CN117003803A

CN117003803A - 一种三糖的新晶型

Info

Publication number: CN117003803A
Application number: CN202210493141.6A
Authority: CN
Inventors: 方诩; 殷文成; 姜福娇; 朱昌雄
Original assignee: Shandong Henglu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hengrui Qingdao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-07
Filing date: 2022-05-07
Publication date: 2023-11-07
Also published as: EP4431518A4; AU2023266722A1; WO2023216890A1; EP4431518A1; US20250042929A1

Abstract

本发明提供了一种乳糖‑N‑三糖（Lacto‑N‑triose II）晶型A，属于分离纯化技术领域。本发明所述乳糖‑N‑三糖晶型A，其粉末X射线衍射图在衍射角（2θ±0.2°）在为4.80、8.32、9.62、12.72、18.67、19.90、21.05、21.59位置有特征衍射峰。本发明提供了一种稳定的乳糖‑N‑三糖（Lacto‑N‑triose II）晶型A及其制备方法，实现了乳糖‑N‑三糖（Lacto‑N‑triose II）制备技术的迭代，为工业化大规模生产提供了可靠技术。

Description

一种三糖的新晶型

技术领域

本发明涉及一种乳糖-N-三糖的晶体，属于分离纯化技术领域。

背景技术

人乳寡糖（Human milk oligosaccharides，HMOs）是一类复合低聚糖，人乳中含量丰富且功能独特，由单糖及衍生物、唾液酸等结构单元通过糖苷键连接而成，至今已发现有200多种不同结构的低聚糖。然而，人们对它的认知却历经一百多年。

早在1886年，澳大利亚儿科医生和微生物学家Escherich就发现婴儿肠道细菌与消化功能存在联系。1900年，Moro和Tissier两位研究者分别证实母乳喂养和人工喂养的婴儿粪便中细菌组成不同。是否母乳中存在造成婴儿肠道细菌不同的成分呢。1926年， Schönfeld发现母乳的乳清中含有促进两歧双歧杆菌生长的促进因子。那么到底是乳清中的什么成分促使双歧杆菌的生长呢，1930年，法国科学家Polonowski和Lespagnol从母乳乳清中检测到具有碳水化合物特征的组分，命名为“gynolactose（乳寡糖）”。1954年，György证实促使双歧杆菌增长的因子“双歧因子”实为低聚糖。同年，Polonowski和Montreuil两位科学家采用二维纸色谱分析法从乳寡糖中分离出低聚糖。1983年，Egge等用快速原子轰击质谱法确认了HMOs，1999年，Coppa等人在母乳喂养的婴儿粪便中检测到30-50%的HMOs以其原始结构形态存在，2000年，有学者发现HMOs可耐受婴儿消化道内酶的水解，这一现象充分说明人乳寡糖的生物作用并非普通意义上的为婴儿提供物质和能量。

21世纪以来，随着研究方法的进步，人们发现母乳总HMOs（酸性和中性低聚糖）浓度随泌乳期延长而下降；人们还发现HMOs对婴儿的生长发育，当前与长远健康非常重要，其可促进婴儿肠道微生态平衡，促进肠道内有益菌的增殖、抑制有害菌的生长、抵御病原菌感染，阻碍致病菌的定殖、预防炎症性大肠疾病和胃肠炎、调节免疫系统和促进婴儿的认知发育等。因此，及时补充HMOs将有利于维护婴幼儿的健康成长。然而，糖类的合成一直是合成工作者所面临的巨大挑战，因为从生物体内糖链的合成来看，这类分子的合成不是单一模板的复制，而是由多种糖基转移酶和糖苷酶共同调控，从而也就决定了糖链结构的复杂性、多样性和微观不均一性。可喜的是，随着糖化学和重组酶学的快速发展，糖化学家和糖生物学家在糖合成领域做了大量工作，相继报道了一系列合成寡糖的新方法和策略。

乳糖-N-三糖（英文名称 Lacto-N-trioseII ，简称LNTII，又称GlcNAc-β1, 3-Gal-β1, 4-Glc，CAS：75645-27-1，化学结构式如式1）。

LNTII是HMOs的主链前体，当前一般是通过化学法或生物法制备。据文献报道，其固体形式可通过蒸发浓缩后过滤干燥、冷冻技术或喷雾干燥的方式获得。中国发明专利CN112154150A （申请号201980034406.2）通过酶法发酵合成人乳寡糖，然后再进行酶处理、超滤、纳滤以及通过色谱柱的分离纯化干燥后得到固体寡糖，该专利泛泛的给出了固体形式的获得方法，但是没有提到采用结晶进行纯化。经多次实验证实，该方法所得到的是无定型固体。中国发明专利CN 109705175A （申请号201811603666.0）中记载了从含有中性人乳寡糖粗溶液中纯化中性人乳寡糖的方法，包括使用模拟移动床色谱以及浓缩、渗析和/或渗滤等纯化步骤，最后喷雾干燥得粒度为5-500微米的无定型粉末。CN104428307 (A)（WO2013/185780）公开了去除或至少大大降低HMO中有机溶剂残余物的量的方法，其包括将HMO的水溶液喷雾干燥的步骤，该方法提供无定形固体形式的HMO。

喷雾干燥方法在喷雾过程中原料容易粘在设备的内壁，有一定的物料损失，相对于结晶的分离纯化方法，存在能耗高、人工投入大、纯化效果低的问题，且高温过程中容易引起一些原料的物理化学性质变化、所得到的无定型粉末吸湿性强等缺陷，给产品的贮存和使用增加了难度。

CN110483652A（申请号201910501997.1）记载了冷冻干燥法获得人乳寡糖(HMOs)的技术，但冷冻干燥技术获得的冻干粉（无定型）在其保存、运输等过程也需要冷冻和/或低温，给产品的保存和使用提升了成本和难度；且冻干过程存在设备投入大，冻干过程能耗巨大、生产效率低的缺陷。

综上，为向市场提供稳定、成本低廉的LNTII固体形式，并满足产品迭代的需求，急需开发一种高效并可大规模工业化应用的LNTII分离方法，并提供具有更多优势的LNTII固体形式，以有利于工业化产品的贮存，加速其应用于乳制品、食品、药品、化妆品、和饲料等各种制品中，满足社会公众的需求。

发明内容

发明目的：提供一种稳定的LNTII新晶型及其制备方法，实现LNTII分离技术和固体产品形态的迭代，为工业化大规模生产提供可靠技术。

通过实验，申请人获得了LNTII新晶型，将其命名为LNTII晶型A。具体如下：

本发明的技术方案是：一种LNTII晶型A，其粉末X射线衍射谱在4.80、8.32、9.62、12.72、18.67、19.90、21.05和21.59的2θ值（2θ±0.2°）处有特征峰。

优选的，所述LNTII晶型A，其粉末X射线衍射谱在4.80、7.24、8.32、9.62、12.72、16.67、18.67、19.28、19.90、21.05、21.59、22.14和26.93的2θ值（2θ±0.2°）处有特征峰。

优选的，本发明所述晶型A，其粉末X射线衍射谱在4.80、7.24、8.32、9.62、12.72、16.67、17.35、18.67、19.28、19.90、20.72、21.05、21.59、22.14、23.17、23.71、24.15、25.20、26.93、29.12和29.49的2θ值（2θ±0.2°）处有特征峰。

优选的，本发明所述晶型A，其粉末X射线衍射谱在4.80、7.24、8.32、9.62、9.89、11.65、12.72、14.42、16.67、17.35、18.67、19.28、19.90、20.72、21.05、21.59、22.14、23.17、23.71、24.15、25.20、26.93、28.68、29.12、29.49、30.34、31.08、31.88和34.10的2θ值（2θ±0.2°）处有特征峰。

本发明所述LNTII晶型A的熔点在191-196℃范围；而现有技术公开的无定型粉末LNTII的熔点在130-134℃范围。

所述LNTII晶型A的制备方法包括如下步骤：

步骤1.制备含LNTII的溶液，备用。

优选的，所述LNTII溶液浓度在0.2-0.5 g/ml；

步骤2.将步骤1所得含LNTII溶液降温，优选的，降温至25℃及或低于25℃的温度，更优选的，降温速率以0.5℃/min为宜，不宜过快；备用。

步骤3.搅拌下，向步骤2溶液中加入丙酮，进行结晶。

优选的，丙酮的添加量等于或者大于水的体积，优选的，以水与丙酮的体积比为1:2-3为宜；更优选的为1:2.4-2.7，进一步优选的为1:2.5。

优选的，搅拌下，流加丙酮，流加速率为0.07-0.25ml/min；流加结束后，搅拌下养晶；

本步骤工艺也可以添加晶种；

优选的，结晶过程的搅拌速率为100r/min以上。

优选的，丙酮流加结束后，继续搅拌，养晶时间为不低于12小时为宜。

所述LNTII晶型A的制备方法，包括在含有LNTII的溶液中，分离该晶体，所述溶液的溶剂含有水和丙酮。

优选的，本发明所述LNTII晶型A，可以是经脱色、除盐等方式纯化后的含LNTII的发酵液添加丙酮后冷却结晶获得；也可以是LNTII固体制备为水溶液后，向其中添加丙酮后冷却结晶获得。所述冷却结晶，指冷却至25℃以下的温度。

本发明所述乳糖-N-三糖（Lacto-N-triose II）晶型A既可以作为合成其他糖或化合物的中间体，也可以作为终端产品应用。

有益效果：

本发明提供了一种稳定的LNTII晶型A及其制备方法，实现了LNTII制备技术的迭代，为工业化大规模生产提供了可靠技术。所述晶型A及制备方法相对于现有技术的无定型粉末及制备方法，具有以下优势：

（1）本发明所述LNTII晶型A的稳定性优于无定型粉末，有利于LNTII产品的长期贮存，以及在食品和药品中的应用。能够降低LNTII的包装成本，延长产品的保质期；

（2）所述晶型A的制备方法，有利于工业化LNTII产品的分离，降低生成成本，提高生产效率。

综上，本发明首次获得了LNTII晶型，实现了人乳寡糖分离技术的历史性跨越，并将惠及社会公众。

附图说明

图1. 乳糖-N-三糖（Lacto-N-triose II）无定型粉末X-射线衍射图谱。

图2. 乳糖-N-三糖（Lacto-N-triose II）晶型A的X-射线衍射图谱。

图3. 乳糖-N-三糖（Lacto-N-triose II）无定型粉末扫描电子显微镜(SEM)照片。

图4. 乳糖-N-三糖（Lacto-N-triose II）A晶型SEM照片。

图5. 乳糖-N-三糖（Lacto-N-triose II）无定型粉末和晶型A置于恒温恒湿箱前的形态（左边为无定型粉末，右边为LNTII晶型A）。

图6. 乳糖-N-三糖（Lacto-N-triose II）无定型粉末和晶型A置于恒温恒湿箱（25℃、相对湿度75%）中吸湿后的形态（左边为无定型粉末，右边为LNTII晶型A）。

具体实施方式

实施例中所述LNTII的固体形式可以根据公开文献制备，可以是喷雾得到的粉末，也可以是冻干粉或其他方式得到的固体。LNTII发酵液是根据现有技术获得的发酵液。

实施例1. 乙酰氨糖转移酶基因lgtA（18S::HPLgtA ）表达盒的建立:

1.1 HPLgtA编码区、ADH1终止区、半乳糖苷酶LAC4启动子区融合序列的获取：

全基因合成HPLgtA，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1所示。

半乳糖苷酶LAC4启动子区序列具体见SEQ ID NO:2。ADH1终止区序列具体见SEQID NO:3。

根据以上序列设计如下所示引物，见表1。

表1

。

分别利用HPLgtA基因、乳酸克鲁维酵母基因组、酿酒酵母基因组为模板进行PCR扩增，扩增组分见表2。

表2

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PCR扩增程序见表3。

表3

。

PCR反应程序结束后，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将大小符合预期的条带利用凝胶回收试剂盒进行纯化回收。将回收后产物利用微量测定仪进行DNA浓度测量，利用ddH2O稀释其浓度至1ng/μL。以稀释后的DNA片段为模板，ADH1-Not1和LAC4Pro-Nde1/LAC4Pro-S为引物进行融合PCR扩增，扩增组分见表4。

表4

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PCR扩增程序见表5。

表5

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PCR反应程序结束后，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将大小符合预期的条带利用凝胶回收试剂盒进行纯化回收，得到HPLgtA编码区、ADH1终止区、半乳糖苷酶LAC4启动子区融合序列。

1.2 通过PCR扩增获得上下游同源臂序列、PUG6载体序列、PUG6载体抗性序列引物设计见表6。

表6

。

以乳酸克鲁维酵母基因组和PUG6载体为模板进行PCR扩增，扩增组分见表7。

表7

。

PCR扩增程序见表8。

表8

。

PCR反应程序结束后，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将大小符合预期的条带利用凝胶回收试剂盒进行纯化回收。

1.3 表达盒的获取

将1.1步骤获得的融合序列与1.2步骤的上下游同源臂序列、骨架序列、抗性序列按照总体积5μL、摩尔比1:1:1:1:1的比例混合后加入5μL无缝克隆MIX进行连接。连接温度50℃，时间30-60min。连接完成后及时进行大肠杆菌转化，挑取正确的转化子进行质粒提取，获得携带HPLgtA表达盒的表达载体18S::HPLgtA。

本实施例所用试剂及试剂盒来源如表9所示。

表9

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本实施例所用溶剂及缓冲液配方如下所示

50×TAE溶液：使用ddH₂O配制，其中含有2 M Tris，100 mM Na₂EDTA·H2O，2% SDS，调pH至8.5。

基因组抽提buffer：使用ddH₂O配制，其中含有200 mM Tris-HCl，250 mM NaCl，2%SDS，25 mM EDTA，调pH至8.0。

大肠杆菌培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L 氯化钠和水配制而成，固体培养基需额外添加20 g/L琼脂粉。采用经121℃高温蒸汽灭菌20 min后备用。

酵母培养基：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L 葡萄糖、加入水配制而成，固体培养基需额外添加20 g/L琼脂粉。采用经115℃高温蒸汽灭菌30 min后备用。

本实施例所用培养条件：

大肠杆菌在温度设置为37 ℃的恒温培养箱中进行固体平板培养，在温度设置为37 ℃，转速设定为200 rpm的摇床中进行摇瓶培养。

酵母在温度设置为30 ℃的恒温培养箱中进行固体平板培养，在温度设置为30℃，转速设定为200 rpm的摇床中进行摇瓶培养。

本实施例酵母基因组提取方法：

（1）将乳酸克鲁维酵母单菌落挑取至1 mL YPD（10 mL离心管）培养基中，30℃，200rpm过夜培养；

（2）取600μL菌液于1.5毫升EP管中，10000rpm离心1min，去上清；

（3）加入600-800μL的基因组抽提buffer，100μL石英砂，充分震荡5min；

（4）65℃水浴30min，每10min颠倒一次；

（5）取上清于新的1.5毫升EP管中，加入等体积的DNA提取液，吹打混匀；

（6）13000rpm离心10min。取400μL上清于新的1.5毫升EP管中；

（7）加入0.6倍体积的异丙醇和40μL 3M醋酸钠，混匀，-20℃静置30min；

（8）13000rpm离心10min，弃上清，得到酵母基因组；

（9）用70%的乙醇洗涤两次，待乙醇挥发后溶于ddH₂O中，-20℃保存。

实施例2：乳酸克鲁维酵母重组菌株的构建：

1. ΔLAC4::HPLgt A表达盒构建成功后进行酵母转化，得到重组菌株。

酵母转化方法具体如下：

（1）先制备酵母感受态细胞：取少量酵母菌株冻存物在平板固体培养基上划线，30℃倒置培养2天。挑取酵母单菌落于50 mL 液体培养基中，30℃，220 rpm 培养至OD₆₀₀在0.8-1.5之间。收集菌体用25 mL无菌水洗涤，室温1500 ×g离心10 min，弃上清。加入 1 mL100 mM的氯化锂缓冲液，重悬沉淀，12000 rpm 离心30s，弃上清。再次加入 400 μL 100 mM的氯化锂缓冲液，重悬沉淀，得酵母细胞感受态，按50 μL/管分装，待转化用。

同时，煮沸1 mL鲑鱼精DNA 5 min，迅速冰浴以制备单链担体DNA。

（2）转化：将上述制备的感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的氯化锂溶液。对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350（240 μL）；1M LiCl（36 μL）；2 mg/mL 单链Salmon sperm DNA（25 μL）；5～10 μg/50 μL H₂O 质粒DNA（50 μL），剧烈旋涡混匀，直至沉淀菌体完全分布均匀；30 ℃水浴孵育30 min；42 ℃水浴热休克20～25 min；8000 rpm离心10 min后，收集酵母菌体；然后，重悬酵母于500 μL 液体培养基，30℃摇床孵育；1～4 h后，取25～100 μL菌液涂布于选择性培养基平板，于30 ℃倒置培养。

所述质粒DNA，为实施例1构建的ΔLAC4敲除盒，或ΔLAC4::HPLgt A 表达盒。

2. 乳酸克鲁维酵母重组菌株的验证：

平板静置培养2-3天，对长出的转化子单菌落进行验证，验证方法如下：

挑取转化子单菌落于1.5mL液体培养基1，30℃、200 rpm震荡培养过夜后分别取50μL菌液转接于1.5mL液体培养基1和液体培养基2，30℃、200 rpm震荡培养过夜。观察其生长情况，选取在固体培养基1中正常生长而在固体培养基2几乎无法生长的转化子保种，认为其为重组菌株。

本实施例中培养基具体情况如下：

固体培养基1：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L 葡萄糖、20 g/L琼脂粉加入水配制而成，经115℃高温蒸汽灭菌30 min后备用。

液体培养基1：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L 葡萄糖加入水配制而成，经115℃高温蒸汽灭菌30 min后备用。

固体培养基2：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L 乳糖、20 g/L琼脂粉加入水配制而成，经115℃高温蒸汽灭菌30 min后备用。

液体培养基2：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L 乳糖加入水配制而成，经115℃高温蒸汽灭菌30 min后备用。

实施例3. 两段式培养乳酸克鲁维酵母重组菌株，催化合成LNTII。

第一阶段为菌体生长期：

以葡萄糖为碳源培养细胞，进行菌体量和酶量的积累，至细胞生长进入对数末期或稳定期。将菌株划线培养于固体培养基中，30℃培养2-3天后挑取单菌落接种于1.5mL液体培养基，30℃、200 rpm培养至OD₆₀₀=1，按2%的接种量接种于5L液体培养基中（10L体积发酵罐），30℃、200 rpm震荡培养过夜。随后按2%的接种量接种于50mL液体培养基摇瓶中，30℃、200 rpm震荡培养进行菌体量积累。

第二阶段为产物合成期：30℃，200 rpm下震荡培养至40 h时，开始流加补料，总发酵时长72 h。发酵72 h结束后，离心发酵液，使用高压匀浆破碎仪进行菌体破碎，离心除去蛋白，收集，将发酵液和上清混合获得含有LNTII的液体后，经过阴阳离子树脂脱色、除盐以及层析树脂纯化得到纯化液，浓缩纯化液，浓缩后溶液中LNTII浓度为466g/L，备用；或者通过喷雾干燥方式得到固体粉末LNTII，备用。

培养基具体情况如下：

固体培养基：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂粉，经115℃高温蒸汽灭菌30 min后备用。

液体培养基：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L 葡萄糖，8 g/L乳糖、终浓度分别为5mM的磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵和硫酸锰，经115℃高温蒸汽灭菌30 min后备用。

补料：2g/L的乳糖、20g/L的葡萄糖、终浓度分别为5mM的磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵和硫酸锰。

下述实施例中采用的是实施例1中的得到的纯化发酵液，或喷雾干燥所得发酵液得到的固体LNTII。

实施例4. 取实施例1所得固体状LNTII 5g，加入10ml纯化水，50℃溶清（完全溶解）。溶清后，降温至25℃，降温速率0.5℃/min，向其中加入0.06g晶种，加入丙酮30ml，流加速率为0.25ml/min，搅拌下，养晶12h。抽滤，用0℃预冷的丙酮洗涤，55℃干燥得LNTII 晶体，称其为晶型A，HPLC测定纯度为97.98%，收率90.89%。

根据中国药典（2020版）附录0451规定的X射线衍射法（第二法粉末X射线衍射法）分别对结晶前固体状LNTII（实施例1喷雾干燥所得），以及本实施例所得晶型进行X-射线衍射（XRD）检测。结晶前固体状LNTII的X射线衍射图谱见附图1；为无定型固体。本实施例所得晶型的X射线衍射图谱见附图2，有晶体的特征峰，其峰位置与峰强度见表10。

根据JY/T0584-2020《扫描电子显微镜分析方法通则》分别检测结晶前固体状LNTII和本发明所得晶型的形貌。结晶前固体粉末LNTII的电镜状扫描图谱见附图3；本实施例所得LNTII晶型A的电镜扫描图谱见附图4。

根据GB/T21781-2008《化学品的熔点及熔融范围试验方法毛细管法》规定的方法，对本实施例所得晶型进行熔点检测，熔点为194℃。

表10

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实施例5. 取实施例3喷雾所得固体粉末状LNTII 5g，加入25ml纯化水，40℃溶清（完全溶解）。溶清后，降温至15℃，向其中加入0.02g晶种，加入丙酮50ml，流加速率为0.07ml/min，搅拌下，养晶20h。抽滤，用8℃预冷的丙酮洗涤，60℃干燥得LNTII晶型，其X射线衍射图谱同实施例4所得晶型，为LNTII晶型A，熔点196℃，HPLC测定纯度为98.18%，收率92.6%。

实施例6. 取实施例3喷雾所得固体粉末状LNTII 5g，加入20ml纯化水，55℃溶清（完全溶解）。溶清后，降温至10℃，向其中加入丙酮50ml，流加速率为0.20ml/min，搅拌下，养晶48h。抽滤，用0-8℃预冷的丙酮洗涤，65℃干燥得LNTII晶型，其X射线衍射图谱同实施例4所得晶型，为LNTII晶型A，熔点194℃，HPLC测定纯度为97.87%，收率93.89%。

实施例7. 浓缩实施例3所得纯化液（ LNTII浓度为466g/L），降温至25℃，取10ml，向其中加入0.04g晶种，加入丙酮20ml，搅拌下，流加速率为0.25ml/min，静止养晶16h。抽滤，用5℃预冷的丙酮洗涤，55℃干燥得LNTII 晶型，其X射线衍射图谱同实施例4所得晶型，为LNTII晶型A，熔点191℃，HPLC测定纯度为92.3%，收率90.89%。

实施例8. 取实施例3所得含LNTII的浓缩液（ LNTII浓度为466g/L），降温至15℃，取10ml，向其中加入0.06g晶种，加入丙酮30ml，搅拌下，流加速率为0.18ml/min，静止养晶16h。抽滤，用0℃预冷的丙酮洗涤，60℃干燥得LNTII 晶型，其X射线衍射图谱同实施例4所得晶型，为LNTII晶型A，熔点193℃，HPLC测定纯度为92.57%，收率92.6%。

实施例9. 取实施例3所得含LNTII的浓缩液（ LNTII浓度为466g/L），降温至20℃，取10ml，向其中加入0.06g晶种，加入丙酮25ml，搅拌下，流加速率为0.20ml/min，静止养晶12h。抽滤，用0℃预冷的丙酮洗涤，65℃干燥得LNTII 晶型，其X射线衍射图谱同实施例4所得晶型，为LNTII晶型A，熔点192℃，HPLC测定纯度为91.98%，收率93.39%。

实施例10. 取实施例3所得固体状LNTII 5g，加入15ml纯化水，45℃溶清（完全溶解）。溶清后，降温至25℃，向其中加入0.06g晶种，养晶0.5-1h；降温至15℃，降温速率为0.1℃/min；在此温度下向溶液中加入丙酮40ml，流加速率为0.15ml/min，搅拌下，养晶18h。抽滤，用5℃预冷的丙酮洗涤，55℃干燥得LNTII晶型，其X射线衍射图谱同实施例4所得晶型，为LNTII晶型A，熔点194℃，HPLC测定纯度为98.58%，收率94.28%。

实施例11. 吸湿性测定

步骤1. 玻璃培养皿的处理

恒温恒湿实验的前一天，将玻璃培养皿（不带盖）置于25±1℃、相对湿度为75±2%的恒温恒湿箱中4小时，取出精密称重，重复试验至恒重，数据记录于表12；

步骤2. 分别称取实施例3所得喷雾干燥LNTII固体粉末、实施例4所得LNTII晶型A，置于步骤1恒重的敞口玻璃培养皿中，置于25℃、相对湿度为75%的恒温恒湿箱中，于5天取出观察外观变化，称重，并计算吸湿情况，结果分别记录于表11、表12，吸湿前样品形态见附图5，吸湿后样品形态见附图6。

表11

。

表12

。

表11现象和表12结果说明，本发明所述LNTII晶型A的稳定性优于无定型粉末，有利于LNTII产品的长期贮存，以及在食品和药品中的应用，且能够降低LNTII的包装成本，延长产品的保质期。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东恒鲁生物科技有限公司

<120> 一种三糖的新晶型

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 333

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 1

Met Gln Pro Leu Val Ser Val Leu Ile Cys Ala Tyr Asn Val Glu Lys

1 5 10 15

Tyr Phe Ala Gln Ser Leu Ala Ala Val Val Asn Gln Thr Trp Arg Asn

20 25 30

Leu Asp Ile Leu Ile Val Asp Asp Gly Ser Thr Asp Gly Thr Leu Ala

35 40 45

Ile Ala Gln Arg Phe Gln Glu Gln Asp Gly Arg Ile Arg Ile Leu Ala

50 55 60

Gln Pro Arg Asn Ser Gly Leu Ile Pro Ser Leu Asn Ile Gly Leu Asp

65 70 75 80

Glu Leu Ala Lys Ser Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Asp

85 90 95

Ala Asp Asp Ile Ala Ala Pro Asp Trp Ile Glu Lys Ile Val Gly Glu

100 105 110

Met Glu Lys Asp Arg Ser Ile Ile Ala Met Gly Ala Trp Leu Glu Val

115 120 125

Leu Ser Glu Glu Lys Asp Gly Asn Arg Leu Ala Arg His His Glu His

130 135 140

Gly Lys Ile Trp Lys Lys Pro Thr Arg His Glu Asp Ile Ala Asp Phe

145 150 155 160

Phe Pro Phe Gly Asn Pro Ile His Asn Asn Thr Met Ile Met Arg Arg

165 170 175

Ser Val Ile Asp Gly Gly Leu Arg Tyr Asn Thr Glu Arg Asp Trp Ala

180 185 190

Glu Asp Tyr Gln Phe Trp Tyr Asp Val Ser Lys Leu Gly Arg Leu Ala

195 200 205

Tyr Tyr Pro Glu Ala Leu Val Lys Tyr Arg Leu His Ala Asn Gln Val

210 215 220

Ser Ser Lys Tyr Ser Ile Arg Gln His Glu Ile Ala Gln Gly Ile Gln

225 230 235 240

Lys Thr Ala Arg Asn Asp Phe Leu Gln Ser Met Gly Phe Lys Thr Arg

245 250 255

Phe Asp Ser Leu Glu Tyr Arg Gln Ile Lys Ala Val Ala Tyr Glu Leu

260 265 270

Leu Glu Lys His Leu Pro Glu Glu Asp Phe Glu Leu Ala Arg Arg Phe

275 280 285

Leu Tyr Gln Cys Phe Lys Arg Thr Asp Thr Leu Pro Ala Gly Ala Trp

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Ala Asp Gly Arg Met Arg Arg Leu Phe Thr Leu Arg

305 310 315 320

Gln Tyr Phe Gly Ile Leu His Arg Leu Leu Lys Asn Arg

325 330

<210> 2

<211> 600

<212> DNA

<213> Kluyveromyces lactis

<400> 2

tgtcttgcat gttaataata gcctagcctg tgagccgaaa cttagggtag gcttagtgtt 60

ggaacgtaca tatgtatcac gttgacttgg tttaaccagg cgacctggta gccagccata 120

cccacacacg ttttttgtat cttcagtata gttgtgaaaa gtgtagcgga aatttgtggt 180

ccgagcaaca gcgtcttttt ctagtagtgc ggtcggttac ttggttgaca ttggtatttg 240

gactttgttg ctacaccatt cactacttga agtcgagtgt gaagggtatg atttctagtg 300

gtgaacacct ttagttacgt aatgttttca ttgctgtttt acttgagatt tcgattgaga 360

aaaaggtatt taatagctcg aatcaatgtg ttatcattgt gaagatgttc ttccctaact 420

cgaaaggtat atgaggcttg tgtttcttag gagaattatt attcttttgt tatgttgcgc 480

ttgtagttgg aaaaggtgaa gagacaaaag cgcttaacac ttgaaattta ggaaagagca 540

gaatttggca aaaaaaataa aaaaaaaata aacacacata ctcatcgaga actgaaagat 600

<210> 3

<211> 188

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta 60

tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct 120

ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat tgaccacacc 180

tctaccgg 188

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

ggaattccat atgtatcacg ttgacttggt ttaac 35

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

atcataagaa attcgcttag gacttcttca acaacttc 38

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

tcgagaactg aaagatatga cctccgcttc ctctca 36

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

gttgaagaag tcctaagcga atttcttatg atttatgatt ttta 44

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

agaatgcggc cgcccggtag aggtgtggtc aa 32

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

acgaggaaca actaacgaga tcatggtatc ctca 34

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

gaagcggagg tcatatcttt cagttctcga tgagt 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

cgagaactga aagatatgac ctccgcttcc tctca 35

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 12

ctatagacat atgatgcttg tctcaaagat taagcc 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

catgatctcg ttagttgttc ctcgttaagg tattta 36

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 14

gatatcagat ccacttgtct gcttaattgc gat 33

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 15

gcataggcca ctataaatga ccaagtttga ccag 34

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 16

cctctaccgg tgcaggtcga caacccttaa t 31

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 17

taagcagaca agtggatctg atatcaccta at 32

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 18

tggtcattta tagtggccta tgcggccgc 29

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 19

ctttgagaca agcatcatat gtctatagtg tcacctaaat 40

Claims

1.一种乳糖-N-三糖Lacto-N-triose II晶型A，其特征在于，其粉末X射线衍射谱在4.80、8.32、9.62、12.72、18.67、19.90、21.05和21.59的2θ±0.2°值处有特征峰。

2.如权利要求1所述乳糖-N-三糖Lacto-N-triose II晶型A，其特征在于，其粉末X射线衍射谱在4.80、7.24、8.32、9.62、12.72、16.67、18.67、19.28、19.90、21.05、21.59、22.14和26.93的2θ±0.2°值处有特征峰。

3.如权利要求1所述乳糖-N-三糖Lacto-N-triose II晶型A，其特征在于，其粉末X射线衍射谱在4.80、7.24、8.32、9.62、12.72、16.67、17.35、18.67、19.28、19.90、20.72、21.05、21.59、22.14、23.17、23.71、24.15、25.20、26.93、29.12和29.49的2θ±0.2°处有特征峰。

4.如权利要求1所述乳糖-N-三糖Lacto-N-triose II晶型A，其特征在于，其粉末X射线衍射谱在4.80、7.24、8.32、9.62、9.89、11.65、12.72、14.42、16.67、17.35、18.67、19.28、19.90、20.72、21.05、21.59、22.14、23.17、23.71、24.15、25.20、26.93、28.68、29.12、29.49、30.34、31.08、31.88和34.10的2θ±0.2°处有特征峰。

5.如权利要求1-4任一项所述乳糖-N-三糖Lacto-N-triose II晶型A，其特征在于，其熔点是191-196 ℃。

6.权利要求1-4任一项所述乳糖-N-三糖Lacto-N-triose II晶型A的制备方法，其特征在于，含有乳糖-N-三糖Lacto-N-triose II的溶液与有机溶剂混合后，获得晶型A；所述有机溶剂，优选的，选自丙酮。

7.如权利要求6所述乳糖-N-三糖Lacto-N-triose II晶型A的制备方法，其特征在于，有机溶剂的添加量等于或者大于水的体积；优选的为1:2.4-2.7，进一步优选的为1:2.5。

8.如权利要求6-7任一项所述乳糖-N-三糖Lacto-N-triose II晶型A的制备方法，其特征在于，在含有乳糖-N-三糖的溶液中加入晶种，养晶0.5h以上，再与有机溶剂混合后获得晶型A；优选的，所述有机溶剂选自丙酮。

9.权利要求1-4任一项所述乳糖-N-三糖（Lacto-N-triose II）晶型A作为中间体或者终端产品的应用。