CN117004723A - Acsm5检测试剂在制备宣威肺癌辅助诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体公开一种ACSM5检测试剂在制备宣威肺癌辅助诊断试剂盒中的应用，具体的，ACSM5基因和/或其编码蛋白检测试剂在制备宣威肺癌辅助诊断或预后判断试剂盒中的应用，表现为宣威肺癌组织较癌旁组织的ACSM5基因和/或其编码蛋白表达水平明显低下，通过本发明的技术方案，从基因组点突变的角度为宣威地区肺癌的早期筛查、精准治疗及防止措施提供新的方向。

Description

ACSM5检测试剂在制备宣威肺癌辅助诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种ACSM5检测试剂在制备宣威肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

背景技术

“宣威肺癌”，是云南省颇具鲜明特色的地方病，主要分布于云南省宣威地区(如来宾镇、龙场镇等)，因其发病特征鲜明，受到世界瞩目。近十年，随着高通量外显子测序的广泛应用，题组前期筛选出了宣威肺癌体细胞突变相关的大量差异表达基因的SNP位点。但是，上述数据及结论并未在后续进一步通过体内外实验验证其致癌作用及分子机制；其次，结论仅局限于基因组层面分析及预测，仅仅揭示了宣威肺癌某些“点”的改变，而肿瘤具有明显的异质性及复杂性，其发生发展涉及多基因参与的恶性生物学行为改变，因而尚不足从“面”上认识宣威肺癌。

因此，为了全面探索宣威肺癌中特征性体细胞突变的SNPs及其作用机制，本部分将对课题组前期的11对宣威肺癌外显子组和转录组测序结果联合分析，通过eQTLs与宣威肺癌差异化表达基因关联，深度挖掘影响宣威肺癌发生发展的候选“驱动基因”及其高频突变SNP位点，即driven突变的筛选。继而扩大样本量，运用Sanger测序验证候选“驱动基因”的高频突变SNP位点，并在分子水平及蛋白水平层面进一步验证候选“驱动基因”，并对其表达量与临床相关资料做相关性分析，明确候选driven突变在宣威肺癌诊治中的临床应用价值。本部分将从基因组点突变的角度为宣威地区肺癌的早期筛查、精准治疗及防止措施提供参考。

发明内容

本发明的主要目的为宣威肺癌精准治疗提供新的且更精准诊断、治疗方向。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

ACSM5基因和/或其编码蛋白检测试剂在制备宣威肺癌辅助诊断或预后判断试剂盒中的应用，具体的，应用时，宣威肺癌组织较癌旁组织的ACSM5基因和/或其编码蛋白表达水平明显低下。

可选的，ACSM5基因检测试剂，选自：特异性扩增所述ACSM5基因的引物；或特异性识别所述ACSM5基因的探针；或特异性结合所述ACSM5基因编码的蛋白的抗体。

作为一种实施方式，特异性扩增所述ACSM5基因的引物包扩上游引物为：5'-TTGTGGATGATGAGGGCAACG-3'，下游引物为：5'-AGAAACAGAAGGGCCGAGTGG-3'的引物对。

作为一种实施方式，本发明还提供了一种ACSM5基因和/或其编码蛋白在制备治疗宣威肺癌的药物中的应用，所述药物是用于在ACSM5表达下调或缺失的宣威肺癌细胞系或癌组织中恢复ACSM5的表达。

本发明还提供了一种宣威肺癌基因ACSM5-P425T，所述ACSM5-P425T序列为基因ACSM5中chr16:20442608位点的C碱基错义突变为A碱基后引起的单核苷酸多态性形成。

进一步的，提供了一种ACSM5-P425T基因和/或其编码蛋白检测试剂在制备宣威肺癌辅助诊断或预后判断试剂盒中的应用。

可选的，ACSM5-P425T基因检测试剂，选自：特异性扩增所述ACSM5基因的引物；或特异性识别所述ACSM5-P425T基因的探针；或特异性结合所述ACSM5-P425T基因编码的蛋白的抗体。

作为一种实施方式，本发明中靶向ACSM5中的SNP位点chr16:20442608的药物可应用在制备治疗宣威肺癌的药物中。

作为一种实施方式，抑制ACSM5-P425T基因和/或其编码蛋白表达的药物可应用在制备治疗宣威肺癌的药物中。

本发明还提供了一种区别宣威肺癌或者非宣威肺癌的方法，具体的，可以在分子水平和/或蛋白质水平上宣威肺癌和非宣威肺癌细胞中ACSM5较癌旁组织表达明显低下。

本发明达到的技术效果为：

1、在11对宣威肺癌组织中，共检测到影响超过2000个基因表达的前三位基因及SNP位点，分别是ACSM5中的SNP位点chr16:20442608，EMLO1中的SNP位点chr7:36934468和CFB中的SNP位点chr6:31945650。40例宣威肺癌及42例非宣威肺癌组织进一步通过Sanger测序验证后，结果表明ACSM5中的SNP位点chr16:20442608(即1273位点的C碱基错义突变为A碱基，导致脯氨酸错误地翻译为苏氨酸)，其突变率在宣威肺癌和非宣威肺癌中分别为13.75％和8.14％。然而，EMLO1中的SNP位点chr7:36934468和CFB中的SNP位点chr6:31945650并未在Sanger测序中被检测出阳性结果。

2、qPCR、Westernblot及IHC等实验从分子水平和蛋白质水平均证实了宣威肺癌和非宣威肺癌中ACSM5较癌旁组织表达明显低下，其表达水平及高低与患者的组织分化和转移情况等临床资料相关(P＜0.05)。值得注意的是，性别与ACSM5的表达量具有相关性，仅出现在宣威肺癌中(P＜0.05)。进一步对ACSM5在IHC中的表达量绘制ROC曲线，结果表明，与非宣威肺癌比较，宣威肺癌中ACSM5的阳性判断cut-off值更低，曲线下面积更大，表明其诊断价值明显。此外，通过与TCGA数据库比对及生存曲线分析，结果显示ACSM5低表达宣威肺癌患者的5年生存率及中位生存时间明显低于ACSM5高表达者，表明宣威肺癌的预后较非宣威肺癌差。

附图说明

图1Driven突变基因挖掘技术路线图；

图2是11对宣威肺癌癌组织及其配对癌旁组织差异表达基因分析图；

图3基于11对宣威肺癌癌组织及其配对癌旁组织的外显子组数据与mRNA转录组数据的eQTL分析图；

图4Sanger测序验证ACSM5,ELMOL及CFB所对应的SNP位点图；

图5Sanger测序验证ACSM5的SNP位点chr16:20442608结果图；

图6基于TCGA数据库分析的ACSM5与宣威肺癌预后相关性的情况图；(A：ACSM5在肿瘤组织中低表达(P＝0.0012)；B：ACSM5(chr16:20442608)突变在肿瘤中显著高于癌旁组织(p＝0.015)；C：ACSM5突变影响了超过4000个以上的基因表达；D:TCGA预测ACSM5表达变化与宣威肺癌患者生存率之间的关系。)

图7ACSM5在宣威肺癌/非宣威肺癌中基因水平及蛋白水平的表达量情况图；(A：qPCR方法检测ACSM5在肿瘤组织中低表达(P＜0.05)(宣威肺癌＝40对，非宣威肺癌＝43对)；B：ACSM5在40对宣威肺癌/43对非宣威肺癌癌组织和癌旁组织中的总蛋白表达情况；C：western-blot检测ACSM5在癌组织及癌旁组织中总蛋白表达的典型条带(n＝7)(p＜0.05)。)

图8ACSM5在宣威肺癌/非宣威肺癌组织切片中的IHC染色结果图。(宣威肺癌癌组织：A(×40)和B(×100)；宣威肺癌癌旁组织：C(×40)和D(×100)非宣威肺癌癌组织：A(×40)和B(×100)；非宣威肺癌癌旁组织：C(×40)和D(×100)XW-宣威肺癌，NXW-非宣威肺癌；Ca-癌组织，P-癌旁组织)

图9ACSM5在宣威肺癌和非宣威肺癌中的ROC曲线图；(A和C)及阳性率比较(B和D)组间比较：*：P＜0.05；**；P＜0.01；Ca：癌组织，P：癌旁组织。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。除非本文另有定义，否则结合本发明公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义，试验方法中购入商品，如中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明中ACSM5基因为公开序列，NCBI序列号为:NM_017888.2。

作为一种实施方式，ACSM5基因和/或其编码蛋白检测试剂可应用在制备宣威肺癌辅助诊断或预后判断试剂盒中，具体的，应用时，宣威肺癌组织较癌旁组织的ACSM5基因和/或其编码蛋白表达水平明显低下。

作为一些可选择的更为具体的实施方案，ACSM5基因检测试剂，选自：特异性扩增所述ACSM5基因的引物；或特异性识别所述ACSM5基因的探针；或特异性结合所述ACSM5基因编码的蛋白的抗体。

作为一种具体的实施方式，特异性扩增所述ACSM5基因的引物包扩上游引物为：5'-TTGTGGATGATGAGGGCAACG-3'，下游引物为：5'-AGAAACAGAAGGGCCGAGTGG-3'的引物对。

作为另一种实施方式，ACSM5基因和/或其编码蛋白可用在制备治疗宣威肺癌的药物中，所述药物是用于在ACSM5表达下调或缺失的宣威肺癌细胞系或癌组织中恢复ACSM5的表达。

作为另一种实施方式，本发明提供了一种宣威肺癌基因ACSM5-P425T，ACSM5-P425T序列为基因ACSM5中chr16:20442608位点的C碱基错义突变为A碱基后引起的单核苷酸多态性(SNP)形成。

对于ACSM5-P425T基因的应用，作为一种实施方式，ACSM5-P425T基因和/或其编码蛋白检测试剂可以应用在制备宣威肺癌辅助诊断或预后判断试剂盒。

作为一些更具体的应用方式，ACSM5-P425T基因检测试剂，选自：特异性扩增所述ACSM5基因的引物；或特异性识别所述ACSM5-P425T基因的探针；或特异性结合所述ACSM5-P425T基因编码的蛋白的抗体。

作为另一种实施方式，靶向ACSM5中的SNP位点chr16：20442608的药物可应用在制备治疗宣威肺癌的药物中。

作为另一种实施方式，抑制ACSM5-P425T基因和/或其编码蛋白表达的药物可应用在制备治疗宣威肺癌的药物中。

作为另一种实施方式，本发明还提供了一种区别宣威肺癌或者非宣威肺癌的方法，具体的，可以在分子水平和/或蛋白质水平上宣威肺癌和非宣威肺癌细胞中ACSM5较癌旁组织表达明显低下。

如上所述，显示了优选的实施方案以便于理解。本发明的范围不限于本文具体描述的实施方案和实施例，并且仅受权利要求的范围限制。下文根据试验过程具体的展示本发明的实施例。

实施例1宣威肺癌Driven突变筛选

1.1全外显子组及mRNA转录组联合eQTL分析

对课题组前期11对宣威肺癌癌组织和配对的癌旁组织的全外显子组及mRNA转录组数据进行生信联合分析。结果显示如下：①火山图(图2A)结果表明宣威肺癌癌组织和配对的癌旁组织中存在差异表达显著的基因，其中上调的基因共有3058个，下调的基因共3567个；②基于上述差异表达基因所绘制的热图(图2B)显示，宣威肺癌癌组织和配对的癌旁组织中差异表达的基因能被很好地区分；③11对宣威肺癌癌组织及其配对癌旁组织的外显子组及mRNA转录组数据的eQTL分析(expressionQuantitativeTraitLoci，eQTL)后，散点图(图3A)结果表明，宣威肺癌的SNP位点显著影响众多数量的基因(表1，仅列出了影响众多数量基因的前10位)，其中影响基因数量最多的前三位SNP位点分别是ACSM5中的SNP位点chr16：20442608，EMLO1中的SNP位点chr7：36934468和CFB中的SNP位点chr6：31945650；④图3B结果显示，ACSM5中的SNP位点chr16：20442608影响了约4100个基因的差异表达，EMLO1中的SNP位点chr7：36934468和CFB中的SNP位点chr6：31945650影响的基因数量也超过2000个。

以上结果表明，ACSM5中的SNP位点chr16：20442608，EMLO1中的SNP位点chr7：36934468和CFB中的SNP位点chr6：31945650均可能是宣威肺癌的driven突变。

表1影响宣威肺癌SNP位点数量最多的前10位基因

1.2ACSM5的SNP位点chr16:20442608可能是宣威肺癌的driven突突

为了明确上述结论，本研究首先对上述11对宣威肺癌癌组织和配对的癌旁组织经步骤2.1所提取的DNA，应用Sanger测序方法对上述结论中影响宣威肺癌基因数量最多的前三位基因的SNP位点验证,具体如下：ACSM5中的SNP位点chr16:20442608，EMLO1中的SNP位点chr7:36934468和CFB中的SNP位点chr6:31945650。结果表明：①11对宣威肺癌癌组织和配对的癌旁组织中，ACSM5中的SNP位点chr16:20442608的1273位C碱基错义突变为A碱基共4例(编号分别为8号,28号,31号,33号)(见图4)，占比18.1(4/22)，其中癌组织与癌旁组织中的检出率均为9.1％，二者差异无统计学差异(P＞0.05)，配对的癌组织与癌旁组织共1对(8号和28号)，占比9％；②11对非宣威肺癌的癌组织和癌旁组织中均未检出ACSM5中SNP位点chr16:20442608的1273位C碱基错义突变为A碱基，与11对宣威肺癌癌组织和配对的癌旁组织中对应的SNP位点检出率比较，二者差异无统计学意义(P＞0.05)(见表2)。ELMOL及CFB所对应的SNP位点均未检出C碱基错义突变为A碱基。

以上结果表明，ACSM5中的SNP位点chr16:20442608可能是宣威肺癌的driven突变。

表211对宣威和11对非宣威癌组织及癌旁组织ACSM5的SNP验证情况

注：ELMO1与CFB无SNP位点检出(未列出)

为了进一步明确ACSM5中的SNP位点chr16：20442608是宣威肺癌的driven突变，本研究将宣威肺癌和非宣威肺癌及其配对的癌旁组织样本分别扩大到29对和32对，应用Sanger测序方法再次对上述组织样本的ACSM5中的SNP位点chr16：20442608，EMLO1中的SNP位点chr7：36934468和CFB中的SNP位点chr6：319456验证。结果表明：①29对宣威肺癌癌组织和配对的癌旁组织中，ACSM5中SNP位点chr16：20442608的1273位点C碱基错义突变为A碱基共7例(编号分别为4号，8号，21号，31号，35号，48号和49号)(见图5)，占比12.1％(7/58)，其中癌组织与癌旁组织中的检出率分别为6.9％和5.2％，组间比较无统计学差异(P>0.05)(见表3)；②癌组织与癌旁组织配对的SNP共3对(4号和31号；8号和35号；21号和48号)，占比10.3％；③32对非宣威肺癌的癌组织和癌旁组织中，ACSM5中的SNP位点chrl6：20442608的1273位点C碱基错义突变为A碱基共7例(编号分别为65号，74号，86号，94号，95号，101号和104号)(见图5)，占比10.9％(7/64)，其中癌组织与癌旁组织中的检出率分别为7.8％和3.1％，组间比较无统计学差异(P＞0.05)，癌组织与癌旁组织配对的SNP共2对(65，95；74，104)，占比6.25％(见表3)。ELMOL及CFB所对应的SNP位点均未检出C碱基错义突变为A碱基(未列出)。

以上结果表明，ACSM5中的C碱基错义突变为A碱基所对应的SNP位点chr16：20442608可能是宣威肺癌的高频driven突变。

表3 29对宣威和32对非宣威癌组织及其癌旁组织ACSM5的SNP验证情况

注：ELMO1与CFB无SNP位点检出(未列出)

接下来，本研究对以上两次Sanger测序结果综合统计分析，比较宣威肺癌与非宣威肺癌患者的癌组织及其配对癌旁组织中ACSM5的SNP位点chr16：20442608阳性检出率并分析二者差异性，以探索宣威肺癌中是否存在与非宣威肺癌有显著差异的特征性SNP位点。结果显示：①40对宣威肺癌患者与43对非宣威肺癌患者的SNP位点chr16：20442608阳性检出率分别为13.75％和8.14％，二者差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)；②虽然宣威肺癌中ACSM5的SNP位点chr16：20442608的阳性检出率13.5％高于非宣威肺癌中ACSM5的SNP位点chr16：20442608的阳性检出率8.14％，但二者组间比较无统计学差异(P＞0.05)(见表4)。

表4 40对宣威和43对非宣威癌组织及其癌旁组织ACSM5的SNP验证情况

综上所述，ACSM5的SNP位点chr16：20442608尚不能明确是宣威肺癌有别于非宣威肺癌的特征性driven突变。

然而，由于本实验数量的局限性(40对)，后续将扩大宣威肺癌与非宣威肺癌患者组织样本数量，以排除小样本所带来的统计学误差，进一步明确ACSM5的SNP位点chr16：20442608是否是宣威肺癌特征性driven突变。

实施例2

ACSM5表达变化与宣威肺癌患者临床特征及预后的生物信息学分析结果

为明确ACSM5的SNP位点chr16：20442608是否在宣威肺癌患者中发挥“驱动基因”的角色，本研究首先通过与TCGA(TheCancerGenomeAtlas)数据库比对，然后通过生物信息学分析技术，预测ACSM5在宣威肺癌中的表达情况与宣威肺癌患者的预后是否存在相关性。结果显示：①宣威肺癌患者癌组织中的ACSM5的表达量明显低于其对应的癌旁组织，二者差异有统计学意义(P＜0.05)(图6A)；②宣威肺癌癌组织中ACSM5的SNP位点chr16：20442608中C碱基错义突变为A碱基的阳性率明显高于其对应的癌旁组织，二者差异也有统计学意义(P＜0.05)(图6B)，并且上述ACSM5的SNP突变之后，其影响的基因超过4000个不同的基因，此结果与表1中的结果一致(图6C)；③ACSM5低表达宣威肺癌患者的5年生存率及中位生存时间明显低于ACSM5高表达者(P<0.05)(图6D)。

上述结果表明：ACSM5可能是一个新的抑癌基因，其突变或低表达可能是宣威肺癌发生发展的原因之一。

实施例3

ACSM5在宣威肺癌和非宣威肺癌组织及癌旁组织中的表达水平验证

3.1qPCR验证结果

图6-A结果显示，基因ACSM5在肺癌患者中的表达量明显低于其配对的癌旁组织，且与不良预后呈相关性。为了证实上述结果，本研究通过qPCR方法，检测基因ACSM5在40对宣威肺癌和43对非宣威患者的癌组织及其配对的癌旁组织中的表达水平。结果表明，宣威肺癌和非宣威肺癌癌组织中的基因ACSM5表达量均低于及其配对的癌旁组织(P＜0.05)(图7-A)，本研究结果与(图6-A)生信分析结果一致。然而，基因ACSM5在宣威肺癌组与非宣威肺癌组中的表达量，组间比较无统计学差异(P＞0.05)(图7-A)。

3.2Western-blot验证结果

为了验证基因ACSM5在宣威肺癌患者/非宣威患者中蛋白质的表达量明显低于其配对的癌旁组织，本研究利用western-blot方法检测基因ACSM5在40对宣威肺癌和43对非宣威患者的癌组织及其配对的癌旁组织中总蛋白质的表达水平(图7-B)。结果表明，宣威肺癌和非宣威肺癌癌组织中的ACSM5总蛋白质表达量均低于及其配对的癌旁组织(P＜0.05)(图7-C)。然而，宣威肺癌组与非宣威肺癌组之间的基因ACSM5总蛋白质表达量无统计学差异(P＞0.05)(图7-C)。本研究结果与qPCR结果均表明与(图6-A)生信分析结果一致。

3.3免疫组织化学方法验证ACSM5在宣威肺癌/非宣威肺癌及癌旁组织中的表达及分布

免疫组织化学(Immunohistochemical，IHC)方法可以观察蛋白在不同组织中的表达水平是否存在差异，也可以观察目的蛋白在组织的不同细胞中表达分布的情况，因为肿瘤组织内部除了肿瘤细胞之外，还有脂肪细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等其它类型的细胞，即免疫组织化学染色，可以定位目的蛋白质在组织细胞内的位置。

在40例宣威肺癌癌组织中，ACSM5高表达为7例，占22.5％，低表达为31例，77.5占％；在配对的癌旁组织中，ACSM5高表达为29例，占72.5％，低表达为11例，占27.5％。结果表明：ACSM5在宣威肺癌癌组织中的表达低于癌旁组织中，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且主要表达于肿瘤细胞的胞浆中(表5，图8A-D)。

在43例非宣威肺癌癌组织中，ACSM5高表达为11例，占25.6％，低表达为32例，占74.4％；在配对的癌旁组织中，ACSM5高表达为29例，占67.4％，低表达为14例，占32.6％。结果表明：ACSM5在宣威肺癌癌组织中的表达低于癌旁组织中，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且主要表达于肿瘤细胞的胞浆中(表5，图8E-H)。

综上所述，在ACSM5在40例宣威肺癌与43例非宣威肺癌中，与癌旁组织相比较，ACSM5蛋白水平在癌组织中主要为低表达(表5)，低表达阳性率分别为77.5％和74.4％，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

上述结果初步证实：ACSM5在宣威肺癌及非宣威肺癌组织中低表达，发挥着抑癌基因角色。

表5 ACSM5在宣威肺癌和非宣威肺癌癌组织及癌旁组织中的表达及分析

4ACSM5与宣威肺癌各病例特点的相关性分析

ACSM5的表达量与40例宣威肺癌和43例非宣威肺癌的各临床特征的关系列入表6A和B。表6A结果表明：①在宣威肺癌中，ACSM5水平表达的高低与性别及转移情况有关(P＜0.05)；②在非宣威肺癌中，ACSM5水平表达的高低与组织分型及转移情况有关(P＜0.05)，而与性别无关(P＞0.05)。表6B结果显示：①在宣威肺癌中，ACSM5的表达量与性别、肿瘤分化程度及转移情况有关(P＜0.05)；②在非宣威肺癌中，ACSM5的表达量与肿瘤分化程度及转移情况有关(P＜0.05)，而与组织分型及性别无关(P＞0.05)。

上述结果表明：宣威肺癌和非宣威肺癌中ACSM5的表达高低水平与表达量，与其对应的临床特征的关系存在一定程度的不一致。

表6-A ACSM5表达水平与宣威肺癌和非宣威肺癌各病理特点的相关性分析

表6-BACSM5表达水平与宣威肺癌和非宣威肺癌各病理特点的相关性分析2

进一步根据ACSM5在40例宣威肺癌和43例非宣威肺癌中的癌组织及癌旁组织中的表达量，绘制受试者工作曲线(receiveroperatorcharacteristiccurve,ROC)(图9)。结果显示，与癌旁组织比较：①宣威肺癌癌组织中ACSM5的阳性表达量cut-off值为0.8472，曲线下面积AUC＝0.8131，差异具有统计学意义(P＜0.05)；②非宣威肺癌癌组织中ACSM5的阳性表达量cut-off值为1.598，曲线下面积AUC＝0.7600，差异具有统计学意义(P＜0.05)。本研究结果表明，与非宣威肺癌比较，宣威肺癌癌组织的ACSM5的阳性表达量cut-off值更低，曲线下面积更大(图9-A/C)。此外，本研究结果也表明：与癌旁组织比较，癌组织中ACSM5的表达阳性率低下(P＜0.05)(图9-B/D),与(图6-A)生信分析结果一致，即ACSM5在宣威肺癌及非宣威肺癌癌组织中低表达。尽管如表5所述，宣威肺癌和非宣威肺癌中ACSM5的高低表达阳性率之间无统计学差异，但通过ACSM5的表达量绘制ROC曲线后，ACSM5在二者中的阳性表达量阈值及诊断价值仍然有差异。

综上所述：ACSM5的表达水平与宣威肺癌的性别、分化程度及是否转移具有相关性，对宣威肺癌具有较好的诊断价值。

综上实施例结果表明：ACSM5在宣威肺癌癌组织中表达明显低于癌旁组织，其表达量与性别、组织分化、转移情况及不良预后呈相关性，可能在宣威肺癌中发挥着抑癌基因的角色；当ACSM5中1273位点的C碱基错义突变为A碱基，导致疏水性的脯氨酸错误地翻译为亲水性的苏氨酸后，其突变体ACSM5-P425T可作为宣威肺癌发生发展的“driven突变”并发挥着癌基因的角色。

研究对象与方法

1研究对象

1.1宣威肺癌的纳入标准和排除标准

纳入标准：(1)研究对象均来自云南省宣威地区，且在该地区至少居住15年以上；(2)组织标本经病理学专家明确诊断为肺癌；(3)术前均未接收过放疗和/或化疗的初诊患者。

排除标准：(1)术前接受过放疗和/或化疗；(2)合并其它免疫系统疾病、慢性消耗性疾病或感染性疾病；(3)合并其它类型的恶性肿瘤；(4)宣威地区其它肺部疾病，如良性肺肿瘤或肺部炎症等。

1.2非宣威肺癌纳入标准和排除标准

除外宣威地区的常住居民，其余纳入和排除标准同1.1.

1.3新鲜组织标本收集

本研究收集2018年10月～2020年12月昆明医科大学第一附属医院胸外科和老年胸外科住院接收手术的40对宣威肺癌和42对非宣威肺癌患者组织及配对的癌旁组织(距离癌组织边缘>5cm)。标本离体后半小时内用无菌盐水洗净，使用经过DEPC水洗净的小钳子切成约3～5mm的组织块并分装，其中1～2份组织经过4％中性甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，以备后续免疫组织化学实验所用。另外1～2份组织保存在含有非冻存RNA保存液的冻存管内，然后保存于液氮罐中以备后续实验用于mRNA水平和蛋白水平验证。

所有患者接收手术之前，均无放化疗病史。接收手术后，至少包含1年完整的临床资料和随访资料。另选取ACSM5蛋白高表达的肝细胞组织作为免疫组化实验的阳性对照。

1.4研究对象的临床资料收集

本研究纳入的研究对象的相关临床资料及组织标本，是在经昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准、患者知情同意的情况下进行。主要包括：姓名、性别、年龄、籍贯、居住地、吸烟史、既往史、家族史、病理诊断、肿瘤大小、TNM分期，免疫组化分子标记物结果、有无远处转移及治疗情况等。

2主要材料和试剂

3主要溶液配制

(1)转膜缓冲液配置(500mL)：Glycine(7.507g)，Tris(1.514g)，DeionizedH2O(400mL)，Methanol(100mL)。(2)TBST：1×TBS，0.1％Tween20。

(3)枸橼酸缓冲液(0.01M，pH6.0±0.1)：A液：2.1g枸橼酸C6H8O7·H2O，用水定容至100mL；B液：14.7g枸橼酸钠C6H5Na3O7·2H2O，用水定容至500mL；工作液：A液9mL+B液41mL，定容至500mL。

实验方法

1候选Driven突变筛选

首先，本研究对课题组前期的11对宣威肺癌及癌旁组织的转录组数据进行差异表达、KEGG富集、G0富集以及聚类分析等；同时，对其外显子组数据分析，获得所有外显子组的SNP位点及这些位点在千人基因组、亚洲人群等的突变数据，然后获得宣威肺癌病人整体的SNP突变特征。

其次，本研究联合转录组和外显子组进行eQTL分析，筛选对基因表达影响的每个SNP，通过计算每个SNP影响基因表达的数量，挖掘潜在的driven突变：通过筛选肿瘤中特异突变的SNP位点(fisher检验)，寻找既影响大量基因表达，又是肿瘤中特异突变的位点，同时其对应基因又在肿瘤中差异表达，这类SNP位点就是潜在的Driven突变。

最后，通过在TCGA数据库中进行验证，进一步判断筛选出的差异表达基因表达的变化是否与肿瘤预后相关，以此最终确认潜在的宣威肺癌特异的Driven突变，详见一下流程图(图1)。

2组织基因组DNA和RNA的提取：利用DNA提取试剂盒提取宣威和非宣威组织及其配对的癌旁组织的基因组DNA；利用Trizol提取上述组织总RNA。

2.1组织基因组DNA提取步骤如下：一般由三步组成：组织裂解、DNA与膜结合、DNA纯化。

2.1.1组织裂解

(1)准确称取约25mg～100mg的宣威和非宣威肺癌及其配对癌旁组织，置于装有液氮容器中研磨，注意研磨前用剪刀尽可能地剪成碎块；

(2)将研磨后的组织匀浆转移至2mlEppendorf管内，加入180μL的BufferGL、20μL的ProteinaseK和10μL的RNaseA(10mg/ml)，于56℃水浴箱中过夜，直到组织完全裂解(注：组织温浴、裂解过程中，可时常将样品取出进行震荡或吸打，以加速裂解)；

(3)组织裂解之后，先12，000rpm离心2分钟，去除杂质后再进行后续操作；

(4)向裂解液中加入120μLBufferGB和200μL100％乙醇，充分吸打混匀。

2.1.2DNA与膜结合、DNA纯化(参考DNAExtractionKit说明书)

(1)将SpinColumn安置于CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12，000rpm离心2分钟，弃滤液；(2)将500μL的BufferWA加至SpinColumn中，12，000rpm离心1分钟，弃滤液；(3)将700μL的BufferWB加至SpinColumn中，12，000rpm离心1分钟，弃滤液(注：实验前，确认BufferWB中已经加入指定体积的100％乙醇；沿着SpinColumn管壁四周加入BufferWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁的盐份)；(4)重复步骤3；(5)将SpinColumn安置于CollectionTube上，12，000rpm离心2分钟；(6)将SpinColumn安置于1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50～200μL的灭菌水或ElutionBuffer，室温放置5分钟(注：将灭菌水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率)；(7)12，000rpm离心2分钟洗脱DNA(注：如需获得更大收量，可将离下的液体重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入50～200μL的灭菌水或ElutionBuffer，室温放置5分钟，12,000rpm离心2分钟洗脱DNA)；(8)基因组DNA定量：提取得到的基因组DNA通过DNA/RNA测定仪测定A260/A280吸光度比值及对应浓度。当A260/A280≈1.8时，表明DNA纯度较高。(9)将符合条件(8)的DNA样品冻存于-20C备用。

2.2组织基因组总RNA提取

(1)将1mLTrizol试剂加入到1.5ml的Eppendorf管中；(2)取新鲜组织，组织块不宜过大，放在4℃的匀浆器中研磨；(3)研磨后的组织(米粒大小)转移至1mL的Trizol试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以上，使组织细胞充分裂解(肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状)；(4)室温孵育10min。(5)加入200μl氯仿，震荡混匀2030s(呈现粉乳色)，4。C放置5min(注意：此期间液体开始分层，此时不要轻易搅动液体)；(6)12500rpm，4。C离心15min；(7)将清澈透明的上层水相200μl(分2次吸取，100μl/次)转移至另一离心管中；(8)组织加入0.5ml异丙醇沉淀RNA，上下颠倒混匀，室温放置10min(此期间，可放置于-20。冰箱过夜接着完成之后步骤)。然后12500rpm，离心10min-30min。弃上清；(9)加1ml新鲜配置的75％乙醇洗涤管壁(注意：贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)；(10)7500rpm离心1min，弃上清。再离心几秒钟，将管壁液体(用加样器)完全移净(注意：①用Trizol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行；②当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速)；(11)室温干燥5～10min；(注意1：①干燥的时间由RNA沉淀大小决定；②干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键)

(注意2：RNA：①避免放在37。C孵箱中过度干燥以防无法溶解。②RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成逆转录实验失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因。③判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥，是逆转录过程成功与否的关键环节。)(12)RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O25μl，加到RNA上，反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存；(13)基因组总RNA定量：提取得到的基因组RNA通过DNA/RNA测定仪测定A260/A280吸光度比值及对应浓度。当A260/A280≈2.0时，表明RNA纯度较高；(14)将符合条件(13)的RNA样品立即应用逆转PCR录合成cDNA，并将其冻存于-20℃备用，逆转录PCR操作步骤详见5。

3组织样本总蛋白提取及定量

3.1总蛋白提取

准确称重新鲜组织约20mg，加入200μLRIPA裂解液(含1％PhosphataseInhibitorCocktail和1％ProteaseInhibitor)，在匀浆器中冰上研磨30min，然后在4C的离心机内12,000rpm离心10分钟，收集上清液置于冰上备用。

3.2BCA蛋白浓度定量

(1)按照50：1的体积比将BCA试剂A和试剂B混匀，配置工作液(该工作液在室温密闭条件下可保存数日)；(2)用超纯水将BCA标准品稀释为梯度浓度0，0.025，0.125，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2mg/mL，各取10μL加入到ELISA96孔反应板中；(3)样品同样用超纯水适量稀释，各取10μL加入孔中；(4)在各反应孔中加入200μL工作液，混匀，37℃温育30min；(5)将板取出冷却至室温，酶标仪上测定各孔在562nm处吸光值，据此绘制出标准曲线并计算样品浓度；(6)用RIPA裂解液(含1％PhosphataseInhibitorCocktail和1％ProteaseInhibitor)将各组织中的蛋白质浓度调至约lng，其中一部分蛋白样本使用loadingbuffer(5×)将蛋白质浓度再次调至20μg/50μL/EP管并分装，用于后续WesternBlot实验。

4组织DNA一代测序(Sanger测序)

将步骤2.1中提取后的DNA样本委托北京擎科生物技术有限公司完成Sanger测序。操作步骤(北京擎科生物技术有限公司提供的Protocol)简要如下：

4.1PCR产物切胶纯化步骤：

(1)补水加loadingbuffer：按照(样品：6×Loadingbuffer＝5：1)加入10μL的6×Loadingbuffer；(2)点纯化胶：将样品点入事先准备好的1％的纯化胶中；(3)电泳：电泳仪电压设定160V接上接头正负极恒压电泳40-60min，开始电泳后要观察纯化胶槽正负极有气泡冒出后，定时；(4)采集图像：将胶块放入凝胶成像仪器中采集图像；(5)切胶：在长波365nm紫外透射仪下，用手术刀切下目的条带，切取的胶块质量应小于3g，将其放入对应的板孔号中；(6)溶胶：纯化板配平4000rpm离心1min，加入500μLBufferGL，盖上封口膜，65℃水浴12～15min；

(7)加磁珠：检查每孔胶块是否完全溶解，若没有完全溶解再次65℃水浴3min，揭开封口膜，用连续加液器每孔加入10μL混匀的磁珠，盖上硅胶垫，漩涡震荡30s，转入水平震荡仪600-800rpm震荡5min；(8)纯化：①将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min；②弃废液，吸水纸上轻磕，用50-1200μL8道电动移液器向每孔移取500μLBufferW1,盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min；③弃废液，吸水纸上轻磕，用50-1200μL8道电动移液器向每孔移取500μLBufferW2盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min；④弃废液，吸水纸上轻磕，倒离心至600rpm；

(9)洗脱：取下磁力架，加入35μL的Eluent(已65℃水浴加热)，盖上封口膜，放入水平震荡仪上600-800转震荡5min，震荡完成后离心至1000rpm,将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min；(10)点鉴定胶：2μL样品+6μL0.5×溴酚蓝混合后点入0.8％的鉴定胶中，300V电泳12min；(11)采集图像：将鉴定胶放入凝胶成像仪中采集图像；(12)鉴定：对照纯化前后胶图，根据PCR定量标准在PCR记录表上标注每孔模板浓度并稀释至指定浓度。

4.2BDT反应操作

(1)样品的准备:96孔板DNA制备组处理好的样品；

(2)引物的准备,将按照要求稀释好的引物(浓度)整理好；

人源ACSM5、ELMO和CFB测序引物如下：

ACSM5上游测序引物为：5'-ACACTCACGTATGCACCTCT-3'

ACSM5下游测序引物为：5'-AAGAAACAGAAGGGCCGAGT-3'

ELMO上游测序引物为：5'-CTGCAGAACCTGAGCTACACT-3'

ELMO下游测序引物为：5'-TTCCCTGAGGAGCTCACAACA-3'

CFB上游测序引物为：5'-AATCAAGGTCAGCGTAGGAGG-3'

CFB下游测序引物为：5'-GGGAGACAAATGGGCCTGATA-3'

(3)BDT反应(反应体系的加入)

①保持反应室内良好的环境，包括卫生、温度、湿度等(具体数据)；②器具材料准备：首先将样品及引物对应BDT表，核实找到对应的96孔样品板及引物板。其次准备全(如冷冻的96反应板、移液器、移液器枪头、封口膜，96孔板板托、连续加液器等)器具；③按照数据库中的实验信息，按照顺序摆放好所找的样品以及引物；④反应体系(正常5μL)加入过程须按先加1μL引物，其次加2μL模板最后加1μLBDT和1μL甜菜碱的顺序；⑤加完检查后，盖上膜盖，配平于离心机(4℃离心，4000转)将液体离心至管底，盖上八连管盖震荡混匀反应体系，再次离心，完成后放上PCR仪，进行反应；⑥最后上完样板，开启程序，选择公司TS—SEQ程序，查看是否是目标程序(96℃4min—96℃10s—50℃5s—60℃3min—4℃∞)，升温是否正常，确认无误后方可。

4.3反应纯化上测序仪

(1)样品的检查与准备:检查PCR仪上是否是完成TS-SEQ程序的DNA样品，确认无误之后，从PCR仪上取下，然后用天平配平，上离心机，用4000转每分钟程序，离心1分钟；(2)试剂的准备:配制MagicalBuffer、FerriteBead这两种试剂，试用完成并且经过检验之后才可投入正常试用。FerriteBead在使用之前，先用振荡器震荡均匀；(3)操作流程:①将离心完的反应板，放在96板板托上面，接下八连管盖，用100μL规格八道移液器加入38μL振荡均匀的FerriteBead，盖上灭过菌的硅胶垫，检查密封性，是否盖好。秒表计时，用振荡器震荡10秒钟，静置1分钟，再次震荡10秒钟。用天平配平，离心机离心至1500转时停止；②取出离心完的反应板，放入磁力架中，检查是否卡好。用秒表计时，静置2分钟。完成后，取下硅胶垫，弃废液，垫上吸水纸，在离心机中用550转每分钟的程序倒离心，离心至550转，就可将离心机停止，取出磁力架；③将磁力架上的样品板放好，加入100μLMagicalBuffer，静置30秒，秒表计时，时间完成后，弃废液，垫上干净的吸水纸，使用550转每分钟的程序倒离心，离心20秒，停止程序，再次垫上干净的吸水纸，离心20秒；④将样品板从磁力架上取出，放在96孔板板托上，静置晾干5分钟，秒表计时。完成后观察样品板上是否还有水珠，若有，继续晾干，若无，加入20μL的无菌高纯水。盖上硅胶垫进行震荡。时间1分钟。完成后，用天平配平，上离心机，用4000转每分钟的程序，离心1分钟；⑤从离心机中取出样品板，放入磁力架卡好，静置1分钟，秒表计时。时间完成后，揭开硅胶垫，10μL八道移液器吸取上清液，转入至新的上机板中，记录好相应的版号。用天平配平，放置离心机中，用4000每分钟程序离心1分钟。完成后，取出上机板，观察96孔板底部是否有磁珠，如过没有，则磁珠纯化操作完成；如果有，用移液器将磁珠吸取出，上离心机离心4000转每分钟持续一分钟，取出检查无误可以上机。

(4)测序结果分析

从测序仪上拷贝出数据，通过SequencingAnalysis5.2分析峰图数据，最后判定数据是否可用。如果可用，发送结果abi格式和seq格式。

5RNA逆转录PCR(RT-PCR)

将2.2中提取完成的组织总RNA应用RT-PCR试剂5×ALL-In-OneMasterMix(GenomicDNARemowalKit，G492，abm)逆转录合成cDNA。具体操作步骤如下：

(1)样品及试剂准备：冰上融化5×ALL-In-OneMasterMix各试剂组分后，短暂旋涡混匀并点甩；(2)按照下列步骤准备20μL反应体系完成RT-PCR过程：

(3)将上述反应体系EP管放入Bio-PCR仪，按以下条件调整PCR反应程序：25℃10分钟-42℃15分钟(qPCR)或50分钟(PCR)-85℃5分钟，4℃无限冷却；(4)新合成的第一条cDNA链随即用于qPCR或-20℃保存。

6实时荧光定量PCR(Real-TimeQuantitativePCR，qPCR)

为了验证目的基因ACSM5在宣威肺癌/非宣威肺癌的癌组织及其配对癌旁组织中的相对表达量，我们采用了SYBRGreenReal-TimeQuantitativePCR方法。将步骤5中新合成的cDNA应用qPCR试剂EvaGreen2×qPCRMasterMix(Cat#：MasterMix-R，abm)qPCR进行。具体操作步骤如下：

(1)样品及试剂准备：冰上融化EvaGreen2×qPCRMasterMix各试剂组分后，短暂旋涡混匀并点甩；人源ACSM5引物序列为：上游引物为：5’-TTGTGGATGATGAGGGCAACG-3’；下游引物为：5’-AGAAACAGAAGGGCCGAGTGG-3’；人源GAPDH引物序列为：上游引物为：5’-GCATCCTGGGCTACACTGAGH-3’；下游引物为：5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3’

(2)按照下列步骤准备20μL/测试反应体系完成qPCR过程：

组分	20μL反应体系	终浓度
			EvaGreen2×qPCRMasterMix	10μL	1×
ForwardPrimer(10μM)	0.6μL	300nM
			ReversePrimer(10μM)	0.6μL	300nM
TemplateDNA	4μL	≈500ng/reaction
			Nuclease-freeH2O	to20μL

(3)qPCR反应程序设置如下：

(4)将加好样本(重复3次)的96孔qPCR反应板封膜并放入qPCR扩增仪，按以上步骤(3)执行qPCR反应；(5)PCR扩增结束后，观察扩增曲线及溶解曲线是否正常，然后采用相对表达倍数变化分析法，计算ACSM5在癌组织及癌旁组织的相对表达量。

计算公式如下：ΔCtcase＝Ctcase-CtGAPDH；ΔCtcontrol＝Ctcontrol-CtGAPDHΔΔCt＝ΔCtcaseΔCtcontrol

7Westernblot检测ACSM5在宣威肺癌和非宣威肺癌患者组织及配对的癌旁组织中的表达水平

7.1SDS-PAGE电泳：

(1)将步骤3分装的总蛋白取出解冻之后，放入≥95℃的沸水中煮沸5分钟，然后放置于冰上；(2)灌胶：按说明书配置相应凝胶后灌注，下层胶至少15min，上层胶至少15min；(3)电泳液配置：14.4gGlucine+1gSDS+3gTri溶于1L水；转膜液配置：14.4gGlucine+3gTri+800ml水+200ml甲醇。(4)上样：向每个上样孔内加入10μL待测样品，接通电源调节电压80V，至分离胶时调至120V，电泳约1.5h；(5)转膜：裁剪成合适大小的三层滤纸+胶(事先切口标注正反)+PVDF膜(事先甲醇浸泡1min)+三层滤纸。注意赶走气泡，由下而上顺序为黑胶白膜，然后转膜框红对白，黑对黑放入转膜槽，将电流调至200mA，90min；(6)封闭：①封闭液配置(2～5％)：0.5gBSA+10mlTBST；②TBST配置：1袋TBST粉+2L水+2ml吐温；③封闭时间为1h；④将目的条带和内参基因条带裁剪(GAPDH约35KD，β-actine约45KD)。(7)杂交反应①一抗及内参抗体反应：4℃过夜摇动，然后用TBST洗3次，每次10min；②二抗反应：1小时摇动，然后用TBST洗3次，每次10min；③注意事项：一抗稀释按说明说用封闭液稀释；二抗按1：5000～10000稀。释(10ML封闭液+2μL二抗)。

7.2PVDF膜曝光检测：

将ECL液A和B按照1：1比例配置合适的量混匀后，向PVDF膜加入适量的AB混合液(覆盖整张PVDF膜)，放入ImageQuantLAS4000mini仪器曝光检测。

8免疫组织化学方法检测ACSM5在宣威肺癌和非宣威肺癌患者组织及配对的癌旁组织中的表达分布

8.1石蜡切片的制作：

(1)将步骤1.3所收集的石蜡包埋的蜡块切成厚度约3～5μm的切片，常规HE染色，光镜下观察宣威肺癌细胞及人正常肝组织细胞(阳性对照)的形态及染色情况；(2)将石蜡切片放入68℃烤箱40分钟；(3)脱蜡：将切片放入含有二甲苯溶液的三个玻璃缸内依次浸泡10分钟。然后，放入装有100％乙醇溶液的两个玻璃缸内，依次浸泡2分钟。再放入装有95％乙醇溶液的两个玻璃缸内，依次浸泡2分钟。之后放入装有75％乙醇溶液的两个玻璃缸内，依次浸泡2分钟。最后使用流动的自来水轻轻冲洗3分钟和蒸馏水清洗1分钟；(4)抗原修复：用0.01mol/L柠檬酸/EDTA缓冲液在1000W的水浴箱中热处理2分30秒后，自然冷却10分钟，开盖水浴箱降温至锅内温度低于37℃，蒸馏水洗1分钟。再用3～3.5％过氧化氢浸泡10分钟，最后使用PBS冲洗3次，每次3分钟；(5)滴加ACSM5一抗(NO：67334-1-Ig按说明书推荐，使用TBST进行1：2000稀释)，在37℃条件下孵育1小时；(6)使用PBS冲洗3次，每次5分钟；(7)擦干后加入二抗，在37℃条件下孵育40分钟；(8)使用PBS冲洗3次，每次5分钟；(9)使用DAB显色剂显色5分钟后，水洗终止显色；(10)复染：将水冲洗后的片子浸泡于苏木精中染色；(11)脱水：将复染后的片子用清水冲洗后，一次放入75％乙醇-95％乙醇-100％乙醇，每次2分钟，最后将切片放入二甲苯中；(12)树胶封片及镜检。

8.2免疫组织化学染色结果评分标准：

根据阳性细胞染色面积百分比评分：①未染色为0分，染色面积25％以下为1分，染色面积25％-50％为2分，染色面积50％以上为3分，染色面积75％以上为4分；②阳性染色强度评分：无染色0分，浅棕色1分，棕色2分，棕褐色3分。最终免疫组织化学染色结果＝①×②，0～1分为低表达，>2分为高表达。

9统计学分析

采用SPSS21.0软件进行分析。分析前数据进行正态性检验。正态数据以X±SD表示，偏态数据以中位数(P25-P75)表示。正态分布数据两组间比较采用两组独立样本的t检验，多组间比较采用ANOVA单因素方差分析；偏态分布数据两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。组间百分率的比较采用卡方检验。变量间相关性采用Spearman相关分析和多元线性回归分析。多项Logistic回归分析计算OR值及其95％CI。聚类分析采用Cluster3.0软件进行。生存时间描述性分析采用Kalpan-Meier法，组间生存情况比较采用logrank检验，对单因素分析中有统计学意义的因素纳入Cox回归模型进行多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

Claims (10)

1.ACSM5基因和/或其编码蛋白检测试剂在制备宣威肺癌辅助诊断或预后判断试剂盒中的应用，其特征在于，宣威肺癌组织较癌旁组织的ACSM5基因和/或其编码蛋白表达水平明显低下。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，ACSM5基因检测试剂，选自：

特异性扩增所述ACSM5基因的引物；或特异性识别所述ACSM5基因的探针；或特异性结合所述ACSM5基因编码的蛋白的抗体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，特异性扩增所述ACSM5基因的引物包扩上游引物为：5'-TTGTGGATGATGAGGGCAACG-3'，下游引物为：5'-AGAAACAGAAGGGCCGAGTGG-3'的引物对。

4.ACSM5基因和/或其编码蛋白在制备治疗宣威肺癌的药物中的应用，其特征在于，所述药物是用于在ACSM5表达下调或缺失的宣威肺癌细胞系或癌组织中恢复ACSM5的表达。

5.一种宣威肺癌基因ACSM5-P425T，其特征在于，所述ACSM5-P425T序列为基因ACSM5中chr16:20442608位点的C碱基错义突变为A碱基后引起的单核苷酸多态性形成。

6.根据权利要求5所述的ACSM5-P425T基因和/或其编码蛋白检测试剂在制备宣威肺癌辅助诊断或预后判断试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，ACSM5-P425T基因检测试剂，选自：特异性扩增所述ACSM5基因的引物；或特异性识别所述ACSM5-P425T基因的探针；

或特异性结合所述ACSM5-P425T基因编码的蛋白的抗体。

8.靶向ACSM5中的SNP位点chr16:20442608的药物在制备治疗宣威肺癌的药物中的应用。

9.抑制ACSM5-P425T基因和/或其编码蛋白表达的药物在制备治疗宣威肺癌的药物中的应用。

10.一种区别宣威肺癌或者非宣威肺癌的方法，其特征在于，在分子水平和/或蛋白质水平上宣威肺癌和非宣威肺癌细胞中ACSM5较癌旁组织表达明显低下。