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CN116970686A - 基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法 - Google Patents

基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法 Download PDF

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CN116970686A
CN116970686A CN202310583980.1A CN202310583980A CN116970686A CN 116970686 A CN116970686 A CN 116970686A CN 202310583980 A CN202310583980 A CN 202310583980A CN 116970686 A CN116970686 A CN 116970686A
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met
exon
qsep
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met gene
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史冬
王丝雨
吕冰清
张逢芳
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Shanghai Yijian Medical Laboratory Co ltd
Original Assignee
Shanghai Yijian Medical Laboratory Co ltd
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Abstract

本发明公开基于QSEP检测c‑MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法，涉及基因检测技术领域；而本发明包括用于扩增c‑MET基因的13、15号外显子区域的检测引物对MET‑E13/E15‑F、MET‑E13/E15‑R；本发明中，方法简单、可操作性强，只需扩增一条目的基因片段，将扩增产物进行毛细管电泳跑胶，QSEP 400具有无需人工制胶、灌胶，染色、加样等优点，通量大，每套卡夹可分析400‑1200个样本；上样形式灵活，样品最低需求体积1ul；同时可自动计算片段大小，分别率高，可分辨1‑4bp，检测范围广；成本相对便宜，操作简单，可替代普通凝胶电泳，且结果更清晰准确，可以满足临床需求。

Description

基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体为基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法。
背景技术
目前对于c-MET基因外显子14跳跃突变的检测常采用的方法有荧光定量PCR法、数字PCR法和二代高通量基因测序分析法。荧光定量PCR法是通过设计特异的探针和引物，结合荧光PCR检测技术来检测血液、外泌体或肿瘤组织中MET基因14外显子跳跃缺失的检测；
然而，该方法需要设计多对引物和探针，成本相对较高。数字PCR是将体系分散成无数个独立反应单元的定量PCR反应，包括样本的分散、PCR扩增、荧光信号的收集与数据分析，缺点是数字PCR系统成本高，通量有限、操作繁琐等不足。二代高通量基因测序分析是指通过提取、建库、杂交捕获、上机测序获得MET基因区域RNA序列，通过生物信息技术分析确定血液、外泌体或肿瘤组织是否存在MET基因14外显子跳跃缺失的检测。但是该方法对仪器设备与实验人员要求高，成本高，且耗时较长，针对上述问题，发明人提出基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法用于解决上述问题。
发明内容
为了解决检测的成本高，通量有限、操作繁琐的问题；本发明的目的在于提供基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法，用于扩增c-MET基因的13、15号外显子区域的检测引物对MET-E13/E15-F、MET-E13/E15-R，包括以下步骤：
S1、提取样品RNA
采用固定组织RNA提取试剂盒抽提阳性样本1例(YJ30415028T)，阴性样本1例(YJ30416536T)，使用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度，确保RNA浓度大于30ng/μL且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7；
S2、以RNA为模板，利用引物对MET-E13/E15-F、MET-E13/E15-R进行PCR扩增
A：采用反转录试剂快速去除基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠，无需跨内含子设计引物，在RNase-free离心管中配制混合液，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min；
B：采用移液器轻轻吹打混匀，基因组DNA去除；
C：采用移液器轻轻吹打混匀，配制第一链cDNA合成反应液；
D：在设定的条件下合成反应第一链cDNA；
S3、对扩增结果进行分析，判定c-MET基因14号外显子是否发生跳跃突变
A：采用Primer Express 3.0.1设计本技术的引物，在c-MET基因13号外显子区域设计上游引物1条，在15号外显子区域设计下游引物1条；
B：将上下游引物进行测试，模板采用1例阳性样本(YJ30415028T)和一例阴性样本(YJ30416536T)；
C：采用扩增试剂进行扩增体系配置；
D：采用博日基因扩增仪，将8联排管放到PCR仪上进行扩增，按照设定的扩增条件进行设置反应程序；
S4、将PCR后的扩增产物进行毛细管电泳片段大小分析；
S5、根据毛细管电泳分析仪的检测结果，最终确定c-MET基因14号外显子是否跳跃突变。
优选地，在S2中，反转录试剂去除基因组DNA污染的温度为42℃，去除的时间为2min。
优选地，在S2中，离心管中配制混合液在65℃下加热5min。
优选地，在S2中，移液器吹打混匀的温度为42℃，时间为2min。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明中，方法简单、可操作性强，只需扩增一条目的基因片段，将扩增产物进行毛细管电泳跑胶，QSEP 400具有无需人工制胶、灌胶，染色、加样等优点，通量大，每套卡夹可分析400-1200个样本；上样形式灵活，样品最低需求体积1ul；同时可自动计算片段大小，分别率高，可分辨1-4bp，检测范围广；成本相对便宜，操作简单，可替代普通凝胶电泳，且结果更清晰准确，可以满足临床需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明MET结构示意图。
图2为本发明M14外显子未缺失突变示意图。
图3为本发明M14外显子缺失突变示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：如图1-3所示，本发明提供了基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法，用于扩增c-MET基因的13、15号外显子区域的检测引物对MET-E13/E15-F、MET-E13/E15-R，包括以下步骤：
S1、提取样品RNA
采用固定组织RNA提取试剂盒抽提阳性样本1例(YJ30415028T)，阴性样本1例(YJ30416536T)，使用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度，确保RNA浓度大于30ng/μL且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7；
S2、以RNA为模板，利用引物对MET-E13/E15-F、MET-E13/E15-R进行PCR扩增
A：采用反转录试剂III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(诺唯赞R312)快速去除基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠，无需跨内含子设计引物，在RNase-free离心管中配制混合液，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min，参考表1；
B：采用移液器轻轻吹打混匀，基因组DNA去除，参考表2；
成分 体积
上一步的混合液 8μl
5×gDNA wiper Mix 2μl
C：采用移液器轻轻吹打混匀，配制第一链cDNA合成反应液，参考表3；
D：在设定的条件下合成反应第一链cDNA，参考表4；
成分 体积
37℃ 45min
85℃ 5 sec
S3、对扩增结果进行分析，判定c-MET基因14号外显子是否发生跳跃突变
A：采用Primer Express 3.0.1设计本技术的引物，在c-MET基因13号外显子区域设计上游引物1条，在15号外显子区域设计下游引物1条，参考表5；
B：将上下游引物进行测试，模板采用1例阳性样本(YJ30415028T)和一例阴性样本(YJ30416536T)；
C：采用扩增试剂Taq Pro U+Multiple Probe qPCR Mix(诺唯赞QN213)进行扩增体系配置，参考表6；
D：采用博日基因扩增仪，将8联排管放到PCR仪上进行扩增，按照设定的扩增条件进行设置反应程序，参考表7；
S4、将PCR后的扩增产物进行毛细管电泳片段大小分析；
S5、根据毛细管电泳分析仪的检测结果，最终确定c-MET基因14号外显子是否跳跃突变。
在S2中，反转录试剂去除基因组DNA污染的温度为42℃，去除的时间为2min。
在S2中，离心管中配制混合液在65℃下加热5min。
在S2中，移液器吹打混匀的温度为42℃，时间为2min。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法，其特征在于，用于扩增c-MET基因的13、15号外显子区域的检测引物对MET-E13/E15-F、MET-E13/E15-R，包括以下步骤：
S1、提取样品RNA
采用固定组织RNA提取试剂盒抽提阳性样本1例(YJ30415028T)，阴性样本1例(YJ30416536T)，使用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度，确保RNA浓度大于30ng/μL且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7；
S2、以RNA为模板，利用引物对MET-E13/E15-F、MET-E13/E15-R进行PCR扩增
A：采用反转录试剂快速去除基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠，无需跨内含子设计引物，在RNase-free离心管中配制混合液，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min；
B：采用移液器轻轻吹打混匀，基因组DNA去除；
C：采用移液器轻轻吹打混匀，配制第一链cDNA合成反应液；
D：在设定的条件下合成反应第一链cDNA；
S3、对扩增结果进行分析，判定c-MET基因14号外显子是否发生跳跃突变
A：采用Primer Express 3.0.1设计本技术的引物，在c-MET基因13号外显子区域设计上游引物1条，在15号外显子区域设计下游引物1条；
B：将上下游引物进行测试，模板采用1例阳性样本(YJ30415028T)和一例阴性样本(YJ30416536T)；
C：采用扩增试剂进行扩增体系配置；
D：采用博日基因扩增仪，将8联排管放到PCR仪上进行扩增，按照设定的扩增条件进行设置反应程序；
S4、将PCR后的扩增产物进行毛细管电泳片段大小分析；
S5、根据毛细管电泳分析仪的检测结果，最终确定c-MET基因14号外显子是否跳跃突变。
2.如权利要求1所述的基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法，其特征在于，在S2中，反转录试剂去除基因组DNA污染的温度为42℃，去除的时间为2min。
3.如权利要求1所述的基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法，其特征在于，在S2中，离心管中配制混合液在65℃下加热5min。
4.如权利要求1所述的基于QSEP检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法，其特征在于，在S2中，移液器吹打混匀的温度为42℃，时间为2min。
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