CN117004635A

CN117004635A - 一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法

Info

Publication number: CN117004635A
Application number: CN202210468072.3A
Authority: CN
Inventors: 生举正; 胡宏羽; 侯进; 王钰佳
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2023-11-07

Abstract

本发明涉及一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法。包括步骤：(1)构建糖胺聚糖骨架合酶文库；(2)构建重组载体；(3)构建筛选糖胺聚糖骨架合酶的重组菌；(4)培养重组菌；(5)将重组菌的菌液通过流式分析或流式分选后，测定荧光度，筛选出目标糖胺聚糖骨架合酶。本发明以枯草芽孢杆菌BS168ASS为宿主菌，过表达了尿苷二磷酸‑葡萄糖‑6‑脱氢酶基因和糖胺聚糖骨架合酶基因，构建筛选糖胺聚糖骨架合酶的重组菌。然后通过测定菌株的荧光，实现对糖胺聚糖骨架合酶菌株高通量且准确的筛选，提高了筛选效率，且对于新来源的酶，特别是宏基因组文库中无法培养的微生物群中新糖胺聚糖骨架合酶的发现提供了新的起点。

Description

一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法

技术领域

本发明涉及了一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，具体地说涉及枯草芽孢杆菌的叠氮化修饰糖胺聚糖骨架合成途径的改造及基于该菌株的针对糖胺聚糖骨架合酶的荧光激活细胞分选，属于生物技术技术领域。

背景技术

糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAGs)是广泛存在于高等动物结缔组织中的一种长线形杂多糖，由己糖醛酸或己糖、己糖胺的重复二糖单元组成，根据单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置，可将糖胺聚糖可分为：透明质酸(Hyaluronic acid，HA)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)、硫酸皮肤素(Dermatan sulfate，DS)、硫酸角质素(Keratin sulfate，KS)、硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)和肝素(heparin，HP)。糖胺聚糖可与生长因子、细胞因子、趋化因子和酶相互作用，对机体生长、炎症反应、凝血、肿瘤转移等过程具有重要的影响。

尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶(Uridine diphosphate glucose-6-dehydrogenase，tuaD)，该酶存在于枯草芽孢杆菌基因组DNA中，可催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glucose)转化为尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)，在已有的研究中已经证明了UDP-GlcA对糖胺聚糖骨架生物合成有限制，因此tuaD是高水平糖胺聚糖骨架生物合成的关键。

糖胺聚糖骨架合酶(Glycosyltransferase，GTs)是催化单糖单元以区域和立体定向的方式从糖供体转移到多糖上的一种酶，为合成复杂低聚糖提供了非常高效的方法。然而，可利用的GTs数量有限，加之其不稳定性和严格的底物特异性，严重阻碍了这些酶的广泛应用，因此，获得可以高效合成特定低聚糖和糖缀合物的糖基转移酶具有深刻的意义。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，属于革兰氏阳性菌，被认为是GRAS(Generally recognized as safe)，对环境具有很好的耐受性，且根据已有的研究，枯草芽孢杆菌关于糖胺聚糖合成途径的相关背景较为干净。

在过去的研究中，通过蛋白质工程定向进化的方法在拓宽底物范围、改变底物特异性和提高GTs活性等方面取得了有限的成功，部分原因是缺乏有效的高通量筛选方法。由于与糖苷键形成相关的荧光或吸光度没有明显变化，因此测定GTs活性极具挑战性。而理想表型的筛选在大多数情况下是一个随机过程。因此，开发可应用于大型GTs文库的高通量、低成本的筛选方法是非常有意义的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法。具体是构建一株高效合成叠氮化修饰糖胺聚糖骨架的重组枯草芽孢杆菌，再通过该菌株对糖胺聚糖骨架合酶进行高通量筛选。

本发明的技术方案如下：

一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，包括步骤如下：

(1)采用BLASTp方法，随机获取糖胺聚糖骨架合酶基因，构建糖胺聚糖骨架合酶文库；

(2)分别将文库中的糖胺聚糖骨架合酶基因和尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶基因tuaD表达盒连接到pHCMC04质粒中，得到重组载体pHCMC04-GTs-tuaD；

(3)将重组载体pHCMC04-GTs-tuaD转化到枯草芽孢杆菌BS168ASS中，挑选阳性重组子，得到筛选糖胺聚糖骨架合酶的重组菌GD；

(4)将筛选糖胺聚糖骨架合酶的重组菌GD按照0.05～0.15％的体积比接种于含特殊底物的LB液体培养基中，在35～40℃，200～250rpm下过夜培养，得到重组菌GD的菌液；

(5)将重组菌GD的菌液按照0.5～1.5％的体积比接种于含特殊底物的LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，然后转移至不含葡萄糖的M9低盐培养基中，培养0.5～1.5h，加入终浓度为15～25g/L的木糖诱导剂和终浓度为80～120μg/mL的N-叠氮乙酰葡萄糖胺，诱导培养4～8h，然后将菌体与荧光素避光反应0.5～1.5h，当糖胺聚糖骨架合酶文库中的基因在20个以下时，将荧光反应后的菌体进行流式分析，再测定荧光强度或测定荧光强度与吸光度的比值，筛选出目标糖胺聚糖骨架合酶；当糖胺聚糖骨架合酶文库中的基因超过20个时，将荧光反应后的菌体进行流式分选，再测定荧光强度，收集荧光强度在前0.5～2％的菌体，筛选出目标糖胺聚糖骨架合酶。

根据本发明优选的，步骤(1)中，所述糖胺聚糖骨架合酶为硫酸软骨素骨架合酶、肝素骨架合酶或透明质酸合酶。

根据本发明优选的，步骤(2)中，所述尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶基因tuaD的NCBI数据库的ID为936766。

根据本发明优选的，步骤(3)中，所述枯草芽孢杆菌BS168ASS为阻断内源尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖苷(GlcNAc)合成途径，表达异源尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖苷补救合成途径的枯草芽孢杆菌。

根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌BS168ASS的构建方法如下：

以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168为出发菌株，敲除编码合成UDP-GlcNAc途径的关键酶分子的基因glmS，然后插入编码N-乙酰己糖胺-1-激酶的基因NahK和编码N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸-尿嘧啶转移酶的基因AGX1，得到枯草芽孢杆菌BS168ASS。基因glmS编码的酶负责催化果糖-6-磷酸到葡萄糖-6-磷酸，基因NahK编码的酶可以利用ATP和GlcNAc催化得到GlcNAc-1-P，基因AGX1编码的酶可以催化GlcNAc-1-P到UDP-GlcNAc，枯草芽孢杆菌BS168ASS可以利用N-叠氮乙酰化葡萄糖胺GlcNAz为底物生成UDP-GlcNAz。

进一步优选的，所述基因glmS的NCBI数据库的ID为938736，所述N-乙酰己糖胺-1-激酶的基因NahK来自于长双歧杆菌，NCBI数据库的ID为69578838，所述N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸-尿嘧啶转移酶的基因AGX1来自于人，NCBI数据库的ID为6675。

根据本发明优选的，步骤(4)和(5)中，所述含特殊底物的LB液体培养基的组分如下：10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L氯化钠、5μg/mL氯霉素和100μg/mL糖胺聚糖骨架合酶天然底物GlcNAc。

根据本发明优选的，步骤(5)中，所述荧光素为Cyanine5 DBCO，荧光素的终浓度为0.5mM，避光反应时间为1h。

根据本发明优选的，步骤(5)中，所述测定荧光强度和吸光度的具体参数为：发射波长为646nm，激发波长为662nm，吸光度为600nm。

本发明的技术特点：

本发明利用GlcNAz培养含糖胺聚糖骨架合酶的重组菌BS168ASSGD，使菌株表面产生叠氮化修饰的糖胺聚糖骨架，该多糖骨架与荧光染料Cyanine5 DBCO发生点击化学反应后使菌株表面带有荧光，含有糖胺聚糖骨架合酶菌株的荧光强度与吸光度的比值是不含糖胺聚糖骨架合酶的菌株的1倍以上，结合荧光激活细胞分选可以实现对有活性的糖胺聚糖骨架合酶进行高通量筛选。

荧光染料Cyanine5 DBCO与GlcNAz发生点击化学反应的反应式如下：

有益效果：

本发明以阻断内源GlcNAc合成途径，表达GlcNAc(GlcNAz)补救合成途径的枯草芽孢杆菌BS168ASS为宿主菌，过表达了尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶基因tuaD和糖胺聚糖骨架合酶基因，构建了筛选糖胺聚糖骨架合酶的重组菌。然后以该菌株为基准，通过测定荧光强度或测定荧光强度与吸光度的比值，实现对有活性的糖胺聚糖骨架合酶菌株进行高通量且准确的筛选，极大的提高了筛选效率，且对于新来源的酶，特别是宏基因组文库中无法培养的微生物群中新糖胺聚糖骨架合酶的发现提供了新的起点。

附图说明

图1：尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶基因tuaD的PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图中：M为marker；1为tuaD基因PCR扩增产物；

图2：硫酸软骨素骨架合酶KfoC基因、透明质酸骨架合酶PmHAS基因、肝素骨架合酶PmHS2基因PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图中：M为marker；1为KfoC基因PCR扩增产物；2为PmHAS基因PCR扩增产物；3为PmHS2基因PCR扩增产物；

图3：通过BLASTp算法寻找的CcCS基因、CvCS基因、NdCS基因、MsCS基因、RhCS基因、MeCS基因、HfCS基因、LeCS基因、PsCS基因和HfCS基因的PCR扩增产物电泳图；

图中：M为marker；1为CcCS基因PCR扩增产物；2为CvCS基因PCR扩增产物；3为NdCS基因PCR扩增产物；4为MsCS基因PCR扩增产物；5为RhCS基因PCR扩增产物；6为MeCS基因PCR扩增产物；7为HfCS基因PCR扩增产物；8为LeCS基因PCR扩增产物；9为PsCS基因PCR扩增产物；10为TmCS基因PCR扩增产物；

图4：pHCMC04质粒骨架经SpeI和BamHI双酶切后的电泳图；

图中：M为marker；1为质粒pHCMC04双酶切片段；

图5：含硫酸软骨素骨架合酶KfoC基因；透明质酸骨架合酶PmHAS基因；肝素骨架合酶PmHS2基因的重组质粒构建图谱；

图中：A为pHCMC04-KfoC-tuaD重组质粒；B为pHCMC04-pmHAS-tuaD重组质粒；C为pHCMC04-PmHS2-tuaD重组质粒；

图6：含通过BLASTp算法寻找的CcCS基因、CvCS基因、NdCS基因、MsCS基因、RhCS基因、MeCS基因、HfCS基因、LeCS基因、PsCS基因和TmCS基因的重组质粒构建图谱；

图中：A为pHCMC04-CcCS-tuaD重组质粒；B为pHCMC04-CvCS-tuaD重组质粒；C为pHCMC04-NdCS-tuaD重组质粒；D为pHCMC04-MsCS-tuaD重组质粒；E为pHCMC04-RhCS-tuaD重组质粒；F为pHCMC04-MeCS-tuaD重组质粒；G为pHCMC04-HfCS-tuaD重组质粒；H为pHCMC04-LeCS-tuaD重组质粒；I为pHCMC04-LeCS-tuaD重组质粒；J为pHCMC04-TmCS-tuaD重组质粒；

图7：重组菌BS168SSAED、BS168SSACD、BS168SSAHS2D和BS168SSAHASD发生点击化学反应后由酶标仪测定的荧光情况；

图中：横坐标为重组菌株类型，纵坐标为荧光强度与吸光度比值；

图8：重组菌BS168SSAED、BS168SSACD、BS168SSAHS2D和BS168SSAHASD发生点击化学反应后由流式分析测定的荧光情况；

图中：A为BS168SSACD与BS168SSAED的荧光强度对比情况；B为BS168SSAHS2D与BS168SSAED的荧光强度对比情况；C为BS168SSAHASD与BS168SSAED的荧光强度对比情况；

图9：含CcCS基因、CvCS基因、NdCS基因、MsCS基因、RhCS基因、MeCS基因、HfCS基因、LeCS基因、PsCS基因和TmCS基因的重组枯草芽孢杆菌发生点击化学反应后由酶标仪测定的荧光情况；

图中：横坐标为重组菌株类型；纵坐标为荧光强度与吸光度比值；

图10:含CvCS基因、HfCS基因、MeCS基因的重组质粒构建图谱；

图中：A为Pet28a(+)-His-CvCS重组质粒；B为Pet28a(+)-His-HfCS重组质粒；A为Pet28a(+)-His-MeCS重组质粒；

图11：CvCs蛋白、HfCS蛋白和MeCS蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图中：M为marker；1为CvC蛋白；2为HfCS蛋白；3为MeCS蛋白；

图12：CvCs蛋白、HfCS蛋白和MeCS蛋白的UDP-GalNAc/UDP-GalNAc转移酶活性图；

图中：横坐标为蛋白类型；纵坐标为转化率。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特殊说明，本发明中所运用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而非限制本发明的保护范围。

以下实施例中所使用的PCR Taq酶、无缝克隆试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21(de3)感受态细胞，均购于Vazyme；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒，均购于OMEGA bio-tek(USA)；限制性核酸内切酶购于Thermo Scientific；荧光素Cyanine5 DBCO购自Lumiprobe。未做特别说明的实验步骤均按照产品说明书进行。

实施例1：高效合成叠氮修饰糖胺聚糖骨架的枯草芽孢杆菌工程菌株BS168SSAGD的构建

1、枯草芽孢杆菌BS168ASS的构建

所述枯草芽孢杆菌BS168ASS为阻断内源尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖苷(GlcNAc)合成途径，表达异源尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖苷(N-叠氮乙酰葡萄糖胺，GlcNAz)补救合成途径的枯草芽孢杆菌，具体构建方法如下：

(1)UDP-GlcNAc内源合成途径的阻断

将公司(金斯瑞)合成的带有新霉素抗性基因glmS基因同源臂片段的pUC57-neo质粒用BamHI酶切，得到1800bp片段；

酶切体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴1h。并将酶切后的体系脱盐液体回收。

将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168以0.1％的体积比例接种于LB液体培养基中，在37℃，225rpm摇床中过夜过化。取2.6mL过夜培养物接于40mL培养基(LB+0.5M山梨醇)中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.8～0.9。将菌液冰水浴10分钟，然后5000g，4℃离心5分钟收集菌体。用50mL预冷的电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油)，重新吹悬菌体，5000g，4℃离心5分钟去上清，如此漂洗4次。将洗涤后的菌体吹悬于1mL电转培养基中，每个EP管分装60μL，得BS168电转感受态。

在60μL电转感受态细胞中加入6μL的pUC57-neo质粒酶切后液体回收产物，冰上孵育2分钟，加入到预冷的电转杯(1mm)中，电击一次。电转仪设置：2kV，1mm，电击1次。电击完毕取出杯子并立即加入1mL RM培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃，200rpm，复苏3小时后，在含有50μg/mL新霉素的LB固体培养基上培养过夜，挑取阳性转化子，记为BS168△glmS菌株。

(2)可利用GlcNAc(GlcNAz)的UDP-GlcNAc(UDP-GlcNAz)补救合成途径的引入

设计带有卡那霉素抗性基因的新霉素抗性基因同源臂片段P_veg-AGX1-P_veg-NahK，以敲除基因组上的新霉素抗性基因，pUC57-P_veg-AGX1-P_veg-NahK质粒在公司合成(生工)。利用Acc65I和SmaI酶切pUC57-P_veg-AGX1-P_veg-NahK质粒；

酶切体系如下：

按照(1)中所述方法制备BS168△glmS电转感受态，并将同源臂片段P_veg-AGX1-P_veg-NahK电转入BS168△glmS电转感受态中，在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜，挑取阳性转化子，得到枯草芽孢杆菌BS168ASS。

所述基因glmS的NCBI数据库的ID为938736，所述N-乙酰己糖胺-1-激酶的基因NahK来自于长双歧杆菌，NCBI数据库的ID为69578838，所述N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸-尿嘧啶转移酶的基因AGX1来自于人NCBI数据库的ID为6675。

此具体方法已经在中国专利文献2021100967185中公开。

2、尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶基因tuaD的获取

提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，tuaD F和tuaD R为引物进行PCR，所述引物序列为：

tuaD F:5’-AGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGG-3’，

tuaD R:5’-GACGTCGACTCTAGAGGATCCTTATAAATTGACGCTTCCCAAGTC-3’；

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：95℃预变性3min，；95℃变性15s，72℃退火15s，58℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳30min，胶回收纯化PCR产物。所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析检测，结果如图1所示，得到大小约为1390bp的电泳条带，即为tuaD片段。

3、构建糖胺聚糖骨架合酶文库

获得来源于Escherichia coli的硫酸软骨素骨架合酶KfoC，NCBI数据库的ID为CAD5992240.1；来源于Pasteurella multocida的肝素骨架合酶PmHS2，NCBI数据库的ID为AY292200.1；来源于Pasteurella multocida的透明质酸骨架合酶pmHAS，NCBI数据库的ID为AAC38318.2，这三个酶均为高活性的糖胺聚糖骨架合酶。

以这三个酶的氨基酸序列为序列比对模板，通过BLASTp算法进行生物信息学数据库(NCBI数据库)序列比对，寻找了十个可能为糖胺聚糖骨架合酶(GTs)的氨基酸序列，分别简称为CcCS，NCBI数据库的ID为WP_150081707.1；CvCS，NCBI数据库的ID为WP_168227469.1；HfCS，NCBI数据库的ID为NBI12747.1；LeCS，NCBI数据库的ID为WP_1661815；MsCS，NCBI数据库的ID为WP_024460064.1；MeCS，NCBI数据库的ID为WP_167432605.1；NdCS，NCBI数据库的ID为WP_085359788.1；PsCS，NCBI数据库的ID为WP_144187813.1；RhCS，NCBI数据库的ID为WP_077587478.1；TmCS，NCBI数据库的ID为WP_136735112.1

以上13个基因片段通过大肠杆菌及枯草芽孢杆菌双密码子优化后由公司(金斯瑞)合成相应的质粒pET28a(+)-His-GT，存在于E.coli TOP10中。分别设计引物，对质粒进行PCR得到相应的基因片段，统称为GT片段。其中引物序列分别为：

KfoC F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGAGTATTCTTAATCAAGCAATA-3’；

KfoC R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTATAAATCATTCTCTATTTTTT-3’；

PmHAS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGAACACACTGAGCCAAGCAA-3’；

PmHAS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTACAGTGTAATTGAATTAATAA-3’；

PmHS2 F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGAAAGGCAAAAAAGAAATGA-3’；

PmHS2 R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTAAAGAAAATAAAACGGCAGGC-3’；

CcCS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGCAACAATCTAGCAAATCATTT-3’；

CcCS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTATATATTTTTGTGAAAAGAGGT-3’；

CvCS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGACAATTTTGAATCAAGCGATT-3’；

CvCS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTATATAAACTGCTGAATACACAG-3’；

HfCS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGAATATACTGTCCAAGGCAATT-3’；

HfCS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTAAGCAAAGTTAAGCCGATGGGT-3’；

LeCS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGTCGATTTTTAACGAAGCAATT-3’；

LeCS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTATATAAATTTGAAACCGATTTT-3’；

MeCS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGGCCAGCTTTGTAGAAGCTAAC-3；’

MeCS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTATTTTTTGAAAAAAACTACCTG-3’；

MsCS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGGGGGCAGGTCAAAATATACTG-3’；

MsCS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTAAAGAAAATAAAACGGCAGGC-3’；

NdCS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGGAAAAGATCCTGAGCCGCGCA-3’；

NdCS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTATATGTTTTTAAACTGAATCAG-3’；

PsCS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGAAGATCCTGAGCAATGCGATT-3’；

PsCS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTACGTTATAAAATTACCAATGGC-3’；

RhCS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGAATATTCTGTCAAAAGCCGTT-3’；

RhCS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTAATAATAGGTAATGTAAAAGTT-3’；

TmCS F:5’-TGACAAATGGTCCAAACTAGTATGAATAAAAATATATTCGATCAA-3’；

TmCS R:5’-GTACATTCCTCTCTTGGTACCTTAAAGCAAAGTGCTGAACTGCTC-3’。

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：95℃预变性3min，；95℃变性15s，72℃退火15s，60℃延伸3min，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳30min，胶回收纯化PCR产物。所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析检测，结果如图2和图3所示。

4、重组表达质粒的构建

(1)将载体质粒pHCMC04用SpeI和BamHI双酶切，得到的8000bp片段，该片段的电泳图如图4所示；

酶切体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴1h。

(2)将酶切后的载体质粒与tuaD片段和GT片段通过DNA无缝克隆的方法连接，再通过化学转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，经测序验证后共得到13个重组表达载体，分别为pHCMC04-CcCS-tuaD重组质粒、pHCMC04-CvCS-tuaD重组质粒、pHCMC04-NdCS-tuaD重组质粒、pHCMC04-MsCS-tuaD重组质粒、pHCMC04-RhCS-tuaD重组质粒、pHCMC04-MeCS-tuaD重组质粒、pHCMC04-HfCS-tuaD重组质粒、pHCMC04-LeCS-tuaD重组质粒、pHCMC04-LeCS-tuaD重组质粒、pHCMC04-TmCS-tuaD重组质粒、pHCMC04-KfoC-tuaD重组质粒、pHCMC04-PmHAS-tuaD重组质粒和pHCMC04-PmHS2-tuaD重组质粒，统称为GD表达载体，具体重组质粒构建图谱如图5和图6所示。

无缝克隆反应体系如下：

无缝克隆反应条件：在50℃下水浴反应30～50min。

5、构建含有GD表达载体的重组枯草芽孢杆菌

按照(1)中所述方法制备BS168ASS电转感受态，将GD表达载体通过电转化的方法转入枯草芽孢杆菌BS168ASS中，在含有5μg/mL氯霉素的LB固体培养基上培养过夜，长出转化子，即为高效合成叠氮修饰糖胺聚糖骨架的重组菌BS168SSAGD。

实施例2：重组菌BS168SSAGD在高通量筛选糖胺聚糖骨架合酶方面的应用

1、基于已知活性的糖胺聚糖骨架合酶KfoC、PmHS2和PmHAS对于高通量筛选体系的验证。

将实施例1中构建的含有KfoC基因和tuaD基因的重组菌称为BS168SSACD；含有PmHS2基因和tuaD基因的重组菌称为BS168SSAHS2D；含有PmHAS基因和tuaD基因的重组菌称为BS168SSAHASD；含有pHCMC04空质粒的枯草芽孢杆菌称为BS168SSAE，作为对照。

然后以0.1％的体积比例接种于特殊底物LB液体培养基中，在37℃，225rpm摇床中过夜培养。将过夜培养的菌株以1％的体积比例扩大至特殊底物LB液体培养基中，待菌株长至OD₆₀₀为0.6～0.8时，用1×PBS缓冲液洗涤3遍菌株，将菌株转移至不含葡萄糖的低盐M9培养基中培养，消耗菌体自身含有的GlcNAc，1h后加入终浓度为20g/L的木糖诱导剂和终浓度为100μg/mL的糖基转移酶非天然底物GlcNAz。于在37℃，225rpm摇床中诱导培养6h。

所述特殊底物LB液体培养基的组分如下：10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L氯化钠、5μg/mL氯霉素和100μg/mL糖基转移酶天然底物GlcNac。

将诱导培养完成的菌株用1×PBS缓冲液通过重悬离心洗涤3遍后，重悬于200μL 1×PBS缓冲液中，于避光1.5mL离心管中加入终浓度为0.5mM荧光素Cyanine5 DBCO，37℃静置反应1h后用1×PBS缓冲液洗涤3遍，采用酶标仪检测其在发射波长646nm，激发波长662nm下荧光强度与600nm下的吸光度，计算其荧光强度与OD₆₀₀的比值，结果如图7所示。

由图7可知，含糖胺聚糖骨架合酶的重组菌BS168SSACD、BS168SSAHS2D、BS168SSAHASD的荧光强度与吸光度比值明显高于不含糖胺聚糖骨架合酶菌株BS168SSAE，且荧光是不含糖胺聚糖骨架合酶表菌株BS168SSAE的荧光1倍以上。

将参与荧光反应后的菌液用1×PBS缓冲液稀释至OD₆₀₀在0.3～0.5之间，在发射波长646nm，激发波长662nm下进行单色流式分析，结果如图8所示，。

由图8可知，含糖胺聚糖骨架合酶的重组菌BS168SSACD、BS168SSAHS2D、BS168SSAHASD的荧光强度明显高于不含糖胺聚糖骨架合酶菌株BS168SSAE，此结果与酶标仪结果一致。

2、基于未知活性的糖胺聚糖骨架合酶文库的筛选

(1)基于荧光强度与吸光度的比值对于糖胺聚糖骨架合酶文库的筛选

将实施例1中构建的十个含有tuaD基因和GT片段的重组菌，分别简称为：CcCS、CvCS、HfCS、LeCS、MsCS、MeCS、NdCS、PsCS、RhCS、TmCS。于96孔深孔板中按照1中所述的方法培养及诱导，并与Cyanine5 DBCO发生点击化学反应，采用酶标仪检测其在发射波长646nm，激发波长662nm下荧光强度与600nm下的吸光度，计算其荧光强度与OD₆₀₀的比值，结果如图9所示。

由图9可知，CvCs基因、HfCS基因和MeCS基因表现出与KfoC基因程度相当甚至更强的荧光。

(2)体外糖胺聚糖骨架合酶活性的验证

将(1)中表现出较强荧光的CvCs基因、HfCS基因和MeCS基因，由公司(金斯瑞)合成相应的质粒公司合成的原始质粒pET28a(+)-His-CvCS、pET28a(+)-His-HfCS、pET28a(+)-His-MeCS，具体重组质粒构建图谱如图10所示。分别通过化学转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中长出转化子，挑取单菌落，并提取质粒经酶切验证，得到含有CvCs基因、HfCS基因和MeCS基因的BL21(DE3)表达菌株。

酶切体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴20min。

将含有CvCs、HfCS、MeCS基因的BL21(DE3)表达菌株分别以1％体积比例扩大至1L的LB液体培养基中，待菌株长至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，22℃，225rpm，诱导12～18h。

诱导结束后，在4℃，8000g条件下离心菌液20min，弃掉上清液，收集菌体沉淀并用上样缓冲液(20Mm Tris-HCl，PH＝7.5，0.5M NaCl，5mM咪唑)重悬；使用超声破碎仪破碎菌体30min，工作条件为：工作15s，间歇45s，振幅35％，能量1500KJ，4℃；使用超低温离心机将破碎菌体在4℃，12000g条件下离心30min，收集上清液并用0.22μm滤膜过滤。使用Ni-charged MagBeads纯化过滤后的上清液，先用ddH₂O将试管中完全重悬磁珠，将试管放在磁珠分离架上收集磁珠，弃去上清洗涤掉原本20％乙醇的磁珠保存液；用上样缓冲液(20MmTris-HCl，pH＝7.5，0.5M NaCl，35mM咪唑)重悬磁珠两次，平衡体系；将过滤后的上清液重悬磁珠，于4℃，225rpm摇床中孵育30min；用平衡缓冲液(20Mm Tris-HCl，pH＝7.5，0.5MNaCl，35mM咪唑)洗去杂蛋白；用洗脱缓冲液(20Mm Tris-HCl，pH＝7.5，0.5M NaCl，200mM咪唑)洗脱目的蛋白并收集。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对诱导后蛋白的表达和纯化情况进行鉴定，结果如图11所示，说明成功分离得到CvCs蛋白、HfCS蛋白和MeCS蛋白。

以GlcA-pNP作为受体底物，UDP-GalNAc/UDP-GlcNAc分别作为供体底物分别测CvCs蛋白、HfCS蛋白和MeCS蛋白的糖胺聚糖骨架合酶活性。

反应体系如下：

反应条件：37℃过夜反应。

将反应后的体系用0.22μm的滤膜过滤后进行PAMN-HPLC分析。在310nm检测pNP基团的特定吸收峰。HPLC分析时用到的色谱柱为YMC-Pack Polyamine II色谱柱，流动相为水和1mol/L KH₂PO₄溶液，流速为0.5mL/min，检测每一种蛋白催化产物通过色谱柱分离后各组分在310/254nm的紫外吸收，结果如图12所示。

HPLC分析程序如下：

由图12可知，CvCs蛋白、HfCS蛋白和MeCS蛋白均表现出强UDP-GalNAc转移酶活性，即CvCs蛋白、HfCS蛋白和MeCS蛋白均为具有高活性的糖胺聚糖骨架合酶。与本实施例2中基于荧光强度与吸光度的比值对于糖胺聚糖骨架合酶文库的筛选结果一致。

3、基于荧光激活细胞分选技术(FACS)对于糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选

基于酶标仪测定荧光的方法仅能对少量的糖胺聚糖骨架合酶进行筛选，高通量的筛选需要依赖于荧光激活细胞分选技术，通过将含KfoC基因和tuaD基因表达盒的菌株BS168SSACD称为KfoC+；仅含有pHCMC04空质粒菌株BS168SSAE，称为KfoC-。

将KfoC+与KfoC-混合培养，按照KfoC+/总细菌分别为10：1、1：1、1:10、1:100的体积比，进一步分析FACS对阳性组的富集效率。

将混合培养的菌株按照本实施例1中所述方法诱导培养及荧光反应，洗涤后通过流式细胞仪分析。收集荧光强度在前2％的菌体，以尽量减少可能的假阳性。将分选后的细菌于含5μg/mL氯霉素的LB固体培养基中过夜培养，挑取单菌落后，鉴定出富集后的阳性比例，与分选前进行比较，结果如表1所示。

表1高效合成叠氮化修饰糖胺聚糖骨架的重组枯草芽孢杆菌应用于FACS体系中，从大量背景细菌中富集含高活性糖胺聚糖骨架合酶重组菌株的效果。

由表1可知，在单轮高严格的流式分选条件下，1:100的混合培养条件下依旧有高达97％概率富集含高活性糖胺聚糖骨架合酶重组菌株KfoC+。

Claims

1.一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，其特征在于，包括步骤如下：

2.如权利要求1所述的糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述糖胺聚糖骨架合酶为硫酸软骨素骨架合酶、肝素骨架合酶或透明质酸合酶。

3.如权利要求1所述的糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶基因tuaD的NCBI数据库的ID为936766。

4.如权利要求1所述的糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，所述枯草芽孢杆菌BS168ASS为阻断内源尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖苷合成途径，表达异源尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖苷补救合成途径的枯草芽孢杆菌。

5.如权利要求4所述的糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BS168ASS的构建方法如下：

以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168为出发菌株，敲除编码合成UDP-GlcNAc途径的关键酶分子的基因glmS，然后插入编码N-乙酰己糖胺-1-激酶的基因NahK和编码N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸-尿嘧啶转移酶的基因AGX1，得到枯草芽孢杆菌BS168ASS。

6.如权利要求5所述的糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，其特征在于，所述基因glmS的NCBI数据库的ID为938736，所述N-乙酰己糖胺-1-激酶的基因NahK来自于长双歧杆菌，NCBI数据库的ID为69578838，所述N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸-尿嘧啶转移酶的基因AGX1来自于人，NCBI数据库的ID为6675。

7.如权利要求1所述的糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(4)和(5)中，所述含特殊底物的LB液体培养基的组分如下：10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L氯化钠、5μg/mL氯霉素和100μg/mL糖胺聚糖骨架合酶天然底物GlcNAc。

8.如权利要求1所述的糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(5)中，所述荧光素为Cyanine5 DBCO，荧光素的终浓度为0.5mM，避光反应时间为1h。

9.如权利要求1所述的糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(5)中，所述测定荧光强度和吸光度的具体参数为：发射波长为646nm，激发波长为662nm，吸光度为600nm。