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CN116904338A - 一株受氮调控的联合固氮菌及其应用 - Google Patents

一株受氮调控的联合固氮菌及其应用 Download PDF

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CN116904338A
CN116904338A CN202310311651.1A CN202310311651A CN116904338A CN 116904338 A CN116904338 A CN 116904338A CN 202310311651 A CN202310311651 A CN 202310311651A CN 116904338 A CN116904338 A CN 116904338A
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nitrogen
corn
sugarcane
combined
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钟永嘉
刘冉
廖红
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Fujian Agriculture and Forestry University
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Fujian Agriculture and Forestry University
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Abstract

本发明公开了一株受氮调控的联合固氮菌RBCS17及其应用。固氮菌RBCS17是从甘蔗品种新台糖22号的根部分离所得。该菌属于副伯克霍尔德氏菌（Paraburkholderia sp.），含有nifH基因，具有生物固氮的能力，能在禾本科作物甘蔗和玉米体内定殖，促进甘蔗和玉米的生长。并且其在甘蔗和玉米根内的定殖收供氮水平严格调控。室内盆栽条件下接种RBCS17，与未接种相比，甘蔗的根系固氮酶活性提高了50.90%，玉米的根系固氮酶活性提高了20.50%。大田条件下接种RBCS17，与未接种相比，甘蔗的生物量和氮含量分别提高了22.24%和25.32%。室内盆栽条件下接种RBCS17，与未接种相比，玉米的生物量和氮含量分别提高了68.94%和18.62%。因此，联合固氮菌RBCS17具有一定的应用潜力。

Description

一株受氮调控的联合固氮菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株受氮调控的联合固氮菌及其应用。
背景技术
氮是植物生长发育中所需的大量矿质营养元素之一。在农业生产中，植物吸收的氮素养分主要来自于化学氮肥的施用。尽管化学氮肥的投入大幅度增加了粮食产量，然而不合理的施肥不仅浪费了资源，也对生态环境造成了严重破坏，不利于农业的可持续发展。先前的研究中发现禾本科作物，如甘蔗、玉米等都具有与固氮微生物联合固氮的特性，可将空气中的氮气转化为植物可利用的氮的形式氨。因此，充分利用高效固氮微生物，并挖掘植物本身的生物固氮潜力对我国甘蔗、玉米等禾本科作物种植“减肥增效”具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一株受氮调控的联合固氮菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一株受氮调控的联合固氮菌RBCS17，所述的受氮调控的联合固氮菌RBCS17是从品种为新台糖22号的甘蔗根部分离得到，其分类命名为副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia sp.)RBCS17，已于2022年10月20日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20221610，保藏地址为中国武汉武汉大学。
联合固氮菌RBCS17的培养及形态特征为：联合固氮菌RBCS17能够在JNFb固体培养基和普通LB培养基上生长，菌落表面有光泽，菌落呈圆形，菌落边界清晰，在JNFb固体培养基上其菌落形态为白色，在LB固体培养基上其菌落形态为淡黄色。
联合固氮菌RBCS17的功能特征：利用nifH基因引物对固氮菌RBCS17进行固氮功能检测，通过PCR扩增可以获得片段长度约450bp的产物，表明该菌具有固氮潜力。通过对细菌16S rDNA进行扩增和测序，并与近缘微生物构建进化树比对发现，该菌属于Paraburkholderia sp.属细菌。通过对该菌进行标记，并在甘蔗和玉米根系上定殖发现，联合固氮菌RBCS17能在甘蔗和玉米的根上不同部位定殖，且其在甘蔗和玉米根上的定殖受氮影响大，表现为低氮处理促进RBCS17在甘蔗、玉米根系上定殖，而高氮处理抑制其在甘蔗、玉米根系上定殖。
上述受氮调控的联合固氮菌RBCS17，可以在禾本科作物甘蔗、玉米的根系大量富集。
本发明提供的受氮调控的联合固氮菌RBCS17能在玉米和甘蔗等禾本科作物的根系定殖，通过与宿主植物进行联合固氮提高植物对氮的吸收利用，促进植物的生长。室内盆栽条件下接种联合固氮菌RBCS17，与未接种相比，甘蔗的根系固氮酶活性提高了50.90％，玉米的根系固氮酶活性提高了20.50％。大田条件下接种联合固氮菌RBCS17，与未接种相比，甘蔗的生物量和氮含量分别提高了22.24％和25.32％。室内盆栽条件下接种联合固氮菌RBCS17，与对照相比，玉米的生物量和氮含量分别提高了68.94％和18.62％。
附图说明
图1：RBCS17固氮基因鉴定与菌落形态观察。
图2：RBCS17的进化树分析。
图3：氮影响RBCS17在甘蔗、玉米根系上的定殖。A，RBCS17在甘蔗根系上的定殖GUS染色结果；B，RBCS17在玉米根系上的定殖GUS染色结果；C，不同氮水平处理对RBCS17在甘蔗、玉米根系上定殖的影响。HN表示高氮处理(5300μΜN)；LN表示低氮处理(530μΜN)。图上标尺为2cm。
图4：接种RBCS17对甘蔗、玉米根系固氮酶活性的影响。Control，不接种RBCS17；RBCS17，接种RBCS17。A-B，接种RBCS17对甘蔗根系固氮酶活性的影响；C-D，接种RBCS17对玉米根系固氮酶活性的影响。
图5：接种RBCS17对甘蔗生长、氮吸收的影响。Control，不接种RBCS17；RBCS17，接种RBCS17。A，甘蔗长势；B，甘蔗生物量；C，甘蔗植株含氮量。图上标尺为20cm。
图6：接种RBCS17对玉米生长、氮吸收的影响。Control，不接种RBCS17；RBCS17，接种RBCS17。A，玉米长势；B，玉米生物量；C，玉米植株含氮量。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
本发明JNFb固体培养基、全氮营养液及低氮营养液配方如下所示。
表1JNFb固体培养基配方
表2低氮营养液(530μmol/LN)配方
表3低氮营养液(1060μmol/LN)的配方
表4低氮营养液(2650μmol/LN)配方
表5全氮营养液(5300μmol/LN)配方
实施例1菌株的筛选
(1)菌株获取
收集种植于大田(福建省福州市，福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心甘蔗圃)的低氮处理下的新台糖22号品种甘蔗根系，将其放于无菌的三角瓶中，加入1×PBS缓冲液浸没样品，220rpm震荡清洗3-5次，洗去附着在根表的土壤。在超净台中用1％的NaClO3溶液浸没样品并震荡处理30s，再用70％的酒精处理1min进行表面消毒，表面消毒后的样品用无菌水洗涤5次。收集最后一次清洗的无菌水，作为对照进行涂板。甘蔗根系样品完成表面消毒后用无菌滤纸吸干表面水分，取5g样品于无菌的研钵中，加入5mL灭菌的1×PBS进行组织破碎，释放内生微生物，研磨好的液体过滤掉残渣后即为甘蔗内生微生物悬浮液。将微生物悬浮液进行稀释，使用无菌的1×PBS分别稀释至原悬浮液的100倍、10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍，并涂布于JNFb固体培养基上(表1)，置于28℃培养箱中倒置培养，从涂布后第三天开始挑取单菌落，并进行划线纯化，挑选单克隆用液体培养基培养后，加入等体积50％无菌甘油，混匀后，将菌种保存于-80℃。
(2)菌株固氮能力筛选与鉴定
将从甘蔗根系分离得到的菌株进行固氮基因的检测。PCR反应体系：正向反向引物各0.3μL，2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 5μL，菌液0.5μL，ddH2O补足体系至10μL。PCR扩增体系：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，39个循环后，72℃补充延伸10min。PCR结束后取5μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行凝胶电泳，观察nifH基因扩增效果。其中，所用到的正反向引物序列如下：
nifH-F：5’-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3’，
nifH-R：5’-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3’。
如图1所示，对甘蔗内生菌进行固氮功能检测，通过PCR扩增获得片段长度约450bp的产物，能够产生阳性条带的即为具有潜在固氮能力的菌株，将该菌株命名为RBCS17。
(3)菌株RBCS17的培养及形态特征
菌株RBCS17能够在JNFb固体培养基和普通LB培养基上生长，菌落表面有光泽，菌落呈圆形，菌落边界清晰，在JNFb固体培养基上其菌落形态为白色(图1)。
(4)菌株RBCS17的16S rDNA序列分析
利用引物16s-rRNA-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；16s-rRNA-R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’扩增菌株RBCS17的16S rDNA，并进行测序，将得到的序列(SEQID NO.1)提交NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST比对分析，构建进化树(图2)。通过分析发现，菌株RBCS17属于副伯克霍尔德氏菌属(Paraburkholderia sp.)。
实施例2菌株的定殖分析
(1)利用下游含有β-葡萄糖苷酸酶基因GUS标签的pRK415载体(即pRK415-GUS)，以电转法(12.5kv/cm)转化至固氮菌RBCS17感受态细胞中，在四环素(50μg/mL)抗性LB平板上筛选阳性克隆，获得含有β-葡萄糖苷酸酶的固氮菌RBCS17。
(2)菌株RBCS17在甘蔗根系的定殖分析：将水培一段时间的单株甘蔗组培苗(新台糖22号)置于组培试管中水培，再将5mL OD600＝0.5的含有β-葡萄糖苷酸酶的固氮菌RBCS17接种到组培试管中，将菌体与低氮营养液(530μmol/LN)(表2)混匀，每天更换营养液并重新添加菌液，培养10-15天，采集甘蔗根系装在50mL离心管中，并用GUS染液对甘蔗的根进行染色，用锡纸将离心管包裹避光放置在真空泵里过夜抽真空，再放置在37℃的培养箱中染色2-3天，用70％的酒精进行脱色2-3天，用Axio Zoom.V16连续变焦体视显微镜(Carl ZeissAG，德国)进行拍照。结果如图3显示，固氮菌RBCS17可以在甘蔗根系定殖。
(3)菌株RBCS17在玉米根系的定殖分析：将50mL OD600＝0.2的含有β-葡萄糖苷酸酶标记的固氮菌RBCS17菌悬液接种到泥炭基质中，在接种菌的基质中播种玉米种子(闽甜6855)，并在生长室内培养7天，培养期间提供低氮营养液(530μmol/LN)。采集玉米根系装在50mL离心管中，用锡纸将离心管包裹避光放置在真空泵里过夜抽真空，再放置在37℃的培养箱中染色1天，之后用70％的酒精进行脱色2-3天，用Axio Zoom.V16连续变焦体视显微镜(Carl Zeiss AG，德国)进行拍照。结果如图3所示，在玉米根系上明显可见蓝色GUS信号，表明固氮菌RBCS17可以在玉米根系定殖。
实施例3接种固氮菌RBCS17对甘蔗根系固氮酶活性的影响
(1)菌株活化：将-80℃保存的菌株RBCS17划线接种于LB固体培养基，放置于28℃培养箱进行培养。待长出单克隆之后，将活化后的菌株转接在5mL LB液体培养基中培养，置于28℃200rpm的摇床，培养至菌液OD600＝2.0。
(2)菌剂制备：取上述菌液500μL，接种到50mL LB液体培养基中，于28℃200rpm下培养2-3天，至OD600＝2.0。通过离心方式(5000rpm,10min)收集菌体，菌体用无菌水重悬，并用无菌水将OD600调整至0.2。
(3)试验使用生根的甘蔗组培苗，打开组培盖炼苗1天以适应外界环境。炼苗完成后，将组培苗分成单株，并去除植株的分蘖。挑选长势一致的单株，用二级水洗去根部残余的培养基，用海绵夹住植株，塞在打孔的黑色泡沫板上。在面包箱中加入全氮营养液(5300μmol/LN)(表5)，浸没甘蔗根部，在人工气候室中培养14天，新根长出约5cm后备用。
(4)将甘蔗幼苗种植于7×7×10cm的装有灭菌(121℃，30min)生长基质(JiffyBase Peat(泥炭基质：荷兰捷菲公司))盆子中，基质距离盆口1cm。实验设置接种处理和不接种处理，实验组每盆基质接种50mL OD600＝0.2的固氮菌RBCS17菌液，对照为不接种处理。在甘蔗生长期间，为甘蔗提供低氮营养液(1060μmol/L N)(表3)。甘蔗与固氮菌RBCS17于生长室共培养20天，之后对甘蔗的长势进行拍照，利用乙炔还原法测定甘蔗的根系固氮酶活性。
(5)结果如图4所示：在低氮条件下，与对照相比，接种固氮菌RBCS17促进甘蔗根系固氮酶活性提高了50.90％，表明RBSC17具有固氮能力，能通过固氮促进甘蔗的生长。
实施例4接种固氮菌RBCS17对玉米根系固氮酶活性的影响
(1)菌株活化：将-80℃保存的菌株RBCS17划线接种于LB固体培养基，放置于28℃培养箱进行培养。待长出单克隆之后，将活化后的菌株转接到5mL LB液体培养基中培养，置于28℃200rpm的摇床，培养至菌液OD600＝2.0。
(2)菌剂制备：取菌液500μL，转接到50mL LB液体培养基中，于28℃200rpm下培养2-3天，至OD600＝2.0。通过离心方式(5000rpm,10min)收集菌体，菌体用无菌水悬浮，并用无菌水将OD600调整至0.2。
(3)将玉米种子播种于7×7×10cm装有灭菌(121℃，30min)生长基质(Jiffy BasePeat(泥炭基质：荷兰捷菲公司))盆子中，基质距离盆口1cm。每盆种4粒玉米种子，于玉米第一片叶完全展开后，去除长势不均一的苗子，每盆只留下一株。实验设置接种处理和不接种处理，实验组每盆基质接种50mL OD600＝0.2的固氮菌RBCS17菌液，对照组不接种固氮菌RBCS17，实验组和对照组每个处理种植6盆。在玉米生长期间，为玉米提供的低氮营养液(1060μmol/LN)。玉米与固氮菌RBCS17于生长室共培养1个月，之后对玉米的长势进行拍照，利用乙炔还原法测定玉米的根系固氮酶活性。
(4)结果如图4所示：在低氮条件下，与对照相比，接种固氮菌RBCS17提高了玉米根系固氮酶活性达20.50％，说明固氮菌RBCS17在玉米上也具有固氮能力，从而促进玉米的生长。
实施例5大田条件下接种固氮菌RBCS17对甘蔗氮吸收以及生长的影响。
(1)菌株活化：将-80℃保存的菌株RBCS17划线接种于LB固体培养基，放置于28℃培养箱进行培养。待长出单克隆之后，将活化后的菌株转接在5mL液体LB培养基中培养，置于28℃，200rpm的摇床，培养至菌液OD600＝2.0。
(2)菌剂制备取上述菌液500μL，接种到50mL LB液体培养基中，于28℃，200rpm下培养2-3天，至OD600＝2.0。通过离心方式(5000rpm,10min)分别收集菌体，菌体用无菌水重悬，并用无菌水将OD600调整至0.2。
(3)试验使用生根的甘蔗组培苗，打开组培盖炼苗1天以适应外界环境。炼苗完成后，将组培苗分成单株，并去除植株的分蘖。挑选长势一致的单株，用二级水洗去根部残余的培养基，用海绵夹住植株，塞在打孔的黑色泡沫板上。在面包箱中加入全氮营养液(5300μmol/LN)，浸没甘蔗根部，在人工气候室中培养14天，新根长出约5cm后备用。
(4)将甘蔗幼苗种植于7×7×10cm的装有灭菌(121℃，30min)生长基质(JiffyBase Peat(泥炭基质：荷兰捷菲公司))盆子中，基质距离盆口1cm。实验设置接种处理和不接种处理，实验组每盆基质接种50mL OD600＝0.2的固氮菌RBCS17菌液，对照组不接种固氮菌RBCS17。在甘蔗生长期间，为甘蔗提供低氮营养液(530μmol/L N)，甘蔗与固氮菌RBCS17于生长室内共培养1个月后移栽至大田。
(5)大田实验规划：实验每个小区设置：3米行长，1.2米行宽。甘蔗株距为30cm，每个小区种植10株，各设置三个独立试验小区。在田间种植7个月后对植物生物量和氮含量进行测定。
(6)结果如图5所示：在田间条件下对甘蔗接种固氮菌RBCS17能够促进甘蔗的生长，相比对照组，生物量提高了22.24％，氮吸收总量提高了25.32％。说明接种固氮菌RBCS17能够提高氮吸收，促进甘蔗生长，具有较好的应用前景。
实施例6室内盆栽接种固氮菌RBCS17对玉米氮吸收以及生长的影响(1)菌株活化：将-80℃保存的菌株RBCS17划线接种于LB固体培养基，放置于28℃培养箱进行培养。待长出单克隆之后，将活化后的菌株转接在5mL液体LB培养基中培养，置于28℃，200rpm的摇床，培养至菌液OD600＝2.0。
(2)菌剂制备：取菌液500μL，转接到50mL液体LB培养基中，于28℃，200rpm下培养2-3天，至OD600＝2.0。通过离心方式(5000rpm,10min)收集菌体，菌体用无菌水悬浮，并用无菌水将OD600调整至OD600＝0.2。
(3)将玉米种子种植于7×7×10cm的装有灭菌(121℃，30min)生长基质(JiffyBase Peat(泥炭基质：荷兰捷菲公司)盆子中，基质距离盆口1cm。每盆种4粒玉米种子，于玉米第一片叶完全展开后，去除长势不均一的苗子，每盆只留下一株。实验设置接种处理和不接种处理，实验组每盆基质接种50mL OD600＝0.2的固氮菌RBCS17菌液，对照组不接种固氮菌RBCS17，实验组和对照组每个处理种植6盆。在玉米生长期间，为玉米提供的低氮营养液(2650μmol/LN)(表4)。玉米与固氮菌RBCS17于生长室共培养1个月，之后对玉米的长势进行拍照，测定植物生物量和氮含量。
(4)结果如图6显示：在低氮条件下，与对照相比，接种固氮菌RBCS17明显的促进玉米的生长，显著增加玉米的生物量和氮吸收量，其中植物的生物量提高了68.94％，植株氮吸收总量提高了18.62％。表明低氮条件下接种固氮菌RBCS17通过联合固氮作用提高玉米对氮的吸收，促进植株的生长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一株受氮调控的联合固氮菌RBCS17，其特征在于：所述联合固氮菌RBCS17分离自甘蔗品种新台糖22号的根部，分类命名为副伯克霍尔德氏菌（Paraburkholderia sp.）RBCS17，已于2022年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221610，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.根据权利要求1所述的联合固氮菌RBCS17，其特征在于：低氮条件促进联合固氮菌RBCS17在甘蔗和玉米根系的定殖与富集。
3.如权利要求1所述的联合固氮菌RBCS17在低氮条件下提高植物根系固氮酶活性中的应用，其特征在于：所述植物为甘蔗或玉米。
4.如权利要求1所述的联合固氮菌RBCS17在低氮条件下促进植物氮吸收中的应用，其特征在于：所述植物为甘蔗或玉米。
5.如权利要求1所述的联合固氮菌RBCS17在低氮条件下促进植物生长中的应用，其特征在于：所述植物为甘蔗或玉米。
6.一种低氮条件下促进植物生长的方法，其特征在于：向植物根际基质中施加权利要求1所述的联合固氮菌RBCS17的菌液；所述植物为甘蔗或玉米。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述联合固氮菌RBCS17的菌液的OD600为0.2。
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