CN116949024A - 一种苯丙氨酸解氨酶突变体及其在合成（s）-2-氯-苯丙氨酸中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苯丙氨酸解氨酶突变体及其在合成(S)‑2‑氯‑苯丙氨酸中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明的苯丙氨酸解氨酶突变体通过将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第240位组氨酸突变为苯丙氨酸，或第80位亮氨酸突变为缬氨酸得到，在不添加任何助溶剂的体系中催化底物生成(S)‑2‑氯‑苯丙氨酸，可以大幅度减轻底物和产物抑制效应，转化率高达61.2％或92％。

Description

一种苯丙氨酸解氨酶突变体及其在合成(S)-2-氯-苯丙氨酸 中的应用

技术领域

本发明涉及一种苯丙氨酸解氨酶突变体及其在合成(S)-2-氯-苯丙氨酸中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

L-苯丙氨酸作为人体必需氨基酸之一，常用作营养强化剂、氨基酸输液和复合氨基酸制剂的成分，在食品行业中可作为添加剂阿斯巴甜的合成原料，在医药行业中则可以用来合成左旋多巴(L-DOPA)和肾上腺素等药物。对映异构体富集的苯丙氨酸化合物是上述药物制品的重要中间体，其中，(S)-2-氯-苯丙氨酸是治疗高血压(hypertension)的血管紧张素I转化酶抑制剂(ACE)的主要生产原料。

WO2006/069799A1公开了一种制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物的工艺，在其中一个实施例中，使用源自Rhodotorula glutinis的苯丙氨酸解氨酶将2-Cl-肉桂酸于氨水中进行反应，以制备(S)-2-氯-苯丙氨酸。该工艺的缺点是发生强烈的底物和产物抑制，因此需要在低浓度下进行。如有大规模制备产物的需求，则需要更大的体积或更复杂的补料方案，从工业生产的角度来看该工艺缺乏竞争力。

CN101517089A公开了一种制备苯丙氨酸类化合物的改进工艺，所使用的苯丙氨酸解氨酶源自Idiomarina loihiensis，用以催化相应的肉桂酸类化合物与氨基供体进行反应，该方法使底物抑制得到了有效降低，且与来源于R.glutinis的苯丙氨酸解氨酶相比具有更高的活性。然而在实际生产过程中，来源于I.loihiensis的苯丙氨酸解氨酶催化活性仍较低，无法达到工业生产的要求。

CN106755160A公开了一种制备苯丙氨酸类化合物的改进工艺，所使用的组氨酸解氨酶源自Pseudoalteromonas sp.P1-26，用于生产L-苯丙氨酸化合物，该方法与上述工艺相比，能够降低生产成本，提高生产效率。使用该方法进行生产，虽然产率与前述两种方法比较有了一定的提升，但筛选得到的组氨酸解氨酶对于底物的选择有限，在生产中所需的酶量也过高，不利于大规模推广。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种催化活性升高，底物和产物抑制降低且底物谱较广的苯丙氨酸解氨酶突变体，该突变体将出发氨基酸第240位组氨酸突变为苯丙氨酸，或将第80位亮氨酸突变为缬氨酸，相对野生型苯丙氨酸解氨酶，对底物的转化率分别达到61.2％、92％，而野生型苯丙氨酸解氨酶的底物转化率仅有33.4％，因此本发明的苯丙氨酸解氨酶突变体在催化过程中表现良好，具有工业应用价值。

本发明的第一个目的是提供一种苯丙氨酸解氨酶突变体，所述苯丙氨酸解氨酶突变体是通过将如SEQ ID NO.1所示苯丙氨酸解氨酶氨基酸序列的第240位组氨酸突变为苯丙氨酸得到，或第80位亮氨酸突变为缬氨酸得到。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述苯丙氨酸解氨酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组质粒。

进一步地，所述重组质粒的载体为pET-28a(+)质粒、pET-28b(+)质粒或pET-20b(+)质粒。

本发明的第四个目的是提供一种携带所述基因或所述重组质粒的宿主细胞。

进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。

本发明的第五个目的是提供所述苯丙氨酸解氨酶突变体的制备方法，所述方法包括以下步骤：将上述重组细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体；将菌体进行破碎后离心，获得细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液进行提取，获得所述苯丙氨酸解氨酶突变体。

本发明的第六个目的是提供一种(S)-2-氯-苯丙氨酸的制备方法，包括采用所述苯丙氨酸解氨酶突变体或含有该突变体的表达系统进行催化转化的步骤。

进一步地，所述反应体系在氨水中进行。

进一步地，所述反应的温度为30～40℃，pH值为9.0～10.5。

本发明的有益效果：

本发明在来自微生物Idiomarina abyssalis的苯丙氨酸解氨酶基础上，通过定点突变技术改造苯丙氨酸解氨酶分子结构最终获得了催化活性升高，催化底物范围增加的苯丙氨酸解氨酶突变体。与其他制备(S)-2-氯-苯丙氨酸的生物催化剂相比，本发明提供的苯丙氨酸解氨酶突变体能够催化高浓度底物，拥有更高的催化活性和更广的底物范围，且大幅度降低底物和产物抑制作用，因此在生产制备(S)-2-氯-苯丙氨酸中有极高的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为本领域常规室温，室温范围是20～40℃。

表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。E.coli DH5α感受态细胞、E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和DNA Marker均购自北京天根生化科技有限公司。限制性核酸内切酶NdeI和XhoI购自大连宝生物有限公司。

实施例1：苯丙氨酸解氨酶野生型基因的克隆

根据Genbank收录的预测为Idiomarina abyssalis基因序列(Genebank登录号：WP_054488769.1)为依据，设计PCR引物如下：

上游引物：

5'-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGACAACTTCAATTATAGCTTTTGGG-3'

下游引物：

5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCCGGCTCTTGATAC-3'

其中模板为Idiomarina abyssalis的基因组DNA。

PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μL，上游引物和下游引物各1μL(0.3μmol/L)，DNA模板1μL(0.1μg)和去离子水7μL。

PCR扩增程序为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，获得一条完整的苯丙氨酸酶全长基因序列。该序列经DNA测序，全长1542bp，命名为IaPAL。所述基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

将所得的苯丙氨酸解氨酶野生型IaPAL全长基因序列进行3个碱基的突变，位置分别是苯丙氨酸解氨酶野生型基因编码序列的第240位的组氨酸突变为苯丙氨酸，第80位的亮氨酸突变为缬氨酸，得到的突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。

实施例2：苯丙氨酸解氨酶重组质粒和重组表达转化体及突变体的制备

将实施例1所得的苯丙氨酸解氨酶基因DNA片段及pET28a空质粒在37℃用限制性核酸内切酶NdeI和XhoI双酶处理2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28a IaPAL。

将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌E.coli DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆菌落，利用PCR的方法验证阳性克隆。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a IaPAL，菌落PCR和基因测序验证阳性克隆。突变体质粒同样按上述方法进行转化。

实施例3：苯丙氨酸解氨酶突变体的表达

将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD 600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞，冷冻干燥24h即可得冻干细胞，收集后4℃条件下保存。将所得的静息细胞悬浮于pH值7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为苯丙氨酸解氨酶的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，苯丙氨酸解氨酶以可溶的形式存在。

实施例4：苯丙氨酸解氨酶野生型及突变体活力的测定

采用高效液相色谱法(HPLC)来检测苯丙氨酸解氨酶的活性及选择性，流动相条件为甲醇：水＝95；5，流速1mL/min，柱温35℃，波长为222nm，所使用的的柱子为氨基酸手性柱，其型号为Astec CHIRBIOTIC 15cm﹡4.6mm，5μm。其活力测定方法如下：与0.5mL反应体系中(6M氨水，pH＝9.6)加入10mM 2-Cl-肉桂酸，适量纯酶，于反相检测产物峰面积的变化。纯酶蛋白浓度的测定是根据大多蛋白在280nm下有最大吸收峰，因此可以通过Nanodrop仪器直接获取浓度数据。纯化的蛋白浓缩除盐之后，利用网站https://web.expasy.org/protparam/查得蛋白的摩尔消光系数和蛋白分子量，将5μL纯酶液滴定在仪器上，根据摩尔消光系数和蛋白分子量设置读取蛋白浓度。蛋白依次稀释不同的倍数，验证在不同稀释倍数下测定结果均有良好的线性关系，即可获得纯酶的蛋白浓度。

在上述反应条件下，每单位苯丙氨酸解氨酶的活力(U)定义为每分钟产生1μmol产物(S)-2-氯-苯丙氨酸所需的酶量。

表1苯丙氨酸解氨酶野生型及突变体活力

实施例5：苯丙氨酸解氨酶野生型及突变体转化率的测定

采用高效液相色谱法(HPLC)来检测苯丙氨酸解氨酶的转化率及选择性。流动相条件为甲醇：水＝95：5，流速1mL/min，柱温35℃，波长为222nm，所使用的的柱子为氨基酸手性柱，其型号为Astec CHIRBIOTIC 15cm﹡4.6mm，5μm。其转化率测定方法如下：于10mL反应体系中(6M氨水，pH 9.6)加入18.26g·L^-1底物，0.73g·L^-1冻干细胞。于24h后取样品，于反相检测底物峰面积的变化。其苯丙氨酸解氨酶野生型及突变体转化率按如下方法计算：

转化率(％)＝[(S底物起始-S底物终止)*100％]/S底物起始

表2苯丙氨酸解氨酶野生型及突变体转化率

实施例6：苯丙氨酸解氨酶野生型及突变体底物谱比活力测定

苯丙氨酸解氨酶催化不同底物比活力测定方法按实施例4的方法进行测定，如表3所示，L80V对邻位取代基底物的活力较高，H240F对邻、间和对取代基底物及天然底物反式肉桂酸相比于WT活力较高。

表3苯丙氨酸解氨酶野生型及突变体对不同底物比活力

注：N.A.：not available.

实施例7：苯丙氨酸解氨酶野生型及突变体底物谱转化率测定

苯丙氨酸解氨酶对不同底物转化率按实施例5的方法进行测定，如表4所示，L80V对邻位取代基底物的转化率较高，H240F对邻、间和对取代基底物及天然底物反式肉桂酸相比于WT转化率较高。

表4苯丙氨酸解氨酶野生型及突变体对不同底物转化率

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种苯丙氨酸解氨酶突变体，其特征在于：所述苯丙氨酸解氨酶突变体通过将如SEQID NO.1所示出发氨基酸序列第240位组氨酸突变为苯丙氨酸，或第80位亮氨酸突变为缬氨酸得到。

2.一种编码权利要求1所述苯丙氨酸解氨酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

4.一种包含权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.一种包含权利要求1所述苯丙氨酸解氨酶突变体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞的类型为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。

7.权利要求1所述苯丙氨酸解氨酶突变体、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在合成(S)-2-氯-苯丙氨酸中的应用。

8.一种合成(S)-2-氯-苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的苯丙氨酸解氨酶突变体或含有该突变体的表达系统添加至含有底物的反应体系中进行反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：反应温度为30～40℃，反应pH值为9.0～10.5。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述底物包括反式肉桂酸、2-Cl-肉桂酸、3-Cl-肉桂酸、4-Cl-肉桂酸、2-NO₂-肉桂酸、3-NO₂-肉桂酸、4-NO₂-肉桂酸、2-Br-肉桂酸、3-Br-肉桂酸、4-Br-肉桂酸、2-CF₃-肉桂酸、3-CF₃-肉桂酸、4-CF₃-肉桂酸、2,4-2-Cl-肉桂酸和2,5-2-Cl-肉桂酸中的一种或几种。