殖组织衍生细胞的方法，本发明包括：从劁手术或阉割手术获得生殖组织；绞碎所述生殖组织；用酶溶液使所述绞碎的生殖组织消化以获得组织悬浮液；搅拌所述组织悬浮液，使得交互机械搅拌(例如，摇摆)被施加到所述组织悬浮液；过滤所述组织悬浮液以得到单细胞悬浮液馏分和部分消化的生殖组织馏分；对所述细胞悬浮液馏分进行离心以形成第一离心细胞团块并使所述第一离心细胞团块重悬成为单细胞悬浮液；在孵化培养基(例如处于37℃)中孵化所述部分消化的生殖组织馏分，使得细胞从所述部分消化的生殖组织馏分迁移到所述孵化培养基中；对所述孵化培养基进行离心以形成第二离心细胞团块并使所述第二离心细胞团块重悬成为迁移细胞悬浮液；组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞。

为了优化本发明的生殖组织处理方法，可以利用增强型手动机械处理技术的使用。具体地，可以使用更大的机械搅拌的施加。举例来说，在优化手动方法中，在37℃的孵化周期中，每隔10分钟摇晃含有组织块和酶促消化溶液的管(摇晃40次)。

在用利用标准酶消化溶液和摇摆的上述非优化方法处理的一系列犬科子宫组织中，每克经过处理的劁组织的活细胞的平均产量是1.3x10⁶个细胞/克(n＝6)。对于用本文中概述的增强型手动机械搅拌(每隔10分钟摇晃40次)和标准酶消化流体规程处理的犬科子宫组织，每克经过处理的劁组织的活细胞平均产量是7.0x10⁶个细胞/克(n＝5)。

为了进一步优化本发明的生殖组织处理方法，可以利用增强型非手动机械处理技术的使用。举例来说，机械搅拌可以使用旋转器，如PTR-60旋转器(Grant USA,Inc.，BeaverFalls，PA)来施加。PTR-60提供三种模式的机械搅拌：围绕平台的长轴旋转，交互运动，和平台振动。可以对这些运动编程，使得可以施加较少的旋转机械搅拌和更多的交互/振动机械搅拌。附加的设置包括平台的角度/振动的持续时间，以及交互运动的弧度及其持续时间。将机械搅拌的这三种模式集成到能够持续规定持续时间的单个过程中。使用利用由胶原酶MA酶材料和嗜热菌蛋白酶(都来自VitaCyte,Inc.)组成的酶制剂的PTR-60旋转器导致如下的平均细胞产量/克：对于劁组织，5.54x10⁶(n＝5)，对于阉割组织，7.16x10⁶(n＝5)。这些结果都基本上高于从客户拥有的用标准方法处理的样本获得的值(利用标准酶促消化溶液并摇摆)，其中劁组织具有1.3x10⁶(n＝6)的平均细胞产量/克，阉割组织具有1.8x10⁶(n＝6)。

为了优化本发明的生殖组织处理方法，可以实现对部分消化的组织块和细胞悬浮液的修改处置。在典型规程中，组织消化在一组细胞粗滤器中发生，以便从组织块分离出组织消化中存在的单细胞，此后，丢弃细胞粗滤器。在本发明的优化规程中，在将单细胞悬浮液从组织块分离之后，将含有组织块的细胞粗滤器中的一个或多个放置在无菌6孔盘中的少量孵化培养基(例如，PBS)中并允许细胞粗滤器在37℃下孵化1到2小时。在附加的孵化周期结束时，用PBS冲洗组织块以回收与组织块相关联的附加细胞，并且收集孔中的流体。对收集到的流体进行离心，丢弃上清液并用少量PBS使团块重悬。组合这个制剂与先前在过程中获得的单细胞悬浮液，在此期间已将单细胞悬浮液储存在4℃下。对组合的等分试样测定细胞计数和活力，并且对制剂进行离心。去除上清液并使团块以适当体积重悬以生产一种或多种临床剂量。已经显露出来自部分消化的组织块的随时间的细胞迁移(表1)，因此本发明方法旨在回收在组织块在PBS中进行孵化的有限持续时间期间释放的任何附加细胞。

为了进一步优化本发明，可以将部分消化的生殖组织冷冻保存。在增强型机械搅拌方法中，用消化组织细胞外基质的一部分的酶溶液对组织块进行处理，由此释放出细胞。然而，消化程度将视组织块的性质(例如所消化的组织的物理尺寸和密度)改变。

一旦单细胞悬浮液已被回收，包括在组织块在6孔盘中的延长搁置时段之后，可以回收组织块并使组织块悬浮在冷冻小瓶中的冷冻保存流体中，并且放置在类似于用于上述临床剂量的储存装置的LN₂储存装置中。冷冻保存部分消化的组织块的益处取决于活细胞的存在。

在一些实施方案中，本文公开的方法导致从生殖组织分离出的单细胞的总产量提高。在一些实施方案中，组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞使从所述生殖组织分离出的单细胞的总产量提高。在一些实施方案中，与仅在所述细胞悬浮液馏分中分离出的单细胞的总产量相比，组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞使从所述生殖组织分离出的单细胞的总产量提高至少50％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、220％、240％、260％、280％、300％、320％、340％、360％、380％或400％，或在由前述百分比中的任意两者限定的范围内的任何百分比。在一些实施方案中，组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞得到以下的从所述生殖组织分离出的单细胞的总产量：每克生殖组织约3x10^6、4x10^6、5x10^6、6x10^6、7x10^6、8x10^6、9x10^6或10^7个细胞，或在由前述细胞数中的任意两者限定的范围内的任何细胞数。

生殖组织衍生细胞的活动机制

在一些实施方案中，生殖组织衍生细胞功能包括消炎/免疫调节效果。使用本发明的方法获得的生殖组织衍生细胞限制炎症反应并且促进消炎通路。当存在于炎性环境中时，本发明的细胞可以更改免疫细胞的细胞因子分泌分布，从而导致从促炎性环境变换到消炎或耐性环境。

在一些实施方案中，生殖组织衍生细胞功能包括营养支持。本发明的生殖组织衍生细胞分泌支持血管生成、组织重塑、分化以及抗凋亡事件的生物活性级细胞因子和生长因子。本发明的细胞分泌许多血管生成相关的细胞因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)。

在一些实施方案中，生殖组织衍生细胞功能包括分化。本发明的生殖组织衍生细胞预计显露多样可塑性，包括分化成脂肪、骨骼、软骨、肌肉、心肌、内皮谱系、肝、神经、上皮谱系以及造血谱系。因此，本发明的细胞能够经由移植植入和分化来修复损伤或疾病组织，包括例如跟腱修复、数字屈指肌腱损伤、修复骨关节炎中的半月板损伤和骨再生与修复。

在一些实施方案中，生殖组织衍生细胞功能展现归巢。本发明的生殖组织衍生细胞与归巢或趋化作用有关，其中细胞从身体的一个区域迁移到需要治疗效果的远距离损伤部位。这个功能由例如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的细胞因子的分泌引起。

在一些实施方案中，生殖组织衍生细胞功能包括组织修复和血管再生。本发明的生殖组织衍生细胞可以包括内皮祖细胞、干细胞以及通过分泌细胞因子(例如血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、肝生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)以及巨噬细胞炎症蛋白-1β)来帮助血管生成和新生血管形成的其他祖细胞。

在一些实施方案中，生殖组织衍生细胞功能包括抗细胞凋亡。凋亡被定义为细胞程序性死亡或“细胞自杀”，是基因控制的事件。本发明的生殖组织衍生细胞通过表达支持细胞存活的因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)以及肝细胞生长因子(HGF)，来减少细胞凋亡。

生殖组织衍生细胞的冷冻保存和解冻

在一些实施方案中，以维持活细胞组合物的所选择水平的方式将生殖组织衍生细胞组合物与包括二甲基亚砜(DMSO)的水性冷冻保存培养基组合。DMSO是在冷冻保存中使用以在细胞膜中形成实现分子的快速膜间通过的瞬态空穴的化学品，并且已经展现出减小冷冻保存期间的细胞毒性。也减小冷冻保存期间的细胞毒性的DMSO的替代品(例如，不含DMSO的冷冻保存培养基)也是本发明预期的。可以进一步将包括DMSO的生殖组织衍生细胞组合物与抗凋亡试剂组合。细胞与DMSO的组合可以用任何合适的方式进行。细胞与DMSO和抗凋亡试剂的组合可以用任何合适的方式进行，包括通过将活细胞与含有DMSO和抗凋亡试剂两者的溶液组合，或通过将细胞与单独溶液组合，所述溶液中的一种含有DMSO，另一种含有抗凋亡试剂。将理解，冷冻保存培养基可以含有除DMSO和抗凋亡试剂以外的试剂，包括其他冷冻保存试剂。然而，在优选形式中，DMSO将组成除水以外的冷冻保存培养基的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％或至少20％，或在由前述百分比中的任意两者限定的范围内的任何百分比。

在要冷冻保存的优选制备的生殖组织衍生的活细胞组合物中，冷冻保存培养基将包括浓度为约10％或更小、5％或更小或约3％或更小、在约1％到3％的范围内或在约1.5％到约2.5％的范围内的DMSO。在某些优选形式中，冷冻保存培养基包括浓度为约10％的DMSO。

在要冷冻保存的优选制备生殖组织衍生的活细胞组合物中，活细胞将以至少约200,000个细胞/ml、至少约500,000个细胞/ml、至少约1百万个细胞/ml、至少约2百万个细胞/ml、至少约5百万个细胞/ml或至少约10百万个细胞/ml的浓度或在由前述细胞浓度中的任意两者限定的范围内的任何细胞浓度存在。

使用本发明的方法获得的生殖组织衍生的活细胞组合物在4℃或液氮下的储存之前和之后并且在以低于12℃的温度下运输或搁置之后都显露出高活力程度。在某些实施方案中，如通过标准计数方法(例如，台盼蓝染料排除法)测定的紧接在制备本发明的活细胞组合物之后的活细胞的百分比为至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、80％、90％或95％。在相关实施方案中，如通过标准计数方法(例如，台盼蓝染料排除法)测定的在解冻之前的活细胞的百分比为至少30％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、85％或90％。在另一个实施方案中，如通过标准计数方法测定的在24小时内的冷冻储存或冰包运输之后的活细胞的百分比为至少、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

非冷冻(液体)形式的包括活细胞和上文公开的冷冻保存培养基的生殖组织衍生的活细胞组合物可以在冷冻保存容器中制备，输送到冷冻保存容器中，或以其他方式提供在冷冻保存容器中，冷冻保存容器例如冷冻保存小瓶或冷冻保存袋。在优选形式中，每个冷冻保存容器将含有约1ml到约10ml细胞组合物，更优选地约1ml到约5ml组合物，并且最优选地约1ml到约3ml组合物。用于本文中的实施方案中的优选冷冻保存小瓶是可购得的。

含有活细胞组合物的冷冻保存容器可以承受冷冻保存条件以储藏组合物。举例来说，冷冻保存条件可以包括在活细胞组合物结冰时的温度下储存冷冻保存容器。举例来说，细胞组合物可以在处于约-60℃或更低的范围内的温度下保持在冷冻保存状态下，例如在约-60℃到-150℃、更优选约-60℃到-100℃并且甚至更优选约-70℃到-90℃的范围内。在某些形式下，细胞组合物可以在约-80℃/-5℃的温度下保持在冷冻保存状态下在一些实施方案中，可以将含有活细胞组合物的冷冻保存容器在外科设施、制造设施、储存设施或分配设施或在护理点设施附近的任何其他设施处在冷冻保存条件下储存(例如浸没在液氮中和/或机械冷冻装置中)，可以将含有活细胞的冷冻保存容器在保持冷冻保存条件(例如在含有液氮系统和/或干冰/冷冻二氧化碳的运输包装中)的同时运输到护理点，并且可以将含有活细胞的冷冻保存容器在冷冻保存条件下储存在护理点(例如兽医诊所或医院)，直到需要给药，优选储存在机械冷冻装置内，如本文公开的。

含有细胞和水性冷冻保存培养基(例如包括DMSO的冷冻保存培养基)的优选生殖组织衍生的活细胞组合物展现出在约-60℃到-196℃的范围内的温度下储存期间保持细胞活力的良好能力。举例来说，取决于初始的患者衍生样本的组成，当在范围是-60℃到-196℃的温度下储存六个月的时段时，并且更优选地，当在范围是-60℃到-196℃的温度下储存一年的时段时，优选组合物将损失不超过20％的初始活细胞、不超过10％的活细胞或不超过5％的活细胞。相对适中的冷却条件下的这些储存稳定性允许有利的产品分配和使用方法，其中多个护理点位置(例如10个或更多个或20个或更多个位置)可以保持储存有各自含有如本文描述的细胞组合物的多个冷冻保存容器的机械冷冻装置。细胞活力在这些储存条件下的稳定性可以在护理点提供可接受的贮存期。在一些实施方案中，细胞活力保持稳定或接近稳定持续数个小时(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时内)。直接在给药之前(例如在6小时内，或在2小时内，或在1小时内)，可以将冷冻保存容器从冷冻装置取出并将冷冻保存容器中的组合物解冻以用于附加操作(例如如下文所述的稀释)和/或给药。

在本文中的一些方法中，为了解冻细胞组合物，可以使冷冻保存容器温热到冷冻的细胞组合物恢复到液体形式时的温度。这可以用任何合适的方式达成。举例来说，保持无菌密封的容器可以在室温(例如约20℃到25℃)下暴露于气态环境(例如护理点处的室内空气环境)，以解冻细胞组合物。在另一种形式中，容器可以在加热液体或珠浴中进行孵化以解冻细胞组合物，例如加热到在约33℃到37℃的范围内、优选约37℃的温度。细胞组合物的冷冻保存和随后的解冻将优选地导致细胞活力的高度保持，例如解冻的组合物能够回收至少60％到至少90％的活细胞。

在解冻后，可以从冷冻保存容器去除活细胞组合物。举例来说，在一些实施方案中，冷冻保存容器具有隔片，针或其他插管装置可以穿过隔片接近容器内容物，同时保持容器内的无菌环境。针或其他插管装置接着可以用于无菌地从容器抽取细胞组合物例如到注射针筒或其他器皿中。将理解，在其他实施方案中，可以使用用于接近冷冻保存容器内的细胞组合物并从冷冻保存容器去除活细胞组合物的其他方法。

在一些形式中，活细胞组合物可以给药到患者，或进行研究或其他用途，在从冷冻保存容器去除后，活细胞组合物的组成就不能修改。在一些实施方案中，针对包括用于给药到患者的用途对活细胞组合物进行修改。修改可以包括例如将一种或多种物质添加到活细胞组合物。

在优选方法中，将活细胞组合物与水性培养基组合以稀释组合物的细胞浓度，并且也有可能稀释活细胞组合物的其他组分(例如DMSO)的浓度。在有益的方面，水性培养基可以是生理上可接受的水性液体，例如磷酸盐缓冲或其他缓冲盐水溶液，有可能具有其他添加剂。还将理解，可以将水性培养基与活细胞组合物组合成为单一体积的给定组合物或多种体积的相同组合物或不同组合物。

在优选方法中，为了制备用于给药到患者或其他用途的稀释活细胞组合物，将以至少2:1、至少3:1、至少5:1或至少8:1的体积比将水性培养基与细胞组合物组合。在更优选形式中，这个体积比将在约3:1到约20:1或约5:1到约15:1的范围内。将考虑到，所制备的稀释组合物中的细胞浓度和DMSO浓度将相对于稀释之前的起始细胞组合物相应地减小；然而，在一些形式中，用于稀释的水性培养基本身可能含有一定浓度的细胞、添加剂、试剂和/或DMSO，虽然通常低于起始细胞组合物中的浓度，以便导致细胞和DMSO在稀释细胞组合物中的一定稀释。

解冻的细胞组合物与水性培养基的组合可以在任何合适的容器或器皿中进行。在有益的模式中，在第二容器(储存或保持细胞的冷冻保存或其他容器除外)中进行组合。这个第二容器可以包括输入端口或其他输入部件(例如隔片)以用于将例如细胞组合物和/或水性培养基的材料无菌转移到第二容器中。在一些形式中，组合细胞组合物与水性培养基可以包括将这两种材料一起例如有序地或同时地输送到第二容器中。在其他形式中，第二容器可以提供为在无菌条件下已经含有水性培养基的预制容器，并且可以将细胞组合物添加到预制容器。在这些实施方案中的任何一个中，第二容器可以是袋和/或可以具有与输入端口或其他部件隔开的出口端口以用于输送来自袋或其他容器的所制备的稀释细胞组合物，例如输送到患者。第二容器可以是具有用于无菌输入材料的隔片和用于输出材料的带阀端口的袋，例如如用于医疗处理中的患者治疗的常见盐水袋中存在的。解冻的细胞组合物和可能的稀释培养基(如果没有预制在袋中)可以用针穿过隔片无菌地输送到袋中，并且所制备的稀释细胞组合物可以通过带阀端口无菌地输送到患者。

在某些实施方案中，将水性培养基与活细胞组合物组合，并且所制备的稀释细胞组合物将具有已经从初始水平(例如上文关于冷冻保存的细胞组合物指示的那些水平中的任何一个)减小到不超过约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.3％、0.1％或0.05％或在由前述浓度中的任意两者限定的范围内的任何DMSO浓度的稀释浓度的DMSO浓度。在一些实施方案中，DMSO浓度为约0.3％或更小。在一些实施方案中，DMSO浓度在约0.05％到约0.5％的范围内或在约0.1％到约0.3％的范围内。关于稀释细胞组合物中的细胞浓度，水性培养基通常不会含有任何细胞，并且稀释后活细胞组合物的细胞浓度将低于起始细胞组合物的细胞浓度，例如在约100,000个细胞/ml到约20百万个细胞/ml或约250,000个细胞/ml到约5百万个细胞/ml或约500,000个细胞/ml到约2百万个细胞/ml的范围内。在某些形式中，所制备的稀释细胞组合物的细胞浓度将为约1百万个细胞/ml。

在本文中的某些实施方案中，水性培养基将含有用于减少解冻后细胞死亡的试剂或添加剂，例如，抗凋亡试剂、添加剂或化合物。抗凋亡试剂或添加剂的实例包括例如抗血小板应答蛋白抗体、促进Bcl-2表达和细胞存活的化合物、自由基氧类产生的抑制剂(包括但不限于维生素E、褪黑[激]素、白藜芦醇、肌肽、辅酶Q10、胱天蛋白酶抑制剂、GSK-3B抑制剂：锂、帕罗酮(paullone)、靛玉红、噻唑、氨基嘧啶、双吲哚马来酰亚胺(由GlaxoSmithKline开发的SB-216763和SB-41528)、PPAR激动剂(例如罗格列酮和曲格列酮)、米诺环素、Cox-2抑制剂或塞来昔布(Celecoxib)。附加的保护性水性组合物可以包括商用产品，如细胞解冻培养基(BioLife Solutions)或HypoThermosol(BioLife)。因此，将水性培养基与细胞组合物组合，并且所制备的稀释细胞组合物将具有抗凋亡剂浓度，所述抗凋亡剂浓度高于DMSO的浓度，和/或为至少约0.1％，更优选为至少约0.3％，并且在一些实施方案中为在约0.1％到约6％的范围内或在约0.3％到约2％的范围内的浓度。

水性培养基可含有任何合适浓度的试剂或添加剂。举例来说，抗结块添加剂可以用于这些目的。在某些方面，水性培养基将以按重量约1％到约20％或按重量约1％到约10％或按重量约2％到约7％或按重量约2.5％到约5％或按重量约3％到约4％的浓度含有试剂或添加剂，例如抗结块试剂或添加剂。无论是否含有如本文中规定的试剂或添加剂，水性培养基也可以包括其他组分和/或具有规定渗量。举例来说，水性培养基可以包括生理上可接受水平(例如在约0.5％到约1.5％的范围内的水平，例如约0.9％)的氯化钠(等渗)。水性培养基也可以包括例如磷酸盐缓冲液的缓冲液，并且可以具有在约6到8或约6.8到7.8或约7到7.5的范围内的pH。水性培养基也可以具有在每千克200到600毫渗模(mosm/kg)或250到500mosm/kg或250到400mosm/kg的范围内的渗量。

可以将含有试剂或添加剂(例如，抗结块试剂或添加剂)的水性培养基与含有DMSO的细胞组合物组合，以制备含有试剂或添加剂(例如，抗结块试剂或添加剂)的稀释细胞组合物，所述稀释细胞组合物具有合适浓度的试剂或添加剂(例如，抗结块试剂或添加剂)以及DMSO(例如以针对上文规定的稀释细胞组合物的浓度具有DMSO)。在某些实施方案中，所制备的稀释后活细胞组合物中的试剂或添加剂(例如，抗结块试剂或添加剂)的这个浓度在以下范围内：按重量计约1％到约10％，试剂或添加剂(例如，抗结块试剂或添加剂)，或按重量计约2％到约7％，或按重量计约2.5％到约5％，或按重量计约3％到约4％。另外或替代地，与没有试剂或添加剂(例如，抗结块试剂或添加剂)的相应细胞组合物相比，试剂或添加剂(例如，抗结块试剂或添加剂)浓度可以有效地抑制细胞结块。抑制结块可以通过例如在制备细胞组合物后至少十分钟、在制备细胞组合物后至少二十分钟或在制备细胞组合物后至少60分钟的时间点在所制备的细胞组合物中形成较少和/或较小的细胞团来观测。试剂或添加剂(例如，抗结块试剂或添加剂)在制备细胞组合物后的重要时间段中抑制结块的能力可以例如提供足够的时间向患者给药所制备的细胞组合物，例如通过经由静脉或动脉接近和/或经由局部植入细胞组合物而将细胞组合物注射或注入到患者的血流中。在细胞组合物的治疗应用中，可以经过相对延长的时间段(例如至少10分钟，至少20分钟，或至少60分钟)向患者给药组合物。

如本文所公开的，所制备的稀释后活细胞组合物可以具有规定浓度的细胞、DMSO、试剂或添加剂(例如，抗凋亡试剂或添加剂)和/或试剂或添加剂(例如，抗结块试剂或添加剂)。在说明最小或最大浓度或浓度范围的情况下，将理解，可以控制起始活细胞组合物的稀释条件以达到所制备的稀释后活细胞组合物中的说明量。这些条件包括例如稀释前的起始活细胞组合物中的组分的的浓度、所用的水性培养基相对于起始活细胞组合物的体积比和水性培养基中的已确定组分的浓度(如果有)。

本文中的附加实施方案包括用于制备如本文所述的稀释细胞组合物的产品。在一个实施方案中，提供用于制备稀释细胞组合物的水性培养基。水性培养基可以按照如本文规定的量含有那些组分。水性培养基也可以用无菌形式提供在包括于试剂盒(kit)中的容器中。容器可以是小瓶、袋或其他容器。在某些形式中，容器具有上述的“第二容器”(稀释细胞组合物可以在其中制备)的特征，包括例如具有入口端口或其他部件(例如针隔片)和单独的出口端口，如上所述。本文公开的试剂盒可以包括含有水性培养基以及一种或多种附加组分的容器，例如包括但不限于液体转移装置，例如注射器和附接的或可附接的针，并且也可能包括含有将用于制备稀释细胞组合物的起始细胞组合物的容器。含有起始细胞组合物的容器可以包括处于冷冻保存状态(例如用试剂盒冷冻运输)或处于非冷冻保存(例如在先前冷冻保存细胞的情况下解冻)状态的细胞组合物，包括冷冻保存细胞组合物以上文规定的那些量中的任何一个含有DMSO的实施方案。本文公开的试剂盒也可以包括：至少一个过滤器，例如Hemo-Nate过滤器，所制备的稀释细胞组合物可以在给药到患者之前通过所述过滤器；和/或管，稀释细胞组合物可以在给药到患者期间通过所述管。

细胞输送

术语“个体”、“患者”、“受试者”可互换地指代哺乳动物，例如，人类、非人类灵长动物、驯化哺乳动物(例如，犬科动物或猫科动物)、农业哺乳动物(例如，马科动物、牛、绵羊、猪)或实验室哺乳动物(例如，家鼠、鼠类、兔类动物、仓鼠)。

如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指的是延迟术语所应用到的疾病或病状(即，干眼综合症或干眼疾病)或这种疾病或病状的一种或多种症状的发生、减缓或逆转疾病或病状(即，干眼综合症或干眼疾病)或这种疾病或病状的一种或多种症状的进程、降低疾病或病状(即，干眼综合症或干眼疾病)或这种疾病或病状的一种或多种症状严重性或消除或预防疾病或病状(即，干眼综合症或干眼疾病)或这种疾病或病状的一种或多种症状。

术语“减轻”指的是减少或消除病理或疾病的一种或多种症状，和/或减少病理或疾病的一种或多种症状的速度或延迟病理或疾病的一种或多种症状的发生或严重性，和/或预防病理或疾病。

术语“有效量”或“治疗有效量”指的是足以诱发所要的生物结果(例如，预防、延迟、减少或抑制一种或多种症状)的有效试剂的量。结果可以是征象、症状或致病原因的缓解，或生物系统的任何其他所要改变。术语“"治疗有效量”在本文中用于表示配方产品在一段时间中反复地施加到感染区域时导致疾病病状的实质改善的任何量。所述量将随着所治疗的病状、病状的发展阶段和所施加的配方产品的类型和浓度改变。任何给定例子中的适当量是本领域技术人员显而易见的，或者能够通过常规实验确定。

如本文所用，术语“治疗效果”涵盖如上所述的治疗效益和/或预防效益。预防效果包括延迟或消除疾病或病状的出现、延迟或消除疾病或病状的症状的发生、减慢、暂停或逆转疾病或病状的进程，或其任何组合。

如本文所用，“给药”指的是局部和全身给药，例如，包括肠内和肠外给药。在本发明中使用的针对细胞的给药途径包括例如栓剂给药、静脉(“iv”)、腹膜内(“ip”)、肌内(“im”)、皮内、鞘内(“it”)、病灶内、鼻内或皮下(“sc”)给药。给药也可以局部于靶或受损组织。举例来说，对于干眼症，细胞可以用眼周、泪腺内、泪腺外、结膜下方式给药、植入或移植到眼皮间质中(例如，在睑缘处)、迈博姆腺中或周围。给药可以通过任何适当的途径进行，使得细胞所分泌的免疫抑制剂预防、减少或抑制对靶组织(例如，泪腺和/或睑板腺和/或结膜的杯状细胞)的破坏或损害。肠外给药包括例如静脉、肌内、动脉内、脑室内、皮内、鞘内、皮下、腹腔内以及直肠内给药

在某些实施方案中，活细胞群体存在于为了适应输送到患者并且适合输送到患者的组合物内，即，生理上相容。因此，活细胞群体的组合物还经常包括一种或多种缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、糖类(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或，葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(例如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)、辅助剂(例如，氢氧化铝)、使配方产品与受体的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。

细胞群体及相关组合物可以通过多种不同的方式提供给患者。制备的细胞组合物可以用任何合适的方式向患者给药。在某些实施方案中，细胞群体及相关组合物被例如局部地提供到实际或可能受伤的部位。在一个实施方案中，使用在可能或实际受伤或疾病的部分注射组合物的注射器提供细胞群体及相关组合物。在其他实施方案中，全身地提供细胞群体及相关组合物。在某些形式中，细胞组合物被全身地输送到患者的血流，例如通过输送到静脉或动脉中。在一个实施方案中，通过静脉或通过动脉将细胞群体及相关组合物给药到血流。特定给药途径将很大程度上取决于要治疗或预防的疾病或损伤的位置和性质。因此，本发明包括经由任何已知并可用的方法或途径来提供本发明的细胞群体或组合物，所述方法或途径包括但不限于口腔、肠外、静脉、动脉、鼻内、皮内、鞘内以及肌内给药。在治疗患者时可以使用这些给药模式中的任何一个或这些给药模式的任何组合。

在某些组合治疗中，可以将第一量的本文中的制备细胞组合物全身地输送到患者的血流中，并且在患者的一个或多个骨骼关节中或附近局部地植入第二量的本文中的制备细胞组合物(例如与第一量一起制备或与第一量分开制备并且包括相同类型或不同类型的细胞)，以治疗关节炎，例如本文中确定的那些关节炎中的任何一种。而且，在本文中的患者治疗中，在一些实施方案中中，可以进行单次给药如本文所述的制备细胞组合物，而在其他实施方案中，可以在一段时间中进行多次分开给药如本文所述的制备细胞组合物(例如按周或按月给药)。在另外的实施方案中，可以在给药到患者之前对所制备的稀释细胞组合物进行过滤，例如以去除可能存在的任何细胞团。在某些形式中，细胞组合物可以通过定位在管中的直列式过滤器，细胞组合物通过所述过滤器进入患者的血流中，例如进入患者的静脉或动脉中。在某些变体中，这种过滤器可以具有约200微米或更小的颗粒大小截止值(即最大横截面尺寸大于约200微米的颗粒不能通过)，或约170微米或更小的颗粒大小截止值，或约100微米或更小的颗粒大小截止值，同时允许单个悬浮的细胞通过过滤器。

在一个具体实施方案中，一种治疗方法包括在实际或可能损伤的部位(例如腱或韧带)将包括从狗、猫或马的生殖组织分离出的活细胞并根据本发明的方法制备的组合物注射到同一个或不同的狗、猫或马中。

为了在多种治疗方案(包括例如口腔、肠外、静脉、鼻内、鞘内以及肌内给药)和配方产品中使用本文描述的细胞群体和组合物的合适剂量和治疗方案的开发将再次很大程度上由要治疗或预防的疾病或损伤和给药途径驱使。合适剂量和治疗方案的确定可以容易基于本领域中一般知道的信息来完成。

治疗可以包括单次治疗或多次治疗。特别地，为了预防目的，在某些实施方案中要考虑到，在可能潜在地造成损伤的应激，例如动物比赛(例如，赛狗或赛马)，之前给药本发明的活细胞群体。

实例

实例1：标准生殖组织处理方案

在兽医诊所收集客户的宠物的劁或阉割组织并在特殊容器中运送到加伦特实验室(Gallant Laboratory)。根据标准化接收/收入规程对组织进行处理。一旦接受组织用于处理，即将组织转移到实验室以开始产生PCF剂量，所述产生以无菌方式通过使用生物安全柜(BSC)进行。

在处于BSC中的同时将组织绞碎成小块。在绞碎后，添加酶溶液以消化组织块。酶溶液由可购得的胶原酶和中性蛋白酶制品(DE10、VitaCyte)组成。

在位于设置在37℃的干式热孵化器中的摇床平台上使组织保持在悬浮液中40分钟。一旦样本已经消化40分钟，则使样本返回BSC。用含有胎牛血清的孵化培养基(10％，FBS)使反应停止，接着用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释。

使组织消化悬浮液通过一堆细胞粗滤器(300或100μm/70μm/40μm叠加的粗滤器(Coming))，以将释放的细胞与组织块分开。用PBS清洗过滤器中的剩余块，此后，丢弃细胞粗滤器。对收集到的细胞进行离心并用PBS清洗两次。

在第二次清洗之前，获得等分试样并测定细胞计数和活力。在第二次离心之后，去除上清液并将细胞团块重悬在适当体积的冷冻保存流体中以产生PCF剂量。

实例2：经过优化的生殖组织处理方案

将增强型手动机械处理技术用于产生PCF

上面列出的标准规程的重要变化涉及应用更强的机械搅拌。在经过修改的手动方法中，在37℃的孵化周期中，每隔10分钟即手动摇晃含有组织块和酶促消化溶液的管(摇晃40次)。在用利用标准酶消化溶液的标准规程处理的一系列犬科子宫组织中，每克经过处理的劁组织的活细胞的平均产量是1.3x10⁶个细胞/克(n＝6)。对于用本部分中概述的增强型手动机械搅拌和标准酶消化流体规程处理的犬科子宫组织，每克经过处理的劁组织的活细胞的平均产量是7.0x10⁶个细胞/克(n＝5)。

将增强型非手动机械处理技术用于产生PCF

机械搅拌也可以与旋转器，如PTR-60旋转器(Grant USA,Inc.,Beaver Falls,PA)，的使用一起应用。PTR-60提供三种模式的机械搅拌：围绕平台的长轴旋转，交互运动，和平台振动。可以对这些运动编程，使得可以施加较少的旋转机械搅拌和更多的交互/振动机械搅拌。附加的设置包括平台的角度/振动的持续时间，以及交互运动的弧度及其持续时间。机械搅拌的这三种模式集成到能够持续规定持续时间的单个过程中。

使用具有由胶原酶MA酶材料和嗜热菌蛋白酶(都来自VitaCyte,Inc.)组成的酶制剂的PTR-60旋转器导致如下的每克平均细胞产量：对于劁组织，5.54x10⁶(n＝5)，而对于阉割组织，7.16x10⁶(n＝5)。这些结果都基本上大于从客户拥有的用标准方法处理的样本获得的值，其中劁组织具有1.3x10⁶(n＝6)的平均细胞产量/克，阉割组织具有1.8x10⁶(n＝6)。

在分离出细胞之后对组织块的修改处置

在标准规程中，组织消化在一组细胞粗滤器中发生，以便从组织块分离出组织消化中存在的单细胞，此后，丢弃细胞粗滤器。在本发明的优化规程中，在将单细胞悬浮液从组织块分离之后，将含有组织块的细胞粗滤器中的一个或多个放置在无菌6孔盘中的少量例如PBS中并允许细胞粗滤器在37℃下孵化1到2小时。在附加的孵化周期结束时，用PBS冲洗组织块以回收与组织块相关联的附加细胞，并且收集孔中的流体。

对收集到的流体进行离心，丢弃上清液并用少量PBS使团块重悬。组合这个制剂与先前在过程中获得的单细胞悬浮液，在此期间已将单细胞悬浮液储存在4℃下。对组合的等分试样测定细胞计数和活力，并且对制剂进行离心，去除上清液并使团块以适当体积重悬以生产PCF剂量。已经显露出来自部分消化的组织块的随时间的细胞迁移(表1)，因此本发明方法旨在回收在组织块在PBS中进行孵化的有限持续时间期间释放的任何附加细胞。

消化的组织块的冷冻保存

在增强型机械搅拌方法中，用消化组织细胞外基质的一部分的酶溶液对组织块进行处理，由此释放出细胞。然而，消化程度将视组织块的性质(例如所消化的组织的物理尺寸和密度)改变，并且在从不同受试者分离的组织之间。一旦单细胞悬浮液已被回收，包括在组织块在6孔盘中的延长搁置时段之后，可以回收组织块并使组织块悬浮在冷冻小瓶中的冷冻保存流体中，并且放置在类似于用于PCF剂量的储存装置的LN₂储存装置中。冷冻保存部分消化的组织块的益处取决于活细胞的存在。

在实验中观测在利用上述的增强型手动搅拌方法(每隔10分钟摇晃40次)进行处理之后获得的部分消化的组织块中的活细胞的存在，在所述实验中，在与单细胞悬浮液分离之后，对组织块进行培养。在平板接种后的第1天，从培养瓶回收组织块并将组织块转移到新的培养瓶，并且在第2天、第3天和第4天重复所述过程。用标准酶促脱离方法回收每个培养瓶中的细胞并对细胞计数。表1中示出了利用手动机械搅拌方法从两种供体子宫组织衍生消化物获得的细胞的总数。

表1：在培养组织块后利用手动机械搅拌从子宫组织衍生消化物获得的细胞总数

如表1所示，迁移出培养的组织块的细胞的数目随培养时间改变，还取决于供体。然而，从两种供体获得的部分消化的组织块含有能够随时间迁移出组织块的活细胞。

从酶促消化获得的部分消化的组织块的冷冻保存

可以执行如劁或阉割组织的组织的消化，以获得不含组织的制剂，如在章节中关于用于生产PCF的标准规程所描述的，期望将所述制剂用于组织来自的同一患者的治疗使用(自体使用)。

在另一个实施方案中，冷冻保存部分消化的组织和释放的细胞两者通过活细胞存在于组织块中来支持，如表1所示。储存在组织消化后获得的组织和细胞有两个选项。如果PCF制剂旨在用作治疗剂量，则的组织应当与PCF冷冻保存“剂量”分开储存。在这个实施方案中，有三种PCF剂量，和单独地，可获得的患者的组织块。在这个布置中，PCF剂量可以在请求后供应。然而，如果客户/患者本人请求增大细胞数，则可以将PCF制剂和组织块均进行培养。另一方面，如果PCF制剂将在未来始终进行培养，将细胞和组织块一起储存在同一个容器中是有利的。组织块和细胞被储存在一起的制剂被称作原代细胞馏分-组织(PCF-T)。

如果组织被消化以创造同种异体剂量，则可以使用这种配置。在这个情况下，释放出的细胞在未来将仅进行培养，因此在冷冻保存期间不需要将细胞与组织块分开。冷冻保存部分消化的组织块提供一种在将PCF和组织块一起培养时增大细胞数的方式，这是因为组织块是附加活细胞的来源，如表1所示。培养患者细胞的一个选项是解冻PCF剂量并将回收的细胞放置到组织培养瓶中。如果将部分消化的组织块冷冻保存，则可以回收冷冻保存的组织，并将组织放置在具有来自PCF剂量的解冻细胞的组织培养瓶中。这个方法的益处是部分消化的组织中剩余的任何细胞会对孵化培养基做出反应并迁移出组织块。组织中存在的生长因子也会向外扩散到培养流体中。添加组织衍生生长因子和从部分消化的组织迁移的细胞将提高继续扩增患者细胞的概率，由此创造更多治疗剂量。

当发现PCF制剂被污染并且进行培养时，存在类似的机会。可以将患者的冷冻保存组织解冻并与PCF细胞组合，以便提高PCF细胞继续扩增的可能性。

在预期供体组织将用于创造同种异体剂量的情况下，将细胞和部分消化的组织一起储存在小瓶中提供了保持细胞/组织制剂的机会，以供随后在未来培养循环期间使用而不需要获得并处理新的供体组织。这个方法允许管理负载并且提供保持先前消化的组织和细胞的储备来源的方式。

在先前描述的实施方案中的至少一些实施方案中，实施方案中所用的一个或多个要素在另一个实施方案中可以互换地使用，除非这种取代在技术上不可行。本领域技术人员将了解，可以对上述的方法和结构做出各种其他省略、添加和修改而不脱离所要求的主题的范围。预期所有这些修改和变化将落在如随附权利要求限定的主题的范围内。

关于基本上任何复数和/或单数术语在本文中的使用，本领域技术人员可以将复数转译成单数和/或将单数转译成复数以适合上下文和/或应用。为清楚起见，可以在本文中明确地陈述各种单数/复数排列。

本领域技术人员将理解，一般地，本文中，尤其是权利要求(例如，随附权利要求的主体)中所用的术语通常意欲是“开放式”术语(例如，术语“包括”应当解释为“包括但不限于”，术语“具有”应当解释为“至少具有”，术语“包括”应当解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员还将理解，如果介绍的权利要求叙述的具体数字是预期的，则这种意图将在权利要求中明确地叙述，而在没有这种叙述时，不存在这种意图。举例来说，为了帮助理解，随附权利要求可以含有使用“至少一个/至少一种”和“一个或多个/一种或多种”的介绍性短语来介绍权利要求叙述。然而，这些短语的使用不应被解释为暗示用不定冠词“一种”或“一个”来介绍权利要求叙述将含有这样介绍的权利要求叙述的任何特定权利要求限于仅含有一个这种叙述的实施方案，即使当同样的权利要求包括介绍性短语“一个或多个/一种或多种”或“至少一个/至少一种”和不定冠词例如“一种”或“一个”(例如，“一个”和/或“一种”应当解译成意味着“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”)时；对于使用定冠词来介绍权利要求叙述，理解相同。另外，即使明确地叙述了介绍的权利要求叙述的具体数字，本领域技术人员也将认识到，这种叙述应当被解译成意味着至少所叙述的数目(例如，没有其他修饰词的“两条叙述”的基本叙述意味着至少两条叙述，或两条或更多条叙述)。此外，在使用类似于“A、B和C中的至少一个/一种等”的约定的那些例子中，一般地，在本领域技术人员可理解的意义上，这样的句式预期约定(例如，“具有A、B和C中的至少一个/一种的系统”将包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、一起具有A和B、一起具有A和C、一起具有B和C和/或一起具有A、B和C的系统，诸如此类)。在使用类似于“A、B或C中的至少一个/一种等”的约定的那些例子中，一般地，在本领域技术人员可理解的意义上，这样的句式预期约定(例如，“具有A、B或C中的至少一个/一种的系统”将包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、一起具有A和B、一起具有A和C、一起具有B和C和/或一起具有A、B和C的系统，诸如此类)。本领域技术人员还将理解，实际上，无论在描述中，还是在权利要求中，表示两个或更多更替代项的任何转折词语和/或短语都应当理解为预期包括所述项中的一个、所述项中的任一个或两个所述项目的可能性。举例来说，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

另外，在从马库什组(Markush groups)方面来描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开因此也从马库什组的各个成员或成员子组方面进行描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，例如从提供书面描述方面，本文公开的所有范围也涵盖所述范围的任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围可以容易辨识为充分地描述并且实现同一个范围被分成至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性实例，本文公开的每个范围可以容易分成上、中、下三份等。如本领域技术人员也将理解的，例如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”以及类似词语的所有语言包括所叙述的数字并且指的是随后可以分成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个别成员。因此，例如，具有1到3个条款的组是指具有1、2或3个条款的组。类似地，具有1到5个条款的组是指具有1、2、3、4或5个条款的组，诸如此类。

所有引用的参考文件包括遍及本申请引用的文献参考、颁布的专利、公开的专利申请以及同在申请中的专利申请)的内容特此明确地以全文引用方式并入。以引用方式并入的公开案和专利或专利申请与说明书中包含的公开矛盾的范围内，预期说明书将取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。本领域技术人员将认识到或能够至多使用常规实验确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等效物。预期这些等效物被随附权利要求包括。

Claims (32)

1.一种处理生殖组织以获得生殖组织衍生细胞的方法，所述方法包括：

a.从劁或阉割手术获得生殖组织；

b.绞碎所述生殖组织；

c.将所述绞碎的生殖组织与酶溶液混合以获得组织悬浮液；

d.搅拌所述组织悬浮液，使得机械搅拌被施加到所述组织悬浮液；

e.过滤所述组织悬浮液以得到细胞悬浮液馏分和部分消化的生殖组织馏分；

f.对所述细胞悬浮液馏分进行离心以形成第一离心细胞团块并使所述第一离心细胞团块重悬成为单细胞悬浮液；

g.在孵化培养基中孵化所述部分消化的生殖组织馏分，使得细胞从所述部分消化的生殖组织馏分迁移到所述孵化培养基中；

h.对所述孵化培养基进行离心以形成第二离心细胞团块并使所述第二离心细胞团块重悬成为迁移细胞悬浮液；以及

i.组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述生殖组织是来自精巢、卵巢、输精管、外附睾、输卵管或子宫或其任何组合的组织。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生殖组织是犬科的或猫科的。

4.如权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述生殖组织是从劁或阉割手术获得的。

5.如权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述酶溶液由胶原酶或中性蛋白酶或两者组成。

6.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述搅拌在设置在37℃的干式热孵化器中执行。

7.如权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述搅拌执行至少40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200分钟，或在由前述时间中的任意两者限定的范围内的任何时间。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述搅拌执行至少四十分钟或更长时间。

9.如权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述搅拌执行最多5、10、15、20、25、30、35或40分钟，或在由前述时间中的任意两者限定的范围内的任何时间。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述搅拌执行最多四十分钟。

11.如权利要求1到10中任一项所述的方法，其中搅拌所述组织悬浮液，使得交互和振动机械搅拌都被施加到所述组织悬浮液。

12.如权利要求1到11中任一项所述的方法，其中搅拌所述组织悬浮液，使得旋转机械搅拌不施加到所述组织悬浮液。

13.如权利要求1到12中任一项所述的方法，其中在平台上执行所述搅拌。

14.如权利要求1到13中任一项所述的方法，其中所述过滤步骤包括使所述组织悬浮液通过一个或多个细胞粗滤器以将所述细胞悬浮液馏分与所述部分消化的组织馏分分开。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述一个或多个细胞粗滤器包括300μm、100μm、70μm或40μm粗滤器，或其任何组合。

16.如权利要求1到15中任一项所述的方法，其中将所述单细胞悬浮液馏分储存在4℃下。

17.如权利要求1到16中任一项所述的方法，其中孵化所述部分消化的生殖组织馏分持续不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或在由前述时间中的任意两者限定的范围内的任何时间。

18.如权利要求17所述的方法，其中孵化所述部分消化的生殖组织馏分持续两小时或更短时间。

19.如权利要求1到18中任一项所述的方法，其中将所述单细胞悬浮液馏分冷冻保存。

20.如权利要求1到19中任一项所述的方法，其中将所述部分消化的生殖组织馏分冷冻保存。

21.如权利要求1到20中任一项所述的方法，其中将所述单细胞悬浮液和所述部分消化的生殖组织馏分一起冷冻保存在同一个小瓶中。

22.如权利要求19到21中任一项所述的方法，所述方法还包括解冻所述单细胞悬浮液和所述部分消化的生殖组织馏分。

23.如权利要求22所述的方法，所述方法还包括将所述解冻的单细胞悬浮液和所述解冻的部分消化的生殖组织在同一个组织培养瓶中一起孵化。

24.如权利要求1到23中任一项所述的方法，其中生殖组织衍生细胞从所述部分消化的生殖组织馏分迁移到所述孵化培养基中。

25.如权利要求1到24中任一项所述的方法，其中生殖组织衍生生长因子从所述部分消化的生殖组织馏分扩散到所述孵化培养基中。

26.如权利要求1到25中任一项所述的方法，其中对所述培养基进行离心以获得包括生殖组织衍生细胞的细胞团块。

27.如权利要求1到26中任一项所述的方法，其中组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞使从所述生殖组织分离出的单细胞的总产量提高。

28.如权利要求1到27中任一项所述的方法，其中与仅在所述细胞悬浮液馏分中分离出的单细胞的总产量相比，组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞使从所述生殖组织分离出的单细胞的总产量提高至少50％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、220％、240％、260％、280％、300％、320％、340％、360％、380％或400％，或在由前述百分比中的任意两者限定的范围内的任何百分比。

29.如权利要求1到28中任一项所述的方法，其中组合所述单细胞悬浮液与所述迁移细胞悬浮液以获得所述生殖组织衍生细胞得到以下的从所述生殖组织分离出的单细胞的总产量：每克生殖组织约3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶、9x10⁶或10⁷个细胞，或在由前述细胞数中的任意两者限定的范围内的任何细胞数。

30.一种冷冻保存部分酶促消化的组织的方法，所述方法包括：

a.获得组织；

b.绞碎所述组织；

c.将所述绞碎的组织与酶溶液混合以获得组织悬浮液；

d.搅拌所述组织悬浮液，使得机械搅拌被施加到所述组织悬浮液；

e.过滤所述组织悬浮液以得到细胞悬浮液馏分和部分消化的生殖组织馏分；以及

f.冷冻保存所述部分消化的组织馏分。

31.如权利要求27所述的方法，其中冷冻保存所述部分消化的组织馏分而不冷冻保存所述细胞悬浮液馏分地。

32.如权利要求27所述的方法，其中将所述部分消化的组织与所述细胞悬浮液馏分一起冷冻保存。