CN116870024A

CN116870024A - 长链非编码RNA linc02041在制备肝癌治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN116870024A
Application number: CN202311005717.0A
Authority: CN
Inventors: 许芳; 李成龙; 程明姣; 刘壮飞; 章金涛; 赵倩伟
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2023-08-10
Filing date: 2023-08-10
Publication date: 2023-10-13

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种长链非编码RNA linc02041在制备肝癌治疗药物中的应用。本发明通过生物信息学分析出linc02041在肝癌与癌旁组织样本中存在差异性表达。基于此，本发明通过构建细胞稳转模型首次发现了linc02041与肝癌细胞的进展相关，同时披露了linc02041相关作用机制。体外试验结果发现，通过敲低linc02041能够抑制肝癌细胞的增殖、克隆、迁移及侵袭，间质细胞标志物的表达，促进上皮细胞标志物、凋亡蛋白的表达来调控肝癌细胞的进展。这表明linc02041在肝癌细胞中发挥促癌的作用，能够为开发新型的肝癌治疗药物提供研发方向和理论支撑。

Description

长链非编码RNA linc02041在制备肝癌治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及长链非编码RNA linc02041在制备肝癌治疗药物中的应用。

背景技术

原发性肝癌简称肝癌，是全球范围内死亡率最高的恶性肿瘤之一。肝细胞癌(HCC)是肝癌的主要组织学亚型，占原发性肝癌的90％。目前HCC的发病机制仍不清楚，再加上HCC本身进展迅速，造成HCC死亡率居高不下。近年来，其发病率逐年上升，5年生存率仅为18％。癌细胞的侵袭转移是肝癌死亡的主要原因，针对肝癌的治疗方法主要包括传统的手术治疗、介入治疗、放疗和超声消融等。目前虽然肝癌的治疗技术得以显著提升，但是患者术后复发率仍较高，长期疗效仍未得到明显的改善。因此，探索新型肝癌治疗药物是生物医药技术领域的热点课题。

长链非编码RNA(LncRNA)是具有特定的空间结构和高度保守的序列原件，广泛存在于细胞的各个层面，能够参与转录、转录后、翻译及翻译后等多个层面的生理过程，如参与调控染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA代谢和表观遗传特征等过程。已有研究发现LncRNA与多种癌症的发生发展、转移及耐药等过程密切相关，这些特征显示LncRNA在生物学过程中发挥着重要作用，并将逐渐成为临床肝癌诊断、治疗及预后的全新靶点。

近年来，LncRNA作为癌症发生发展过程中的重要参与者，其在癌症中诊治和预后判断方面表现出巨大潜力，因此研究热度持续上升。已有研究发现linc02041与胰腺癌进展的铜死亡(铜离子载体引起的细胞死亡)以及肠癌患者的预后相关，但是尚未有将linc02041与肝癌相结合的报道。因此探索与肝癌相关的LncRNA及其作用机制，对改进、开发新型的肝癌治疗药物具有重要意义，也能够为改善肝癌的诊治现状提供理论依据。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种长链非编码RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，长链非编码RNA为linc02041，通过敲低linc02041能够抑制肝癌细胞的增殖、克隆、迁移、侵袭，从而调控肝癌的进展。

为实现本发明目的，采用以下技术方案：

一种长链非编码RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，所述长链非编码RNA为linc02041，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述肝癌为肝细胞癌。

进一步地，所述肝癌治疗药物通过敲低linc02041来调控肝癌的进展。

进一步地，所述肝癌治疗药物通过敲低linc02041来抑制肝癌细胞的增殖、克隆、迁移、侵袭，从而实现肝癌进展的调控。

进一步地，所述敲低linc02041是通过设计特异性小干扰RNA来降低linc02041的表达水平；所述特异性小干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；

其中，SEQ ID NO:2的序列为AAGAGGACTTGCCTAAAGTTA；SEQ ID NO:3的序列为GATAACAGAAGTGTAGGATTG。

本发明的目的之二在于提供靶向长链非编码RNA的特异性小干扰RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，特异性小干扰RNA通过促进上皮细胞标志物、凋亡蛋白的表达，降低间质细胞标志物的表达，进而调控肝癌的进展。

为实现本发明目的，采用以下技术方案：

靶向长链非编码RNA的特异性小干扰RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，所述长链非编码RNA为linc02041，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述特异性小干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；

进一步地，所述肝癌为肝细胞癌。

进一步地，所述特异性小干扰RNA通过抑制linc02041的表达来抑制肝癌细胞的增殖、克隆、迁移、侵袭，从而实现肝癌进展的调控。

进一步地，所述特异性小干扰RNA通过促进上皮细胞标志物、凋亡蛋白的表达，降低间质细胞标志物的表达，来调控肝癌的进展。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明通过生物信息学分析出linc02041在肝细胞癌与癌旁组织样本中存在差异性表达。基于此，本发明通过构建细胞转染模型，同时获得了过表达和敲低linc02041的肝癌细胞，首次发现了linc02041与肝细胞癌的进展相关，同时披露了linc02041相关作用机制。体外试验结果发现，通过敲低linc02041能够抑制肝癌细胞的增殖、克隆、迁移及侵袭，抑制间质细胞标志物的表达，促进上皮细胞标志物以及凋亡蛋白的表达，来调控肝癌的进展。这表明linc02041在肝癌中发挥促癌的作用，能够为开发新型的肝癌治疗药物提供研发方向和理论支撑。

附图说明

图1为linc02041在肝癌细胞中的表达情况，以及linc02041表达水平与肝细胞癌患者总生存期的关系图；

图2为过表达/敲低linc02041肝癌细胞中mRNA表达情况图；

图3为过表达/敲低linc02041的肝癌细胞增殖情况图；

图4为过表达/敲低linc02041的肝癌细胞克隆情况图；

图5为过表达linc02041的肝癌细胞横向迁移和侵袭情况图；

图6为敲低linc02041的肝癌细胞横向迁移和侵袭情况图；

图7为过表达linc02041的肝癌细胞纵向迁移和侵袭情况图；

图8为过表达/敲低linc02041的肝癌细胞纵向迁移和侵袭情况图；

图9为过表达/敲低linc02041的肝癌细胞中上皮间质标志物转化情况图；

图10为过表达/敲低linc02041的肝癌细胞中凋亡蛋白表达情况图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及试验例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、试剂等情况简要介绍如下：

生物材料：12对肝细胞癌患者癌和癌旁组织样本来源于郑州大学第一附属医院；SMMC7721细胞购买于武汉塞维尔生物科技有限公司；SNU449细胞为实验室保存；HCCLM3细胞购买于上海葵赛生物科技有限公司；过表达/敲低linc02041的慢病毒载体和空载体慢病毒购买于上海吉凯基因医学科技有限公司。

试验试剂：反转录试剂盒为诺唯赞HiScript III All-in-one-RT SuperMixPerfect for qPCR；基因扩增试剂盒为诺唯赞ChamQ Universal SYBR RT-qPCR MasterMix。

实施例1长链非编码RNA在制备肝癌治疗药物中的应用

本实施例提供长链非编码RNA制备肝癌治疗药物，其中非编码RNA为linc02041，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

具体地，本实施例中肝癌为肝细胞癌；肝癌治疗药物通过敲低linc02041来调控肝癌的进展，具体表现为：肝癌治疗药物通过敲低linc02041，抑制肝癌细胞的增殖、克隆、迁移、侵袭来调控肝癌的进展；其中，敲低linc02041是通过设计特异性小干扰RNA来抑制linc02041的表达水平；特异性小干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:2的序列为AAGAGGACTTGCCTAAAGTTA；SEQ ID NO:3的序列为GATAACAGAAGTGTAGGATTG。

实施例2靶向长链非编码RNA的特异性小干扰RNA在制备肝癌治疗药物中的应用

本实施例提供靶向长链非编码RNA的特异性小干扰RNA制备肝癌治疗药物，其中靶向长链非编码RNA为linc02041，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；特异性小干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；SEQ ID NO:2的序列为

AAGAGGACTTGCCTAAAGTTA；SEQ ID NO:3的序列为GATAACAGAAGTGTAGGATTG。

具体地，肝癌为肝细胞癌；特异性小干扰RNA通过抑制linc02041的表达来抑制肝癌细胞的增殖、克隆、迁移、侵袭，从而实现肝癌进展的调控；特异性小干扰RNA还能够通过促进上皮细胞标志物、凋亡蛋白的表达，降低间质细胞标志物的表达，来调控肝癌的进展。

试验例1linc02041在肝细胞癌(HCC)中的表达情况

1.1、数据库中肝细胞癌肿瘤样本与正常样本中linc02041表达情况

从肿瘤基因组图谱(TCGA)的在线数据库中获得HCC项目下的RNA-Seq数据，筛选并保留50对HCC及其癌旁组织样本信息，进行基因表达分析。在基因表达分析中参数采用，对数尺度采用log2(TPM+1)，总生存期采用Kaplan-Meier进行检验，结果如图1所示。

1.2、临床肝细胞癌患者的肿瘤细胞样本与正常样本中linc02041表达情况

1.2.1、细胞系及培养

SMMC7721细胞、SNU449细胞在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中进行培养；HCCLM3在含10％胎牛血清的DMEM培养基中进行培养；所有细胞系均培养在37℃和5％CO₂的培养箱中。

1.2.2、RNA的提取

(1)从培养后长满细胞的6孔板中吸去培养基，用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次。向每个孔中加入1mL Trizol试剂，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞不再附着于孔壁；然后将样品转移至无RNA酶的1.5mL离心管中；

(2)向步骤(1)的离心管中加入0.2mL氯仿，涡旋振荡15s后，于室温下静置5min；

(3)将步骤(2)的离心管置于4℃、转速为12000rpm的低温高速离心机上离心15min；完成离心后，吸取离心后最上层液体至新的离心管中，并记录吸取液体的量；

(4)向步骤(3)新的离心管中加入与吸取液体等体积的异丙醇，颠倒混匀后于室温下静置10min；

(5)将步骤(4)的置于4℃、转速为12000rpm的低温高速离心机上离心10min，离心完成后，去除上清液后，即得RNA；然后于RNA加入1mL 75％的乙醇，以4℃、转速为5000rpm离心3min；

(6)去除上清液后，将离心管置于超净台中干燥；

(7)依据RNA沉淀量，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水，充分溶解RNA。

1.2.3、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

(1)mRNA反转录为cDNA

将步骤1.2.2所得RNA置于冰上，采用诺唯赞HiScript III All-in-one-RTSuperMix Perfect for qPCR试剂盒的进行cDNA的合成，反应结束后将cDNA于-20℃冰箱中保存，反应体系如表1所示，反应条件表2所示：

表1反转录反应体系配比

表2反转录过程反应条件设置

(2)PCR扩增(qRT-PCR)

将-20℃保存的cDNA稀释10倍，采用诺唯赞ChamQ Universal SYBR RT-qPCRMaster Mix试剂盒对目的基因进行扩增，引物序列如表3所示，在八联排qRT-PCR管中按照表4所示体系配制PCR反应混合液；将配置好的体系按照表5程序上机检测。反应结束后导出CT值，根据2^-△△CT算法计算临床患者的肝癌肿瘤样本、肝癌正常样本中mRNA的相对表达水平，结果如图1所示。

表3引物序列

表4PCR扩增体系

表5PCR扩展程序

图1为linc02041在肝癌细胞中的表达情况，以及linc02041表达水平与肝细胞癌患者总生存期的关系图。图1A-B为TCGA数据库中肝细胞癌正常样本与肿瘤样本中linc02041表达情况图。由图1A-B可知，linc02041在肝细胞癌肿瘤样本中高表达。图1C为12对临床肝细胞癌患者癌组织和癌旁组织中linc02041表达情况图。由图1C可知，linc02041在临床肝细胞癌患者癌组织中高表达。图1D为linc02041表达水平与肝细胞患者生存曲线图。由图1D可知，linc02041表达水平与肝细胞患者生存期呈负相关。^**P<0.01表明组间具有显著差异。

试验例2构建细胞稳转模型

本试验例通过siDirect(sidirect2.rnai.jp/)和DSIR(http://biodev.extra.cea.fr/DSI)设计出2条敲低linc02041的siRNA序列，siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；过表达linc02041的序列来源于NCBI数据库，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

1.1、过表达/敲低linc02041的慢病毒载体、空载体慢病毒的构建

过表达/敲低linc02041的慢病毒载体、空载体慢病毒的构建由上海吉凯基因医学科技有限公司完成。

1.2、构建敲低linc02041的HCCLM3细胞

1)在6孔板中加入2mL培养基，然后把处于对数生长期的待转染的HCCLM3细胞接种在6孔板中，密度为1×10⁵～2×10⁵个，置于37℃培养箱中培养；在第二天生长汇合度为50％左右，准备进行慢病毒载体转染；

2)把1.1得到的敲低linc02041的慢病毒载体放在室温下解冻，弃去细胞的旧培养基，每孔首先加入1mL新鲜培养基，然后加入10μL慢病毒载体溶液、适量聚凝胺助转剂，之后吹打混匀，感染4小时后添加新的培养基至培养基的体积为2mL；

3)将细胞培养24h后，弃去细胞的旧培养基，更换新鲜的完全培养基；继续胞培养72h后于荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度确定不同组的细胞转染情况，从而初步判定转染效果；

4)使用终浓度为2μg/mL嘌呤霉素的抗性筛选药物进行病毒转染后细胞筛选，最终得到敲低linc02041的HCCLM3细胞系。

1.3、构建过表达linc02041的MMC7721细胞、SNU449细胞

试验过程同1.2，区别在于：将慢病毒载体更换为过表达linc02041的慢病毒载体，最终得到过表达linc02041的MMC7721细胞系、SNU449细胞系。

1.4、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测转染后细胞系中linc02041的表达情况

1)将1.2与1.3构建的过表达/敲低linc02041细胞系培养14天后，提取各组转染后细胞系中的RNA；

2)通过qRT-PCR法检测过表达/敲低linc02041组和对照组HCC细胞中RNA的表达情况，结果如图2所示。

图2为过表达/敲低linc02041的肝癌细胞中mRNA表达情况图。其中图2A为linc02041在SMMC7721细胞的空载体慢病毒组(LV-NC即对照组)、过表达慢病毒组(2041-OE)中的mRNA表达情况图。图2B为linc02041在SNU449细胞的LV-NC、2041-OE组中的mRNA表达情况图。由图2A-B可知，linc02041在SMMC7721细胞、SNU449细胞的2041-OE组表达显著高于LV-NC组。

图2C为linc02041在HCCLM3细胞的LV-NC、敲低慢病毒组(2041-sh)中的mRNA表达情况图。由图2C可知，linc02041在2041-sh组表达显著低于LV-NC组。^****P<0.0001表明组间具有显著差异。

综合图2A-C可知，SMMC7721、SNU449细胞转染过表达linc02041慢病毒载体后能够显著上调肝癌细胞中linc02041的表达水平，HCCLM3细胞经过转染敲低linc02041慢病毒载体后能够显著抑制肝癌细胞中linc02041的表达水平。

试验例3过表达/敲低linc02041肝癌细胞的增殖情况

本试验例通过细胞计数试验(CCK-8)探讨过表达/敲低linc02041肝癌细胞的增殖情况，具体步骤如下：

1)用胰蛋白酶处理各组转染后的细胞，并用细胞计数仪进行计数；然后用适量的完全培养基重悬各组转染后的细胞，使每100μL细胞悬液中含2500个细胞之后；在96孔板中接种各组转染后的细胞，每孔含有100μL细胞悬液，每组设置6个复孔，不含培养基的孔需要加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行液封，然后将96孔板放入37℃、5％ CO₂的培养箱中培养；

2)待细胞贴壁后，向培养基中加入10μL细胞计数(CCK-8)试剂；

3)将96孔培养板放入培养箱中培养1-4h，并使用酶标仪每隔1h测量450nm处的吸光值；这些测量结果作为起始时间点(0h)的试验结果；

4)在培养细胞的24h、48h、72h后，分别向培养基中加入10μL的CCK-8试剂，然后将96孔板放回培养箱中继续进行培养1-4h，并在每隔1h后使用酶标仪测450nm吸光值；

5)处理试验数据，以0h、24h、48h、72h为横坐标，450nm吸光值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，结果如图3所示。

图3为过表达/敲低linc02041肝癌细胞的增殖情况图。由图3可知，SMMC7721细胞、SNU449细胞的2041-OE组的增殖显著高于LV-NC组，而HCCLM3细胞的2041-sh组增殖显著低于LV-NC组。^****P<0.0001表明组间具有显著差异。

分析图3可知，与对照组细胞相比，过表达linc02041肝癌细胞的OD450值明显增强，这说明过表达linc02041能够促进肝癌细胞的增殖；而敲低linc02041肝癌细胞的OD450值明显受到抑制，这说明敲低linc02041能够抑制肝癌细胞的增殖。

试验例4过表达/敲低linc02041的肝癌细胞克隆情况

本试验例通过克隆形成试验探讨过表达/敲低linc02041的肝癌细胞克隆情况，具体步骤如下：

1)选取对数生长期的各组转染后的细胞，使用胰蛋白酶消化处理胞获取细胞沉淀后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞两次，最后通过细胞计数仪对细胞数目进行计数；

2)在6孔板中接种各组转染后的细胞，每孔接种2500个细胞，每种细胞设置3个重复孔，每孔加2mL培养基配制细胞悬浮液；

3)将6孔板中的细胞混匀后，放入37℃、5％ CO₂的细胞培养箱中培养10-14天。当能够在显微镜下看到各组克隆转染细胞时，停止培养细胞，吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞两次。然后，在每个孔中加入1mL 4％的多聚甲醛，在25℃下固定细胞30min。之后除去固定液，加入1mL0.1％的结晶紫，在25℃下染色30min；除去染色液，用PBS洗两遍，室温下静置10min；将6孔板放在白色A4纸上进行拍照，并使用显微镜计数，结果如图4所示。

图4为过表达/敲低linc02041肝癌细胞的克隆情况图。由图4可知，SMMC7721细胞、SNU449细胞2041-OE组的克隆显著高于LV-NC组，而HCCLM3的2041-sh组克隆显著低于LV-NC组。^****P<0.0001表明组间具有显著差异。分析图4知，与对照细胞相比，过表达linc02041能够促进肝癌细胞的克隆；而敲低linc02041能够抑制肝癌细胞的克隆。

试验例5过表达/敲低linc02041的肝癌细胞的横向迁移和侵袭

本试验例通过伤口愈合试验检测过表达/敲低linc02041肝癌细胞的横向迁移和侵袭，具体步骤如下：

1)选取对数生长期的各组转染后的细胞，使用胰蛋白酶消化处理获取细胞沉淀后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞两次，最后通过细胞计数仪对细胞数目进行计数。按照每孔加入2mL细胞悬液使用完全培养基重悬细胞，在6孔板的每孔铺1×10⁶个细胞，每组细胞做3个复孔；

2)待转染后的细胞长至85％左右时，弃去旧培养基并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗一次，用量程为200μL移液枪和枪头在6孔板底部均匀地画三条平行竖线；

3)使用PBS清洗6孔板两次，使用显微镜进行观察并拍照，作为第0h的划痕图像；然后去除PBS，在每孔加入中2mL不含血清的培养基继续培养细胞；

4)分别在划痕后的第24h和48h拍摄细胞划痕图像，结果如图5-6所示。

图5为伤口愈合试验检测linc02041过表达肝癌细胞的横向迁移和侵袭情况图。其中图5A-B分别为过表达linc02041的SMMC7721细胞、SNU449细胞横向迁移和侵袭情况图(显微镜放大倍数为10×)。由图5可知，linc02041过表达的SMMC7721细胞、SNU449细胞的2041-OE组的相对间隙显著高于LV-NC组。

图6为伤口愈合试验检测过表达/敲低linc02041的HCCLM3细胞横向迁移和侵袭情况图(显微镜放大倍数为10×)。由图6可知，敲低linc02041的HCCLM3细胞的2041-sh组相对间隙显著低于LV-NC组。^**P<0.01表明组间具有显著差异。

综合图5-6可知，过表达linc02041能够显著促进肝癌细胞的横向迁移和侵袭；敲低linc02041能够显著抑制肝癌细胞的横向迁移和侵袭。

试验例6过表达/敲低linc02041肝癌细胞的纵向迁移和侵袭

本试验例通过细胞迁移及侵袭试验检测过表达/敲低linc02041肝癌细胞的纵向迁移和侵袭，具体步骤如下：

1、细胞迁移试验(Transwell)

1)试验开始前12h将各组转染后细胞的培养基更换为不含血清的培养基；

2)将8.0μm的Transwell小室放入24孔板中，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗两次，之后向Transwell小室中加入100μL无血清培养基，将24孔板置于37℃，5％ CO₂培养箱中处理20min；

3)使用胰蛋白酶消化处理饥饿状态下的各组转染后的细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后用无血清培养基重悬细胞，通过细胞计数仪对细胞数目进行计数；

4)每个小室加入细胞数量为6×10⁴个(其与无血清培养基总体积为200μL)；

5)取出Transwell小室，吸去培养基后加入相应的细胞悬液；每个小室下方的孔中需加入600μL含20％ FBS培养基；将24孔板放入37℃，5％CO₂培养箱中培养；

6)铺入细胞36h后，取出Transwell小室，吸除小室内的培养基，将小室移至另一个每孔含600μL PBS的24孔板中，洗涤两次；然后将小室放入600μL甲醇溶液中固定30min；固定完成后，将小室放入600μL 0.1％结晶紫溶液中染色30min；结束后用PBS洗涤三遍；用棉签擦拭干净小室内部的细胞；

7)将小室晾干后置于载玻片上于显微镜进行观察并拍照；统计分析细胞纵向迁移。

2、细胞侵袭试验(Transwell)

先使用基质胶：无血清培养基＝1：6的混合物涂覆Transwell孔，然后将Transwell小室置于在37℃、5％ CO₂的培养箱中处理4h，其余步骤细胞迁移试验一致。

图7为Transwell试验检测过表达linc02041的SMMC7721细胞、SNU449细胞的纵向迁移和侵袭情况图(显微镜放大倍数为200×)。图8为Transwell试验检测敲低linc02041的HCCLM3细胞的纵向迁移和侵袭情况图(显微镜放大倍数为200×)。由图7可知，过表达linc02041的SMMC7721细胞、SNU449细胞的2041-OE组的纵向迁移和侵袭均显著高于LV-NC组。由图8可知，敲低linc02041的HCCLM3细胞的2041-sh组迁移、侵袭均显著低于LV-NC组。^**P<0.01表明组间具有显著差异。

综合图7-8可知，过表达linc02041能够显著促进肝癌细胞的纵向迁移和侵袭；敲低linc02041能够显著抑制肝癌细胞的纵向迁移和侵袭。

试验例7过表达/敲低linc02041肝癌细胞的上皮间质转化(EMT)、凋亡蛋白表达情况

本试验例通过蛋白质印迹法探讨过表达/敲低linc02041的肝癌细胞的EMT、凋亡蛋白表达情况，具体步骤如下：

1)蛋白提取

用胰蛋白酶消化各组转染后的细胞，并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次；然后采用蛋白酶抑制剂(PMSF)与RIPA裂解液混合物，使各组转染后的细胞裂解30min，期间每隔5min涡旋震荡一次；裂解完成后，将细胞于温度为4℃、转速为12000rpm的高速离心机中离心处理15min。离心结束后，将上清液并转移至新的离心管中，即可得到细胞蛋白溶液，保存于-80℃备用。

2)BCA蛋白浓度检测试验

(1)根据BCA试剂盒说明书的建议，分别取0μL、2μL、4μL、6μL、8μL和10μL的BSA标准溶液加入96孔酶标板中，每孔加入10μL的去离子水补足体积；待测样品组，每孔加入10μL的待测样品；

(2)所有的样品孔和BSA标准品孔中均加入200μL的BCA工作液，然后将96孔酶标板置于37℃的环境黑暗中孵育30min；

(3)取出96孔酶标板，恢复至室温后，使用酶标仪在562nm处测量吸光度值；然后，通过测量BSA标准品溶液的吸光度值和已知浓度绘制出标准曲线；最后通过标准曲线和待测样品吸光度值计算出待测样品的蛋白质浓度。

3)蛋白质印迹法检测目的蛋白

样品蛋白质变性：根据蛋白质浓度结果，使用RIPA裂解液调整所有样品的浓度，使所有样品浓度相等；然后在40μL蛋白样品中加入10μL 5×SDS蛋白上样缓冲液混合后进行离心；离心完成后于98℃下加热10min，待冷却后分装并储存于-20℃冰箱中；

制备凝胶：清洗凝胶材料并晾干。将平面玻璃板和凹槽玻璃板对齐放入凝胶架中固定，加入双蒸水检漏，然后按照表6配制分离凝胶和浓缩凝胶的试剂配比。分离凝胶的浓度越高，越有利于小分子蛋白的分离。首先配制合适浓度的分离凝胶，混合后快速倒入两块玻璃板中间。液面距离最短玻璃板为1cm左右，然后缓慢加入ddH₂O液封。在25℃下静置30min，等待分离凝胶凝固后，倒掉液封的ddH₂O并用吸水纸吸干残余的水。然后配制5％的浓缩凝胶，混合后加入到分离凝胶的上层，直到刚刚溢出为止。缓慢插入梳子，避免产生气泡；

表6SDS-PAGE凝胶配比

电泳：待浓缩胶凝固后缓慢垂直拔掉梳子，然后放入电泳槽中，加入适量的电泳缓冲液；将蛋白样品加入孔中，在适当孔位加入等体积的蛋白marker作为对照，多余的孔位加入与蛋白样品等体积的1×SDS上样缓冲液；把电极插在电泳仪上，打开开关调整初始电压为80V；当溴芬蓝进入分离胶后，把电压更改至120V，当样品接近玻璃板固定架底部时应当立即停止电泳；

转膜：电泳结束后根据彩色marker条带指示，切取目的蛋白所在区域的胶并将胶浸泡在转膜液中；按照所切胶的长宽裁剪相应大小的PVDF膜，并将PVDF膜放入甲醇中浸泡10-30s激活。将海绵垫、滤纸、胶、PVDF膜依次构建三明治转膜结构；按照负极(黑色面)-海绵垫-两层滤纸-凝胶-PVDF膜-两层滤纸-海绵垫-正极(白色面)的顺序组装完成；将上述三明治结构放入含有预冷转膜液的转膜槽内，将转膜槽放入冰水浴中。然后把电极插在电泳仪上，打开开关调整电流为200mA，转膜时间根据目的蛋白大小而定；

封闭：转膜后将PVDF膜放入使用1×TBST溶液配制的5％脱脂奶粉溶液中，在室温下，置于摇床上封闭2h；

孵育一抗：将PVDF膜用纯水清洗两次后浸泡在1×TBST溶液中，将按照表7配制的抗体倒入抗体孵育盒中，将含有目的条带的PVDF膜放入与其对应的抗体溶液中，4℃孵育过夜；

洗膜：取出抗体孵育盒，将抗体回收后在低速摇床上用1×TBST溶液洗膜5次，每次约7min；

孵育二抗：按照二抗说明书配制二抗溶液，将相应的PVDF膜浸润在其二抗溶液中，在摇床上以室温孵育2h；

洗膜：方法同上述洗膜过程；

显影：用吸水纸上吸去PVDF膜上沾附的TBST溶液，放在曝光仪托盘中央，滴加ECL发光液使其浸润整个PVDF膜后，使用全自动凝胶成像仪进行显影和采集图像；

分析：根据显影结果，分析目的蛋白的表达量以及相关信息，结果如图9-10所示。

表7一抗稀释比例及其种属

图9为过表达/敲低linc02041细胞中上皮细胞-间质转化(EMT)标志物表达情况图。由图9可知，过表达linc02041细胞中上皮细胞标志物(E-cadherin)表达降低，间质细胞标志物(N-cadherin、vimentin)表达增强；敲低linc02041细胞的E-cadherin表达增加，N-cadherin、vimentin表达降低。

图10为过表达/敲低linc02041细胞凋亡蛋白表达情况图。由图10可知，过表达linc02041细胞能显著抑制凋亡蛋白的表达；敲低linc02041细胞能显著促进凋亡蛋白的表达。

综上，本发明通过生物信息学分析出linc02041在肝细胞癌与癌旁组织样本中存在差异性表达。基于linc02041在肝癌与癌旁组织样本中的差异性表达，本发明通过构建细胞转染模型，同时获得了过表达和敲低linc02041的肝癌细胞，首次发现了linc02041与肝癌的进展相关，同时披露了linc02041相关作用机制。体外试验结果发现，通过敲低linc02041能够抑制肝癌细胞的增殖、克隆、迁移及侵袭，抑制间质细胞标志物的表达，促进上皮细胞标志物以及凋亡蛋白的表达，来调控肝癌的进展。这表明linc02041在肝癌中发挥促癌的作用，能够为开发新型的肝癌治疗药物提供研发方向和理论支撑。

以上仅为本发明的优选实施例，不限于上述的举例，对于本领域的技术人员来说，在本发明的原理下，可以有各种更改和变化。所作的任何修改、改进等，均应视为在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种长链非编码RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA为linc02041，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的长链非编码RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述肝癌为肝细胞癌。

3.如权利要求1所述的长链非编码RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述肝癌治疗药物通过敲低linc02041来调控肝癌的进展。

4.如权利要求1所述的长链非编码RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述肝癌治疗药物通过敲低linc02041来抑制肝癌细胞的增殖、克隆、迁移、侵袭，从而调控肝癌的进展。

5.如权利要求3或4所述的长链非编码RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述敲低linc02041是通过设计特异性小干扰RNA来降低linc02041的表达水平；所述特异性小干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；

6.靶向长链非编码RNA的特异性小干扰RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA为linc02041，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.如权利要求6所述的靶向长链非编码RNA的特异性小干扰RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述特异性小干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；

8.如权利要求6或7所述的靶向长链非编码RNA的特异性小干扰RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述肝癌为肝细胞癌。

9.如权利要求7所述的靶向长链非编码RNA的特异性小干扰RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述特异性小干扰RNA通过抑制linc02041的表达来抑制肝癌细胞的增殖、克隆、迁移、侵袭，从而调控肝癌的进展。

10.如权利要求7所述的靶向长链非编码RNA的特异性小干扰RNA在制备肝癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述特异性小干扰RNA通过促进上皮细胞标志物、凋亡蛋白的表达，降低间质细胞标志物的表达，来调控肝癌的进展。