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CN116964076A - 化合物或其盐、以及由它们得到的抗体 - Google Patents

化合物或其盐、以及由它们得到的抗体 Download PDF

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CN116964076A
CN116964076A CN202280020193.XA CN202280020193A CN116964076A CN 116964076 A CN116964076 A CN 116964076A CN 202280020193 A CN202280020193 A CN 202280020193A CN 116964076 A CN116964076 A CN 116964076A
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CN
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group
salt
antibody
residue
atom
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CN202280020193.XA
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藤井友博
山田慧
松田丰
平间龙介
畑田纪子
岚田直子
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Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Abstract

本发明涉及将抗体与修饰基团的结合比率控制在所需范围的技术。更具体而言，本发明涉及下述式(I)所表示的化合物或其盐、以及可使用这样的化合物或其盐制作的抗体或其盐：式(I)中，X表示离去基团，Y表示在包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，O表示氧原子，S表示硫原子，W表示氧原子或硫原子，N3表示叠氮基，La表示键或二价基团，Lb表示键或二价基团。

Description

化合物或其盐、以及由它们得到的抗体
技术领域
本发明涉及化合物或其盐、以及由它们得到的抗体等。
背景技术
近年来，抗体药物复合物(Antibody-Drug Conjugate(抗体药物缀合物)：ADC)的研究开发正在积极进行。ADC顾名思义，是将药物(例如，抗癌药)与抗体缀合(偶联)而成的药剂，对癌细胞等具有直接的杀细胞活性。作为代表性的ADC，有Immunogene公司和Roche公司共同开发的T-DM1(商品名：Kadcyla(注册商标))。
以T-DM1为代表的ADC从开发初期就存在其不均匀性的问题。即，由于使小分子药物随机地与抗体中约70～80个赖氨酸残基反应，因此药物抗体比(Drug Antibody Ratio：DAR)或缀合位点不恒定。通常，可知如果采用这样的随机缀合法，则DAR为0～8的范围，产生药物的结合数不同的多种抗体药剂。近年来，报道了如果改变ADC的药物的结合数和结合位点，则会改变体内动力学或药物的释放速度、效果。基于这些情况，对于下一代ADC，要求控制待缀合的药物的个数和位点。据信，如果个数和位点恒定，则预期的功效(efficacy)、缀合药剂的多样性(Variation)、批次差异即所谓的标准化(regulation)问题就迎刃而解了。
全球都在研究抗体的位点选择性修饰法，但大多数方法是基因工程方法或使用酶的修饰法。关于基因工程修饰法，尽管可控制位点选择性、个数选择性，但已经指出会存在抗体本身的表达效率降低(调制ADC时的总收率降低)等问题。而且，还存在抗体表达体系的构建等需要很长时间的问题。
最近，开发了一种可通过化学合成方法进行抗体的位点选择性修饰的C-CAP(Chemical conjugation by Affinity Peptide，基于亲和性肽的化学偶联)法(专利文献1)。该方法通过使NHS活化酯和药物与亲和性肽(Affinity Peptide)连接而成的肽试剂与抗体反应，成功地进行了抗体的位点选择性修饰。然而，就通过该方法制作的ADC而言，抗体和药物经由包含肽部分的接头(linker)结合。肽部分具有潜在的免疫原性，而且在血液中容易被水解。因此，通过该方法制作的ADC在接头中包含肽部分这方面存在改善的空间。
作为上述C-CAP法的改良方法，报道了下述技术：通过使用包含亲和性肽的规定化合物的化学合成方法，可调制不含肽部分作为接头的、位点选择性地具有功能性物质(例如，药物)的抗体(专利文献2～6)。在临床应用中，期望避免使用包含肽部分的接头。这些技术中，已经提出了对应于CH2和CH3结构域中的各种氨基酸残基(例如，赖氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基和苏氨酸残基)的多个位点作为可被药物位点选择性地修饰的抗体中的氨基酸残基的位点。然而，用功能性物质位点选择性地修饰抗体、且将抗体与功能性物质的结合比率控制在所需范围未必容易。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2016/186206号；
专利文献2：国际公开第2018/199337号；
专利文献3：国际公开第2019/240287号；
专利文献4：国际公开第2019/240288号；
专利文献5：国际公开第2020/009165号；
专利文献6：国际公开第2020/090979号。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于，将抗体与修饰基团的结合比率控制在所需的范围。
用于解决课题的手段
本发明人进行了深入研究，结果发现了：通过选择免疫球蛋白单元中的重链中的赖氨酸残基作为抗体的修饰位点、且使用式(I)所表示的化合物(含叠氮基的化合物)作为可对该赖氨酸残基进行位点特异性修饰的化合物，容易将免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率(含叠氮基的修饰基团/免疫球蛋白单元)高度地控制在所需的范围(1.0～3.0)。
本发明人还发现了：根据上述含叠氮基的化合物，容易进行免疫球蛋白单元中的重链中的不同赖氨酸残基的位点选择性修饰，因此上述含叠氮基的化合物对免疫球蛋白单元的位点选择性修饰的通用性优异。例如，通过使用具备具有某种氨基酸序列的亲和性肽的含叠氮基的化合物，在位点选择性地修饰人IgG重链的246/248位的赖氨酸残基的同时，还可将免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率高度地控制在上述所需的范围。另外，通过使用具备具有另一种氨基酸序列的亲和性肽的含叠氮基的化合物，在位点选择性地修饰人IgG重链的288/290位的赖氨酸残基的同时，还可将免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率高度地控制在上述所需的范围。
本发明人进一步发现：通过使用式(I)所表示的化合物或它们的盐可调制的抗体能够体现出优异的稳定性等，所述抗体为免疫球蛋白单元中的重链中的赖氨酸残基被含叠氮基的修饰基团修饰、且免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率(含叠氮基的修饰基团数/免疫球蛋白单元)被高度地控制在所需的范围(1.0～3.0)，从而完成了本发明。
即，本发明提供如下所示的化合物或其盐、或包含它们的抗体衍生用试剂。
[1]式(I)所表示的化合物或其盐。
[2][1]的化合物或其盐，其中，离去基团选自下述基团：
(a)R-S(在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，S表示硫原子。)；
(b)R-O(在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，O表示氧原子。)；或
(c)RA-(RB-)N(在此，RA和RB分别独立地表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，N表示氮原子。)；或
(d)卤原子。
[3][1]或[2]的化合物或其盐，其中，上述免疫球蛋白单元为人免疫球蛋白单元。
[4][1]～[3]中任一项的化合物或其盐，其中，上述免疫球蛋白单元为人IgG。
[5][1]～[4]中任一项的化合物或其盐，其中，M中的由3～5个碳原子构成的主链部分是包含直链亚烷基、或成环碳原子、或者它们的组合的部分。
[6][1]～[5]中任一项的化合物或其盐，其中，连接M和Y的主链的原子数为6～20个。
[7][1]～[6]中任一项的化合物或其盐，其中，La所相邻的羰基与亲和性肽中的赖氨酸残基的侧链中的氨基形成酰胺键。
[8][1]～[7]中任一项的化合物或其盐，其中，上述亲和性肽包含下述(A)的氨基酸序列：
(A)(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:1)
在此，
(X0-3)a不存在或为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基之外)，
(X0-3)b不存在或为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基之外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基或组氨酸残基。
[9][8]的化合物或其盐，其中，包含上述(A)的氨基酸序列的亲和性肽含有下述(1)的氨基酸序列：
(1)RGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:2)。
[10][1]～[7]中任一项的化合物或其盐，其中，上述亲和性肽包含下述(B)的氨基酸序列：
(B)PNLNEEQRNARIRSI(SEQ ID NO:3)。
[11][10]的化合物或其盐，其中，包含上述(B)的氨基酸序列的亲和性肽含有选自下述(1)～(3)的氨基酸序列：
(1)FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:4)；
(2)FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC(SEQ ID NO:5；或
(3)MQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSI(Orn)EEC(SEQ ID NO:6)。
[12][8]～[11]中任一项的化合物或其盐，其中，上述亲和性肽中的N末端和C末端氨基酸残基可被保护，且
上述亲和性肽中的2个半胱氨酸残基(C)的侧链中的2个硫醇基可通过二硫键或经由接头连接。
[13]抗体衍生用试剂，其包含式(I)所表示的化合物或其盐。
本发明还提供抗体中间体或其盐。
[1]抗体中间体或其盐，其包含式(II)所表示的结构单元。
[2][1]的抗体中间体或其盐，其中，抗体为人抗体。
[3][1]或[2]的抗体中间体或其盐，其中，抗体为人IgG。
[4][1]～[3]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，上述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个以上的位点。
[5][1]～[4]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，上述赖氨酸残基对依据EU编号的人IgG重链的246/248位的赖氨酸残基具有位点选择性。
[6][1]～[4]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，上述赖氨酸残基对依据EU编号的人IgG重链的288/290位的赖氨酸残基具有位点选择性。
[7][1]～[6]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，上述平均比率r为1.5～2.5。
[8][1]～[7]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，M中的由3～5个碳原子构成的主链部分是包含直链亚烷基、或成环碳原子、或者它们的组合的部分。
[9][4]～[8]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，所述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的2个位点。
[10][9]的抗体中间体或其盐，其中，所述2个位点为246/248位和288/290位。
[11][1]～[10]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，连接M和Y的主链的原子数为6～20个。
[12][1]～[11]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，La所相邻的羰基与亲和性肽中的赖氨酸残基的侧链中的氨基形成酰胺键。
[13][1]～[12]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，上述亲和性肽包含下述(A)的氨基酸序列：
(A)(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:1)
在此，
(X0-3)a不存在或为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基之外)，
(X0-3)b不存在或为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基之外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基或组氨酸残基。
[14][13]的抗体中间体或其盐，其中，包含上述(A)的氨基酸序列的亲和性肽含有下述(1)的氨基酸序列：
(1)RGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:2)。
[15][1]～[12]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，上述亲和性肽包含下述(B)的氨基酸序列：
(B)PNLNEEQRNARIRSI(SEQ ID NO:3)。
[16][15]的抗体中间体或其盐，其中，包含上述(B)的氨基酸序列的亲和性肽含有选自下述(1)～(3)的氨基酸序列：
(1)FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:4)；
(2)FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC(SEQ ID NO:5)；或
(3)MQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSI(Orn)EEC(SEQ ID NO:6)。
[17][1]～[16]中任一项的抗体中间体或其盐，其中，上述亲和性肽中的N末端和C末端氨基酸残基可被保护，且
上述亲和性肽中的2个半胱氨酸残基(C)的侧链中的2个硫醇基可通过二硫键或经由接头连接。
本发明还提供引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐。
[1]引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其包含式(III)所表示的结构单元。
[2][1]的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，由T表示的一价基团为可被取代的羟基氨基。
[3][1]或[2]的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，抗体为人抗体。
[4][1]～[3]中任一项的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，抗体为人IgG。
[5][1]～[4]中任一项的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，M中的由3～5个碳原子构成的主链部分是包含直链亚烷基、或成环碳原子、或者它们的组合的部分。
[6][1]～[5]中任一项的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，连接M和Y的主链的原子数为6～20个。
[7][1]～[6]中任一项的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，上述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个以上的位点。
[8][1]～[7]中任一项的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，上述赖氨酸残基对依据EU编号的人IgG重链的246/248位的赖氨酸残基具有位点选择性。
[9][1]～[7]中任一项的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，上述赖氨酸残基对依据EU编号的人IgG重链的288/290位的赖氨酸残基具有位点选择性。
[10][1]～[9]中任一项的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，上述平均比率r为1.5～2.5。
[11][7]～[10]中任一项的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，所述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的2个位点。
[12][11]的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，所述2个位点为246/248位和288/290位。
本发明还提供抗体和功能性物质的缀合物(conjugate，偶联物)或其盐。
[1]抗体和功能性物质的缀合物或其盐，其包含式(IV)所表示的结构单元。
[2][1]的缀合物或其盐，其中，抗体为人抗体。
[3][1]或[2]的缀合物或其盐，其中，抗体为人IgG。
[4][1]～[3]中任一项的缀合物或其盐，其中，M中的由3～5个碳原子构成的主链部分是包含直链亚烷基、或成环碳原子、或者它们的组合的部分。
[5][1]～[4]中任一项的缀合物或其盐，其中，连接M和Y的主链的原子数为6～20个。
[6][1]～[5]中任一项的缀合物或其盐，其中，上述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个以上的位点。
[7][1]～[6]中任一项的缀合物或其盐，其中，上述赖氨酸残基对依据EU编号的人IgG重链的246/248位的赖氨酸残基具有位点选择性。
[8][1]～[7]中任一项的缀合物或其盐，其中，上述赖氨酸残基对依据EU编号的人IgG重链的288/290位的赖氨酸残基具有位点选择性。
[9][1]～[8]中任一项的缀合物或其盐，其中，上述平均比率r为1.5～2.5。
[10][6]～[9]中任一项的缀合物或其盐，其中，所述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的2个位点。
[11][10]的缀合物或其盐，其中，所述2个位点为246/248位和288/290位。
本发明还提供抗体中间体、引入有叠氮基的抗体衍生物、或抗体和功能性物质的缀合物、或它们的盐的制造方法。
[1]抗体中间体或其盐的制造方法，所述方法包括：使式(I)所表示的化合物或其盐与包含上述免疫球蛋白单元的抗体反应，生成包含式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐。
[2]引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐的制造方法，所述方法包括：
(1)使式(I)所表示的化合物或其盐与包含上述免疫球蛋白单元的抗体反应，生成包含式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐；以及
(2)将上述抗体中间体或其盐供于硫酯的切割反应，生成包含式(III)所表示的结构单元的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐。
[3]抗体和功能性物质的缀合物或其盐的制造方法，所述方法包括：
(1)使式(I)所表示的化合物或其盐与包含上述免疫球蛋白单元的抗体反应，生成包含式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐；以及
(2)将上述抗体中间体或其盐供于硫酯的切割反应，生成包含式(III)所表示的结构单元的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐；以及
(3)使上述引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐与式(V)所表示的目标物质反应，生成包含式(IV)所表示的结构单元的抗体和功能性物质的缀合物或其盐。
[4]引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐的制造方法，所述方法包括：将包含式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐供于硫酯的切割反应，生成包含式(III)所表示的结构单元的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐。
[5]抗体和功能性物质的缀合物或其盐的制造方法，所述方法包括：
(1)将包含式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐供于硫酯的切割反应，生成包含式(III)所表示的结构单元的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐；以及
(2)使上述引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐与式(V)所表示的目标物质反应，生成包含式(IV)所表示的结构单元的抗体和功能性物质的缀合物或其盐。
[6]抗体和功能性物质的缀合物或其盐的制造方法，所述方法包括：使包含式(III)所表示的结构单元的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐与式(V)所表示的目标物质反应，生成包含式(IV)所表示的结构单元的抗体和功能性物质的缀合物或其盐。
发明效果
式(I)所表示的化合物或其盐可高度修饰免疫球蛋白单元中的重链中的赖氨酸残基，使得免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率(含叠氮基的修饰基团数/免疫球蛋白单元)为所需的范围(1.0～3.0)。式(I)所表示的化合物或其盐还具有下述优点：在免疫球蛋白单元中的重链中的不同位点的赖氨酸残基的位点选择性修饰的通用性优异。因此，式(I)所表示的化合物或其盐可用作抗体衍生用试剂。
另外，根据式(I)所表示的化合物或其盐，可提供式(II)所表示的抗体中间体或其盐，其中，免疫球蛋白单元中的重链中的赖氨酸残基被含亲和性肽的基团特异性地修饰，且免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率(含叠氮基的修饰基团数/免疫球蛋白单元)被高度地控制在所需的范围。
而且，使用式(II)所表示的抗体中间体或其盐作为原料而制作的抗体可继承该抗体中间体或其盐的所需特性(例如，结合的平均比率、位点选择性)。因此，根据本发明，可提供具有上述所需特性的式(III)所表示的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐、以及式(IV)所表示的抗体和功能性物质的缀合物或其盐。
另外，上述的本发明的抗体具有优异的稳定性。
附图说明
[图1]图1是显示式(I)所表示的本发明的化合物或其盐对免疫球蛋白单元进行修饰的概念的示意图(其一)。首先，式(I)所表示的本发明的化合物或其盐经由亲和性肽(Y)与免疫球蛋白单元中的CH2结构域缔合。其次，式(I)所表示的本发明的化合物或其盐经由具有离去基团(X)的活化羰基，与CH2结构域中的特定氨基酸残基的侧链(图中，赖氨酸残基的侧链中的氨基)反应，生成抗体中间体或其盐。
[图2]图2是显示式(I)所表示的本发明的化合物或其盐对免疫球蛋白单元进行修饰的概念的示意图(其二)。通过切割硫酯基，生成引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐。
[图3]图3是显示式(I)所表示的本发明的化合物或其盐对免疫球蛋白单元进行修饰的概念的示意图(其三)。通过引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐中的叠氮基与功能性物质(Z)的反应，生成抗体和功能性物质的缀合物或其盐。这样的反应被称为环张力促进的叠氮-炔环加成(Strain-promoted azide-alkyne cyclization,SPAAC)反应。
[图4]图4是显示本发明的一个实施方式的概要的图。
具体实施方式
1.一般术语的定义
本发明中，术语“抗体”如下所述。另外，术语“免疫球蛋白单元”与作为这种抗体的基本构成要素的二价单体单元对应，是包含2个重链和2个轻链的单元。因此，关于免疫球蛋白单元，其来源、种类(多克隆或单克隆、同种型和全长抗体或抗体片段)、抗原、赖氨酸残基的位点和位点选择性的定义、示例和优选示例与以下说明的抗体相同。
对抗体的来源没有特别限定，例如可以是来自哺乳动物、鸟类(例如，鸡)等动物的抗体。优选地，免疫球蛋白单元来自哺乳动物。作为这样的哺乳动物，例如可列举：灵长类(例如，人、猴、黑猩猩)、啮齿类(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔)、宠物(例如，狗、猫)、家畜(例如，牛、猪、山羊)、役用动物(例如，马、绵羊)，优选为灵长类或啮齿类，更优选为人。
抗体的种类可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体也可以是二价抗体(例如，IgG、IgD、IgE)或四价以上的抗体(例如，IgA抗体、IgM抗体)。优选地，抗体为单克隆抗体。作为单克隆抗体，例如可列举：嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、添加了规定糖链的抗体(例如，修饰成具有N型糖链结合共有序列等的糖链结合共有序列的抗体)、双特异性抗体、Fc区蛋白、Fc融合蛋白。作为单克隆抗体的同种型，例如可列举：IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD、IgE和IgY。本发明中，作为单克隆抗体，可利用全长抗体、或包含可变区以及CH1结构域和CH2结构域的抗体片段，但优选全长抗体。抗体优选为人IgG单克隆抗体，更优选为人IgG全长单克隆抗体。
作为抗体的抗原，可使用任意的抗原。例如，作为这样的抗原，可列举：蛋白[包括寡肽、多肽。可以是用糖等生物分子修饰的蛋白(例如，糖蛋白)]、糖链、核酸、小分子化合物。优选地，抗体可以是以蛋白为抗原的抗体。作为蛋白，例如可列举：细胞膜受体、除细胞膜受体以外的细胞膜蛋白(例如，细胞外基质蛋白)、配体、可溶性受体。
更具体而言，作为抗体的抗原的蛋白可以是疾病靶蛋白。作为疾病靶蛋白，例如可列举如下。
(1)癌症领域
PD-L1、GD2、PDGFRα(血小板衍生生长因子受体)、CD22、HER2、磷脂酰丝氨酸(PS)、EpCAM、纤连蛋白、PD-1、VEGFR-2、CD33、HGF、gpNMB、CD27、DEC-205、叶酸受体、CD37、CD19、Trop2、CEACAM5、S1P、HER3、IGF-1R、DLL4、TNT-1/B、CPAAs、PSMA、CD20、CD105(内皮糖蛋白)、ICAM-1、CD30、CD16A、CD38、MUC1、EGFR、KIR2DL1,2、NKG2A、腱生蛋白-C、IGF(胰岛素样生长因子)、CTLA-4、间皮素、CD138、c-Met、Ang2、VEGF-A、CD79b、ENPD3、叶酸受体α、TEM-1、GM2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、巨噬细胞抑制因子、CD74、Notch1、Notch2、Notch3、CD37、TLR-2、CD3、CSF-1R、FGFR2b、HLA-DR、GM-CSF、EphA3、B7-H3、CD123、gpA33、Frizzled7受体、DLL4、VEGF、RSPO、LIV-1、SLITRK6、Nectin-4、CD70、CD40、CD19、SEMA4D(CD100)、CD25、MET、组织因子、IL-8、EGFR、cMet、KIR3DL2、Bst1(CD157)、P-钙粘着蛋白、CEA、GITR、TAM(肿瘤相关巨噬细胞)、CEA、DLL4、Ang2、CD73、FGFR2、CXCR4、LAG-3、GITR、岩藻糖基GM1、IGF-1、血管生成素2、CSF-1R、FGFR3、OX40、BCMA、ErbB3、CD137(4-1BB)、PTK7、EFNA4、FAP、DR5、CEA、Ly6E、CA6、CEACAM5、LAMP1、组织因子、EPHA2、DR5、B7-H3、FGFR4、FGFR2、α2-PI、A33、GDF15、CAIX、CD166、ROR1、GITR、BCMA、TBA、LAG-3、EphA2、TIM-3、CD-200、EGFRvIII、CD16A、CD32B、PIGF、Axl、MICA/B、Thomsen-Friedenreich、CD39、CD37、CD73、CLEC12A、Lgr3、转铁蛋白受体、TGFβ、IL-17、5T4、RTK、免疫抑制蛋白、NaPi2b、Lewis血型B抗原、A34、赖氨酰氧化酶、DLK-1、TROP-2、α9整联蛋白、TAG-72(CA72-4)、CD70。
(2)自身免疫疾病/炎症性疾病
IL-17、IL-6R、IL-17R、INF-α、IL-5R、IL-13、IL-23、IL-6、ActRIIB、β7-整联蛋白、IL-4αR、HAS、嗜酸性粒细胞趋化因子-1、CD3、CD19、TNF-α、IL-15、CD3ε、纤连蛋白、IL-1β、IL-1α、IL-17、TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素)、LAMP(α4β7整联蛋白)、IL-23、GM-CSFR、TSLP、CD28、CD40、TLR-3、BAFF-R、MAdCAM、IL-31R、IL-33、CD74、CD32B、CD79B、IgE(免疫球蛋白E)、IL-17A、IL-17F、C5、FcRn、CD28、TLR4、MCAM、B7RP1、CXCR1,2配体、IL-21、钙粘着蛋白-11、CX3CL1、CCL20、IL-36R、IL-10R、CD86、TNF-α、IL-7R、Kv1.3、α9整联蛋白、LIFHT。
(3)脑神经疾病
CGRP、CD20、β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白原纤维、降钙素基因相关肽受体、LINGO(包括Ig结构域的1)、α突触核蛋白、细胞外tau、CD52、胰岛素受体、tau蛋白、TDP-43、SOD1、TauC3、JC病毒。
(4)感染症
艰难梭菌(Clostridium Difficile)毒素B、巨细胞病毒、RS病毒、LPS、金黄色葡萄球菌(S.Aureus)α-毒素、M2e蛋白、Psl、PcrV、金黄色葡萄球菌毒素、甲型流感、海藻酸盐、金黄色葡萄球菌、PD-L1、乙型流感、不动杆菌(Acinetobacter)、F-蛋白、Env、CD3、病原性大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、肺炎球菌(Pneumococcus)。
(5)遗传病/罕见疾病
淀粉样蛋白AL、SEMA4D(CD100)、胰岛素受体、ANGPTL3、IL4、IL13、FGF23、促肾上腺皮质激素、转甲状腺素蛋白(Transthyretin)、亨廷顿蛋白。
(6)眼病
因子D、IGF-1R、PGDFR、Ang2、VEGF-A、CD-105(内皮糖蛋白)、IGF-1R、β淀粉样蛋白。
(7)骨/整形外科领域
骨硬化蛋白(Sclerostin)、肌肉生长抑制素(Myostatin)、Dickkopf-1、GDF8、RNAKL、HAS、Siglec-15。
(8)血液疾病
vWF、因子IXa、因子X、IFNγ、C5、BMP-6、膜铁转运蛋白(Ferroportin)、TFPI。
(9)其它疾病
BAFF(B细胞活化因子)、IL-1β、PCSK9、NGF、CD45、TLR-2、GLP-1、TNFR1、C5、CD40、LPA、催乳素受体、VEGFR-1、CB1、内皮糖蛋白、PTH1R、CXCL1、CXCL8、IL-1β、AT2-R、IAPP。
作为单克隆抗体的具体例，可列举：特定的嵌合抗体(例如，利妥昔单抗、巴利昔单抗、英夫利西单抗、西妥昔单抗、司妥昔单抗、达妥昔单抗、奥他妥沙西单抗(オルタトキサシマブ))、特定的人源化抗体(例如，达利珠单抗、帕利珠单抗、曲妥珠单抗、阿仑单抗、奥马珠单抗、依法利珠单抗、贝伐珠单抗、那他珠单抗(IgG4)、托珠单抗、依库珠单抗(IgG2)、莫格利珠单抗、帕妥珠单抗、奥妥珠单抗、维得利珠单抗、帕博利珠单抗(IgG4)、美泊利珠单抗、埃罗妥珠单抗、达雷木单抗、依奇珠单抗(IgG4)、瑞替珠单抗(IgG4)、阿替利珠单抗)、特定的人抗体(例如，阿达木单抗(IgG1)、帕尼单抗、戈利木单抗、乌司奴单抗、卡那单抗、奥法妥木单抗、地舒单抗(IgG2)、伊匹单抗、贝利木单抗、雷昔库单抗、雷莫芦单抗、纳武单抗、杜匹鲁单抗(IgG4)、司库奇尤单抗、依洛尤单抗(IgG2)、阿利西尤单抗、耐昔妥珠单抗、柏达鲁单抗(IgG2)、奥拉单抗)(在未提及IgG亚型的情况下，显示为IgG1)。
关于抗体中的氨基酸残基的位点和重链恒定区的位点(例如，CH2结构域)，依据EU编号(参照http：//www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html)。例如，在以人IgG为对象的情况下，246位的赖氨酸残基相当于人IgG CH2区的第16位的氨基酸残基，248位的赖氨酸残基相当于人IgG CH2区的第18位的氨基酸残基，288位的赖氨酸残基相当于人IgG CH2区的第58位的氨基酸残基，290位的赖氨酸残基相当于人IgG CH2区的第60位的氨基酸残基，317位的赖氨酸残基相当于人IgG CH2区的第87位的氨基酸残基。246/248位的表述表示246位或248位的赖氨酸残基是对象。288/290位的表述表示288位或290位的赖氨酸残基是对象。
根据本发明，可位点选择性地修饰抗体中的重链中的特定的赖氨酸残基(例如，246/248位或288/290位的赖氨酸残基)。本说明书中，“位点选择性的”或“位点选择性”是指，尽管在抗体中特定的氨基酸残基没有偏向于特定的区域，但可与抗体中的特定氨基酸残基结合的规定的结构单元偏向于抗体中的特定区域。因此，“位点选择性地具有”、“位点选择性的结合”、“以位点选择性的结合”等与位点选择性有关的表述是指，包含1个以上的特定氨基酸残基的靶区域中的规定的结构单元的持有率或结合率以显著水平高于包含与靶区域中的该特定氨基酸残基同种的多个氨基酸残基的非靶区域中的该结构单元的持有率或结合率。这样的位点选择性可以是50％以上、优选为60％以上、更优选为70％以上、更进一步优选为80％以上、特别优选为90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上或100％。根据本发明，可以不利用含有肽的接头，而位点选择性地修饰抗体中的重链中的特定的赖氨酸残基。肽部分具有潜在的免疫原性，而且容易在血液中水解。因此，避免使用包含肽部分的接头在临床应用中是理想的。
本发明中，其它位点的特定氨基酸残基也可进一步被位点选择性地修饰，只要抗体中的重链中的特定赖氨酸残基被位点选择性地修饰即可。例如，关于位点选择性地修饰抗体中的规定位点的特定氨基酸残基的方法，记载于国际公开第2018/199337号、国际公开第2019/240288号、国际公开第2019/240287号和国际公开第2020/090979号中。作为这样的特定氨基酸残基，可利用具有容易修饰的侧链(例如，氨基、羧基、酰胺基、羟基、硫醇基)的氨基酸残基(例如，赖氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸残基、半胱氨酸残基)，但优选为具有包含氨基的侧链的赖氨酸残基、具有包含羟基的侧链的酪氨酸残基、丝氨酸残基和苏氨酸残基、或具有包含硫醇基的侧链的半胱氨酸残基，可更优选为赖氨酸残基(即，246/248位的赖氨酸残基、288/290位的赖氨酸残基和317位的赖氨酸残基中的2个赖氨酸残基可位点选择性地双重修饰、3个赖氨酸残基可位点选择性地三重修饰)。更进一步优选地，可位点选择性地修饰存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的2个位点的赖氨酸残基。特别优选地，可位点选择性地修饰存在于246/248位和288/290位的2个位点的赖氨酸残基。
本发明中，作为术语“盐”，例如可列举：与无机酸的盐、与有机酸的盐、与无机碱的盐、与有机碱的盐、以及与氨基酸的盐。作为与无机酸的盐，例如可列举：与氯化氢、溴化氢、磷酸、硫酸、硝酸的盐。作为与有机酸的盐，例如可列举：与甲酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、酒石酸、富马酸、草酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、苯磺酸、对甲苯磺酸的盐。作为与无机碱的盐，例如可列举：与碱金属(例如，钠、钾)、碱土金属(例如，钙、镁)和锌、铝等其它金属、以及铵的盐。作为与有机碱的盐，例如可列举：与三甲胺、三乙胺、丙二胺、乙二胺、吡啶、乙醇胺、单烷基乙醇胺、二烷基乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺的盐。作为与氨基酸的盐，例如可列举：与碱性氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸)和酸性氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)的盐。盐优选为与无机酸(例如，氯化氢)的盐、或与有机酸(例如，三氟乙酸)的盐。
2.化合物或其盐
本发明提供下述式(I)所表示的化合物或其盐。
[化学式1]
[式中，
X表示离去基团，
Y表示在包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团。]
在与本发明相关联而给出的式(I)和其它式中，-(连字符)表示在其两侧存在的2个单元共价键合。因此，式(I)中，X与构成羰基的碳原子共价键合，M与构成羰基的碳原子、构成C＝W的碳原子和Lb共价键合，S与构成C＝W的碳原子和La共价键合，La与S和Y共价键合，Lb与M和N3共价键合，Y与La共价键合，N3与Lb共价键合。
由X所示的离去基团是能够通过X所相邻的羰基的碳原子与氨基之间的反应而离去的基团。本领域技术人员可适当设定这样的离去基团。作为这样的离去基团，例如可列举如下：
(a)R-S(在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，S表示硫原子。)；
(b)R-O(在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，O表示氧原子。)；
(c)RA-(RB-)N(在此，RA和RB分别独立地表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，N表示氮原子。)；或
(d)卤原子。
优选地，由X所示的离去基团可如下：
(a)R-S(在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，S表示硫原子。)；
(b)R-O(在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，O表示氧原子。)；或
(c)RA-(RB-)N(在此，RA和RB分别独立地表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，N表示氮原子。)。
更优选地，由X所示的离去基团可如下：
(a)R-S(在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，S表示硫原子。)；或
(b)R-O(在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，O表示氧原子。)。
更进一步优选地，由X所示的离去基团可如下：
(a)R-S(在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，S表示硫原子。)。
特别优选地，由X所示的离去基团可如下：
(a’)R-S(在此，R表示可具有取代基的一价芳族烃基(例如，苯基)，S表示硫原子。)。
作为卤原子，例如可列举：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
作为一价烃基，例如可列举：一价链状烃基、一价脂环式烃基和一价芳族烃基。
一价链状烃基是指仅由链状结构构成的烃基，主链不含环状结构。然而，链状结构可以是直链状也可以是支链状。作为一价链状烃基，例如可列举：烷基、烯基、炔基。烷基、烯基和炔基可以是直链状或支链状的任一种。
作为烷基，优选碳原子数为1～12的烷基、更优选碳原子数为1～6的烷基、进一步优选碳原子数为1～4的烷基。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为1～12的烷基，例如可列举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基。
作为烯基，优选碳原子数为2～12的烯基、更优选碳原子数为2～6的烯基、进一步优选碳原子数为2～4的烯基。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为2～12的烯基，例如可列举：乙烯基、丙烯基、正丁烯基。
作为炔基，优选碳原子数为2～12的炔基、更优选碳原子数为2～6的炔基、进一步优选碳原子数为2～4的炔基。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为2～12的炔基，例如可列举：乙炔基、丙炔基、正丁炔基。
作为一价链状烃基，优选烷基。
一价脂环式烃基是指仅包含脂环式烃作为环结构、而不含芳族环的烃基，脂环式烃可以是单环、多环的任一种。然而，无需仅由脂环式烃构成，其一部分中可包含链状结构。作为一价脂环式烃基，例如可列举：环烷基、环烯基、环炔基，它们可以是单环、多环的任一种。
作为环烷基，优选碳原子数为3～12的环烷基、更优选碳原子数为3～6的环烷基、进一步优选碳原子数为5～6的环烷基。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为3～12的环烷基，例如可列举：环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
作为环烯基，优选碳原子数为3～12的环烯基、更优选碳原子数为3～6的环烯基、进一步优选碳原子数为5～6的环烯基。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为3～12的环烯基，例如可列举：环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基。
作为环炔基，优选碳原子数为3～12的环炔基、更优选碳原子数为3～6的环炔基、进一步优选碳原子数为5～6的环炔基。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为3～12的环炔基，例如可列举：环丙炔基、环丁炔基、环戊炔基、环己炔基。
作为一价脂环式烃基，优选环烷基。
一价芳族烃基是指包含芳族环结构的烃基。然而，无需仅由芳族环构成，其一部分中可包含链状结构或脂环式烃，芳族环可以是单环、多环的任一种。作为一价芳族烃基，优选碳原子数为6～12的芳基、更优选碳原子数为6～10的芳基、进一步优选碳原子数为6的芳基。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为6～12的芳基，例如可列举：苯基、萘基。
作为一价芳族烃基，优选苯基。
这些之中，作为一价烃基，优选烷基、环烷基、芳基。
一价杂环基是指从杂环化合物的杂环中去除1个氢原子后的基团。一价杂环基为一价芳族杂环基或一价非芳族杂环基。作为构成杂环基的杂原子，优选包含选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子的1种以上，更优选包含选自氧原子、硫原子和氮原子的1种以上。
作为一价芳族杂环基，优选碳原子数为1～15的芳族杂环基、更优选碳原子数为1～9的芳族杂环基、进一步优选碳原子数为1～6的芳族杂环基。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为一价芳族杂环基，例如可列举：吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、三唑基、四唑基、吲哚基、嘌呤基、蒽醌基、咔唑基、芴基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基和酞嗪基。
作为一价非芳族杂环基，优选碳原子数为2～15的非芳族杂环基、更优选碳原子数为2～9的非芳族杂环基、进一步优选碳原子数为2～6的非芳族杂环基。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为一价非芳族杂环基，例如可列举：环氧乙烷基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、吡咯烷基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢噻吩基、吡咯啉基、咪唑烷基、唑烷基、哌啶基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、二氢嗪基、四氢嗪基、二氢嘧啶基和四氢嘧啶基。
这些之中，作为一价杂环基，优选5元或6元的杂环基。
上述R、RA和RB所示的“可具有取代基的一价烃基”和“可具有取代基的一价杂环基”中的“取代基”的个数例如可以是1～5个、优选为1～3个、更优选为1或2个。作为这样的取代基，例如可列举如下：
(i)卤原子；
(ii)一价烃基；
(iii)一价杂环基；
(iv)芳烷基；
(v)Ra-O-、Ra-C(＝O)-、Ra-O-C(＝O)-或Ra-C(＝O)-O-(Ra表示氢原子或一价烃基。)；
(vi)NRbRc-、NRbRc-C(＝O)-、NRbRc-C(＝O)-O-或Rb-C(＝O)-NRc-(Rb和Rc相同或不同地表示氢原子或一价烃基。)；或
(vii)硝基、硫酸基、磺酸基、氰基和羧基。
上述取代基中的卤原子、一价烃基和一价杂环基的定义、示例和优选示例分别与上述R、RA和RB中说明的一价烃基和一价杂环基相同。
芳烷基是指芳基烷基。芳基烷基中的芳基和烷基的定义、示例和优选示例如上所述。作为芳烷基，优选碳原子数为3～15的芳烷基。作为这样的芳烷基，例如可列举：苯甲酰基、苯乙基、萘基甲基、萘基乙基。
优选地，取代基可如下：
(i)卤原子；
(ii)碳原子数为1～12的烷基、苯基或萘基；
(iii)碳原子数为3～15的芳烷基；
(iv)5元或6元的杂环；
(v)Ra-O-、Ra-C(＝O)-、Ra-O-C(＝O)-或Ra-C(＝O)-O-(Ra表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基。)；
(vi)NRbRc-、NRbRc-C(＝O)-、NRbRc-C(＝O)-O-或Rb-C(＝O)-NRc-(Rb和Rc相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基。)；或
(vii)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
更优选地，取代基可如下：
(i)卤原子；
(ii)碳原子数为1～12的烷基；
(iii)Ra-O-、Ra-C(＝O)-、Ra-O-C(＝O)-或Ra-C(＝O)-O-(Ra表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基。)；
(iv)NRbRc-、NRbRc-C(＝O)-、NRbRc-C(＝O)-O-或Rb-C(＝O)-NRc-(Rb和Rc相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基。)；或
(v)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
更进一步优选地，取代基可如下：
(i)卤原子；
(ii)碳原子数为1～6的烷基；
(iii)Ra-O-、Ra-C(＝O)-、Ra-O-C(＝O)-或Ra-C(＝O)-O-(Ra表示氢原子或碳原子数为1～6的烷基。)；
(iv)NRbRc-、NRbRc-C(＝O)-、NRbRc-C(＝O)-O-或Rb-C(＝O)-NRc-(Rb和Rc相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～6的烷基。)；或
(v)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
特别优选地，取代基可如下：
(i)卤原子；
(ii)碳原子数为1～4的烷基；
(iii)Ra-O-、Ra-C(＝O)-、Ra-O-C(＝O)-或Ra-C(＝O)-O-(Ra表示氢原子或碳原子数为1～4的烷基。)；
(iv)NRbRc-、NRbRc-C(＝O)-、NRbRc-C(＝O)-O-或Rb-C(＝O)-NRc-(Rb和Rc相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～4的烷基。)；或
(v)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
由Y所示的亲和性肽在包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区。作为亲和性肽，可使用在免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的任意肽。亲和性肽包括氨基酸残基(例如，赖氨酸残基、脯氨酸残基、色氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基)，所述氨基酸残基包含含有可与Y所相邻的羰基(C＝O)结合的部分(例如，氨基、羟基)的侧链，且亲和性肽可经由赖氨酸残基的侧链中的氨基与Y所相邻的羰基(C＝O)形成酰胺键。优选地，亲和性肽包含赖氨酸残基，且可经由赖氨酸残基的侧链中的氨基与Y所相邻的羰基(C＝O)形成酰胺键。作为这样的亲和性肽，例如可使用国际公开第2016/186206号、国际公开第2018/199337号、国际公开第2019/240287号、国际公开第2019/240288号和国际公开第2020/090979号中公开的亲和性肽、以及在这些国际公开公报中引用的文献中公开的各种亲和性肽。
在一个实施方式中，亲和性肽可包含下述(A)的氨基酸序列或其类似物氨基酸序列：
(A)(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:1)。
另外，作为上述(A)的氨基酸序列或其类似物氨基酸序列，例如可列举如下。
(1)国际公开第2016/186206号中记载的式(I)～(V)所表示的氨基酸序列(例如，国际公开第2016/186206号中记载的SEQ ID NO:1～17、36、37的氨基酸序列)；
(2)国际公开第2018/199337号中记载的式(i)、(i-1)、(i-1’)和(i-1”)、(i-2)、(ii)～(viii)所表示的氨基酸序列(例如，国际公开第2018/199337号中记载的SEQ ID NO:20～60、73～91、94～105的氨基酸序列)；
(3)国际公开第2019/240287号中记载的式(1-1)～(1-9)、(2-1)所表示的氨基酸序列(例如，国际公开第2019/240287号中记载的SEQ ID NO:5、8～92的氨基酸序列)；
(4)国际公开第2019/240288号中记载的式(1-1)～(1-9)、(2-1)所表示的氨基酸序列(例如，国际公开第2019/240288号中记载的SEQ ID NO:15～24、46～96、99、108的氨基酸序列)；
(5)国际公开第2020/090979号中记载的(10)～(11)的氨基酸序列(例如，国际公开第2020/090979号中记载的SEQ ID NO:24、25的氨基酸序列)。
包含上述(A)的氨基酸序列或其类似物氨基酸序列的亲和性肽，从其保守部分可理解，在免疫球蛋白单元中的CH2结构域中的相同位点具有结合区。因此，具有包含上述类似物氨基酸序列的亲和性肽的化合物与具有包含上述(A)的氨基酸序列的亲和性肽的化合物同样，与免疫球蛋白单元中的CH2结构域中的相同位点结合，在位点选择性地修饰人IgG重链的246/248位的赖氨酸残基的同时，还可将免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率高度地控制在所需的范围。亲和性肽优选包含上述(A)的氨基酸序列、更优选包含下述(1)的氨基酸序列：
(1)RGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:2)。
在另一个实施方式中，亲和性肽可包含下述(B)的氨基酸序列或其类似物氨基酸序列：
(B)PNLNEEQRNARIRSI(SEQ ID NO:3)。
另外，作为上述(B)的氨基酸序列或其类似物氨基酸序列，例如可列举如下。
(1)国际公开第2018/199337号中记载的(a)～(d)的氨基酸序列(例如，国际公开第2018/199337号中记载的SEQ ID NO:61～72、92的氨基酸序列)；
(2)国际公开第2019/240288号中记载的(a)～(b)的氨基酸序列(例如，国际公开第2019/240288号中记载的SEQ ID NO:5～8、11～14、37～45、97、98、100的氨基酸序列)；
(3)国际公开第2020/090979号中记载的(1)～(9)的氨基酸序列(例如，国际公开第2020/090979号中记载的SEQ ID NO:5～10、22、23、51～53的氨基酸序列)。
包含上述(B)的氨基酸序列或其类似物氨基酸序列的亲和性肽，从其保守部分可理解，在免疫球蛋白单元中的CH2结构域中的相同位点具有结合区。因此，具有包含上述类似物氨基酸序列的亲和性肽的化合物与具有包含上述(B)的氨基酸序列的亲和性肽的化合物同样，与免疫球蛋白单元中的CH2结构域中的相同位点结合，在位点选择性地修饰人IgG重链的288/290位的赖氨酸残基的同时，还可将免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率高度地控制在所需的范围。亲和性肽优选包含上述(B)的氨基酸序列、更优选包含下述(1)～(3)中任一条的氨基酸序列：
(1)FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:4)；
(2)FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC(SEQ IDNO:5)；或
(3)MQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSI(Orn)EEC(SEQ ID NO:6)。
上述亲和性肽的各氨基酸序列中的至少2个分离的半胱氨酸残基可通过二硫键形成环状肽。或者，上述肽中，2个半胱氨酸残基中的硫醇基可通过接头(例如，以下所表示的含羰基的接头)连接。
[化学式2]
上述所表示的含羰基的接头的虚线部分是指与硫醇基的结合部分。与通常的二硫键相比，该接头对还原反应等更稳定。例如可通过国际公开第2016/186206号中记载的方法调制这样的肽。
构成上述亲和性肽的氨基酸可以是L体或D体的任一种，优选L体(实施例中，构成肽的氨基酸残基全部为L体)。上述亲和性肽可通过交联剂修饰特定的氨基酸残基，而与式(I)的化合物或其盐连接。作为这样的特定的氨基酸残基，例如可列举：赖氨酸残基、天冬氨酸残基和谷氨酸残基，但优选为赖氨酸残基。作为交联剂，例如可列举：DSG(disuccinimidyl glutarate、二琥珀酰亚氨基戊二酸酯)、DSS(disuccinimidylsuberate、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯)等优选包含2个以上琥珀酰亚氨基的交联剂；DMA(dimethyl adipimidate/2HCl、己二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMP(dimethylpimelimidate/2HCl、庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DMS(dimethyl suberimidate/2HCl、辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)等优选包含2个亚氨酸部分的交联剂；以及DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate/2HCL、3,3-二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)、二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯))等具有SS键的交联剂(例如，国际公开第2016/186206号)。
上述亲和性肽可保护位于末端的氨基和羧基。作为N-末端氨基的保护基，例如可列举：烷基羰基(酰基)(例如，乙酰基、丙氧基、叔丁氧基羰基等丁氧基羰基)、烷氧基羰基(例如，芴基甲氧基羰基)、芳氧基羰基、芳基烷基(芳烷基)氧羰基(例如，苄氧基羰基)。作为N-末端氨基的保护基，优选乙酰基。在N-末端氨基酸为谷氨酸的情况下，受保护的N-末端的谷氨酸可具有焦谷氨酸的环状结构。另外，在N-末端氨基酸为谷氨酰胺的情况下，受保护的N-末端的谷氨酰胺可具有焦谷氨酸型的环状结构。作为C-末端羧基的保护基，例如可列举：可形成酯或酰胺的基团。作为可形成酯或酰胺的基团，例如可列举：烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基)、芳氧基(例如，苯氧基、萘氧基)、芳烷氧基(例如，苄氧基)、氨基。作为C-末端羧基的保护基，优选氨基。
M表示将M所相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子、即M所相邻的第1碳原子(C＝O中的碳原子)和M所相邻的第2碳原子(C＝W中的碳原子)用由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团。因此，在连接M所相邻的第1和第2碳原子之间的主链部分中不含杂原子。通过使用具有这样的结构的化合物，可期待以下优点。
第一，通过使用上述化合物，容易将抗体与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率高度地控制在所需的范围(1.5～2.5)。本发明中，可通过用DAR计算器(Agilent公司软件)分析MS分析数据来确认抗体与规定基团(例如，含叠氮基的修饰基团)的结合的平均比率。
第二，通过使用上述化合物，可位点选择性地修饰免疫球蛋白单元中的重链中的不同赖氨酸残基。例如，通过使用具有某种氨基酸序列的亲和性肽作为Y，可位点选择性地修饰人IgG重链的246/248位的赖氨酸残基。另外，通过使用具有另一种氨基酸序列的亲和性肽作为Y，可位点选择性地修饰人IgG重链的288/290位的赖氨酸残基。
第三，通过使用上述化合物而调制的抗体可显示优异的稳定性。
由3～5个碳原子构成的主链部分，由链状结构、或环状结构、或者包含它们的组合的结构构成。在主链是不含环状结构的链状结构的情况下，可通过计数链状结构中的原子数来确定主链的原子数。另一方面，在主链是包含环状结构的结构的情况下，可通过将构成环状结构的规定原子数作为主链的原子数计数来确定。具体而言，环状结构中的主链的原子数可通过计数连接环状结构中的2个结合键的最短路径的原子数来确定(例如，参照以下(a)～(d)的粗体路径)。在主链是包含链状结构和环状结构的组合的结构的情况下，主链的原子数可通过将不含环状结构的链状结构中的原子数与连接环状结构中的2个结合键的最短路径的原子数相加来确定。
[化学式3]
·为结合键。
(a)的情况下，由于最短路径为粗体路径，因此作为主链的原子数而计数的二价环状结构中的原子数为2。
(b)的情况下，由于最短路径为粗体路径，因此作为主链的原子数而计数的二价环状结构中的原子数为3。
(c)的情况下，由于任一路径均为最短路径(等距离)，因此作为主链的原子数而计数的二价环状结构中的原子数为4。
(d)的情况下，由于稠合部位的路径为最短路径，因此作为主链的原子数而计数的二价环状结构中的原子数为4。
由3～5个碳原子构成的主链部分是连接与M相邻的第1碳原子(C＝O中的碳原子)和与M相邻的第2碳原子(C＝W中的碳原子)的部分，因此，在与这样的第1和第2碳原子的关系中，可作为二价基团来把握。另一方面，M不仅是这样的第1和第2碳原子，而且还是与Lb键合的三价基团。因此，M可表述为从由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)中去除1个氢原子后的三价基团。在此，由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)可由以下构成：
(1)碳原子数为3～5个的二价直链烃基；
(2)二价环状烃基和碳原子数为1～4个的二价直链烃基(1个或2个)连接的二价基团；
(3)二价环状烃基；和
(4)连接有2个二价环状烃基的二价基团(即，二价双环结构物)。
碳原子数为3～5个的直链烃基是碳原子数为3～5个的直链亚烷基、碳原子数为3～5个的直链亚烯基、或碳原子数为3～5个的直链亚炔基。
碳原子数为3～5个的直链亚烷基是正亚丙基、正亚丁基或正亚戊基。
碳原子数为3～5个的直链亚烯基是正亚丙烯基、正亚丁烯基或正亚戊烯基。
碳原子数为3～5个的直链亚炔基是正亚丙炔基、正亚丁炔基或正亚戊炔基。
作为碳原子数为3～5个的二价直链烃基，优选碳原子数为3～5个的直链亚烷基。
二价环状烃基为亚芳基或二价非芳族环状烃基。通过在这样的二价环状烃基中适当设定2个结合键，可将构成上述主链的碳原子数设定为3～5个。
作为亚芳基，优选碳原子数为6～14的亚芳基、更优选碳原子数为6～10的亚芳基、特别优选碳原子数为6的亚芳基。作为亚芳基，例如可列举：亚苯基、亚萘基、亚蒽基。
作为二价非芳族环状烃基，优选碳原子数为3～12的单环式或多环式的二价非芳族环状烃基、更优选碳原子数为4～10的单环式或多环式的二价非芳族环状烃基、特别优选碳原子数为5～8的单环式的二价非芳族环状烃基。作为二价非芳族环状烃基，例如可列举：亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基、亚环辛基。
作为二价环状烃基，优选亚芳基。
碳原子数为1～4个的二价直链烃基是碳原子数为1～4个的直链亚烷基、碳原子数为2～4个的直链亚烯基或碳原子数为2～4个的直链亚炔基。
碳原子数为1～4个的直链亚烷基是亚甲基、亚乙基、正亚丙基或正亚丁基。
碳原子数为1～4个的直链亚烯基是亚乙烯基、正亚丙烯基或正亚丁烯基。
碳原子数为1～4个的直链亚炔基是亚乙炔基、正亚丙炔基或正亚丁炔基。
作为碳原子数为1～4个的二价直链烃基，优选碳原子数为1～4个的直链亚烷基。
由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)优选上述(1)～(4)中的(1)～(3)，更优选(1)和(2)。
在特定的实施方式中，M中的由3～5个碳原子构成的主链部分可以是包含直链亚烷基、或成环碳原子、或者它们的组合的部分。因此，由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)可由以下构成：
(1’)碳原子数为3～5个的直链亚烷基；
(2’)二价环状烃基和碳原子数为1～4个的直链亚烷基(1个或2个)连接的二价基团；
(3’)二价环状烃基；和
(4’)连接有2个二价环状烃基的二价基团(即，二价双环结构物)。
由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)优选上述(1’)～(4’)中的(1’)～(3’)，更优选(1’)和(2’)。因此，M可以是从下述式(i)或(ii)所表示的由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)中去除1个氢原子后的三价基团：
[化学式4]
[式中，
n表示3～5的整数，
m表示0～4的整数，
k表示0～4的整数，
环B表示二价环状烃基，
b1表示与M所相邻的C＝O中的碳原子的结合键，
b2表示与M所相邻的C＝W中的碳原子的结合键。]
环B所示的二价环状烃基与上述相同。在由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)由式(ii)表示的情况下，M优选为从式(ii)所表示的由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)中的环B中去除1个氢原子后的三价基团。
优选地，上述式(ii)所表示的由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)可以是下述式(ii’)所表示的部分。
[化学式5]
[式中，
m表示0～4的整数，
k表示0～4的整数，
Ph表示亚苯基，
b1表示与M所相邻的C＝O中的碳原子的结合键，
b2表示与M所相邻的C＝W中的碳原子的结合键。]
Ph可以在间位、邻位或对位与2个直链亚烷基键合。在由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)由式(ii’)表示的情况下，M优选为从式(ii’)所表示的由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)中的亚苯基中去除1个氢原子后的三价基团。
更优选地，上述式(ii)所表示的由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)可以是下述式(ii”)所表示的部分。
[化学式6]
[式中，
m表示0～2的整数，
k表示0～2的整数，
b1表示与M所相邻的C＝O中的碳原子的结合键，
b2表示与M所相邻的C＝W中的碳原子的结合键。]
在由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)由式(ii”)表示的情况下，M优选为从式(ii”)所表示的由3～5个碳原子构成的主链部分(二价基团)中的亚苯基(优选相对于2个亚烷基为邻位的碳原子)中去除1个氢原子后的三价基团。
W表示氧原子或硫原子，优选表示氧原子。
La和Lb各自独立地表示键或二价基团。
La是包含在由式(I)所表示的化合物制造的抗体中间体中但不包含在由抗体中间体制造的引入有叠氮基的抗体衍生物、以及抗体和功能性物质的缀合物中的部分。因此，对于由式(I)所表示的化合物制造的抗体，La的稳定性难以成为问题。
Lb是包含在由式(I)所表示的化合物制造的抗体中间体、引入有叠氮基的抗体衍生物、以及抗体和功能性物质的缀合物中的部分。另外，Lb是在引入有叠氮基的抗体衍生物中作为连接抗体和叠氮基的接头起作用的部分。
La和Lb所示的二价基团中的主链优选由二价直链烃基、二价环状烃基、二价杂环基、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-NRd-(Rd表示氢原子或取代基。)、-O-、-S-、或它们的2个以上(例如为2～15、优选为2～10、更优选为2～8、更进一步优选为2～6、特别优选为2、3、4或5)的组合而成的基团构成。构成由La和Lb所示的二价基团中的主链的原子数优选为1～17个、更优选为1～15个。另外，构成由La和Lb所示的二价基团中的主链的原子数的下限值可以是2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上或7个以上。构成由La和Lb所示的二价基团中的主链的原子数的上限值可以是14个以下、13个以下、12个以下、11个以下或10个以下。在主链为包含环状结构的结构的情况下，环状结构中的主链的原子数可如上所述地确定。
二价直链烃基为直链亚烷基、直链亚烯基或直链亚炔基。
直链亚烷基是碳原子数为1～6的直链亚烷基、优选碳原子数为1～4的直链亚烷基。作为直链亚烷基，例如可列举：亚甲基、亚乙基、正亚丙基、正亚丁基、正亚戊基、正亚己基。
直链亚烯基是碳原子数为2～6的直链亚烯基、优选碳原子数为2～4的直链亚烯基。作为直链亚烯基，例如可列举：亚乙烯基、正亚丙烯基、正亚丁烯基、正亚戊烯基、正亚己烯基。
直链亚炔基是碳原子数为2～6的直链亚炔基、优选碳原子数为2～4的直链亚炔基。作为直链亚炔基，例如可列举：亚乙炔基、正亚丙炔基、正亚丁炔基、正亚戊炔基、正亚己炔基。
作为二价直链烃基，优选直链亚烷基。
二价环状烃基为亚芳基或二价非芳族环状烃基。
作为亚芳基，优选碳原子数为6～14的亚芳基、更优选碳原子数为6～10的亚芳基、特别优选碳原子数为6的亚芳基。作为亚芳基，例如可列举：亚苯基、亚萘基、亚蒽基。
作为二价非芳族环状烃基，优选碳原子数为3～12的单环式或多环式的二价非芳族环状烃基、更优选碳原子数为4～10的单环式或多环式的二价非芳族环状烃基、特别优选碳原子数为5～8的单环式的二价非芳族环状烃基。作为二价非芳族环状烃基，例如可列举：亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基、亚环辛基。
作为二价环状烃基，优选亚芳基。
二价杂环基为二价芳族杂环基或二价非芳族杂环基。作为构成杂环的杂原子，优选包含选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子的1种以上，更优选包含选自氧原子、硫原子和氮原子的1种以上。
作为二价芳族杂环基，优选碳原子数为3～15的二价芳族杂环基、更优选碳原子数为3～9的二价芳族杂环基、特别优选碳原子数为3～6的二价芳族杂环基。作为二价芳族杂环基，例如可列举：吡咯二基、呋喃二基、噻吩二基、吡啶二基、哒嗪二基、嘧啶二基、吡嗪二基、三嗪二基、吡唑二基、咪唑二基、噻唑二基、异噻唑二基、唑二基、异唑二基、三唑二基、四唑二基、吲哚二基、嘌呤二基、蒽醌二基、咔唑二基、芴二基、喹啉二基、异喹啉二基、喹唑啉二基和酞嗪二基。
作为二价非芳族杂环基，优选碳原子数为3～15的非芳族杂环基、更优选碳原子数为3～9的非芳族杂环基、特别优选碳原子数为3～6的非芳族杂环基。作为二价非芳族杂环基，例如可列举：吡咯二酮二基、吡咯啉二酮二基、环氧乙烷二基、氮丙啶二基、氮杂环丁烷二基、氧杂环丁烷二基、硫杂环丁烷二基、吡咯烷二基、二氢呋喃二基、四氢呋喃二基、二氧戊环二基、四氢噻吩二基、吡咯啉二基、咪唑啉二基、唑烷二基、哌啶二基、二氢吡喃二基、四氢吡喃二基、四氢噻喃二基、吗啉二基、硫代吗啉二基、哌嗪二基、二氢嗪二基、四氢嗪二基、二氢嘧啶二基和四氢嘧啶二基。
作为二价杂环基，优选二价芳族杂环基。
在特定的实施方式中，La所相邻的羰基可与亲和性肽中的赖氨酸残基的侧链中的氨基形成酰胺键。
在特定的实施方式中，从合成的容易度等观点出发，由Lb所示的二价基团中的主链可不含环状结构。因此，由Lb所示的二价基团中的主链可由二价直链烃基、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-NRd-(Rd表示氢原子或取代基。)、-O-、-S-、或它们的2个以上(例如，2、3、4或5)的组合而成的基团构成。优选地，从确保Lb的稳定性的观点出发，从上述组合中去除-C(＝O)-NRd-、-C(＝O)-O-、-C(＝O)-S-、-C(＝S)-NRd-、-C(＝S)-O-、-C(＝S)-S-。构成由Lb所示的二价基团中的主链的原子数优选为1～12个、更优选为1～10个。
构成由La和Lb所示的二价基团中的主链的基团可具有例如1～5个、优选1～3个、更优选1或2个的取代基。另外，附属于第1接头和第2接头中的主链上的上述Rd相当于取代基。作为这样的取代基，例如可列举如下：
(i’)卤原子；
(ii’)一价烃基；
(iii’)芳烷基；
(iv’)一价杂环基；
(v’)Re-O-、Re-C(＝O)-、Re-O-C(＝O)-或Re-C(＝O)-O-(Re表示氢原子或一价烃基。)；或
(vi’)NRfRg-、NRfRg-C(＝O)-、NRfRg-C(＝O)-O-或Rf-C(＝O)-NRg-(Rf和Rg相同或不同地表示氢原子或一价烃基。)；
(vii’)硝基、硫酸基、磺酸基、氰基和羧基。
上述取代基中的卤原子、一价烃基、芳烷基和一价杂环基的定义、示例和优选示例分别与上述R、RA和RB、以及上述(i)～(iv)中说明的卤原子、一价烃基、芳烷基和一价杂环基相同。
优选地，取代基可如下：
(i’)卤原子；
(ii’)碳原子数为1～12的烷基、苯基或萘基；
(iii’)碳原子数为3～15的芳烷基；
(iv’)5元或6元的杂环；
(v’)Re-O-、Re-C(＝O)-、Re-O-C(＝O)-或Re-C(＝O)-O-(Re表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基。)；
(vi’)NRfRg-、NRfRg-C(＝O)-、NRfRg-C(＝O)-O-或Rf-C(＝O)-NRg(Rf和Rg相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基。)；或
(vii’)与上述(vii’)中列举的基团相同的基团。
更优选地，取代基可如下：
(i’)卤原子；
(ii’)碳原子数为1～12的烷基；
(iii’)Re-O-、Re-C(＝O)-、Re-O-C(＝O)-或Re-C(＝O)-O-(Re表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基。)；
(iv’)NRfRg-、NRfRg-C(＝O)-、NRfRg-C(＝O)-O-或Rf-C(＝O)-NRg(Rf和Rg相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基。)；或
(v’)与上述(vii’)中列举的基团相同的基团。
更进一步优选地，取代基可如下：
(i’)卤原子；
(ii’)碳原子数为1～6的烷基；
(iii’)Re-O-、Re-C(＝O)-、Re-O-C(＝O)-或Re-C(＝O)-O-(Re表示氢原子或碳原子数为1～6的烷基。)；
(iv’)NRfRg-、NRfRg-C(＝O)-、NRfRg-C(＝O)-O-或Rf-C(＝O)-NRg-(Rf和Rg相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～6的烷基。)；或
(v’)与上述(vii’)中列举的基团相同的基团。
特别优选地，取代基可如下：
(i’)卤原子；
(ii’)碳原子数为1～4的烷基；
(iii’)Re-O-或Re-C(＝O)-(Re表示氢原子或碳原子数为1～4的烷基。)；
(iv’)NRfRg-(Rf和Rg相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～4的烷基。)；或
(v’)与上述(vii’)中列举的基团相同的基团。
在特定的实施方式中，式(I)所表示的化合物可由连接M和Y的主链的原子数来规定。连接M和Y的主链相当于连接M和Y的结构“C(＝W)-S-La-C(＝O)”中的主链“C-S-La-C”。连接M和Y的主链的原子数可以是6～20个。连接M和Y的主链的原子数具有这样的个数的式(I)所表示的化合物容易合成。另外，容易将抗体与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率高度地控制在所需的范围，并且，免疫球蛋白单元的位点选择性修饰的通用性优异。连接M和Y的主链的原子数还可以是6～19个、6～18个、6～17个、6～16个、6～15个、6～14个、6～13个、6～12个、6～11个、6～10个、7～19个、7～18个、7～17个、7～16个、7～15个、7～14个、7～13个、7～12个、7～11个、7～10个、8～19个、8～18个、8～17个、8～16个、8～15个、8～14个、8～13个、8～12个、8～11个、8～10个。
式(I)所表示的本发明的化合物或其盐可通过合成例如式(I)所表示的化合物或其盐中Y的部分被离去基团(优选离去能力高于X的离去基团、或羟基)取代的化合物或其盐，然后使该合成的化合物或其盐与亲和性肽反应而得到。例如，这样的反应可在适当的反应体系(例如，有机溶剂或水溶液或其混合溶剂中)中、在适当温度(例如，约15～200℃)下进行。反应体系可包含适当的催化剂。反应时间例如为1分钟～20小时、优选为10分钟～15小时、更优选为20分钟～10小时、更进一步优选为30分钟～8小时。
优选地，式(I)所表示的化合物或其盐中Y的部分被离去基团取代的化合物或其盐可以是下述式(I’)所表示的化合物或其盐。
[化学式7]
[式中，
X表示离去基团，
X’表示离去能力高于离去基团X的离去基团，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团。]
由X’所示的离去能力高于离去基团X的离去基团，只要是离去能力高于离去基团X的离去基团即可，没有特别限定，例如可列举：五氟苯氧基、四氟苯氧基、对硝基苯氧基和N-琥珀酰亚氨氧基。
式(I’)中的X(离去基团)、M(三价基团)、W(氧原子或硫原子)、La(键或二价基团)、Lb(键或二价基团)等符号、术语和表述的定义、示例和优选示例与上述式相同。
式(I’)所表示的化合物或其盐例如可用作用于有效地制造式(I)所表示的化合物或其盐的合成中间体。
式(I’)所表示的化合物或其盐可由下述式(I”)所表示的化合物或其盐制造。
[化学式8]
[式中，
X表示离去基团，
OH表示羟基，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团。]
式(I”)中的X(离去基团)、M(三价基团)、W(氧原子或硫原子)、La(键或二价基团)、Lb(键或二价基团)等符号、术语和表述的定义、示例和优选示例与上述式相同。
式(I’)所表示的化合物或其盐可通过使式(I”)所表示的化合物或其盐与羧基修饰试剂反应而得到。作为羧基修饰试剂，例如可列举：五氟苯基化试剂(例如，三氟乙酸五氟苯酯)、四氟苯基化试剂(例如，三氟乙酸四氟苯酯)、对硝基苯基化试剂(例如，三氟乙酸对硝基苯酯)、N-琥珀酰亚胺化试剂(例如，三氟乙酸N-琥珀酰亚胺酯)。例如，这样的反应可在适当的有机溶剂系(例如，包含CH2Cl2等卤代烷基(例如，卤代甲基)和三乙胺等胺的有机溶剂)中、在适当温度(例如，约-10～30℃)下进行。反应时间例如为1分钟～20小时、优选为10分钟～15小时、更优选为20分钟～10小时、更进一步优选为30分钟～8小时。
式(I”)所表示的化合物或其盐例如可用作用于有效地制造式(I’)所表示的化合物或其盐的合成中间体。或者，(I”)所表示的化合物或其盐还可用作用于直接且有效地制造式(I)所表示的化合物或其盐的合成中间体。
可通过实施例所示的各种合成方法得到式(I”)所表示的化合物。
上述一系列化合物或其盐的生成的确认还取决于其具体的原料和产物的分子量，例如，可通过电泳法、色谱法(例如，凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)、NMR或质谱分析来进行。这样的化合物或其盐可通过色谱法(例如，上述的色谱法及亲和色谱法)等任意方法适当纯化。
3.抗体中间体或其盐
本发明提供包含下述式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐。
[化学式9]
[式中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与Ig所相邻的羰基形成酰胺键，
Y表示在所述免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0。]
由Ig所示的免疫球蛋白单元如上所述。式(II)中的Y(亲和性肽)、M(三价基团)、W(氧原子或硫原子)、La(键或二价基团)、Lb(键或二价基团)等符号、术语和表述的定义、示例和优选示例与上述式相同。
式(II)中，每2个重链的上述酰胺键的平均比率(r)表示免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率(含叠氮基的修饰基团数/免疫球蛋白单元)。这样的平均比率为1.0～3.0、优选1.5～2.5。而且，这样的平均比率可优选为1.6以上、更优选为1.7以上、更进一步优选为1.8以上、特别优选为1.9以上。这样的平均比率还可优选为2.4以下、更优选为2.3以下、更进一步优选为2.2以下、特别优选为2.1以下。更具体而言，这样的平均比率可优选为1.6～2.4、更优选为1.7～2.3、更进一步优选为1.8～2.2、特别优选为1.9～2.1。具有包含与Ig所相邻的羰基形成酰胺键的氨基的侧链的赖氨酸残基，在2个重链中的所需的1个位点(例如，依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个位点)中，可被修饰成表示上述值的平均比率。另外，在2个重链分别在2个以上位点被修饰的情况下，具有包含与Ig所相邻的羰基形成酰胺键的氨基的侧链的赖氨酸残基，在2个重链中的所需的2个以上位点(例如，依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个位点；优选246/248位和288/290位)的各位点中，也可被修饰成表示上述值的平均比率。
本发明的抗体中间体或其盐可通过使本发明的化合物或其盐与包含上述免疫球蛋白单元的抗体反应而得到。反应中，首先，使本发明的化合物或其盐与抗体混合。由此，本发明的化合物或其盐可经由与抗体具有亲和性的亲和性肽而与抗体缔合。其次，在抗体缔合后，具有离去基团(X)的羰基(X-C＝O)可位点选择性地与抗体的重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基反应。通过这样的反应，该氨基与羰基的碳原子键合，且离去基团(X)从羰基上离去，从而得到本发明的抗体中间体或其盐。反应中的、本发明的化合物或其盐相对于抗体的摩尔比率(本发明的化合物或其盐/抗体)，会根据本发明的化合物或其盐、及抗体的种类等因素而变动，因此没有特别限定，例如为1～100、优选为2～80、更优选为4～60、更进一步优选为5～50、特别优选为6～30。
这样的反应可在不引起蛋白的变性/降解(例如，酰胺键的切割)的条件(温和的条件)下适当进行。例如，这样的反应可在适当的反应体系例如缓冲液中、在室温(例如，约15～30℃)下进行。缓冲液的pH例如为5～9、优选为5.5～8.5、更优选为6.0～8.0。缓冲液可包含适当的催化剂。反应时间例如为1分钟～20小时、优选为10分钟～15小时、更优选为20分钟～10小时、更进一步优选为30分钟～8小时。关于这样的反应的细节，例如请参照G.J.L.Bernardes等人,Chem.Rev.,115,2174(2015)；G.J.L.Bernardes等人,Chem.Asian.J.,4,630(2009)；B.G.Davies等人,Nat.Commun.,5,4740(2014)；A.Wagner等人,Bioconjugate.Chem.,25,825(2014)。
抗体中间体或其盐的生成的确认还取决于其具体的原料和产物的分子量，例如可通过电泳法、色谱法(例如，凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析来进行。位点选择性的确认例如可通过肽图谱(peptide maping)来进行。肽图谱例如可通过蛋白酶处理和质谱分析来进行。作为蛋白酶，优选内切蛋白酶。作为这样的内切蛋白酶，例如可列举：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Lys-N、Lys-C、Asp-N。亲和性肽的引入个数的确认例如可通过电泳法、色谱法或质谱分析、优选通过质谱分析来进行。抗体中间体或其盐可通过色谱法(例如，上述的色谱法及亲和色谱法)等任意方法适当纯化。
4.引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐
本发明提供包含下述式(III)所表示的结构单元的、引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐。
[化学式10]
[式中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与Ig所相邻的羰基形成酰胺键，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
T表示一价基团，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
Lb表示键或二价基团，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0。]
由Ig所示的免疫球蛋白单元如上所述。式(III)中的M(三价基团)、W(氧原子或硫原子)、Lb(键或二价基团)等符号、术语和表述的定义、示例和优选示例与上述式相同。
T表示一价基团。T可通过式(II)所表示的化合物中的部分结构“C(＝W)-S”中的碳原子与硫原子之间的切割反应而生成。因此，作为T，可采用与切割反应的种类相应的适当的一价基团。
在特定的实施方式中，T所示的一价基团可以是可被取代的羟基氨基。可被取代的羟基氨基可由下述式(α)表示。
[化学式11]
NR1-OR2 (α)
[式中，
R1、R2相同或不同地表示氢原子或可被取代的一价烃基。)
一价烃基和取代基的定义、示例和优选示例如上所述。
式(III)中，每2个重链的上述酰胺键的平均比率(r)表示免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率(含叠氮基的修饰基团数/免疫球蛋白单元)。这样的平均比率为1.0～3.0、优选1.5～2.5。而且，这样的平均比率可优选为1.6以上、更优选为1.7以上、更进一步优选为1.8以上、特别优选为1.9以上。这样的平均比率还可优选为2.4以下、更优选为2.3以下、更进一步优选为2.2以下、特别优选为2.1以下。更具体而言，这样的平均比率可优选为1.6～2.4、更优选为1.7～2.3、更进一步优选为1.8～2.2、特别优选为1.9～2.1。具有包含与Ig所相邻的羰基形成酰胺键的氨基的侧链的赖氨酸残基，在2个重链中的所需的1个位点(例如，依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个位点)中，可被修饰成表示上述值的平均比率。另外，在2个重链分别在2个以上位点被修饰的情况下，具有包含与Ig所相邻的羰基形成酰胺键的氨基的侧链的赖氨酸残基，在2个重链中的所需的2个以上位点(例如，依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个位点；优选246/248位和288/290位)的各位点中，也可被修饰成表示上述值的平均比率。
本发明的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐可通过将本发明的抗体中间体或其盐供于硫酯的切割反应而得到。硫酯的切割反应可在不引起蛋白(免疫球蛋白/抗体)的变性/降解(例如，酰胺键的切割)的条件(上述的温和条件)下进行。更具体而言，硫酯可通过在pH4.0～8.0下、在处于10mM～10M的范围的羟胺盐酸盐溶液中搅拌适当的时间(例如，1小时)来切割(例如，Vance,N.等人,Bioconjugate Chem.2019,30,148-160.)。
引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐的生成的确认也取决于其具体的原料和产物的分子量，例如可通过电泳法、色谱法(例如，凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析、优选通过质谱分析来进行。位点选择性的确认例如可通过肽图谱来进行。肽图谱例如可通过蛋白酶(例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)处理和质谱分析来进行。作为蛋白酶，优选内切蛋白酶。作为这样的内切蛋白酶，例如可列举：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Lys-N、Lys-C、Asp-N。硫醇基的引入个数的确认例如可通过电泳法、色谱法或质谱分析、优选通过质谱分析来进行。引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐可通过色谱法(例如，上述的色谱法及亲和色谱法)等任意方法适当纯化。
5.抗体和功能性物质的缀合物或其盐
本发明提供包含下述式(IV)所表示的结构单元的、抗体和功能性物质的缀合物或其盐。
[化学式12]
[式中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与Ig所相邻的羰基形成酰胺键，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
T表示一价基团，
W表示氧原子或硫原子，
N表示氮原子，
Lb表示键或二价基团，
Z表示功能性物质，
L表示键或二价基团，
环A表示与三唑环稠合的环，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0。]
由Ig所示的免疫球蛋白单元如上所述。式(IV)中的M(三价基团)、W(氧原子或硫原子)、Lb(键或二价基团)等符号、术语和表述的定义、示例和优选示例与上述式相同。
环A表示与三唑环稠合的环。环A的构成部分不包括稠合的三唑环本身，但包括与三唑共有的碳碳双键的部分。因此，可以说环A是具有碳碳双键的环。
环A为单环、或单环与其它环的稠环。环A可具有取代基。作为单环，优选碳环、或包含选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子的1种以上的杂环。更优选单环为碳环、或包含选自氧原子、硫原子和氮原子的1种以上的杂环。作为单环，优选5～12元的单环、更优选6～10元的单环、更进一步优选7～9元的单环。作为单环，优选非芳族性的单环。
在环A为稠环的情况下，作为与单环稠合的其它环，例如可列举：环烷烃、芳烃、杂环。
作为与单环稠合的环烷烃，优选碳原子数为3～24的环烷烃、更优选碳原子数为6～18的环烷烃、进一步优选碳原子数为3～14的环烷烃、更进一步优选碳原子数为3～10的环烷烃。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为环烷烃，例如可列举：环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、环辛烷。
作为与单环稠合的芳烃，优选碳原子数为6～24的芳烃、更优选碳原子数为6～18的芳烃、进一步优选碳原子数为6～14的芳烃、更进一步优选碳原子数为6～10的芳烃。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为芳烃，例如可列举：苯、萘、蒽。
与单环稠合的杂环为芳族杂环或非芳族杂环。作为构成杂环的杂原子，优选包含选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子的1种以上，更优选包含选自氧原子、硫原子和氮原子的1种以上。
作为与单环稠合的芳族杂环，优选碳原子数为3～21的芳族杂环、更优选碳原子数为3～15的芳族杂环、进一步优选碳原子数为3～9的芳族杂环、更进一步优选碳原子数为3～6的芳族杂环。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。更具体而言，作为芳族杂环，例如可列举：芘、吡咯、呋喃、噻吩、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、吡咯啉、哌啶、三唑、嘌呤、蒽醌、咔唑、芴、喹啉和异喹啉。
作为与单环稠合的非芳族杂环，优选碳原子数为3～21的非芳族杂环、更优选碳原子数为3～15的非芳族杂环、进一步优选碳原子数为3～9的非芳族杂环、更进一步优选碳原子数为3～6的非芳族杂环。上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。更具体而言，作为非芳族杂环，例如可列举：环氧乙烷、氮丙啶、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、二氢呋喃、四氢呋喃、二氧戊环、四氢噻吩、咪唑烷、唑烷、哌啶、二氢吡喃、四氢吡喃、四氢噻喃、吗啉、硫代吗啉、哌嗪、二氢嗪、四氢嗪、二氢嘧啶和四氢嘧啶。
环A可具有的取代基与上述(i)～(vii)的取代基相同，优选的范围也相同。取代基的个数例如为1～5个、优选为1～3个、更优选为1或2个。
优选地，环A可以是7～9元的单环、或7～9元的单环与其它环的稠环(例如，参照Org.Biomol.Chem.2013,11,6439；Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,1190)。例如，作为这样的环A，可使用国际公开第2017/191817号中记载的式(i’)～(vii’)的环。
式(IV)中，由L所示的二价基团是连接功能性物质(Z)与环A的直链、支链或环状的基团、或它们的组合而成的基团。L所示的二价基团中的主链例如可由二价直链烃基、二价环状烃基、二价杂环基、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-NR-(R表示氢原子或取代基。)、-O-、-S-、或它们的2个以上(例如为2～15、优选为2～10、更优选为2～8、更进一步优选为2～6、特别优选为2、3、4或5)的组合而成的基团构成。由L所示的二价基团可具有取代基。这样的取代基与上述(i)～(vii)的取代基相同，优选的范围也相同。取代基的个数例如为1～5个、优选为1～3个、更优选为1或2个。L可与环A中不同于与三唑共有的碳原子的任意的成环原子键合。
对功能性物质没有特别限定，只要是对抗体赋予任意的功能的物质即可，例如可列举：药物、标记物质、稳定剂，优选为药物或标记物质。功能性物质可以是单一的功能性物质，或者可以是连接有2种以上的功能性物质的物质。
作为药物，可以是针对任意疾病的药物。作为这样的疾病，例如可列举：癌症(例如，肺癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫癌、骨癌、皮肤癌、脑瘤、黑色素瘤)、自身免疫疾病/炎症性疾病(例如，过敏性疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮)、脑神经疾病(例如，脑梗塞、阿尔茨海默症、帕金森症、肌萎缩性侧索硬化症)、感染症(例如，细菌感染症、病毒感染症)、遗传病/罕见疾病(例如，遗传性球形红细胞增多症、非营养不良性肌强直病)、眼病(例如，老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜色素变性)、骨/整形外科领域的疾病(例如，变形性关节炎)、血液疾病(例如，白血病、紫癜)、其它疾病(例如，糖尿病、高脂血症等代谢异常症、肝脏疾病、肾病、肺病、循环系统疾病、消化系统疾病)。药物可以是疾病的预防或治疗药、副作用的缓解药。
更具体而言，药物可以是抗癌药。作为抗癌药，例如可列举：化疗药、毒素、放射性同位素或包含其的物质。作为化疗药，例如可列举：DNA损伤剂、代谢拮抗剂、酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA切割剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA结合抑制剂、微管蛋白结合抑制剂、细胞毒性核苷、铂化合物。作为毒素，例如可列举：细菌毒素(例如，白喉毒素)、植物毒素(例如，蓖麻毒蛋白)。作为放射性同位素，例如可列举：氢原子的放射性同位素(例如，3H)、碳原子的放射性同位素(例如，14C)、磷原子的放射性同位素(例如，32P)、硫原子的放射性同位素(例如，35S)、钇的放射性同位素(例如，90Y)、锝的放射性同位素(例如，99mTc)、铟的放射性同位素(例如，111In)、碘原子的放射性同位素(例如，123I、125I、129I、131I)、钐的放射性同位素(例如，153Sm)、铼的放射性同位素(例如，186Re)、砹的放射性同位素(例如，211At)、铋的放射性同位素(例如，212Bi)。更具体而言，作为药物，可列举：澳瑞他汀(MMAE、MMAF)、美登素(DM1、DM4)、PBD(吡咯并苯并二氮杂)、IGN、喜树碱类似物、卡奇霉素、倍癌霉素、艾日布林、蒽环类抗生素、dmDNA31、Tubulysin。
标记物是可进行靶(例如，组织、细胞、物质)的检测的物质。作为标记物，例如可列举：酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶)、亲和性物质(例如，链霉亲和素、生物素、地高辛、适配体)、荧光物质(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白)、发光物质(例如，萤光素、水母素、吖啶酯、三(2,2’-联吡啶)钌、鲁米诺)、放射性同位素(例如，上述的同位素)、或包含其的物质。
稳定剂是可使抗体稳定的物质。作为稳定剂，例如可列举：二元醇类、甘油、非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、天然系表面活性剂、糖类和多元醇类。
另外，功能性物质可以是肽、蛋白、核酸、小分子有机化合物、糖链、脂质、高分子聚合物、金属(例如，金)、螯合剂。作为肽，例如可列举：细胞穿透肽、血脑屏障穿透肽、肽药物。作为蛋白，例如可列举：酶、细胞因子、片段抗体、凝集素、干扰素、血清白蛋白、抗体。作为核酸，例如可列举：DNA、RNA、人工核酸。另外，作为核酸，例如可列举：RNA干扰诱导性核酸(例如，siRNA)、适配体、反义RNA。作为小分子有机化合物，例如可列举：蛋白降解诱导嵌合分子、色素、光分解性化合物。
在功能性物质不具有所需官能团(例如，环A、或容易与L连接的官能团)的情况下，功能性物质可被衍生为具有这样的官能团。衍生为该领域中的技术常识(例如，国际公开第2004/010957号、美国专利申请公开第2006/0074008号说明书、美国专利申请公开第2005/0238649号说明书)。例如，衍生可使用任意的交联剂来进行。或者，衍生可使用具有所需官能团的特定接头来进行。例如，这样的接头可以是在适当的环境(例如，细胞内或细胞外)中通过切割接头可分离功能性物质和抗体的接头。作为这样的接头，例如可列举：由特定的蛋白酶[例如，细胞内蛋白酶(例如，溶酶体或核内体中存在的蛋白酶)、细胞外蛋白酶(例如，分泌性蛋白酶)]降解的肽基接头(例如，美国专利第6,214,345号；Dubowchik等人,Pharm.Therapeutics 83:67-123(1999))、生物体内存在的可在局部酸性部位切割的接头(例如，美国专利第5,622,929号、美国专利第5,122,368号；美国专利第5,824,805号)。接头可以自裂解(self-immolative)(例如，国际公开第02/083180号、国际公开第04/043493号、国际公开第05/112919号)。本发明中，已衍生的功能性物质也简称为“功能性物质”。
式(IV)中，每2个重链的上述酰胺键的平均比率(r)表示免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率(含功能性物质的基团数/免疫球蛋白单元)。这样的平均比率为1.0～3.0、优选1.5～2.5。而且，这样的平均比率可优选为1.6以上、更优选为1.7以上、更进一步优选为1.8以上、特别优选为1.9以上。这样的平均比率还可优选为2.4以下、更优选为2.3以下、更进一步优选为2.2以下、特别优选为2.1以下。更具体而言，这样的平均比率可优选为1.6～2.4、更优选为1.7～2.3、更进一步优选为1.8～2.2、特别优选为1.9～2.1。具有包含与Ig所相邻的羰基形成酰胺键的氨基的侧链的赖氨酸残基，在2个重链中的所需的1个位点(例如，依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个位点)中，可被修饰成表示上述值的平均比率。另外，在2个重链分别在2个以上位点被修饰的情况下，具有包含与Ig所相邻的羰基形成酰胺键的氨基的侧链的赖氨酸残基，在2个重链中的所需的2个以上位点(例如，依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个位点；优选246/248位和288/290位)的各位点中，也可被修饰成表示上述值的平均比率。
本发明的缀合物或其盐可通过使本发明的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐与功能性物质反应而得到。这样的反应可在不引起蛋白(免疫球蛋白/抗体)的变性/降解(例如，酰胺键的切割)的条件(上述的温和条件)下进行。作为功能性物质，可使用衍生为具有在温和条件下能够与叠氮基反应的环炔基的物质。这样的功能性物质可由下述式(V)表示。
[化学式13]
[式中，
环A’表示具有碳碳三键的环，
Z表示功能性物质，
L表示键或二价基团。]
环A’表示具有碳碳三键的环。环A’为单环、或单环与其它环的稠环。环A’可具有取代基。作为单环，优选碳环、或包含选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子的1种以上的杂环。更优选单环为碳环、或包含选自氧原子、硫原子和氮原子的1种以上的杂环。作为单环，优选7～10元的单环、更优选7～9元的单环。作为单环，优选非芳族性的单环。
在环A’为稠环的情况下，作为与单环稠合的其它环，例如可列举：环烷烃、芳烃、杂环。环烷烃、芳烃、杂环的定义、示例和优选示例与关于环A’的稠环中的其它环相同。
环A’可具有的取代基与上述(i)～(vii)的取代基相同，优选的范围也相同。取代基的个数例如为1～5个、优选为1～3个、更优选为1或2个。
优选环A’为7～9元的单环、或7～9元的单环与其它环的稠环。这样的环A’与叠氮基的反应也称为环张力促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)反应(例如，Org.Biomol.Chem.2013,11,6439；Angew.Chem.Int.Ed.2015,1190；J.Am.Chem.Soc.2004,126,15046；J.Am.Chem.Soc.2008,130,11486；Chem.Commun.2010,46,97)。例如，作为这样的环A，可使用国际公开第2017/191817号中记载的式(i”)～(vii”)的环。
反应中，功能性物质相对于引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐的摩尔比率(功能性物质/引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐)，根据引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐、和功能性物质的种类、和反应时间等因素而变动，因此没有特别限定，例如为2以上、优选为3以上、更优选为5以上。为了使功能性物质在短的反应时间内充分地与引入有叠氮基的抗体衍生物的硫醇基反应，可使用相对于引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐的充分量(例如，过剩量)的功能性物质。
缀合物或其盐的生成的确认也取决于其具体的原料和产物的分子量，例如可通过电泳法、色谱法(例如，凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析、优选通过质谱分析来进行。位点选择性的确认例如可通过肽图谱来进行。肽图谱例如可通过蛋白酶(例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)处理和质谱分析来进行。作为蛋白酶，优选内切蛋白酶。作为这样的内切蛋白酶，例如可列举：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Lys-N、Lys-C、Asp-N。功能性物质的引入个数的确认例如可通过电泳法、色谱法或质谱分析、优选通过质谱分析来进行。缀合物或其盐可通过色谱法(例如，上述的色谱法及亲和色谱法)等任意方法适当纯化。
6.用途
本发明的化合物或其盐可将免疫球蛋白单元与含叠氮基的修饰基团的结合的平均比率(含叠氮基的修饰基团/免疫球蛋白单元)高度地控制在所需的范围(1.0～3.0)。本发明的化合物或其盐还可位点选择性地修饰免疫球蛋白单元中的重链中的赖氨酸残基。因此，本发明提供包含本发明的化合物或其盐的抗体衍生用试剂。
本发明的试剂可以以进一步包含其它成分的组合物的形式提供。作为这样的其它成分，例如可列举：溶液、稳定剂(例如，抗氧化剂、保存剂)。作为溶液，优选水溶液。作为水溶液，例如可列举：水(例如，蒸馏水、灭菌蒸馏水、纯净水、生理盐水)、缓冲液(例如，磷酸水溶液、Tris-盐酸缓冲液、碳酸-碳酸氢盐缓冲液、硼酸水溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、柠檬酸缓冲液)，优选缓冲液。溶液的pH例如为5.0～9.0、优选为5.5～8.5。本发明的试剂可以以液态或粉末状(例如，冷冻干燥粉末)来提供。
本发明的抗体中间体或其盐、和本发明的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，例如可用作用于调制抗体和功能性物质的缀合物或其盐的中间体。
本发明的缀合物或其盐可用作例如药物或试剂(例如，诊断药、用于研究的试剂)。特别地，本发明的缀合物或其盐可用作药物，所述缀合物或其盐被功能性物质位点选择性地修饰，并且抗体与功能性物质的结合的平均比率被高度地控制在所需的范围(1.0～3.0)。据报道，如果改变抗体药物复合物(ADC)的药物的结合数和结合位点，则会改变体内动力学或药物的释放速度、效果。基于这些情况，对于下一代ADC，要求控制待缀合的药物的个数和位点。据信，如果个数和位点恒定，则预期的功效、缀合药剂的多样性、批次差异即所谓的标准化问题就迎刃而解了。因此，本发明的缀合物或其盐可解决这样的标准化问题。
本发明的缀合物或其盐可以以药物组合物的形式提供。这样的药物组合物除了包含本发明的缀合物或其盐以外还包含药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，例如可列举：蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂；纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯树胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等粘合剂；淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等崩解剂；硬脂酸镁、AEROSIL、滑石、十二烷基硫酸钠等润滑剂；柠檬酸、薄荷醇、甘草酸铵盐(glycyrrhizic acid ammonium salt)、甘氨酸、橙粉等芳香剂；苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯等保存剂；柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等稳定剂；甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等助悬剂；表面活性剂等分散剂；水、生理盐水、橙汁等稀释剂；可可脂、聚乙二醇、灯用煤油等基础蜡等，但并不限于这些。本发明的缀合物或其盐还可具有实现稳定性的任意修饰(例如，PEG化)。
适合口服给药的制剂为：将有效量的配体溶解于水、生理盐水、橙汁这样的稀释液而得的液体制剂；以固体或颗粒的形式包含有效量的配体的胶囊剂、香囊剂或片剂；在适当的分散介质中悬浮有有效量的有效成分的悬浮液剂；将溶解有有效量的有效成分的溶液在适当的分散介质中分散、乳化而得的乳剂等。
药物组合物适合胃肠外给药(例如，静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、局部注入、腹腔内给药)。作为这样的适合胃肠外给药的药物组合物，有水性和非水性的等渗无菌注射液剂，其中可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、等渗剂等。还可列举：水性和非水性的无菌悬浮液剂，其中可含有悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。
药物组合物的给药量根据有效成分的种类/活性、疾病的严重程度、成为给药对象的动物种类、给药对象的药物耐受性、体重、年龄等而不同，可适当设定。
实施例
接下来，给出实施例以更详细地说明本发明，但本发明并不限于以下的实施例。
实施例1：IgG1修饰用试剂的合成
(1-1)修饰试剂(1)的合成
(1-1-1)接头中间体(2)的合成
[化学式14]
将2-叠氮基-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐(4.0g、14.0mmol)溶解于CH2Cl2(23.4mL)，加入5-氨基间苯二甲酸二甲酯(977mg、4.67mmol)、DMAP(1.7g、14.0mmol)，在50℃下搅拌1小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝1/1)确认反应后，浓缩反应液。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝2/1)确认各馏分。回收包含产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(2)(1.08g、4.59mmol)。
(1-1-2)接头中间体(3)的合成
[化学式15]
将(1-1-1)中合成的接头中间体2(1.08g、4.59mmol)溶解于甲醇(23mL)，加入1MNaOH水溶液(13.8mL、13.8mmol)、THF(23mL)，在室温下搅拌2小时。通过LC/MS确认反应后，用2M HCl水溶液使反应液呈酸性。之后，用乙酸乙酯和2M HCl水溶液进行萃取，浓缩有机层，进行真空干燥，得到了接头中间体3(953.2mg、4.60mmol)。
(1-1-3)接头(4)的合成
[化学式16]
将(1-1-2)中合成的接头中间体3(200mg、0.97mmol)溶解于DMF(4.85mL)，加入五氟苯酚(893mg、4.85mmol)、PyBOP(1.0g、1.94mmol)、DIPEA(990μL、5.82mmol)、DMAP(11.9mg、0.097mmol)，在室温下搅拌2小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认反应后，用乙酸乙酯和2M HCl水溶液进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认各馏分。回收包含产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头(4)(173.4mg、0.32mmol)。
(1-1-4)肽中间体(5)的合成
[化学式17]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
依据国际公开第2018/199337号中记载的方法固相合成了由SEQ ID NO:X1的氨基酸序列构成的肽(关于肽的合成，以下同样)。将Ac-RGNCAYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:2、50.0mg、19.6μmol，其中第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)和N-琥珀酰亚胺-3-(乙酰硫代)丙酸酯(48.0mg、196μmol)溶解于DMF(1.00mL)，加入三乙胺(8.2μL、58.8μmol)，在室温下搅拌1.5小时。通过LC-MS确认反应后，在反应液中加入1.0M NH2OH、20mM EDTA(2mL)，进一步搅拌2小时。通过LC-MS确认反应后，溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，进行以十八烷基化学键合型硅胶为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水与乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各馏分。回收包含产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了肽中间体(5)(29.1mg、13.4μmol)。
MS(ESI)m/z：z＝3727.10[M+3H]3+
(1-1-5)修饰试剂(1)的合成
[化学式18]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
将(1-1-4)中合成的肽中间体(5)(29.1mg、13.4μmol)和(1-1-3)中合成的接头(4)(72.3mg、134μmol)溶解于DMF(1.00mL)，加入三乙胺(5.6μL、40.2μmol)、DMAP，在室温下搅拌1小时。通过LC-MS确认反应后，溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，进行以十八烷基化学键合型硅胶为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水与乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各馏分。回收包含产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了上述修饰试剂(1)(9.0mg、3.55μmol)。
MS(ESI)m/z：z＝3845.55[M+3H]3+
(1-2)修饰试剂(6)的合成
(1-2-1)接头中间体(7)的合成
[化学式19]
将5-甲基间苯二甲酸二甲酯(830mg、4.0mmol)溶解于乙腈(100mL)，加入NBS(783mg、4.4mmol)、过氧化苯甲酰(40mg、0.17mmol)，在90℃下搅拌20小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认反应后，浓缩反应液。溶解于己烷/乙酸乙酯＝1/1的混合溶剂中并过滤。收集晶体，进行真空干燥，得到了接头中间体(7)(630mg、2.19mmol)。
(1-2-2)接头中间体(8)的合成
[化学式20]
将叠氮化钠(204mg、3.13mmol)溶解于DMF(2.0mL)，加入(1-2-1)中合成的接头中间体(7)(300mg、1.04mmol)，在60℃下搅拌3小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认各馏分。回收包含产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(8)(268mg、1.08mmol)。
(1-2-3)接头中间体(9)的合成
[化学式21]
将(1-2-2)中合成的化合物(268mg、1.08mmol)溶解于甲醇(5.4mL)、THF(5mL)，加入1M NaOH水溶液，在室温下搅拌2小时。通过MS确认反应后，用2M HCl水溶液使其呈酸性，用乙酸乙酯和2M HCl水溶液进行萃取，浓缩有机层。进行真空干燥，得到了接头中间体(9)(227mg、1.00mmol)。
(1-2-4)接头中间体(10)的合成
[化学式22]
将(1-2-3)中合成的接头中间体(9)(227mg、1.00mmol)溶解于DMF(5.0mL)，加入五氟苯酚(920mg、5.00mmol)、PyBOP(1.3g、2.5mmol)、DIPEA(1.02mL、6.0mmol)、DMAP(12.2mg、0.1mmol)，在室温下搅拌20小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认反应后，用乙酸乙酯和1M HCl水溶液进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认各馏分。回收包含产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(10)(395.7mg、0.72mmol)。
(1-2-5)修饰试剂(6)的合成
[化学式23]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
将(1-1-4)中合成的肽中间体(5)(30.3mg、13.9μmol)和(1-2-4)中合成的接头中间体(10)(76.9mg、139μmol)溶解于DMF(1.00mL)，加入三乙胺(5.8μL、41.7μmol)、DMAP，在室温下搅拌1小时。通过LC-MS确认反应后，溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，进行以十八烷基化学键合型硅胶为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水与乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各馏分。回收包含产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了修饰试剂(6)(14.4mg、5.65μmol)。
MS(ESI)m/z：z＝3850.20[M+3H]3+
(1-3)修饰试剂(11)的合成
(1-3-1)接头中间体(12)的合成
[化学式24]
将5-甲基-1,3-苯二乙腈(5.0g、29.4mmol)溶解于1M NaOH水溶液(100mL)，加入DMF，在110℃下搅拌20小时。通过LC/MS确认反应后，浓缩反应液。用2M HCl水溶液使其呈酸性，用乙酸乙酯和2M HCl水溶液进行萃取，浓缩有机层。进行真空干燥，得到了接头中间体(12)(6.0g、28.8mmol)。
(1-3-2)接头中间体(13)的合成
[化学式25]
将(1-3-1)中合成的接头中间体(12)(6.0g、28.8mmol)溶解于甲醇，在0℃下下加入亚硫酰氯(21.4mL、288mmol)，在常温下搅拌3小时。通过LC/MS确认反应后，用乙酸乙酯和碳酸氢钠水溶液萃取，浓缩有机层，由此得到了接头中间体(13)。
(1-3-3)接头中间体(14)的合成
[化学式26]
将(1-3-2)中合成的化合物溶解于四氯化碳(28.8mL)，加入N-溴代琥珀酰亚胺(5.6g、31.6mmol)、过氧化苯甲酰(157mg、0.49mmol)，在85℃下搅拌2小时。之后，加入N-溴代琥珀酰亚胺(5.6g、31.6mmol)，在85℃下搅拌30分钟。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝3/1)确认反应后，去除晶体，通过减压下浓缩去除有机溶剂。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝3/1)确认各馏分。回收包含产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(14)(870mg、2.76mmol)。
(1-3-4)接头中间体(15)的合成
[化学式27]
将(1-3-3)中合成的接头中间体(14)(870mg、2.76mmol)溶解于DMF(5.0mL)，加入叠氮化钠(540mg、8.28mmol)，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝3/1)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层，进行真空干燥，得到了接头中间体(15)。
(1-3-5)接头中间体(16)的合成
[化学式28]
将(1-3-4)中合成的接头中间体(16)溶解于THF(3.0mL)，在0℃下加入1M NaOH水溶液(7.0mL)，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS确认反应后，用2M HCl水溶液使其呈酸性，用乙酸乙酯和2M HCl水溶液进行萃取，浓缩有机层。进行真空干燥，得到了接头中间体(16)(637.8mg、2.56mmol)。
(1-3-6)接头中间体(17)的合成
[化学式29]
将(1-3-5)中合成的接头中间体(16)(237mg、0.95mmol)溶解于DMF(4.75mL)，加入五氟苯酚(874mg、4.75mmol)、PyBOP(1.24g、2.38mmol)、DIPEA(969μL、5.70mmol)、DAMP(11.6mg、0.095mmol)，在室温下搅拌20小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝3/1)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝3/1)确认各馏分。回收包含产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(17)(300mg、0.52mmol)。
(1-3-7)修饰试剂(11)的合成
[化学式30]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
将(1-1-4)中合成的肽中间体(5)(15.0mg、6.93μmol，其中第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)和(1-3-6)中合成的接头中间体(17)(40.2mg、69.3μmol)溶解于DMF(1.00mL)，加入三乙胺(2.89μL、20.79μmol)、DMAP，在室温下搅拌1小时。通过LC-MS确认反应后，溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，进行以十八烷基化学键合型硅胶为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水与乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了修饰试剂(11)(1.44mg、0.56μmol)。
MS(ESI)m/z：z＝3854.30[M+3H]3+
(1-4)修饰试剂(18)的合成
(1-4-1)接头中间体(19)的合成
[化学式31]
使5-叠氮戊酸(800mg、5.59mmol)溶解于THF(14mL)，加入氯甲酸异丁酯(808μL、6.15mmol)、N-甲基吗啉(873μL、8.39mmol)，在0℃下搅拌30分钟后，加入溶解于1M NaOH水溶液(4mL)的肼水合物(1.36g、6.71mmol)，在室温下搅拌3小时。减压下浓缩后，加入1MNaOH水溶液，将体系内的pH调节为pH10，用乙酸乙酯洗涤后，在水层中加入1M HCl水溶液，将体系内的pH调节为3.0，加入乙酸乙酯进行洗涤，在所得的乙酸乙酯溶液中加入硫酸钠。通过过滤去除硫酸钠后，减压下浓缩，通过柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝10：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，减压浓缩，由此得到了接头中间体(19)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ6.29(d,J＝7.7Hz,1H),4.56(td,J＝8.0,4.9Hz,1H),3.32(t,J＝6.6Hz,2H),2.53-2.38(m,3H),2.36-2.16(m,3H),2.12(s,2H),1.96(dq,J＝14.7,7.6Hz,1H),1.84-1.59(m,4H),1.50(s,9H).
MS(ESI)m/z:329[M+H]+
(1-4-2)接头中间体(20)的合成
[化学式32]
使接头中间体(19)(2.41g、5.59mmol)溶解于二氯甲烷(28mL)，加入苯硫酚(627μL、6.15mmol)、苯并三唑-1-基氧基(3.49g、6.71mmol)、DIPEA(1.42mL、8.39mmol)，在室温下搅拌2小时。之后，减压下浓缩，通过柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝4：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩，得到了接头中间体(20)(2.20g、5.23mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ7.43(s,5H),6.10(d,J＝7.8Hz,1H),4.55(td,J＝7.7,4.9Hz,1H),3.31(t,J＝6.7Hz,2H),2.87-2.63(m,2H),2.28(dd,J＝8.7,5.9Hz,2H),2.16-1.98(m,1H),1.83-1.58(m,4H),1.50(s,9H),1.37-1.22(m,2H),0.91(t,J＝6.7Hz,1H).
MS(ESI)m/z:421[M+H]+
(1-4-3)接头中间体(21)的合成
[化学式33]
使接头中间体(20)(2.20g、5.23mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)，加入三氟乙酸(10mL)，在室温下搅拌1小时后，减压下浓缩去除二氯甲烷，加入水并进行冷冻干燥，由此得到了接头中间体(21)(1.98g、5.43mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ7.44(s,J＝6.3,4.6,2.4Hz,5H),6.76(s,1H),4.62(td,J＝7.5,4.9Hz,1H),3.31(t,J＝6.6Hz,2H),2.88(qt,J＝16.8,6.8Hz,2H),2.33(dt,J＝12.4,6.8Hz,3H),2.18(dq,J＝14.4,7.4Hz,1H),1.74(dq,J＝11.8,7.5,6.9Hz,2H),1.63(ddd,J＝17.7,10.5,4.8Hz,2H).
MS(ESI)m/z:365[M+H]+
(1-4-4)接头中间体(22)的合成
[化学式34]
使接头中间体(21)(100mg、0.274mmol)溶解于二氯甲烷(3mL)，加入(40.6μL、0.280mmol)、苯并三唑-1-基氧基(150mg、0.288mmol)、DIPEA(70.1μL、0.412mmol)，在室温下搅拌2小时。加入1M HCl水溶液将体系内调节为pH3，加入二氯甲烷进行稀释，用水、食盐水洗涤后，加入硫酸钠。通过过滤去除硫酸钠后，减压下浓缩，通过柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝4：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩，得到了接头中间体(22)(84.7mg、0.171mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ7.50-7.38(m,5H),6.33(d,J＝8.4Hz,1H),4.78(tdd,J＝7.8,4.6,3.0Hz,1H),3.70-3.54(m,2H),3.32(dt,J＝9.1,6.7Hz,2H),2.96-2.67(m,2H),2.30(pd,J＝7.1,4.5Hz,2H),1.85-1.60(m,6H),1.49(d,J＝2.8Hz,9H).
MS(ESI)m/z:495[M+H]+
(1-4-5)接头中间体(23)的合成
[化学式35]
使接头中间体(22)(84.7mg、0.171mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)，加入三氟乙酸(5mL)，在室温下搅拌1小时后，减压下浓缩去除二氯甲烷，加入水并进行冷冻干燥后，通过柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝10：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩，得到了接头中间体(23)(46.8mg、0.107mmol)。
1H NHR(400MHz,甲醇-d4)δ7.44(dq,J＝2.3,1.5Hz,5H),4.69-4.57(m,1H),3.79-3.67(m,2H),3.40-3.30(m,2H),2.89-2.71(m,2H),2.44-2.23(m,4H),2.08-1.95(m,1H),1.82-1.61(m,4H).
MS(ESI)m/z:439[M+H]+
(1-4-6)修饰试剂(18)的合成
[化学式36]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
将Ac-RGNCAYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:2、30.9mg、14.9μmol，其中第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于(468μL)，加入接头中间体(23)(46.8mg、0.107mmol)、WSC-HCl(29.7mg、0.155mmol)，在室温下搅拌5小时后，通过反相制备色谱法洗脱。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了上述修饰试剂(18)(15.1mg、6.02μmol)。
(1-5)修饰试剂(24)的合成
(1-5-1)接头中间体(25)的合成
[化学式37]
将3-溴-5-硝基苯甲酸叔丁酯(500mg、1.65mmol)溶解于1,4-二烷/H2O＝4/1的混合溶液(8.25mL)，加入2-乙氧羰基乙烯基硼酸频哪醇酯(447mg、1.98mmol)、Pd(dppf)Cl2(67.8mg、0.083mmol)、Na2CO3(438mg、4.13mmol)，在100℃下搅拌2小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝10/1)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝10/1)确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(25)(371.7mg、1.16mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.69(d,J＝1.8,1H),8.43(t,J＝2.0,1H),8.35(d,J＝1.6,1H),7.67(d,J＝16.0,1H),6.55(d,J＝16.0,1H),4.23(q,J＝7.1,2H),1.57(s,9H),1.36-1.22(m,3H).
(1-5-2)接头中间体(26)的合成
[化学式38]
将接头中间体(25)(371.7mg、1.16mmol)溶解于甲醇(5.8mL)、乙酸乙酯(5.0mL)，加入Pd/C(5％Pd、53％H2O)(5.0mol％)，在氢气下搅拌3小时。通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认反应后，用膜滤器过滤，浓缩滤液后，进行真空干燥，得到了接头中间体(26)(320.5mg、1.09mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.24-7.11(m,1H),6.75(t,J＝1.9,1H),4.14(q,J＝7.1,2H),2.90(t,J＝7.8,2H),2.61(t,J＝7.8,2H),1.58(s,9H),1.25(td,J＝7.1,4.5,3H).
(1-5-3)接头中间体(27)的合成
[化学式39]
将接头中间体(26)(320.5g、1.09mmol)溶解于CH2Cl2(5.45mL)，加入2-叠氮基-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐(932mg、3.27mmol)、DMAP(399mg、3.27mmol)，并搅拌1.5小时。通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝2/1)确认反应后，浓缩反应液。用己烷与乙酸乙酯的混合溶剂洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝2/1)确认。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(27)(278mg、1.18mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.60(d,J＝1.5,1H),7.50(t,J＝1.8,1H),7.02(t,J＝2.0,1H),4.14(q,J＝7.1,2H),2.98(t,J＝7.7,2H),2.64(t,J＝7.7,2H),1.60(s,10H),1.25(t,J＝7.1,4H).
(1-5-4)接头中间体(28)的合成
[化学式40]
将接头中间体(27)(278mg、1.18mmol)溶解于THF(4.35mL)，在0℃下加入1M NaOH水溶液(1.74mL)、乙醇(4mL)，在室温下搅拌1.5小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝2/1)确认反应后，在0℃下加入1M HCl水溶液(2.61mL)使其呈酸性。用乙酸乙酯和1M HCl水溶液萃取，浓缩有机层，进行真空干燥，得到了接头中间体(28)(246.6mg、0.85mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.61(d,J＝1.5,1H),7.52(t,J＝1.8,1H),7.02(t,J＝1.9,1H),3.00(t,J＝7.7,2H),2.72(t,J＝7.7,2H),1.60(s,8H).
(1-5-5)接头中间体(29)的合成
[化学式41]
将接头中间体(28)(246.6mg、0.85mmol)溶解于DMF(4.25mL)，加入苯硫醇(86.7μL、0.85mmol)、PyBOP(442mg、0.85mmol)、DIPEA(218μL、1.28mmol)，在室温下搅拌1.5小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝4/1)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝4/1)确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(29)(250.9mg、0.65mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.53(d,J＝1.6,1H),7.44(t,J＝1.8,1H),7.34(p,J＝3.6,5H),6.93(t,J＝1.9,1H),3.04-2.80(m,4H),1.53(s,10H).
(1-5-6)接头中间体(30)的合成
[化学式42]
将接头中间体(29)(250.9mg、0.65mmol)溶解于CH2Cl2/TFA＝1/1的混合溶剂(10mL)，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝4/1)确认反应后，通过减压下浓缩去除有机溶剂，进行真空干燥，得到了接头中间体(30)(215.1mg、0.66mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.74(s,1H),7.64(d,J＝1.8,1H),7.49-7.32(m,4H),7.10(d,J＝2.0,1H),3.19-2.88(m,4H).
(1-5-7)接头中间体(31)的合成
[化学式43]
将接头中间体(30)(215.1mg、0.66mmol)溶解于DMF(3.3mL)，加入2-硫烷基乙酸叔丁酯(97.8mg、0.66mmol)、PyBOP(343mg、0.66mmol)、DIPEA(168μL、0.99mmol)，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(31)(247.8mg、0.54mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.60(d,J＝1.6,1H),7.49(t,J＝1.9,1H),7.42(p,J＝3.7,4H),7.08(d,J＝1.9,1H),3.82(d,J＝3.1,2H),3.03(dd,J＝21.1,6.9,4H),1.50(s,9H).
(1-5-8)接头中间体(32)的合成
[化学式44]
将接头中间体(31)(247.8mg、0.54mmol)溶解于CH2Cl2/TFA＝1/1的混合溶剂(10mL)，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认反应后，通过减压下浓缩去除有机溶剂，进行真空干燥，得到了接头中间体(32)(227.3mg、0.56mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.70(d,J＝1.6,1H),7.42(t,J＝1.9,1H),7.41(p,J＝3.7,4H),7.01(d,J＝1.9,1H),3.67(d,J＝3.1,2H),3.20(dd,J＝21.1,6.9,4H).
MS(ESI)m/z:z＝1402.29[M+H]+
(1-5-9)修饰试剂(24)的合成
[化学式45]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
将Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2(SEQ ID NO:4、330.0mg、7.06μmol，其中第5位和第34位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)和接头中间体(32)(29mg、70.6μmol)、WSC-HCl(13.5mg、70.6μmol)溶解于DMF(1.00mL)，在室温下搅拌1小时。通过LC-MS确认反应后，溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，进行以十八烷基化学键合型硅胶为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水与乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了修饰试剂(24)(5.5mg、1.19μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3928.30[M+3H]3+
(1-6)修饰试剂(33)的合成
(1-6-1)接头中间体(34)的合成
[化学式46]
将3-碘-5-硝基苯甲酸(1.0g、3.41mmol)溶解于甲苯(17mL)，加入N,N-二甲基甲酰胺二叔丁基缩醛(5mL、20.5mmol)，在80℃下搅拌2小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝5/1)确认反应后，浓缩反应液。进行真空干燥，得到了接头中间体(34)(1.37g、3.92mmol)。
(1-6-2)接头中间体(35)的合成
[化学式47]
将接头中间体(34)(1.25g、3.58mmol)溶解于1,4-二烷/H2O＝4/1的混合溶液(18mL)，加入(E)-乙氧乙烯基-2-硼酸频哪醇酯(851mg、4.3mmol)、Pd(dppf)Cl2(146mg、0.179mmol)、Na2CO3(948mg、8.95mmol)，在100℃下搅拌3小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝10/1)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝10/1)确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(35)(415mg、1.41mmol)。
(1-6-3)接头中间体(36)的合成
[化学式48]
将接头中间体(35)(614mg、2.09mmol)溶解于THF(20mL)、1MHCl水溶液(2.0mL)，加入6M HCl水溶液(1mL)，进一步在60℃下搅拌20小时。通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝2/1)确认反应后，用乙酸乙酯和1MHCl水溶液萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝2/1)确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(36)(426.4mg、1.61mmol)。
(1-6-4)接头中间体(37)的合成
[化学式49]
将接头中间体(36)(426.4mg、1.61mmol)溶解于tBuOH(16.1mL)，加入2-甲基-2-丁烯(1.71mL、16.1mmol)、0.85M NaH2PO4水溶液(11.4mL、9.66mmol)、0.5M NaClO2水溶液(16.1mL、8.05mmol)，在常温下搅拌1.5小时。通过LC/MS确认反应后，加入1.0M NaHSO3水溶液(16.1mL、16.1mmol)终止反应。加入1M HCl水溶液调节为弱酸性，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层。进行真空干燥，得到了接头中间体(37)(591.5mg、2.10mmol)。
(1-6-5)接头中间体(38)的合成
[化学式50]
将接头中间体(37)(591.5mg、2.10mmol)溶解于DMF，加入碘甲烷(392μg、6.30mmol)、碳酸钾(319mg、2.31mmol)，搅拌1.5小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝3/1)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层。进行真空干燥，得到了接头中间体(38)(413.5mg、1.40mmol)。
(1-6-6)接头中间体(39)的合成
[化学式51]
将接头中间体(38)(413.5mg、1.40mmol)溶解于甲醇，加入Pd/C(317mg、0.07mmol)，在氢气下搅拌1小时。通过LC/MS确认反应后，用膜滤器去除Pd/C，浓缩溶剂。进行真空干燥，得到了接头中间体(39)(348.4mg、1.31mmol)。
(1-6-7)接头中间体(40)的合成
[化学式52]
将11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷酸(700mg、3.0mmol)溶解于CH2Cl2(15.0mL)，在0℃下加入三乙胺(2.09mL、15.0mmol)、五氟苯基三氟乙酸(1.02mL、6.0mmol)，在0℃下搅拌1小时。通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝2/1)确认反应后，浓缩反应液。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝2/1)确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(40)(1.4g、3.51mmol)。
(1-6-8)接头中间体(41)的合成
[化学式53]
将接头中间体(39)(348.4mg、1.31mmol)溶解于DMF(6.55mL)，加入接头中间体(40)(523mg、1.31mmol)、DIPEA(445μL、2.62mmol)、DMAP(16.0mg、0.131mmol)，在常温下搅拌1小时。通过LC/MS确认反应后，用水和乙酸乙酯萃取，浓缩有机层。进行真空干燥，得到了接头中间体(41)(429.4mg、0.89mmol)。
(1-6-9)接头中间体(42)的合成
[化学式54]
将接头中间体(41)(429.4mg、0.89mmol)溶解于THF(4.45mL)，加入1M NaOH水溶液(2.67mL、2.67mmol)，在常温下搅拌1小时。通过LC/MS确认反应后，用2M HCl水溶液调节为酸性，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层。进行真空干燥，得到了接头中间体(42)(412.5mg、0.88mmol)。
(1-6-10)接头中间体(43)的合成
[化学式55]
将接头中间体(42)(412.5mg、0.88mmol)溶解于DMF(4.40mL)，加入苯硫醇(89.7μL、0.88mmol)、PyBOP(458mg、0.88mmol)、DIPEA(226μL、1.33mmol)，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS和TLC(乙酸乙酯)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(乙酸乙酯)确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(43)(388.3mg、0.69mmol)。
(1-6-11)接头中间体(44)的合成
[化学式56]
将接头中间体(43)(388.3mg、0.69mmol)溶解于CH2Cl2/TFA＝1/1的混合溶剂，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS和TLC(乙酸乙酯)确认反应后，去除有机溶剂，进行真空干燥，得到了接头中间体(44)(382.7mg、0.76mmol)。
(1-6-12)接头中间体(45)的合成
[化学式57]
将接头中间体(44)(382.7mg、0.76mmol)溶解于DMF(3.8mL)，加入2-硫烷基乙酸叔丁酯(112.6mL、0.76mmol)、PyBOP(395mg、0.76mmol)、DIPEA(194μL、1.14mmol)，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS和TLC(乙酸乙酯)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TL(乙酸乙酯)确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(45)(350mg、0.55mmol)。
(1-6-13)接头中间体(46)的合成
[化学式58]
将接头中间体(45)(350mg、0.55mmol)溶解于CH2Cl2/TFA＝1/1的混合溶剂，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS确认反应后，去除有机溶剂，用二氯甲烷与甲醇的混合溶液洗脱，通过LC/MS确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(46)(130.8mg、0.23mmol)。
MS(ESI)m/z:z＝1 577.83[M+H]+
(1-6-14)修饰试剂(33)的合成
[化学式59]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
将Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2(SEQ ID NO:4、30.0mg、7.06μmol，其中第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)和接头中间体(46)40.7mg、70.6μmol)溶解于DMF(1.00mL)，加入WSC-HCl(13.5mg、70.6μmol)、DIPEA(3.6μL、21.2μmol)，在室温下搅拌2小时。通过LC-MS确认反应后，溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，进行以十八烷基化学键合型硅胶为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水与乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了修饰试剂(33)(4.1mg、0.85μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 802.50[M+3H]3+
(1-7)修饰试剂(47)的合成
(1-7-1)接头中间体(48)的合成
[化学式60]
使3,3’-二硫代二丙酸(608mg、2.89mmol)溶解于二氯甲烷(15mL)，加入D-脯氨酸叔丁酯盐酸盐(1.32g、6.36mmol)、WSC-HCl(1.39mg、2.72mmol)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(78.7mg、0.578mmol)、三乙胺(2.00mL、14.5mmol)，在室温下搅拌过夜。减压下浓缩，然后加入乙酸乙酯进行稀释，用水、食盐水洗涤后，加入硫酸钠。通过过滤去除硫酸钠后，减压下浓缩，通过柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压浓缩，得到了接头中间体(48)(1.06g、2.04mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ4.40(dd,J＝8.6,3.5Hz,2H),3.64-3.49(m,J＝8.5,7.9,4H),3.08-2.86(m,4H),2.77(td,J＝8.1,7.6,3.3Hz,4H),2.23-1.87(m,8H),1.68(s,2H),1.47(s,16H),1.40-1.24(m,2H),0.90(t,J＝6.6Hz,2H).
MS(ESI)m/z:517[M+H]+
(1-7-2)接头中间体(49)的合成
[化学式61]
使接头中间体(48)(1.06g、2.04mmol)溶解于DMF(5mL)，加入溶解于水(5mL)的三(2-羧乙基)膦(760mg、2.65mmol)，在室温下搅拌过夜后，用乙酸乙酯稀释反应液，用水、食盐水洗涤后，加入硫酸钠。通过过滤去除硫酸钠后，减压下浓缩，然后通过柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩，得到了接头中间体(49)(859mg、3.70mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ4.42(dd,J＝8.6,3.5Hz,1H),3.70-3.56(m,2H),3.52(dt,J＝9.6,6.9Hz,1H),2.84(pd,J＝11.1,9.7,6.0Hz,3H),2.75-2.43(m,3H),2.31-1.86(m,5H),1.86-1.64(m,3H),1.48(s,9H).
MS(ESI)m/z:260[M+H]+
(1-7-3)接头中间体(50)的合成
[化学式62]
使接头中间体(21)(52.4mg、0.144mmol)溶解于二氯甲烷(1mL)，加入接头中间体(49)(41.9mg、0.158mmol)、苯并三唑-1-基氧基(89.9mg、0.173mmol)、DIPEA(73.5μL、0.432mmol)，在室温下搅拌1小时。减压下浓缩，然后通过柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩，得到了接头中间体(50)(38.7mg、0.0639mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ7.49-7.37(m,5H),6.26(q,J＝11.3,9.5Hz,1H),4.72(tt,J＝8.1,3.9Hz,1H),4.39(dd,J＝8.6,3.3Hz,1H),3.67-3.40(m,2H),3.31(t,J＝6.6Hz,2H),3.20(dt,J＝14.4,7.1Hz,2H),2.92-2.40(m,4H),2.30(t,J＝6.9,6.2Hz,3H),1.80-1.60(m,4H),1.48(d,J＝2.1Hz,9H).
MS(ESI)m/z:606[M+H]+
(1-7-4)接头中间体(51)的合成
[化学式63]
使接头中间体(50)(38.7mg、0.0639mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)，加入三氟乙酸(5mL)，在室温下搅拌1小时后，减压下浓缩去除二氯甲烷，加入水并进行冷冻干燥，由此得到了接头中间体(51)(39.8mg、0.0639mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ7.85(s,3H),7.43(q,J＝5.8,4.9Hz,5H),6.82(s,1H),4.80-4.48(m,2H),3.78-3.40(m,2H),3.31(t,J＝6.5Hz,2H),3.19(t,J＝6.9Hz,2H),2.94-2.51(m,4H),2.41-2.22(m,4H),2.22-1.87(m,4H),1.68(dp,J＝28.1,7.3Hz,4H).
(1-7-5)接头中间体(52)的合成
[化学式64]
使接头中间体(51)(37.7mg、0.0686mmol)溶解于二氯甲烷(1mL)，加入五氟苯基三氟乙酸(23.4mg、0.137mmol)、三乙胺(28.6μL、0.206mmol)，在室温下搅拌1小时。减压下浓缩，然后通过柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩，得到了接头中间体(52)(37.4mg、0.0523mmol)。
MS(ESI)m/z:716[M+H]+
(1-7-6)修饰试剂(47)的合成
[化学式65]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
将Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2的肽(SEQ ID NO:4、22.2mg、5.23μmol，其中第5位和第35位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于DMF(374μL)，加入接头中间体(52)(37.4mg、52.3μmol)、三乙胺(2.2μL、0.0157mmol)，在室温下搅拌3小时后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了上述修饰试剂(47)(7.76mg、1.62μmmol)。
MS(ESI)m/z:z＝31595[M+3H]3+,z＝41196[M+4H]4+,z＝5957
[M+5H]5+,z＝6798[M+6H]6+
(1-8)修饰试剂(53)的合成
(1-8-1)接头中间体(54)的合成
[化学式66]
使二硫代乙醇酸(613mg、3.36mmol)溶解于二氯甲烷(17mL)，加入D-脯氨酸叔丁酯盐酸盐(1.53g、7.40mmol)、WSC-HCl(1.61mg、8.40mmol)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(91.4mg、0.672mmol)、三乙胺(2.33mL、16.8mmol)，在室温下搅拌过夜。减压下浓缩后，加入乙酸乙酯进行稀释，用水、食盐水洗涤后，加入硫酸钠。通过过滤去除硫酸钠后，减压下浓缩，通过柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压浓缩，得到了接头中间体(54)(1.09g、2.23mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ4.39(dt,J＝8.3,3.6Hz,2H),3.79-3.60(m,8H),2.35-2.14(m,2H),2.14-1.85(m,6H),1.47(s,18H).
MS(ESI)m/z:489[M+H]+
(1-8-2)接头中间体(55)的合成
[化学式67]
使接头中间体(54)(1.09g、2.23mmol)溶解于DMF(5mL)，加入溶解于水(5mL)的三(2-羧乙基)膦(831mg、2.90mmol)，在室温下搅拌过夜后，用乙酸乙酯稀释反应液，用水、食盐水洗涤后，加入硫酸钠。通过过滤去除硫酸钠后，减压下浓缩，然后通过柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩，得到了接头中间体(55)(867mg、3.53mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ4.39(ddd,J＝14.0,8.4,3.1Hz,1H),3.77-3.53(m,2H),3.39-3.24(m,2H),2.33-2.06(m,2H),2.06(m,2H),1.49(d,J＝4.5Hz,9H).
MS(ESI)m/z:246[M+H]+
(1-8-3)接头中间体(56)的合成
[化学式68]
使接头中间体(21)(264g、0.723mmol)溶解于二氯甲烷(4mL)，加入接头中间体(55)(195mg、0.795mmol)、苯并三唑-1-基氧基(452mg、0.868mmol)、DIPEA(370μL、2.17mmol)，在室温下搅拌1小时。减压下浓缩后，通过柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩，得到了接头中间体(56)(180mg、0.303mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ7.44(p,J＝3.5Hz,5H),6.52(m,1H),4.75(td,J＝8.5,4.6Hz,1H),4.42(ddd,J＝19.2,8.4,3.3Hz,1H),3.80-3.49(m,4H),3.39-3.26(m,2H),2.94-2.67(m,2H),2.39-2.27(m,2H),2.27-1.87(m,3H),1.87-1.57(m,8H),1.47(d,J＝3.2Hz,9H).
MS(ESI)m/z:592[M+H]+
(1-8-4)接头中间体(57)的合成
[化学式69]
使接头中间体(56)(180mg、0.303mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)，加入三氟乙酸(5mL)，在室温下搅拌1小时后，减压下浓缩去除二氯甲烷，加入水并进行冷冻干燥，由此得到了接头中间体(57)(172.6mg、0.322mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ7.43(q,J＝5.7,4.7Hz,5H),4.71(td,J＝8.7,4.7Hz,1H),4.53(t,J＝5.7Hz,1H),3.97-3.47(m,4H),3.32(dt,J＝12.9,6.5Hz,2H),2.82(qq,J＝15.4,7.4,6.1Hz,2H),2.44-2.00(m,8H),1.87-1.59(m,4H).
MS(ESI)m/z:536[M+H]+
(1-8-5)接头中间体(58)的合成
[化学式70]
使接头中间体(57)(172.6mg、0.322mmol)溶解于二氯甲烷(1.6mL)，加入五氟苯基三氟乙酸(110mL、0.644mmol)、三乙胺(134μL、0.966mmol)，在室温下搅拌3小时。减压下浓缩，然后通过柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：1)进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩，得到了接头中间体(58)(158.6mg、0.226mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ7.47-7.36(m,5H),6.59-6.40(m,1H),4.92-4.78(m,1H),4.73(tt,J＝7.6,3.5Hz,1H),4.01-3.62(m,4H),3.31(qd,J＝6.6,2.8Hz,2H),2.99-2.68(m,2H),2.50-2.09(m,8H),1.84-1.56(m,4H).
MS(ESI)m/z:702[M+H]+
(1-8-6)修饰试剂(53)的合成
[化学式71]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
将Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2的肽(SEQ ID NO:4、96.1mg、22.6μmol、其中第5位和第35位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于DMF(1.59mL)，加入接头中间体(58)(159mg、226μmol)、三乙胺(9.4μL、67.8μmol)，在室温下搅拌3小时后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了上述修饰试剂(53)(49.4mg、10.4μmmol)。
MS(ESI)m/z:z＝31590[M+3H]3+,z＝41193[M+4H]4+,z＝5954[M+5H]5+,z＝6795[M+6H]6+
(1-9)修饰试剂(59)的合成
[化学式72]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
将Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2的肽(SEQ ID NO:4、24.5mg、5.77μmol，其中第5位和第35位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于DMF(500μL)，以与实施例(1-7-5)的接头中间体(52)同样的方法，加入由L-脯氨酸叔丁酯盐酸盐衍生的接头中间体(60)(41.3mg、57.7μmol)、三乙胺(2.40μL、17.3mmol)，在室温下搅拌3小时后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了修饰试剂(59)(13.4mg、2.80μmmol)。
MS(ESI)m/z:z＝41196[M+4H]4+,z＝5957[M+5H]5+,z＝6798[M+6H]6+
(1-10)修饰试剂(61)的合成
[化学式73]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
将Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2的肽(SEQ ID NO:4、14.0mg、3.31μmol，其中第5位和第35位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于DMF(300mL)，以与实施例(1-8-5)的接头中间体(58)同样的方法，加入由L-脯氨酸叔丁酯盐酸盐衍生的接头中间体(62)(23.2mg、33.1μmol)、三乙胺(1.40μL、9.93μmol)，在室温下搅拌3小时后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了上述修饰试剂(61)(6.6mg、1.38μmmol)。
MS(ESI)m/z:z＝31590[M+3H]3+,z＝41193[M+4H]4+,z＝6795[M+6H]6+
(1-11)修饰试剂(63)的合成
[化学式74]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
将Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC-NH2的肽(SEQ ID NO:5、100mg、23.4μmol，其中第5位和第35位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于DMF(1002μL)，加入接头中间体(52)(50.3mg、70.2μmol)、三乙胺(9.8μL、70.2μmol)，在室温下搅拌30分钟后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了上述修饰试剂(63)(63.7mg、13.2μmmol)。
MS(ESI)m/z:z＝31603[M+3H]3+,z＝41203[M+4H]4+,z＝5963[M+5H]5+
(1-12)修饰试剂(64)的合成
[化学式75]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
将Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC-NH2的肽(SEQ ID NO:5、101mg、23.6μmol，其中第5位和第35位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于DMF(1.01mL)，加入接头中间体(58)(50.0mg、71.3μmol)、三乙胺(9.9μL、71.3μmol)，在室温下搅拌1.5小时后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了上述修饰试剂(64)(61.2mg、12.8μmmol)。
MS(ESI)m/z:z＝31599[M+3H]3+,z＝41200[M+4H]4+,z＝5960[M+5H]5+,z＝6800[M+6H]6+
(1-13)修饰试剂(65)的合成
[化学式76]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
将Ac-MQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSI(Orn)EEC-NH2(SEQ ID NO:6、30.0mg、7.08μmol，其中第3位和第32位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)和接头中间体(32)(28.4mg、70.8μmol)溶解于DMF(1.00mL)，加入WSC-HCl(13.6mg、70.8μmol)，在室温下搅拌2小时。通过LC-MS确认反应后，溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，进行以十八烷基化学键合型硅胶为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水与乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了上述肽(5.9mg、1.34μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 1098.20[M+3H]3+
(1-14)修饰试剂(66)的合成
(1-14-1)接头中间体(67)的合成
[化学式77]
将实施例(1-3-5)中合成的接头中间体(16)(400mg、1.60mmol)溶解于DMF(8.0mL)，加入苯硫醇(163μL、1.60mmol)、PyBOP(833mg、1.60mmol)、DIPEA(408μL、2.40mmol)，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS确认反应后，加入2-硫烷基乙酸叔丁酯(237mg、1.60mmol)、PyBOP(833mg、1.60mmol)、DIPEA(408μL、2.40mmol)，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS和TLC(己烷/乙酸乙酯＝3/1)确认反应后，用乙酸乙酯和水进行萃取，浓缩有机层。用己烷与乙酸乙酯的混合溶液洗脱，通过TLC(己烷/乙酸乙酯＝3/1)确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂，得到了接头中间体(67)。
(1-14-2)接头中间体(68)的合成
[化学式78]
将接头中间体(67)溶解于CH2Cl2/TFA＝1/1的混合溶剂(10.0mL)，在室温下搅拌1小时。通过LC/MS和TLC(二氯甲烷/甲醇＝10/1)确认反应后，去除有机溶剂。用二氯甲烷与甲醇的混合溶液洗脱，通过LC/MS确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除有机溶剂后，进行真空干燥，得到了接头中间体(68)(162.9mg、0.39mmol)。
1H NHR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.39(s,5H),7.23(s,2H),7.19(s,1H),4.36(s,2H),3.92(d,J＝8.5,4H),3.72(s,2H).
MS(ESI)m/z:z＝1 402.29[M+H]+
(1-14-3)修饰试剂(66)的合成
[化学式79]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
将Ac-MQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSI(Orn)EEC-NH2(SEQ ID NO:6、25.0mg、6.2μmol，其中第3位和第32位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)和接头中间体(68)(25.0mg、62.0μmol)溶解于DMF(1.00mL)，加入WSC-HCl(11.9mg、62.0μmol)，在室温下搅拌2小时。通过LC-MS确认反应后，溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，进行以十八烷基化学键合型硅胶为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水与乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各馏分。回收含有产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈后，进行冷冻干燥，得到了修饰试剂(66)(8.60mg、1.95μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝41101.70[M+3H]3+
[实施例2：使用具有亲和性物质的修饰试剂进行抗HER2抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(2-1)使用具有亲和性物质的修饰试剂进行抗HER2抗体曲妥珠单抗的修饰
(2-1-1)使用修饰试剂(1、6、11)的修饰反应
使用实施例(1-1-4)中合成的修饰试剂(1)，进行抗HER2抗体曲妥珠单抗的修饰反应。将修饰试剂(1)溶解于DMF，制成30mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药)溶解于乙酸铵缓冲液(pH5.5)，加入DMF(6.88μL、5.0mg/mL)、30mM的肽试剂(1.12μL、相对于抗体为10当量)，在37℃下搅拌1小时，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(69)。
以同样的方法使用修饰试剂(6)进行抗体修饰反应，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(70)。
以同样的方法使用修饰试剂(11)进行抗体修饰反应，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(71)。
(2-1-2)使用修饰试剂(18)的修饰反应
使用实施例(1-4-6)中合成的修饰试剂(18)，进行抗HER2抗体曲妥珠单抗的修饰反应。将修饰试剂(18)溶解于DMF，制成10mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药)溶解于乙酸铵缓冲液(pH5.5)，加入DMF(6.88μL、5.0mg/mL)、10mM的肽试剂(3.3μL、相对于抗体为10当量)，在室温下搅拌1小时，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(72)。
(2-1-3)使用修饰试剂(24、33、65、66)的修饰反应
将实施例(1-5-9)中合成的修饰试剂(24)溶解于二甲基亚砜，制成20mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药)溶解于0.1MHEPES缓冲液(pH8.0)100μL(5.0mg/mL)或200μL(2.5mg/mL)，加入20mM的肽试剂(1.69μL、相对于抗体为10当量)，在室温下搅拌1小时，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(73)。
以同样的方法使用修饰试剂(33)进行抗体修饰反应，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(74)。
以同样的方法使用修饰试剂(65)进行抗体修饰反应，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(75)。
以同样的方法使用修饰试剂(66)进行抗体修饰反应，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(76)。
(2-1-4)使用修饰试剂(47、53、59、61、63、64)的修饰反应
将实施例(1-7-6)中合成的修饰试剂(47)溶解于DMF，制成20mM。使500μg的抗HER2IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药)溶解于50mM HEPES缓冲液(pH8.2)100μL(5.0mg/mL)，加入20mM的肽试剂(1.69μL、相对于抗体为10当量)，在室温下搅拌1小时，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(77)。
以同样的方法使用修饰试剂(53)进行抗体修饰反应，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(78)。
以同样的方法使用修饰试剂(59)进行抗体修饰反应，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(79)。
以同样的方法使用修饰试剂(61)进行抗体修饰反应，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(80)。
以同样的方法使用修饰试剂(63)进行抗体修饰反应，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(81)。
以同样的方法使用修饰试剂(64)进行抗体修饰反应，得到了曲妥珠单抗-肽复合物(82)。
(2-2)基于ESI-TOFMS的分析
依据已有报道(国际公开第2019/240287号(WO2019/240287A1))进行了曲妥珠单抗-肽复合物(69)的ESI-TOFMS分析。在148222处观测到原料的曲妥珠单抗的峰。反应产物为在引入了2个修饰试剂(1)的152915处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表1。由表1的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为1.9。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为1.9)。
[表1]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
1 150568.2 1.17E+005 12.3
2 152916.7 8.34E+005 87.7
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(70)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(6)的152945处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表2。由表2的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为1.7。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为1.7)。
[表2]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
0 148219.5 1.01E+004 1.1
1 150581.7 2.52E+005 27.3
2 152944.0 6.62E+005 71.6
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(71)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(11)的152973处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表3。由表3的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为1.8。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为1.8)。
[表3]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
1 150597.2 2.12E+005 20.8
2 152972.5 8.05E+005 79.2
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(72)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(18)的153023处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表4。由表4的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为1.8。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为1.8)。
[表4]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
1 150875.3 1.22E+005 20.6
2 153021.75 4.70E+005 79.4
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(73)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(24)的157267处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表5。由表5的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为1.7。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为1.7)。
[表5]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
1 152743.1 2.19E+005 25.5
2 157267.4 6.40E+005 74.5
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(74)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(33)的157619处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表6。由表6的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为1.5。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为1.5)。
[表6]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
0 148222.7 1.40E+004 5.6
1 152921.0 1.18E+005 47.0
2 157618.7 1.19E+005 47.5
3 157618.7 1.50E+004 5.7
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(75)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(65)的161051处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表7。由表7的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为2.0。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为2.0)。
[表7]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
1 152497.4 2.43E+004 3.6
2 156772.2 6.43E+005 96.4
3 161046.8 1.03E+005 1.5
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(76)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(66)的156802处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表8。由表8的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为1.5。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为1.5)。
[表8]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
1 148218.8 1.56E+004 3.5
2 152509.0 1.72E+005 38.8
3 156799.6 2.55E+005 57.7
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(77)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(47)的157567处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表9。由表9的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为2.0。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为2.0)。
[表9]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
0 148496.65 2.33E+003 0.3
1 153047.95 1.41E+004 1.9
2 157563.95 6.70E+005 90.5
3 162405.95 5.42E+004 7.3
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(78)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(53)的157540处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表10。由表10的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为2.0。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为2.0)。
[表10]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
0 153043.55 6.37E+004 5.0
1 157538.5 1.16E+006 91.3
2 162201.65 4.68E+004 3.7
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(79)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(59)的157563处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表11。由表11的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为1.6。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为1.6)。
[表11]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
0 148223.05 1.17E+004 2.1
1 152891.95 1.98E+005 35.3
2 157559.55 3.43E+005 61.2
3 162228.2 7.86E+003 1.4
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(80)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(61)的157543处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表12。由表12的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为1.6。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为1.6)。
[表12]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
1 148384.45 1.14E+002 1.6
2 152880.25 2.56E+003 35.2
3 157537.05 4.60E+003 63.2
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(81)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(63)的152784处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表13。由表13的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为2.0。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为2.0)。
[表13]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
1 153180.75 1.26E+004 1.4
2 157781.6 8.32E+005 91.7
3 162319 6.27E+004 6.9
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(82)的ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个修饰试剂(64)的157596处确认到峰。接下来，利用DAR计算器(Agilent公司软件)进行肽/抗体结合比的确认，结果见表14。由表14的DAR峰和％面积算出的平均的肽/抗体结合比为2.0。因此，确认生成了下述结构式所表示的抗体中间体(平均的肽/抗体结合比为2.0)。
[表14]
DAR峰 观测的质量(Da) 峰面积 ％面积
1 153160.25 2.21E+003 0.2
2 157594.6 9.62E+005 96.7
3 162439.6 3.05E+004 3.0
(2-3)在还原条件下通过ESI-TOFMS确认重链选择性
依据已有报道(国际公开第2019/240287号(WO2019/240287A1))进行曲妥珠单抗-肽复合物(69)在还原条件下的ESI-TOFMS分析。对于原料的曲妥珠单抗，在50594、50755处观测到重链峰、在23439处观测到轻链峰，对于反应产物，重链确认到引入了接头的52917、53079，轻链确认到与原料相同的23439。
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(70)的ESI-TOFMS分析，对于反应产物，重链确认到引入了接头的52956、53118，轻链确认到与原料相同的23439。
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(71)的ESI-TOFMS分析，对于反应产物，重链确认到引入了接头的52971、53133，轻链确认到与原料相同的23439。
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(72)的ESI-TOFMS分析，对于反应产物，重链确认到引入了接头的52996、53157，轻链确认到与原料相同的23439。
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(73)的ESI-TOFMS分析，对于反应产物，重链确认到引入了接头的55091、55253，轻链确认到与原料相同的23439。
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(75)的ESI-TOFMS分析，对于反应产物，重链确认到引入了接头的54849、55010，轻链确认到与原料相同的23439。
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(76)的ESI-TOFMS分析，对于反应产物，重链确认到引入了接头的54888、55050，轻链确认到与原料相同的23439。
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(77)的ESI-TOFMS分析，对于反应产物，重链确认到引入了接头的55268、55430，轻链确认到与原料相同的23439。
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(78)的ESI-TOFMS分析，对于反应产物，重链确认到引入了接头的55254、55416，轻链确认到与原料相同的23439。
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(81)的ESI-TOFMS分析，对于反应产物，重链确认到引入了接头的55296、55458，轻链确认到与原料相同的23439。
同样地进行曲妥珠单抗-肽复合物(82)的ESI-TOFMS分析，对于反应产物，重链确认到引入了接头的55281、55443，轻链确认到与原料相同的23439。
[实施例3：曲妥珠单抗-亲和性物质复合物的接头切割反应及其基于ESI-TOFMS的分析]
(3-1)曲妥珠单抗-亲和性物质复合物的接头切割反应
使用曲妥珠单抗-肽复合物(69)，依据已有报道(国际公开第2019/240287号(WO2019/240287A1))，使用羟胺盐酸盐进行接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(83)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(70)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(84)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(71)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(85)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(72)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(86)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(73)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(87)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(74)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(88)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(75)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(87)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(76)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(89)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(77)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(90)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(78)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(90)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(79)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(90)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(80)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(90)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(81)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(90)。
以同样的方法使用羟胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(82)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(90)。
以同样的方法使用甲氧胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(72)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(91)。
以同样的方法使用甲氧胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(77)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(92)。
以同样的方法使用甲氧胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(78)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(92)。
以同样的方法使用甲氧胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(79)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(92)。
以同样的方法使用甲氧胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(80)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(92)。
以同样的方法使用甲氧胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(81)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(92)。
以同样的方法使用甲氧胺盐酸盐进行曲妥珠单抗-肽复合物(82)的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体(92)。
(3-2)基于ESI-TOFMS的分析
依据已有报道(国际公开第2019/240287号(WO2019/240287A1))进行引入有叠氮基的抗体(84)的ESI-TOFMS分析，在接头被切割的148657处确认到峰。
同样地进行引入有叠氮基的抗体(85)的ESI-TOFMS分析，在接头被切割的148712处确认到峰。
同样地进行引入有叠氮基的抗体(86)的ESI-TOFMS分析，在接头切割已进行的148755处确认到峰。
同样地进行引入有叠氮基的抗体(87)的ESI-TOFMS分析，在接头切割已进行的148679处确认到峰。
同样地进行引入有叠氮基的抗体(89)的ESI-TOFMS分析，在接头切割已进行的148706处确认到峰。
同样地进行引入有叠氮基的抗体(90)的ESI-TOFMS分析，在接头切割已进行的148775处确认到峰。
同样地进行引入有叠氮基的抗体(91)的ESI-TOFMS分析，在接头切割已进行的148779处确认到峰。
同样地进行引入有叠氮基的抗体(92)的ESI-TOFMS分析，在接头切割已进行的148790处确认到峰。
[实施例4：曲妥珠单抗的位点特异性叠氮基引入体与任意化合物的缀合和产物的ESI-TOFMS分析]
(4-1)引入有叠氮基的抗体与荧光物质的缀合
依据已有报道(国际公开第2019/240287号(WO2019/240287A1)和国际公开第2019/240288号(WO2019/240288A1))，向引入有叠氮基的抗体(83)中加入羧基罗丹明110-PEG4-DBCO(Broadpharm公司制造)，得到了ADC模拟物(ADC mimic)(93)。
以同样的方法由引入有叠氮基的抗体(84)得到了ADC模拟物(94)。
以同样的方法由引入有叠氮基的抗体(85)得到了ADC模拟物(95)。
以同样的方法由引入有叠氮基的抗体(86)得到了ADC模拟物(96)。
以同样的方法由引入有叠氮基的抗体(87)得到了ADC模拟物(97)。
以同样的方法由引入有叠氮基的抗体(88)得到了ADC模拟物(98)。
以同样的方法由引入有叠氮基的抗体(89)得到了ADC模拟物(99)。
以同样的方法由引入有叠氮基的抗体(90)得到了ADC模拟物(100)。
以同样的方法由引入有叠氮基的抗体(91)得到了ADC模拟物(101)。
以同样的方法由引入有叠氮基的抗体(92)得到了ADC模拟物(102)。
以同样的方法，得到了使DBCO-MMAE(Abzena公司制造)与引入有叠氮基的抗体(83)反应而得的ADC(103)。
以同样的方法，得到了使DBCO-MMAE(Abzena公司制造)与引入有叠氮基的抗体(86)反应而得的ADC(104)。
以同样的方法，得到了使DBCO-MMAE(Abzena公司制造)与引入有叠氮基的抗体(91)反应而得的ADC(105)。
根据以上所述确认到：本发明的化合物或其盐可用于制作DAR优异的抗体药物复合物。
(参考例1)修饰试剂(106)的合成和诱导成ADC模拟物(107)
修饰试剂(106)如下合成，依据实施例2与抗HER2抗体曲妥珠单抗反应后，依据实施例3切割接头，依据实施例4与羧基罗丹明110-PEG4-DBCO(Broadpharm公司制造)反应，得到了ADC模拟物(107)。
[化学式80]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
(参考例2)修饰试剂(108)的合成和诱导成ADC模拟物(109)
修饰试剂(108)如下合成，依据实施例2与抗HER2抗体曲妥珠单抗反应后，依据实施例3切割接头，依据实施例4与羧基罗丹明110-PEG4-DBCO(Broadpharm公司制造)反应，得到了ADC模拟物(109)。
[化学式81]
上述氨基酸序列均为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
(参考例3)使用叠氮基抗体(111)的修饰反应及其分析
依据实施例4，使已有报道(国际公开第2019/240287号(WO2019/240287A1))中记载的下述的叠氮基抗体(111)与羧基罗丹明110-PEG4-DBCO(Broadpharm公司制造)反应，得到了ADC模拟物(112)。另外，同样地使其与DBCO-MMAE(Abzena公司制造)反应，得到了ADC(113)。
[化学式82]
[实施例5：通过使用大鼠血浆的稳定性试验评价ADC模拟物]
如下所述，对在大鼠血液中孵育ADC模拟物时从ADC模拟物脱落的荧光分子的量进行分析，由此评价各种ADC模拟物的血液中稳定性。
(5-1)血浆中稳定性试验
向700μL大鼠血浆(Charles River公司制造)中加入ADC模拟物使浓度为0.1mg/mL，之后进行灭菌过滤。向6支微型离心管中分别注入各50μL的该溶液。6支样本中的3支在设定为37℃的恒温箱中保管4天。剩下的3支在-80℃的冷库中同样地保管4天。向各样本中分别加入100μL乙腈，经涡旋搅拌后进行离心，由此得到了沉淀物。回收所产生的上清液，进行HPLC分析。
(5-2)采用HPLC分析对脱落的荧光分子的量进行分析
测定是利用液相色谱法/荧光检测法，测定从ADC模拟物脱落的荧光分子的量。以实施例5-1中冷库保管的3支样本作为第0天的样本，以实施例5-1中37℃保管的3支样本作为第4天的样本，分析第4天与第0天的荧光强度的差值。
结果如下表所示，进行评价。使用实施例16(1)中合成的ADC模拟物作为对照，通过比较实施例化合物的荧光强度，利用下述式算出上升量之比。上升量之比越低，则表示血浆中稳定性越高。
从实施例ADC模拟物脱落的荧光分子的荧光强度的上升量＝[(第4天的荧光强度)-(第0天的荧光强度)]
从对照ADC模拟物脱落的荧光分子的荧光强度的上升量＝[(第4天的荧光强度)-(第0天的荧光强度)]
另外使用羧基罗丹明110-PEG4-DBCO，算出基于HPLC的荧光强度的区域面积与浓度的相关性。利用该算式将上述各ADC模拟物的荧光强度的上升量转换为浓度。将第0天的浓度设为100％时的所述上升量的浓度的比例作为脱落率算出。
[表15]
表15.使用ADC模拟物的血浆中稳定性试验结果(其一)
[表1 6]
表16.使用ADC模拟物的血浆中稳定性试验结果(其二)
[表17]
表17.使用ADC模拟物的血浆中稳定性试验结果(其三)
比较例1(107)、比较例2(109)不符合M(将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子用由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团)。这是由于比较例1、2不是用由3～5个碳原子连接，而是用由2个碳原子构成的主链部分(比较例1)、用由2个碳原子和1个氮原子构成的主链部分(比较例2)连接。
其结果，实施例3中合成的ADC模拟物稳定。比较例1、2中合成的ADC模拟物的结果为不稳定(表15～17)。
[实施例6：通过使用大鼠血浆的稳定性试验评价ADC]
各种ADC的血液中稳定性依据实施例5来进行。
(6-1)血浆中稳定性试验
使用大鼠血浆，与实施例5-1同样地，对实施例4-1和比较例2中合成的ADC进行孵育，对各自的ADC准备了冷库保管的3支样本和37℃保管的3支样本。
(6-2)使用HPLC分析对脱落的有效载荷(payload)的量进行分析
测定是使用液相色谱-质谱分析法(包括串联质谱分析法)，测定脱落的有效载荷量。以实施例6-1中冷库保管的3支样本作为第0天的样本，以实施例6-1中37℃保管的3支样本作为第4天的样本，通过提取离子色谱图分别算出在第4天和第0天时检测到的有效载荷的MS强度，并分析了它们的差值。
与已有报道(国际公开第2019/240287号(WO2019/240287A1))中记载的由叠氮基抗体(109)合成的ADC(112)相比，实施例4中合成的ADC(103)～(105)稳定，与实施例5的ADC模拟物的比较研究结果相同。
[实施例6：引入有叠氮基的抗体的位点选择性的确认]
通过下述工序对(4-1)中得到的曲妥珠单抗的叠氮基引入体进行了肽图谱分析。
(6-1)曲妥珠单抗的叠氮基引入体(86)的肽图谱分析
依据已有报道(国际公开第2019/240288号(WO2019/240288A))，实施了曲妥珠单抗的叠氮基引入体(86)的肽图谱分析。利用LC-MS/MS进行分析的结果，通过曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化，观测到由包括对赖氨酸残基的叠氮基修饰的33个氨基酸残基构成的肽，即THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR的肽片段。另外，通过用BioPharma Finder进行分析显示出：高选择性地对EU编号中的246位或248位的赖氨酸残基进行修饰。
由该结果可知，上述(4-1)中得到的曲妥珠单抗的叠氮基引入体(86)中，在抗体的重链上位点选择性地与EU编号中的Lys246和Lys248进行缀合。
(6-2)曲妥珠单抗的叠氮基引入体(91)的肽图谱分析
与(6-1)同样地进行操作，实施了(4-1)中得到的曲妥珠单抗的叠氮基引入体(91)的肽图谱分析。利用LC-MS/MS进行分析的结果，通过曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化，观测到由包括对赖氨酸残基的叠氮基修饰的33个氨基酸残基构成的肽，即THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR的肽片段。另外，通过用BioPharma Finder进行分析显示出：高选择性地对EU编号中的246位或248位的赖氨酸残基进行修饰。
(6-3)曲妥珠单抗的叠氮基引入体(90)的肽图谱分析
依据已有报道(国际公开第2019/240288号(WO2019/240288A)，实施了曲妥珠单抗的叠氮基引入体(90)的肽图谱分析。利用LC-MS/MS进行分析的结果，通过曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化，观测到由包括对赖氨酸残基的叠氮基修饰的18个氨基酸残基构成的肽，即FNWYVDGVEVHNAKTKPR的肽片段。另外，通过用BioPharma Finder进行分析显示出：高选择性地对EU编号中的288位或290位的赖氨酸残基进行修饰。
由该结果可知，上述(4-1)中得到的曲妥珠单抗的叠氮基引入体(90)中，在抗体的重链上位点选择性地与EU编号中的Lys288和Lys290进行缀合。
(6-4)曲妥珠单抗的叠氮基引入体(92)的肽图谱分析
与(6-1)同样地进行操作，实施了(4-1)中得到的曲妥珠单抗的叠氮基引入体(92)的肽图谱分析。利用LC-MS/MS进行分析的结果，通过曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化，观测到由包括对赖氨酸残基的叠氮基修饰的18个氨基酸残基构成的肽，即FNWYVDGVEVHNAKTKPR的肽片段。另外，通过用BioPharma Finder进行分析显示出：高选择性地对EU编号中的288位或290位的赖氨酸残基进行修饰。
由该结果可知，上述(4-1)中得到的曲妥珠单抗的叠氮基引入体(92)中，在抗体的重链上位点选择性地与EU编号中的Lys288和Lys290进行缀合。
实施例7：IgG1 Fc亲和性肽试剂对IgG1 Fc的多个不同靶区的位点选择性修饰和抗体药物复合物的合成
(7-1)抗HER2抗体曲妥珠单抗的位点选择性修饰之后，通过切割硫酯基来制造引入有叠氮基的抗体衍生物
将实施例(3-1)中合成的引入有叠氮基的抗体(91)置换成50mM的HEPES缓冲液(pH8.2)。向该溶液中加入相对于抗体为10当量的实施例(1-14)中合成的修饰试剂(64)，在室温下搅拌3小时。将反应液置换成20mM乙酸铵缓冲液。针对所得的抗体，通过ESI-TOFMS测定质量时，确认到对(3-1)中合成的引入有叠氮基的抗体引入了2个结合性肽的158,319的峰。
由该结果确认到：本实施例(7-1)中得到的抗体在抗体的2个重链上包含EU编号中的246位或248位的赖氨酸残基和288位或290位的赖氨酸残基的修饰。
(7-2)抗HER2抗体曲妥珠单抗的位点选择性修饰之后，通过切割硫酯基来制造引入有叠氮基的抗体衍生物
按照实施例(3-1)的方法，使用甲氧胺盐酸盐进行实施例(7-1)中得到的抗体-肽复合物的接头切割反应，得到了引入有叠氮基的抗体。对所得的叠氮基抗体进行ESI-TOFMS分析，进行接头切割，在对抗体引入了4个叠氮基的149,350处确认到峰。
由该结果确认到：本实施例(7-2)中得到的抗体在抗体的2个重链上包含引入至EU编号中的246位或248位的赖氨酸残基和288位或290位的赖氨酸残基的侧链的4个叠氮基(叠氮基/抗体结合比＝4)。
(7-3)DAR＝4的ADC合成
按照与实施例(4-1)同样的方法，使实施例(7-2)中得到的引入有叠氮基的抗体与DBCO-MMAE(Abzena公司制造)反应，得到了ADC。
因此，确认了本实施例(7-2)中得到的抗体在抗体的2个重链上包含引入至EU编号中的246位或248位的赖氨酸残基和288位或290位的赖氨酸残基的侧链的四个药物(DAR＝4)。
<110> 味之素株式会社
<120> 化合物或其盐、以及由它们得到的抗体
<130> AM-R040265
<150> JP2021-039706
<151> 2021-03-11
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对人IgG的Fc区具有亲和力的肽。N末端的氨基酸残基可被乙酰化，C末端的氨基酸残基可被胺化，并且两个半胱氨酸残基可通过二硫桥连接。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 不存在，或除赖氨酸和半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 不存在，或除赖氨酸和半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 不存在，或除赖氨酸和半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或苯丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 酪氨酸、色氨酸、组氨酸或苯丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸或甘氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 赖氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或精氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或组氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> 不存在，或除赖氨酸和半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> 不存在，或除赖氨酸和半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> 不存在，或除赖氨酸和半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ile Trp Cys Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和性肽
<400> 2
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr
1 5 10 15
His
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和性肽
<400> 3
Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile
1 5 10 15
<210> 4
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和性肽
<400> 4
Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro
1 5 10 15
Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Asp
20 25 30
Asp Cys
<210> 5
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和性肽
<400> 5
Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro
1 5 10 15
Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Glu
20 25 30
Glu Cys
<210> 6
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和性肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> 鸟氨酸
<400> 6
Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu
1 5 10 15
Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Xaa Glu Glu Cys
20 25 30

Claims (49)

1.下述式(I)所表示的化合物或其盐：
式(I)中，
X表示离去基团，
Y表示在包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团。
2.权利要求1所述的化合物或其盐，其中，离去基团选自下述基团：
(a)R-S，在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，S表示硫原子；
(b)R-O，在此，R表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，O表示氧原子；或
(c)RA-(RB-)N，在此，RA和RB分别独立地表示氢原子、可具有取代基的一价烃基或可具有取代基的一价杂环基，N表示氮原子；或
(d)卤原子。
3.权利要求1或2所述的化合物或其盐，其中，所述免疫球蛋白单元为人免疫球蛋白单元。
4.权利要求1～3中任一项所述的化合物或其盐，其中，所述免疫球蛋白单元为人IgG。
5.权利要求1～4中任一项所述的化合物或其盐，其中，M中的由3～5个碳原子构成的主链部分是包含直链亚烷基、或成环碳原子、或者它们的组合的部分。
6.权利要求1～5中任一项所述的化合物或其盐，其中，La所相邻的羰基与亲和性肽中的赖氨酸残基的侧链中的氨基形成酰胺键。
7.权利要求1～6中任一项所述的化合物或其盐，其中，所述亲和性肽包含下述(A)的氨基酸序列：
(A)(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:1)
在此，
(X0-3)a不存在或为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基之外)，
(X0-3)b不存在或为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基之外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基或组氨酸残基。
8.权利要求7所述的化合物或其盐，其中，包含所述(A)的氨基酸序列的亲和性肽含有下述(1)的氨基酸序列：
(1)RGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:2)。
9.权利要求1～6中任一项所述的化合物或其盐，其中，所述亲和性肽包含下述(B)的氨基酸序列：
(B)PNLNEEQRNARIRSI(SEQ ID NO:3)。
10.权利要求9所述的化合物或其盐，其中，包含所述(B)的氨基酸序列的亲和性肽含有选自下述(1)～(3)的氨基酸序列：
(1)FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:4)；
(2)FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC(SEQ ID NO:5)；或
(3)MQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSI(Orn)EEC(SEQ ID NO:6)。
11.权利要求7～10中任一项所述的化合物或其盐，其中，所述亲和性肽中的N末端和C末端氨基酸残基可被保护，且
所述亲和性肽中的2个半胱氨酸残基(C)的侧链中的2个硫醇基可通过二硫键或经由接头连接。
12.抗体衍生用试剂，其包含下述式(I)所表示的化合物或其盐：
式(I)中，
X表示离去基团，
Y表示在包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团。
13.下述式(I’)所表示的化合物或其盐：
式(I’)中，
X表示离去基团，
X’表示离去能力高于离去基团X的离去基团，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团。
14.权利要求13所述的化合物或其盐，其中，离去能力高于离去基团X的离去基团为五氟苯氧基、四氟苯氧基、对硝基苯氧基或N-琥珀酰亚氨氧基。
15.下述式(I”)所表示的化合物或其盐：
式(I”)中，
X表示离去基团，
OH表示羟基，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团。
16.抗体中间体或其盐，其包含下述式(II)所表示的结构单元：
式(II)中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与Ig所相邻的羰基形成酰胺键，
Y表示在所述免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0。
17.权利要求16所述的抗体中间体或其盐，其中，抗体为人抗体。
18.权利要求16或17所述的抗体中间体或其盐，其中，抗体为人IgG。
19.权利要求16～18中任一项所述的抗体中间体或其盐，其中，所述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个以上的位点。
20.权利要求16～19中任一项所述的抗体中间体或其盐，其中，所述平均比率r为1.5～2.5。
21.权利要求19或20所述的抗体中间体或其盐，其中，所述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的2个位点。
22.权利要求21所述的抗体中间体或其盐，其中，所述2个位点为246/248位和288/290位。
23.引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其包含下述式(III)所表示的结构单元：
式(III)中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与Ig所相邻的羰基形成酰胺键，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
T表示一价基团，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
Lb表示键或二价基团，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0。
24.权利要求23所述的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，由T表示的一价基团为可被取代的羟基氨基。
25.权利要求23或24所述的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，抗体为人抗体。
26.权利要求23～25中任一项所述的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，抗体为人IgG。
27.权利要求23～26中任一项所述的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，M中的由3～5个碳原子构成的主链部分是包含直链亚烷基、或成环碳原子、或者它们的组合的部分。
28.权利要求23～27中任一项所述的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，所述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个以上的位点。
29.权利要求23～28中任一项所述的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，所述赖氨酸残基对依据EU编号的人IgG重链的246/248位的赖氨酸残基具有位点选择性。
30.权利要求23～28中任一项所述的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，所述赖氨酸残基对依据EU编号的人IgG重链的288/290位的赖氨酸残基具有位点选择性。
31.权利要求23～30中任一项所述的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，所述平均比率r为1.5～2.5。
32.权利要求28～31中任一项所述的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，所述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的2个位点。
33.权利要求32所述的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，其中，所述2个位点为246/248位和288/290位。
34.抗体和功能性物质的缀合物或其盐，其包含下述式(IV)所表示的结构单元：
式(IV)中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与Ig所相邻的羰基形成酰胺键，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
T表示一价基团，
W表示氧原子或硫原子，
N表示氮原子，
Lb表示键或二价基团，
Z表示功能性物质，
L表示键或二价基团，
环A表示与三唑环稠合的环，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0。
35.权利要求34所述的缀合物或其盐，其中，抗体为人抗体。
36.权利要求34或35所述的缀合物或其盐，其中，抗体为人IgG。
37.权利要求34～36中任一项所述的缀合物或其盐，其中，M中的由3～5个碳原子构成的主链部分是包含直链亚烷基、或成环碳原子、或者它们的组合的部分。
38.权利要求34～37中任一项所述的缀合物或其盐，其中，所述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的1个以上的位点。
39.权利要求34～37中任一项所述的缀合物或其盐，其中，所述赖氨酸残基对依据EU编号的人IgG重链的246/248位的赖氨酸残基具有位点选择性。
40.权利要求34～37中任一项所述的缀合物或其盐，其中，所述赖氨酸残基对依据EU编号的人IgG重链的288/290位的赖氨酸残基具有位点选择性。
41.权利要求34～40中任一项所述的缀合物或其盐，其中，所述平均比率r为1.5～2.5。
42.权利要求38～41中任一项所述的缀合物或其盐，其中，所述赖氨酸残基存在于依据EU编号的选自人IgG重链的246/248位、288/290位和317位的2个位点。
43.权利要求42所述的缀合物或其盐，其中，所述2个位点为246/248位和288/290位。
44.抗体中间体或其盐的制造方法，所述方法包括：使下述式(I)所表示的化合物或其盐与包含免疫球蛋白单元的抗体反应，生成包含下述式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐：
式(I)中，
X表示离去基团，
Y表示在包含2个重链和2个轻链的所述免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团；
式(II)中，
Ig表示所述免疫球蛋白单元，
Y、M、O、S、W、N3、La和Lb与所述式(I)中的定义相同，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0。
45.引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐的制造方法，所述方法包括：
(1)使下述式(I)所表示的化合物或其盐与包含免疫球蛋白单元的抗体反应，生成包含下述式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐，
式(I)中，
X表示离去基团，
Y表示在包含2个重链和2个轻链的所述免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团；
式(II)中，
Ig表示所述免疫球蛋白单元，
Y、M、O、S、W、N3、La和Lb与所述式(I)中的定义相同，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0；以及
(2)将所述抗体中间体或其盐供于硫酯的切割反应，生成包含下述式(III)所表示的结构单元的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，
式(III)中，
T表示一价基团，
Ig、M、O、W、N3、Lb和r与所述式(II)中的定义相同。
46.抗体和功能性物质的缀合物或其盐的制造方法，所述方法包括：
(1)使下述式(I)所表示的化合物或其盐与包含免疫球蛋白单元的抗体反应，生成包含下述式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐，
式(I)中，
X表示离去基团，
Y表示在包含2个重链和2个轻链的所述免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团；
式(II)中，
Ig表示所述免疫球蛋白单元，
Y、M、O、S、W、N3、La和Lb与所述式(I)中的定义相同，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0；以及
(2)将所述抗体中间体或其盐供于硫酯的切割反应，生成包含下述式(III)所表示的结构单元的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，
式(III)中，
T表示一价基团，
Ig、M、O、W、N3、Lb和r与所述式(II)中的定义相同；以及
(3)使所述引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐与下述式(V)所表示的目标物质反应，生成包含下述式(IV)所表示的结构单元的抗体和功能性物质的缀合物或其盐，
式(V)中，
环A’表示具有碳碳三键的环，
Z表示功能性物质，
L表示键或二价基团；
式(IV)中，
环A表示与三唑环稠合的环，
N表示氮原子，
Ig、M、O、T、W、Lb和r与所述式(III)中的定义相同，
Z和L与所述式(V)中的定义相同。
47.引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐的制造方法，所述方法包括：
将包含下述式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐供于硫酯的切割反应，生成包含下述式(III)所表示的结构单元的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，
式(II)中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与Ig所相邻的羰基形成酰胺键，
Y表示在所述免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0；
式(III)中，
T表示一价基团，
Ig、M、O、W、N3、Lb和r与所述式(II)中的定义相同。
48.抗体和功能性物质的缀合物或其盐的制造方法，所述方法包括：
(1)将包含下述式(II)所表示的结构单元的抗体中间体或其盐供于硫酯的切割反应，生成包含下述式(III)所表示的结构单元的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐，
式(II)中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与Ig所相邻的羰基形成酰胺键，
Y表示在所述免疫球蛋白单元中的CH2结构域处具有结合区的亲和性肽，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
S表示硫原子，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
La表示键或二价基团，
Lb表示键或二价基团，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0；
式(III)中，
T表示一价基团，
Ig、M、O、W、N3、Lb和r与所述式(II)中的定义相同；以及
(2)使所述引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐与下述式(V)所表示的目标物质反应，生成包含下述式(IV)所表示的结构单元的抗体和功能性物质的缀合物或其盐，
式(V)中，
环A’表示具有碳碳三键的环，
Z表示功能性物质，
L表示键或二价基团；
式(IV)中，
环A表示与三唑环稠合的环，
N表示氮原子，
Ig、M、O、T、W、Lb和r与所述式(III)中的定义相同，
Z和L与所述式(V)中的定义相同。
49.抗体和功能性物质的缀合物或其盐的制造方法，所述方法包括：
使包含下述式(III)所表示的结构单元的引入有叠氮基的抗体衍生物或其盐与下述式(V)所表示的目标物质反应，生成包含下述式(IV)所表示的结构单元的抗体和功能性物质的缀合物或其盐，
式(III)中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与Ig所相邻的羰基形成酰胺键，
M表示将与M相邻的C＝O中的碳原子和C＝W中的碳原子通过由3～5个碳原子构成的主链部分连接的三价基团，
O表示氧原子，
T表示一价基团，
W表示氧原子或硫原子，
N3表示叠氮基，
Lb表示键或二价基团，
每2个重链的所述酰胺键的平均比率r为1.0～3.0；
式(V)中，
环A’表示具有碳碳三键的环，
Z表示功能性物质，
L表示键或二价基团；
式(IV)中，
环A表示与三唑环稠合的环，
N表示氮原子，
Ig、M、O、T、W、Lb和r与所述式(III)中的定义相同，
Z和L与所述式(V)中的定义相同。
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