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CN117003866B - 一种抗calr突变蛋白抗体、制备方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种抗calr突变蛋白抗体、制备方法及检测试剂盒 Download PDF

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CN117003866B CN202311067686.1A CN202311067686A CN117003866B CN 117003866 B CN117003866 B CN 117003866B CN 202311067686 A CN202311067686 A CN 202311067686A CN 117003866 B CN117003866 B CN 117003866B
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Abstract

本发明涉及生物领域，公开了一种抗CALR突变蛋白抗体，所述抗体包括框架区和互补决定区；所述互补决定区包括CDR‑VH1、CDR‑VH2和CDR‑VH3，CDR‑VL1、CDR‑VL2和CDR‑VL3；所述互补决定区CDR‑VH1序列为SEQ ID NO.1；所述互补决定区CDR‑VH2序列为SEQ ID NO.2；所述互补决定区CDR‑VH3序列为SEQ ID NO.3；所述互补决定区CDR‑VL1序列为SEQ ID NO.4；所述互补决定区CDR‑VL2序列为SEQ ID NO.5；所述互补决定区CDR‑VL3序列为SEQ ID NO.6。

Description

一种抗CALR突变蛋白抗体、制备方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及抗体制备和免疫学检测的技术领域，具体涉及一种抗CALR(骨髓增殖性肿瘤标志物钙网)突变蛋白抗体、制备方法及检测试剂盒
背景技术
骨髓增殖性肿瘤(MPN)是一类起源于骨髓造血干细胞的克隆性、慢性增殖性疾病，主要包括真性红细胞增多症(PV)、血小板增多症(ET)与骨髓纤维化(MF)等。
近年来，JAK2、MPL和TET等多个分子标志物的突变相继被发现，这些标志物的发现对于MPN的检测和诊断具有重要意义。但是，研究表明，有30％-45％的携有野生型JAK2/MPL的ET或MF患者仍然存在诊断困难。
近年来，多项研究表明在JAK2突变呈阴性的MPN病人中发现特征性的钙网蛋白(CALR)突变，这就提示钙网蛋白(CALR)突变有望成为诊断骨髓增殖性肿瘤又一种新的分子标志物。
目前研究显示，CALR的突变类型已超过50种类，最常见的突变类型为9号外显子上52个碱基的缺失(p.L367fs*46，I型突变)和5个碱基TTGTC的插入(p.K385fs*47，II型突变)，携带这二型突变的患者数量约占携带所有CALR突变患者人数的80％。尽管CALR第9外显子的缺失或插入突变多种多样，但无论何种突变形式，都会导致一个碱基对的读码框移位，继而产生一种具有缺乏内质网保留序列(KDEL氨基酸序列)的新型的C-羧基末端的蛋白，针对此CALR突变肽段的检测可能成为临床检测CALR突变的新思路。
目前，已有研究根据CALR突变蛋白的该特点制备了多克隆抗体和单克隆抗体(CAL2)，用于MPN患者骨髓组织的免疫组织化学染色，其中多克隆抗体存在非特异性着色，CAL2虽为单克隆抗体，但只能用于福尔马林固定骨髓蜡块的免疫组织化学检测，结果分析严重依赖技术人员主观判断，无法实现标志物的标准化检测和疾病诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种抗CALR突变蛋白抗体，所述抗体包括框架区和互补决定区；所述互补决定区包括CDR-VH1、CDR-VH2和CDR-VH3，CDR-VL1、CDR-VL2和CDR-VL3；所述互补决定区CDR-VH1序列为SEQ ID NO.1；所述互补决定区CDR-VH2序列为SEQ ID NO.2；所述互补决定区CDR-VH3序列为SEQ ID NO.3；所述互补决定区CDR-VL1序列为SEQ ID NO.4；所述互补决定区CDR-VL2序列为SEQ ID NO.5；所述互补决定区CDR-VL3序列为SEQ ID NO.6。
作为对所述的抗CALR突变蛋白抗体的改进，所述抗体的重链互补决定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；轻链互补决定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
作为对所述的抗CALR突变蛋白抗体的进一步改进，所述抗体包括序列依次如SEQID NO:7-10所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H；序列依次如SEQ ID NO:11-14所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L。
作为对所述的抗CALR突变蛋白抗体的进一步改进，所述抗体还包含恒定区。
作为对所述的抗CALR突变蛋白抗体的进一步改进，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的任意一者的恒定区。
作为对所述的抗CALR突变蛋白抗体的进一步改进，所述恒定区的种属来源为牛、羊、兔、小鼠、大鼠或人。
一种抗CALR突变蛋白抗体的制备方法，包括如下步骤：S1依据CALR突变蛋白C-羧基末端异常的氨基酸区段，设计并合成优势抗原表位多肽，将多肽偶联载体蛋白成完全抗原；S2将上步制备的完全抗原与弗氏完全佐剂等体积混合并乳化均匀；Balb/c小鼠多次免疫后，每只小鼠眼眶采血，离心分离血清；S3测定血清效价，取血清效价大于107的小鼠进行脾内加强免疫；S4加强免疫后取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按比例融合；S5融合后加入培养基终止融合，并用培养液重悬细胞，置于培养箱中培养；S6融合细胞培养后，检测细胞培养上清中的特异性抗体，获得杂交瘤细胞；S7取健康小鼠，腹腔注射石蜡后分别注射杂交瘤细胞后，收集腹水，得到单克隆抗体。
一种抗CALR突变蛋白抗体在制备检测血小板增多症和/或骨髓纤维化试剂中的应用。
一种用于血小板增多症和骨髓纤维化检测试剂盒，包括包被抗体和标记抗体；所述包被抗体为如权利要求1、2或者3所述的单克隆抗体；所述标记抗体为针对CALR蛋白N端的单克隆抗体。
作为对所述的血小板增多症和骨髓纤维化检测试剂盒的改进，该试剂盒为免疫组织化学试剂盒、酶联免疫试剂盒、化学发光免疫试剂盒、胶体金免疫试剂盒、免疫荧光试剂盒、及流式细胞术试剂盒中的任意一种。
本发明根据上述技术方案，有益效果如下：
通过本申请中提供的新型抗CALR突变蛋白的单克隆抗体，具有全新的抗原结合域，只特异性结合CALR突变蛋白，与野生型CALR蛋白不结合，具有较强的活性和亲和力，稳定性高等优点。
上述单克隆抗体及试剂盒在运用于血清CALR突变蛋白的检测，具有较强的特异性和较高的灵敏度，检测范围到达2.93-375ng/mL。
上述检测试剂可以能够有效推动CALR突变蛋白检测的应用，促进CALR突变蛋白检测纳入常规临床检测中，在血小板增多症和骨髓纤维化的临床诊断中具有重要的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍：
图1单克隆抗体抗原识别特异性检测(western blot)；
图2抗CALR突变蛋白的单克隆抗体免疫组织化学染色图；
图3CALR突变体蛋白酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒标准曲线；
图4酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测20例临床血清样品中CALR突变提蛋白浓度示例；
图5流式细胞术试剂盒检测CALR突变体细胞标准品判读方法示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全的描述。附图中给出了本发明的典型实施例。
实施例1抗CALR突变蛋白的单克隆抗体的制备与鉴定
1.1免疫原设计及制备
针对CALR突变蛋白C-羧基末端异常的氨基酸区段，根据各氨基酸区段的亲水性、表面可接触性、抗原倾向性等理论研究，设计优势抗原表位多肽CALR-1(SPARPRTSCREACLQGWTEA)，并设计野生型羧基末端抗原表位多肽CALR-2(EDEEDEEDKEEDEEEDVPGQAKDEL)作为对照；
采用戊二醛法将多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)进行偶联形成完全抗原(CALR-1-KLH、CALR-2-KLH、CALR-1-BSA、CALR-2-BSA)。
1.2小鼠免疫
将上步制备的CALR-1-KLH完全抗原与弗氏完全佐剂等体积混合并乳化均匀；
免疫6周龄Balb/c小鼠，采用皮下多点注射，免疫3次，每次间隔2周；
第3次免疫2周后，每只小鼠眼眶采血，离心分离血清，用间接ELISA测定血清效价，取血清效价大于107的小鼠进行脾内加强免疫。
1.3细胞融合
加强免疫后3天，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按6:1的比例融合，融合剂为PEG(MW1450，sigma)；
融合10分钟后加入新鲜无血清培养基终止融合，并用含2％ HAT的DMEM培养液重悬细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
1.4克隆筛选
融合细胞培养7-10天，用包被CALR-1-BSA和CALR-2-BSA的96孔板间接法检测细胞培养上清中的特异性抗体；
同一细胞株上清，若仅与CALR-1-BSA反应结果为阳性，而与CALR-2-BSA反应结果为阴性，则确定该细胞株为可分泌特异性识别CALR突变蛋白抗体的杂交瘤细胞株；
连续三次亚克隆后，经ELISA法检测抗体阳性率为100％时，确定为稳定表达目的抗体的杂交瘤细胞，最终获得3株特异性强、效价高的杂交瘤细胞，分别命名为Cal26B10、Cal26B11、Cal26B15，并进行保藏。
1.5鼠单克隆抗体的制备与纯化
取健康F1小鼠，腹腔注射石蜡，0.5ml/只，7天后分别注射Cal26B10、Cal26B11、Cal26B15细胞，剂量为107个/只，7-10天后收集腹水，经辛酸-硫铵初纯及Protein A亲和纯化，得到纯度较高(>95％)鼠单克隆抗体。
1.6抗CALR突变蛋白单克隆特异性鉴定
收集血小板增多症(ET)与骨髓纤维化(MF)患者外周血，Ficoll分离外周血单个核细胞，提取总蛋白，采用Western blot方法检测抗体的特异性，并以慢病毒稳转CALR野生型质粒的293T细胞总蛋白为阴性对照，稳转CALR I型突变型和CALR II型突变型质粒的293T细胞总蛋白为阳性对照。
Western blot结果显示(如图1所示)，Cal26B10、Cal26B11、Cal26B15可与CALR突变阳性的临床外周血单个核细胞样本及过表达突变型CALR蛋白的293T细胞样本反应，而与过表达野生型CALR蛋白的293T细胞样本不反应，表明抗体特异性较好。
图1(制备抗体特异性检测结果)中，WT：过表达野生型CALR的293T细胞；del52：过表达CALR I型突变的293T细胞；ins5：过表达CALR II型突变的293T细胞；P1：携带CALR I型突变的MPN患者外周血PBMC细胞；P2：携带CALR II型突变的MPN患者外周血PBMC细胞。
实施例2抗CALR突变蛋白的单克隆抗体亲和力测定
使用WeSPR 100测定各抗体亲和力，结果如表1(抗CALR突变蛋白单克隆抗体亲和力检测结果)所示。选择亲和力最高的Cal26B11作为检测用抗CALR突变蛋白的单克隆抗体，用于后续检测和进一步研发。
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
Cal26B10 1.24×105 6.80×10-4 5.48×10-9
Cal26B11 3.00×105 1.77×10-4 5.90×10-10
Cal26B15 4.48×105 3.36×10-4 7.51×10-10
表1抗CALR突变蛋白单克隆抗体亲和力检测结果
实施例3Cal26B11单克隆抗体可变区的分析
3.1基因钓取
单克隆抗体Cal26B11杂交瘤细胞株进行扩培，待进入对数生长周期，取107个细胞，提取细胞总RNA，通过反转录获得cDNA产物，将该产物用rTaq DNA聚合酶进扩增并回收后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取重链和轻链基因克隆各3个克隆送基因测序公司进行测序。
3.2重链和轻链可变区基因的序列分析
编码单克隆抗体Cal26B1的重链可变区的核苷酸序列(345bp)如下：
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGTTCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGACCTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAAAGCCAACATATGCTGGTGACTTCAAGGGACGATTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACGACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTTCAAGCCAATTACGAGGGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
重链可变区CDRH1氨基酸序列：
GYTFTNY(SEQ ID NO:1)
重链可变区CDRH2氨基酸序列：
NTYTGK(SEQ ID NO:2)
重链可变区CDRH3氨基酸序列：
FCSSQLRGAY(SEQ ID NO:3)
重链框架区氨基酸序列:
FR1-H：QIQLVQSGPVLKKPGETVKISCKAS(SEQ ID NO:7)
FR2-H：GMTWVKQAPGKGLKWMGWI(SEQ ID NO:8)
FR3-H：PTYAGDFKGRFAFSLETSASTAYLQINDLKNEDTATY(SEQ ID NO:9)
FR4-H：WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:10)
编码单克隆抗体C8F3的轻链可变区的核苷酸序列(339bp)如下：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCGTCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTACCAATCAGAAGAACTCCTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
轻链可变区CDRL1氨基酸序列：
KSSQSLLYSTNQKNSLA(SEQ ID NO:4)
轻链可变区CDRL2氨基酸序列：
WASTRES(SEQ ID NO:5)
轻链可变区CDRL3氨基酸序列:
CQQYYSYPWT(SEQ ID NO:6)
轻链框架区氨基酸序列:
FR1-L：DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSC(SEQ ID NO:11)
FR2-L：WYQQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:12)
FR3-L：GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYY(SEQ ID NO:13)
FR4-L：FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:14)
实施例4Cal26B11单克隆抗体与人MPN样本的免疫组织化学染色研究
4.1临床样本收集
收集2015年-2017年华山医院北院和长海医院门诊及住院病房的MPN(PV、ET、MF)患者骨髓组织蜡块，共28例；
其中携带CALRI突变的5例，携带CALRII突变的4例，携带CALR V(c.1091_1142del)突变的1例，JAK2突变的18例，采用Cal26B11抗体对收集的临床样本免疫组织化学染色；
根据ASCO/CAP指南(American Society of Clinical Oncology/College ofAmerican Pathologists)对免疫组织化学染色结果进行评分。
4.2免疫组织化学染色
(1)选取MPN患者组织蜡块，获取4μm的组织石蜡切片。
(2)室温下用二甲苯脱蜡2次，每次10分钟。
(3)乙醇梯度洗涤，去除二甲苯，双蒸水中洗5分钟。
(4)用0.3％H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，室温10分钟。
(5)双蒸水中洗4次，每次5分钟。
(6)将Cal26B11单克隆抗体滴加在组织切片上，4℃孵育12小时。
(7)PBS缓冲液冼4次，每次5分钟。
(8)滴加辣根过氧化物酶标记的第二抗体，37℃孵育30分钟。
(9)PBS缓冲液冼4次，每次5分钟。
(10)滴加DAB显色剂，室温孵育显色。
(11)双蒸水洗4次，每次5分钟。
(12)晾干，封片，显微镜观察。
结果发现免疫组织化学染色结果与Sanger测序结果完全一致，且仅存在CALR突变的样本着色阳性，而不携带CALR突变的样本则不着色(图2)。
样本编号 临床诊断 Sanger测序检测 CALR突变体免疫组化结果
P1 PV JAK2 V617F —
P2 PV JAK2 V617F —
P3 PV JAK2 V617F —
P4 PV JAK2 V617F —
P5 PV JAK2 V617F —
P6 PV JAK2 V617F —
P7 PV JAK2 V617F —
P8 ET CALR I型 巨核细胞(3+)
P9 ET CALR I型 多形核粒细胞(1+)
P10 ET JAK2 V617F —
P11 ET CALR II型 巨核细胞(1+)
P12 ET JAK2 V617F —
P13 ET JAK2 V617F —
P14 ET CALR I型 巨核细胞(2+)多形核粒细胞(1+)
P15 ET JAK2 V617F —
P16 ET CALR I型 多形核粒细胞(1+)
P17 ET JAK2 V617F —
P18 ET JAK2 V617F —
P19 ET CALR V型 巨核细胞(3+)多形核粒细胞(1+)
P20 ET CALR II型 多形核粒细胞(1+)
P21 ET JAK2 V617F —
P22 ET CALR II型 多形核粒细胞(1+)
P23 PMF JAK2 V617F —
P24 PMF CALR I型 PMN(1+)
P25 PMF JAK2 V617F —
P26 PMF JAK2 V617F —
P27 PMF CALR II型 PMN(1+)
P28 PMF JAK2 V617F —
表2 28例MPN患者的临床诊断、基因检测及病理分析结果
图2、Cal26B11抗体用于免疫组织化学方法对MPN患者骨髓切片染色结果(×200倍)中A-I对应表2中相关样本编号：
A:对应的样本编号为P8；
B:对应的样本编号为P9；
C:对应的样本编号为P11；
D:对应的样本编号为P14；
E:对应的样本编号为P19；
F:对应的样本编号为P20；
G:对应的样本编号为P22；
H:对应的样本编号为P24；
I:对应的样本编号为P28。
实施例5CALR突变蛋白检测试剂盒的建立
试剂盒中包含包被抗体Cal26B11和标记抗体C7492(Sigma-Aldrich)，该试剂盒为酶联反应试剂盒，具体操作步骤如下：
用CB将包被抗体Cal26B11稀释到10μg/ml，以每孔100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜；
翌日将酶标板拍干，每孔加入200μl封闭液(含1％BSA的PBS)，于37℃下封闭2h，封闭结束后并拍干；
每孔加入标准品或患者血清样本(患者血清样本需稀释3倍)100μl；
37℃孵育1h后洗板3次，洗液为0.05％的PBST；
用含1％BSA的洗液将酶标抗体稀释成1000倍的工作液，每孔加50μl，37℃孵育30min，然后洗板5次并拍干；
每孔加入100μl TMB显色液，37℃孵育10min；
每孔加50μl加入终止液，在酶标仪上用450nm读取OD值。
5.1试剂盒检测线性
将CALR突变标准品蛋白(375ng/mL)用阴性血清以2倍梯度稀释至2.93ng/mL，并对各个梯度稀释的样本进行检测，测量吸光值并绘制标准曲线，以P/N值大于等于2作为阳性结果，并最低值高于空白OD值的两倍作为检出限，其结果如表3和图3所示。
表3、配对抗体的线性检测
通过上述表3和图3的实验数据可知，本申请中采用包被抗体Cal26B11和标记抗体C7492(Sigma-Aldrich)得到的试剂盒，在抗原浓度低至2.93ng/mL的浓度下依旧具有明显的阳性表现，在2.93-375ng/mL之间可呈现较好的线性关系，拟合系数均大于0.99。以此，可证明本申请中所采用的单克隆抗体，具有较低检出限，在实际运用中，灵敏度高，在定性检测方面具有广阔的运用前景。
5.2试剂盒检测精密度
将CALR突变标准品蛋白按一定浓度加入到阴性血清中，进行试剂批内差分析，每个样品做3次平行测试，批内CV小于5％，批内精密度符合要求。
将CALR突变标准品蛋白按一定浓度加入到阴性血清中，用3批试剂进行检测，连续检测5天，进行试剂批间差分析，批间CV小于3％，批间精密度符合要求(表4)。
表4标准品浓度和对应的吸光度(OD)值
5.3试剂盒检测特异性
试剂盒检测同时检测同浓度CALR突变蛋白标准品和CALR野生型蛋白标准品(187.5ng/mL、46.88ng/mL、11.72ng/mL)，采用t检验进行统计学分析，p<0.05，结果证明所建立的CALR突变蛋白ELISA试剂盒特异性较好(表5)。
表5标准品浓度和对应的吸光度(OD)值
5.4试剂盒检测临床样本
选取CALR突变患者血清10例(I型-J1522、J1525、J1526、J1531、J1535)及II型-J1550、J1567、J1576、J1580、J1675)，JAK2突变患者血清5例(J1504、J1505、J1516、J1538、J1618)，阴性患者血清标本5例(P1-P5)，用上述建立的CALR突变蛋白ELISA试剂进行检测，测得的CALR组浓度与JAK2组或野生组之间均有显著差异(表6、图4)。
图4中，ELISA试剂盒检测10例CALR突变MPN、5例JAK2突变MPN及5例正常体检志愿者血清，经分子检测方法确认CALR突变的患者，外周血清CALR突变体蛋白浓度显著高于JAK2突变型MPN及正常体检志愿者。
通过上述实验数据可知，本申请中的CALR突变蛋白ELISA试剂具有较好的灵敏度、特异性，较高的批内、批间精密度，证明了上述试剂盒的具有出色的性能。
患者编号 吸光度值 CALR蛋白浓度 患者编号 吸光度值 CALR蛋白浓度
J1522 0.1371 20.84 J1504 0.0883 4.56
J1525 0.1321 18.51 J1505 0.0832 4.11
J1526 0.1082 7.4 J1516 0.0813 3.94
J1531 0.1221 13.86 J1538 0.0749 3.37
J1535 0.1652 33.91 J1618 0.0781 3.65
J1550 0.1711 36.65 P1 0.0577 1.84
J1567 0.1457 24.84 P2 0.08 3.82
J1576 0.1346 19.67 P3 0.0908 4.78
J1580 0.2216 60.14 P4 0.0697 2.91
J1675 0.1639 33.3 P5 0.0675 2.71
表6临床样本检测吸光度值及对应CALR蛋白浓度
实施例6CALR突变蛋白流式细胞术检测试剂盒的建立
试剂盒中包含CALR突变蛋白特异性结合抗体Cal26B11(一抗)和荧光标记二抗山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488(abcam)，该试剂盒为流式细胞术检测试剂盒，具体操作步骤如下：
胰酶消化收集细胞，300g离心6分钟；
去上清，加入1ml PBS洗涤，300g离心6分钟，去上清；
每106细胞加入100μl 4％多聚甲醛固定，混匀；
室温孵育20分钟；
加入1ml PBS洗涤细胞，300g离心6分钟，去上清，并重复一次(清洗细胞两次，即重复一次加入1ml PBS洗涤细胞，300g离心6分钟，去上清)；
每106细胞加入100μl预冷的90％甲醇破膜，冰上孵育15分钟；
加入1ml PBS洗涤，300g离心6分钟，去上清，并重复一次(加入1ml PBS洗涤细胞，300g离心6分钟，去上清)；
加入10μg/ml浓度的一抗100μl，充分混匀，4℃避光孵育1小时；
加入1ml PBS洗涤，300g离心6分钟，去上清，并重复一次(清洗细胞两次，即重复一次加入1ml PBS洗涤细胞，300g离心6分钟，去上清)；
加入用0.5μg/ml浓度的二抗，充分混匀，4℃避光孵育30分钟；
加入1ml PBS洗涤，300g离心6分钟，去上清，并重复一次(清洗细胞两次，即重复一次加入1ml PBS洗涤细胞，300g离心6分钟，去上清)。
加入350μl的PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测，结果见图5，图5中，使用HEK-293T细胞过表达mCherry空载体、mCherry-CALR野生型融合蛋白、mCherry-CALR T1型突变融合蛋白、mCherry-CALR T2型突变融合蛋白，制备细胞标准品。流式细胞术以AF488绿色荧光检测CALR蛋白突变体，CALR突变型样品检出显著的绿色荧光阳性信号。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种抗CALR突变蛋白抗体，其特征在于，所述抗体包括框架区和互补决定区；
所述互补决定区包括CDR-VH1、CDR-VH2和CDR-VH3，CDR-VL1、CDR-VL2和CDR-VL3；
所述互补决定区CDR-VH1序列为SEQ ID NO.1；
所述互补决定区CDR-VH2序列为SEQ ID NO.2；
所述互补决定区CDR-VH3序列为SEQ ID NO.3；
所述互补决定区CDR-VL1序列为SEQ ID NO.4；
所述互补决定区CDR-VL2序列为SEQ ID NO.5；
所述互补决定区CDR-VL3序列为SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的抗CALR突变蛋白抗体，其特征在于，所述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:7-10所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H；
序列依次如SEQ ID NO:11-14所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L。
3.根据权利要求1或者2所述的一种抗CALR突变蛋白抗体，其特征在于，所述抗体还包含恒定区。
4.根据权利要求3所述的抗CALR突变蛋白抗体，其特征在于，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的任意一者的恒定区。
5.根据权利要求3所述的抗CALR突变蛋白抗体，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、羊、兔、小鼠、大鼠或人。
6.根据要求1或者2所述抗CALR突变蛋白抗体在制备检测血小板增多症和/或骨髓纤维化试剂中的应用。
7.一种用于血小板增多症和骨髓纤维化检测试剂盒，其特征在于，包括包被抗体和标记抗体；
所述包被抗体为如权利要求1或者2所述的单克隆抗体；
所述标记抗体为针对CALR蛋白N端的单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的血小板增多症和骨髓纤维化检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒为免疫组织化学试剂盒、酶联免疫试剂盒、化学发光免疫试剂盒、胶体金免疫试剂盒、免疫荧光试剂盒、及流式细胞术试剂盒中的任意一种。
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