CN117007819B - 用于辅助诊断阿尔茨海默病的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种辅助诊断阿尔茨海默病（AD）的试剂盒，以及生物样品中突触囊泡蛋白SV2A含量的检测试剂在制备用于辅助诊断AD的试剂盒中的用途。本申请首次发现生物样品中突触囊泡蛋白SV2A含量的检测试剂在制备用于辅助诊断AD的试剂盒中的用途，通过检测血清等中的突触囊泡蛋白SV2A的含量来辅助诊断AD。本申请的试剂盒的成分简单、成本低且准确度高，具有良好的应用前景。

Description

用于辅助诊断阿尔茨海默病的试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫学诊断领域，具体涉及一种辅助诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒，以及生物样品中SV2A含量的检测试剂在制备用于辅助诊断AD的试剂盒中的用途。

背景技术

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，以下，有时简称为AD）是一种原因不明的慢性神经退行性病变，其病理改变主要表现为β-淀粉样蛋白的沉积导致老年斑，Tau蛋白异常磷酸化导致神经纤维缠结，神经元和突触的丢失，临床表现为进行性认知功能减退和非认知性神经精神症状。目前AD的主要诊断手段是神经心理学量表、影像学检查、生物标志物检测等。神经心理学量表评估受试者的认知功能，现主要采用简易精神状态量表、特利尔认知评估量表、长谷川痴呆量表等量表，但由于受试者教育程度及个人理解能力不同，测试结果浮动大；神经影像学检测主要有磁共振成像（MRI）、正电子发射（PET）、计算机断层扫描（CT）等，都也是AD诊断的有力证据，CT可以直接显示AD患者脑萎缩现象，但由于软组织分辨力不佳，使其价值有限，MRI和PET价格昂贵，不适合人群筛查。

对AD的精确和早期诊断有利于患者接受早期医疗干预，从而为延缓AD的发作或疾病进展提供了可能性。脑脊液Aβ42/Aβ40（或脑脊Aβ2）和AβPET均与脑内Aβ病理相关，被认为是AD最早的生物标志物。近来来，随着对AD的重视，报道了越来越多的针对AD的生物标志物，以下结合专利文献1~7进行简单介绍。

专利文献1通过检测AD患者血液中的miRNA水平，发现了7个与p-tau/Aβ比例有显著相关性的miRNA，通过这7种miRNA建立了AD患者脑脊液p-tau/Aβ比例预测计算模型，并在两个独立人群中验证了该模型的诊断效能，证实了由血液中7种miRNA组成的模型能够准确预测脑脊液中P-tau/Aβ42的比值。

专利文献2提供了一种用于早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒，含有表皮生长因子、生长调节的α蛋白/C-X-C基序趋化因子、巨噬细胞衍生的趋化因子/C-C基序趋化因子22、单核细胞趋化蛋白1/C-C基序趋化因子2、单核细胞趋化蛋白2/C-C基序趋化因子8、单核细胞趋化蛋白4/C-C基序趋化因子13、胸腺和活化调节的趋化因子/C-C基序趋化因子17、干细胞因子/Kit配体、TNF相关性细胞凋亡诱导配体/肿瘤坏死因子配体超家族成员10、皮肤T细胞吸引趋化因子/C-C基序趋化因子27和γ-微管蛋白复合物成分2生物标记物。

专利文献3公开了一组用于阿尔兹海默症的早期诊断的生物标志物，包括脑源性神经生长因子、胰岛素样生长因子-1、肿瘤生长因子β1、血管内皮生长因子、白介素18和单核细胞趋化蛋白-1。通过对其中至少四种特定的生物标志物进行检测，确定个体的生物样品中的生物标志物的水平，和生物标志物的参比水平相比，确定生物标志物水平的升高或降低，从而利用生物标志物指示阿尔兹海默症。

专利文献4公开了一组用于辅助诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的生物标志物，包括胆酸、鹅脱氧胆酸、别胆酸、吲哚-3-乳酸及色氨酸，通过对血浆中的生物标志物的含量进行检测，能够对阿尔兹海默症早期进行测评。

专利文献5公开了一组用于阿尔茨海默症检测标志物，具体为α-1-糜蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、α白蛋白、载脂蛋白A-1、载脂蛋白B-100等中的任意3种或3种以上蛋白的组合。

专利文献6公开了诊断阿尔茨海默病的外泌体蛋白及其用途，所述外泌体蛋白具体为Ig样结构域包含蛋白、补体C1q亚单位C、补体成分C9、血小板糖蛋白Ibβ链、RAS抑制蛋白1和去整合素和金属蛋白酶结构域10这六种试剂的组合。

专利文献7公开了用于评估阿尔茨海默病的蛋白标志物，其通过整合12或19种血浆蛋白（如CD164、CETN2、GAMT、GSAP、hK14、LGMN、NELL1、PRDX1、PRKCQ、TMSB10、VAMP5和VPS37A等）来预测AD风险。

上述专利文献均是组合多种标志物来辅助诊断AD，需要测定多种标志物的表达水平，必然将显著提高试剂盒的制备成本及工艺复杂度，增加患者负担，需要一种在保证诊断准确度的基础上针对单一标志物的用于辅助诊断AD的试剂盒。

突触囊泡蛋白2（synaptic vesicle protein2，SV2）是一类具有12个跨膜结构的糖蛋白，存在于所有突触泡和内分泌泡中。SV2A是其分布最广泛的亚型，几乎存在于各种神经元中，在大脑皮质广泛分布，与神经递质的释放、内分泌泡胞吐作用、突触泡稳态的维持等密切相关。近些年来，SV2A蛋白在癫痫相关认知功能障碍中的作用机制被广泛研究（参见非专利文献1），其与AD的关联也正在被研究（参见非专利文献2），与AD中的关键致病因子的相互作用也有报道（参见非专利文献3）。但是，目前关于SV2A蛋白在AD中的研究主要是通过对AD患者的大脑中的SV2A蛋白进行PET成像扫描来量化AD临床试验中突触损伤或损失（参见非专利文献4和5）。专利文献8涉及检测和定量囊泡上的生物标记的方法、组合物和试剂盒，并提及了用于诊断或预后受试者的神经障碍的试剂盒，包含（1）针对CD171、CD63、CD81、SNAP25、EAAT1或OMG的捕获试剂；和（2）选择性地结合GAPDH、CTSD、NRGN、MBP、GFAP、Tau、磷酸化Tau、或SV2A等的检测试剂，其使用抗外泌体表面上的至少两种不同标记物的抗体进行检测，虽然泛泛提及了SV2A蛋白，但没有提及单一SV2A蛋白在辅助诊断AD的试剂盒中的应用。另外，该文献中虽然泛泛提及了包括磷酸化Tau、αβ-42、Tau蛋白、SV2A蛋白在内的数十种标志物与神经障碍存在关联，但正如根据PET成像所知晓的，这些蛋白与AD等神经障碍存在关联是本领域已知的，并不意味着本领域技术人员能够想到仅使用SV2A蛋白来辅助诊断AD，其所有实施例中也完全没有针对SV2A蛋白进行研究。而且，该文献是以囊泡作为分析对象，其需要从样品中富集囊泡后使用，这样的处理需要昂贵的试剂且耗时，将增加处理负担。因此，综上所述，尚未报道生物样品中SV2A蛋白含量的检测试剂在制备用于辅助诊断AD的试剂盒中的用途，也未报道基于单一SV2A蛋白的用于辅助诊断AD的试剂盒。

现有技术文献

专利文献1：CN112980941A；

专利文献2：CN106885909B；

专利文献3：CN106062563A；

专利文献4：CN110333310A；

专利文献5：CN106018827A；

专利文献6：CN114150057A；

专利文献7：CN115461474A；

专利文献8：WO2018218090A1；

非专利文献1：Synaptic Vesicle Glycoprotein 2A Ligands in the Treatmentof Epilepsy and Beyond，Wolfgang Loscher et al.，CNS Drugs 2016，30：1055-1077；

非专利文献2：The Synaptic Vesicle Glycoprotein 2: Structure, Function,and Disease Relevance，Kristen A. Stout et al.，ACS Chem. Neurosci. 2019，10：3927-3938；

非专利文献3：The Synaptic Vesicle Protein 2A Interacts With KeyPathogenic Factors in Alzheimer’s Disease: Implications for Treatment，YanyanKong et al.，Front. Cell Dev. Biol. 2021，9：1-13；

非专利文献4：The clinical promise of biomarkers of synapse damage orloss in Alzheimer’s disease，Martí Colom-Cadena et al.，Alzheimer’s Research&Therapy 2020，12：21；

非专利文献5：In vivo measurement of widespread synaptic loss inAlzheimer’s disease with SV2A PET，Adam P.Mecca et al.，Alzheimer’s Dement2020，16：974-982。

发明内容

发明所要解决的课题

如前文所述，现有技术对AD标志物的研究较多，对能够从血液等非脑脊液中进行采样的标志物的研究也不少，但大多涉及多种蛋白或RNA的组合，这就导致诊断体系复杂，试剂盒成分繁多，极大地增大了成本，限制了在实际临床上的使用。现有技术中也不乏单一标志物应用于AD诊断的报道（如检测AD患者的粪便中的牛磺酸或胆酸），但其准确度不佳，不到50%。

鉴于上述现有技术的状况，本申请的目的在于提供一种在保证诊断准确度的基础上仅通过对一种生物标志物的含量（浓度）进行检测来辅助诊断AD的试剂盒。本申请的另一目的在于提供生物样品中突触囊泡蛋白SV2A（以下，有时简称为SV2A蛋白）含量的检测试剂在制备用于辅助诊断AD的试剂盒中的用途。

用于解决课题的手段

申请人对辅助诊断AD的标志物进行了深入研究，结果意外地首次发现，相比于正常人，AD患者的外周血（血清等）和脑脊液中的SV2A蛋白的量显著较低，SV2A蛋白的含量与AD的严重程度呈负相关。基于该发现，本发明人确信以往通常用作癫痫病靶点的SV2A蛋白非常适合作为AD辅助诊断的标志物，特别是通过从血清等中进行采样后测定样品中的SV2A蛋白含量，能够以较佳的诊断准确度辅助区分AD患者和非AD患者，与通过PET成像技术并使用示踪剂将大脑中的SV2A蛋白进行成像（SV2A-PET）来检测神经退行性疾病（包括AD）中突触密度的局部降低相比，本申请的技术极大地简化了诊断流程、降低了诊断成本，具有良好的应用前景。需要说明，虽然现有技术中通过SV2A-PET成像技术研究了AD患者与正常人的突触密度不同，但根据本领域的技术知识，本领域技术人员甚至本领域专家都无法预期AD患者与正常人的各部位的SV2A蛋白含量是否存在显著区别，这需要大量研究分析及创造性的劳动才能知晓。申请人充分检索现有技术后发现，目前甚至没有针对性地对SV2A蛋白含量进行检测的相关技术，更不可能对AD患者与正常人的血液或脑脊液中SV2A蛋白含量的差异进行研究。

本申请的一个技术方案如下，

生物样品中SV2A蛋白含量的检测试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于辅助诊断受试者是否患AD。

优选地，所述生物样品是全血（例如外周血）、血浆、血清或脑脊液，所述受试者是哺乳动物或人，更优选为人。

优选地，所述生物样品是血清或脑脊液，进一步优选地，所述生物样品为血清。此外，上述样品均未经过囊泡（包括外泌体、微粒/微囊泡、凋亡小体、肿瘤小泡以及其他各种EV亚群）的富集或提取而直接使用。

优选地，所述检测试剂通过以计数为特征的单分子免疫检测技术、化学发光免疫分析技术、放射免疫技术、或流式荧光技术来检测生物样品中SV2A蛋白的浓度。进一步优选地，所述检测试剂通过以计数为特征的单分子免疫检测技术来检测生物样品中SV2A蛋白的浓度。更进一步优选地，所述以计数为特征的单分子免疫检测技术的特征在于，使用了原位信号增强粒子和磁珠，并基于双抗夹心法来检测SV2A蛋白的浓度，其中，所述原位信号增强粒子是在原位对荧光信号进行增强的纳米粒子，包含荧光探针和载体，且平均粒径为180~350nm。进一步优选地，所述载体为二氧化硅、聚苯乙烯、或聚丙烯酰胺，优选为聚丙烯酰胺或二氧化硅。优选地，所述荧光探针为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、或量子点类发光材料。

优选地，所述试剂包含针对SV2A蛋白的捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体和检测抗体分别与SV2A蛋白的第一位点和第二位点结合，且不包含针对其他蛋白的抗体。所述捕获抗体与磁珠结合，此外，所述捕获抗体与SV2A蛋白的第一位点的结合在pH8~10的范围内进行。

优选地，所述试剂包含缓冲液，进一步优选地，所述缓冲液的pH为7.0～7.6，包含PBS、动物血清白蛋白、非离子表面活性剂、无机碱金属盐、生物防腐剂、和无菌蒸馏水，且不含Tris碱、尿素、三羟甲基氨基甲烷、纤维素盐、纤维素衍生物、叠氮钠或甘油。所述试剂并非PET示踪剂。

本申请的另一技术方案涉及用于辅助诊断AD的试剂盒，其包含针对SV2A蛋白的抗体。所述试剂盒不包含针对其他蛋白的抗体，且所述试剂盒并非ELISA试剂盒。

优选地，其中，针对SV2A蛋白的抗体为分别与SV2A蛋白的不同位点结合的捕获抗体和检测抗体。所述捕获抗体与磁珠结合，所述检测抗体与前述原位信号增强粒子结合。

优选地，所述试剂盒用于辅助区分患AD的受试者和正常受试者。

上述试剂盒不包含用于囊泡（包括外泌体、微粒/微囊泡、凋亡小体、肿瘤小泡以及其他各种EV亚群）的富集或捕获囊泡（vesicles）的试剂。

优选地，所述试剂盒还包含原位信号增强粒子和磁珠，所述原位信号增强粒子是在原位对荧光信号进行增强的纳米粒子，包含荧光探针和载体，且平均粒径为180~350nm。

优选地，所述荧光探针为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、或量子点类发光材料。

优选地，所述试剂盒包含缓冲液。进一步优选地，所述缓冲液的pH为7.0～7.6，包含PBS、动物血清白蛋白、非离子表面活性剂、无机碱金属盐、生物防腐剂、和无菌蒸馏水，且不含Tris碱、尿素、三羟甲基氨基甲烷、纤维素盐、纤维素衍生物、叠氮钠或甘油。

本发明的效果

根据本发明，能够提供提供一种在保证诊断准确度的基础上仅通过对一种生物标志物的含量（浓度）进行检测来辅助诊断AD的试剂盒。

附图说明

图1为AD患者（DAT）和认知正常人群（HC）中血清（serum）中SV2A蛋白含量比较。

图2为血清SV2A蛋白与认知功能评分的相关性分析图。

图3为基于AD患者的脑脊液SV2A蛋白水平的AD预测模型的受试者工作特征曲线（ROC）。

图4为AD患者（DAT）和认知正常人群（HC）中脑脊液（CSF）中SV2A蛋白含量比较。

图5为脑脊液SV2A蛋白与认知功能评分的相关性分析图。

图6为基于AD患者的脑脊液SV2A蛋白水平的AD预测模型的受试者工作特征曲线（ROC）。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如本文中所使用的，术语“阿尔茨海默病（AD）”是老年人常见的神经退行性疾病，以认知功能障碍为主要临床特征。对于AD的诊断可采用磁共振成像（MRI）、正电子发射断层显像（PET）和生物标志物诊断等方法。

如本文中所使用的，术语“标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能患的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

如本文中所使用的，试剂盒是指用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子，在本说明书中特指用于检测样品中SV2A蛋白含量的包含多种试剂的盒子。另外，试剂盒还包含配套的说明书、反应杯、废杯等，在此省略详细说明。

如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，特别是哺乳动物和人。

（1）本申请的第一方案：生物样品中SV2A蛋白含量的检测试剂在制备用于辅助诊断AD的试剂盒中的用途

本申请的第一方案涉及检测SV2A蛋白在生物样品中含量的试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于辅助诊断受试者是否患AD。所述生物样品可以为血清、血浆、全血（如外周血等）、脑脊液等，从诊断准确度的观点考虑，优选为血清和脑脊液，从取样容易度的方面考虑，进一步优选为血清。此外，上述样品均未经过囊泡（包括外泌体、微粒/微囊泡、凋亡小体、肿瘤小泡以及其他各种EV亚群）的富集或提取而直接使用。申请人对于AD患者的肌肉、肝脏等中的SV2A表达量也进行过研究，发现这些部位的SV2A蛋白含量与正常人差别不明显，这可能是因为SV2A蛋白在血液、脑脊液、海马组织、皮层、骨骼肌等中的表达量各不相同。

所述检测试剂通过各种免疫检测技术来检测生物样品中SV2A蛋白的浓度，如以计数为特征的单分子免疫检测技术、化学发光免疫分析技术、放射免疫技术、或流式荧光技术，只要能够准确地测定生物样品中较低含量的SV2A蛋白的浓度即可。现有技术中，针对SV2A蛋白的免疫检测技术尚不完善，这可能是由于血液、脑脊液等中的SV2A蛋白含量较低，不易检测。进一步优选地，从提高灵敏度的方面考虑，检测试剂通过以计数为特征的单分子免疫检测技术来检测生物样品中SV2A蛋白的浓度。单分子检测（SMD）是以单个分子的分析为基础构建的一种方法，到目前为止，它已经在生命科学的研究中备受关注。近几年来，该方法被应用于细胞成像、蛋白质相互作用的研究以及蛋白质和核酸的定量检测中。在上述提及的应用中，定量检测是以对目标物分子的一个接一个的计数来实现的，这种定量检测手段代表了检测的最终极限。在SMD定量方法中，对可以产生信号的分子进行计数，更具有可视性和数字性，在获得极高灵敏度的同时保证了较高的重现性，故是更优选的。

更具体而言，上述以计数为特征的单分子免疫检测技术的特征在于，使用了原位信号增强粒子和磁珠，并基于双抗夹心法来检测SV2A蛋白的浓度，其中，所述原位信号增强粒子是在原位对荧光信号进行增强的纳米粒子，包含荧光探针和载体，且平均粒径为180~350nm。进一步优选地，上述载体为二氧化硅、聚苯乙烯、或聚丙烯酰胺，优选为聚丙烯酰胺或二氧化硅。优选地，所述荧光探针为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、或量子点类发光材料。上述原位信号增强粒子优选为二氧化硅包裹荧光染料分子（如荧光素）而成的荧光粒子、聚丙烯酰胺包裹荧光染料分子（如荧光素）而成的荧光粒子、聚苯乙烯包裹量子点而成的荧光粒子等。

优选地，上述检测试剂包含针对SV2A蛋白的捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体和检测抗体分别与SV2A蛋白的第一位点和第二位点结合，所述捕获抗体与磁珠结合。并且上述检测试剂不包含针对其他蛋白的抗体。此外，所述捕获抗体与SV2A蛋白的第一位点的结合在pH8~10的范围内进行。

上述磁珠的表面修饰有能够与抗体进行共价偶联的活性官能团，例如羟基、羧基、氨基、琥珀酰亚胺酯基、磺酰基（如甲苯磺酰基）及它们的衍生基团中的一种或多种。

如前文所述，本发明中的针对SV2A蛋白的抗体可以为与SV2A蛋白的不同位点结合的捕获抗体和检测抗体。上述捕获抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种。上述捕获抗体按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体、羊驼源抗体中的一种或多种。所述检测抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种。所述检测抗体按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体以及羊驼源抗体中的一种或多种。

来源于哺乳动物的单克隆抗体和多克隆抗体的实例包括：产生在动物血液中的抗体、由杂交瘤产生的抗体、以及由转染有表达载体的宿主产生的抗体（所述表达载体包含由基因工程技术得到的抗体基因），利用最优抗体的基因在CHO细胞工厂大量生产的抗体，或者利用产生人抗体的抗基因小鼠直接产生的人抗体，等等。单克隆抗体和多克隆抗体可以利用本领域技术人员已知的方法来生产，也可以购买市售品。

（2）本申请的第二方案：用于辅助诊断AD的试剂盒，其包含针对SV2A蛋白的抗体。

本申请的第二方案涉及试剂盒产品，其用于辅助诊断AD。需要说明的是，通过该用途限定，具体限定了仅用于AD的辅助诊断中，该限定也决定了本方案的试剂盒中不包含明显不适合于AD辅助诊断的组分，例如以往的针对癫痫病的诊断成分，还决定了其附带的说明书为与AD诊断相匹配的说明书。

如前文所述，所述针对SV2A蛋白的抗体可以为分别与SV2A蛋白的不同位点结合的捕获抗体和检测抗体，此时是基于双抗夹心法。也可以仅是与SV2A蛋白结合的捕获抗体。另外，该试剂盒中不包含针对其他蛋白的抗体。

本说明书中使用的“抗体”，是指单克隆抗体、单特异性抗体（例如，既可以为单克隆抗体，也可以是普通生殖细胞产生抗体之外的其他方法所产生的抗体）、多特异性抗体、人源抗体、人源化抗体（完全或部分人源化的抗体）、动物抗体（例如但不限于：鸟类（例如鸭或鹅）、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类（例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等）、或者非人灵长类（例如，猴子、黑猩猩等）、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv（“scFv”）、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F（ab’）片段、F（ab’）2片段等，优选单/多克隆的鼠/兔抗。另外，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、任何类别（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或任何亚类的蛋白分子，优选IgG。

来源于哺乳动物的单克隆抗体和多克隆抗体的实例包括：产生在动物血液中的抗体、由杂交瘤产生的抗体、以及由转染有表达载体的宿主产生的抗体（所述表达载体包含由基因工程技术得到的抗体基因），利用最优抗体的基因在CHO细胞工厂大量生产的抗体，或者利用产生人抗体的抗基因小鼠直接产生的人抗体，等等。单克隆抗体和多克隆抗体可以利用本领域技术人员已知的方法来生产，也可以购买市售品。

所述试剂盒可以还包含原位信号增强粒子和磁珠，所述原位信号增强粒子是在原位对荧光信号进行增强的纳米粒子，包含荧光探针和载体，且平均粒径为180~350nm。试剂盒不包含对生物样品进行囊泡（包括外泌体、微粒/微囊泡、凋亡小体、肿瘤小泡以及其他各种EV亚群）的富集或提取的试剂。

所述试剂盒可以还包含缓冲液。进一步优选地，所述缓冲液的pH为7.0～7.6，包含PBS、动物血清白蛋白、非离子表面活性剂、无机碱金属盐、生物防腐剂、和无菌蒸馏水，且不含Tris碱、尿素、三羟甲基氨基甲烷、纤维素盐、纤维素衍生物、叠氮钠或甘油。具体而言，每100mL缓冲液中包含10mM～40mM的PBS、0.05mL～0.30mL的非离子表面活性剂、0.4g～1.0g的无机碱金属盐、0.2g～0.8g的动物血清白蛋白、0.03mL～0.06mL的生物防腐剂、和无菌蒸馏水。前述非离子表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80或它们中的至少两种的混合物，优选为吐温-20，且在每100mL前述缓冲液中，前述非离子表面活性剂为0.08mL～0.20mL。优选地，前述无机碱金属盐为氯化钠或氯化钾，优选为氯化钠，且每100mL前述缓冲液中，前述无机碱金属盐为0.5g～0.8g。优选地，前述动物血清白蛋白为牛血清白蛋白，且在每100mL所述缓冲液中，其质量为0.4g～0.6g。优选地，前述生物防腐剂为proclin-300，且在每100mL缓冲液中，其体积为0.04mL～0.06mL。优选地，每100mL前述缓冲液还包含2g～10g的海藻糖，优选包含4g～6g的海藻糖。

所述试剂盒可以是基于以计数为特征的单分子免疫检测技术的试剂盒。

实施例1

以下，举出实施例进一步详细地说明本申请，但本申请并不限定于此。

关于统计分析

使用t-检验或Mann-Whitney U检验比较两个独立样品之间的连续变量。使用受试者工作特征曲线（ROC）分析评价诊断准确性。曲线下面积（AUC）和代表性的最佳灵敏度和特异性用于评价模型的性能。所有检验均为双尾检验，并且p<0.05被认为是统计学显著的。所有分析均用SPSS24版（IBM，Armonk，NY，USA）进行。使用GraphPad Prism 9软件（San Diego,CA, USA）来呈现数据。

实施例1：AD患者和认知正常对照组血清中SV2A蛋白水平的检测

该实施例的数据来自108名认知正常对照组和164名AD患者，它们均在首都医科大学宣武医院招募；招募后，记录AD组和认知正常受试者的人口学特征，包括年龄、性别、教育年限、蒙特利尔认知评估（MoCA）、简易智力状态检查（MMSE）得分，如下表1所示。

患者的入选标准如下：（1）第一次住院且未接受系统医学治疗的认知损害患者；（2）患者完成认知尺度测试，包括MMSE和MOCA，并通过成像（CT或MRI）证实脑萎缩；（3）AD的诊断基于由美国NIA-AA公布的标准。患者的排除标准如下：（1）排除患有创伤性脑障碍和其它精神障碍的患者；（2）排除患有全身性疾病如肿瘤、血液病、高血压、高血糖的患者；（3）排除拒绝参与本研究的患者。认知正常对照组的参与者的纳入标准如下：（1）参与者是第一次住院的患者，其未接受全身性治疗；（2）没有认知损伤如海马萎缩的成像发现；（3）至少两名神经病学家证实他们没有认知损伤的临床表现。所有操作和流程均符合首都医科大学宣武医院人类研究行为伦理委员会批准的方案，该研究已获得了所有参与者或监护人的书面知情同意。

血清采集方式：12小时禁食后，早晨通过静脉穿刺从登记个体抽取血样，并与凝块活化剂一起保存在血清管中。通过以2000×g离心10分钟从血液样品中提取血清。然后将血清于-80℃储存在聚丙烯试管中，直到下一次测试，避免重复冷冻和融化。未进行囊泡的富集及提取。

血清SV2A蛋白检测使用苏州宇测生物科技有限公司生产的人SV2A试剂盒（自研，未市售）和单分子免疫检测仪（AST-Sc-Ulti，有市售），基于以计数为特征的单分子免疫检测技术（具体步骤可借鉴本申请人的授权专利CN111771126B）进行，通过标准曲线计算其浓度（以pg/mL表示）。具体而言，所述人SV2A试剂盒包含针对SV2A蛋白的捕获抗体和检测抗体（均为自研的单克隆抗体）、羧基活化磁珠（购自Merck）、二氧化硅包裹异硫氰酸荧光素而成的荧光粒子（粒径为250nm，自制）、缓冲液（自制，成分可见前文）、校准品、质控品及与AD诊断相关的说明书。试剂盒不包含对生物样品进行囊泡（包括外泌体、微粒/微囊泡、凋亡小体、肿瘤小泡以及其他各种EV亚群）的富集或提取的试剂。

表1、认知正常对照组和AD组人口学特征结果

	认知正常组（N=108）	AD组（N=164）
			年龄（年±SD）	65.59±7.89	67.20±8.63
性别（男性，%）	51，47%	77，47%
			教育年限（年±SD）	10.25±2.35	9.30±3.26
MoCA评分	29.13±2.41	12.52±6.32
			MMSE评分	28.35±1.41	17.35±6.61
SV2A水平（pg/mL）	4956.07	2081.87

通过上述试剂盒检测发现，AD患者组血清中SV2A蛋白平均水平（2081.87pg/ml）显著低于认知正常组血清中SV2A蛋白平均水平（4956.07pg/ml）（如图1所示）。同时，经过相关性分析发现，血清中SV2A蛋白水平与MoCA评分具有正相关性（如图2所示，其中相关性系数r=0.14，p=0.0052，即p<0.05），与MMSE评分也具有正相关性（如图2所示，其中相关性系数r=0.133，p=0.0081，即p<0.05）。这提示：血清中SVA2A蛋白水平的降低与认知功能降低有关；而AD是以认知损害为主要临床特征的疾病，因此，上述结果表明：血清中SV2A蛋白可以作为阿尔茨海默病的临床诊断的蛋白标志物。

为评价诊断准确性，使用受试者工作特征曲线（ROC）进行分析并测定曲线下面积（参见图3），由图3可知，AUC为0.70左右，准确性优异。

实施例2：AD患者和认知正常对照组脑脊液中SV2A蛋白水平的检测

该实施例的数据来自35名认知正常对照组和46名AD患者，它们均在首都医科大学宣武医院招募；招募后，记录AD组和认知正常受试者的人口学特征，包括年龄、性别、教育、MoCA、MMSE量表得分，如下表2所示。所有操作和流程均符合首都医科大学宣武医院人类研究行为伦理委员会批准的方案，该研究已获得了所有参与者或监护人的书面知情同意。采集人体脑脊液样本。脑脊液采集步骤如下：进行腰椎穿刺时，将受试者置于左侧位置；选择L3-L5椎间盘间隙作为穿刺部位；用20号无损伤针收集CSF，并在室温下于2000×g离心10分钟。然后将脑脊液于-80℃储存在聚丙烯试管中，直到下一次测试，避免重复冷冻和融化。

脑脊液SV2A蛋白检测也使用苏州宇测生物科技有限公司生产的人SV2A试剂盒（自研，未市售，同上）和单分子免疫检测仪（AST-Sc-Ulti，有市售），基于以计数为特征的单分子免疫检测技术进行，通过标准曲线计算其浓度（以pg/mL表示）。

表2、认知正常对照组和AD组人口学特征结果

	认知正常组（N=35）	AD组（N=46）
			年龄（年）	62.23±8.43	61.80±7.37
性别（男性占比）	17（48%）	21（46%）
			教育年限（年）	9.35±2.48	9.85±4.16
MoCA评分	28.24±3.15	12.30±6.84
			MMSE评分	29.05±2.67	17.04±7.17
SV2A水平（pg/mL）	6197.46	3522.20

通过上述试剂盒检测发现，AD患者组脑脊液中SV2A蛋白平均水平（3522.20pg/ml）显著低于认知正常组脑脊液中SV2A蛋白平均水平（6197.46pg/ml）（如图4所示）。同时，经过相关性分析发现，脑脊液中SV2A蛋白水平与MoCA评分具有正相关性（如图5所示，其中相关性系数r=0.20，p=0.0315，即p<0.05），与MMSE评分也具有正相关性（如图5所示，其中相关性系数r=0.20，p=0.0309，即p<0.05）。这提示：脑脊液中SVA2A蛋白水平的降低与认知功能降低有关；而AD是以认知损害为主要临床特征的疾病，因此，上述结果表明：脑脊液中SV2A蛋白可以作为阿尔茨海默病的临床诊断的蛋白标志物。

为评价诊断准确性，使用受试者工作特征曲线（ROC）进行分析并测定曲线下面积（参见图6），由图6可知，AUC为0.8左右，准确性优异。

Claims (1)

1.生物样品中突触囊泡蛋白SV2A含量的检测试剂在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于辅助诊断受试者是否患阿尔茨海默病，

其中，所述生物样品是血清或脑脊液，所述受试者是人，所述检测试剂通过以计数为特征的单分子免疫检测技术来检测生物样品中突触囊泡蛋白SV2A的浓度。