CN116875738A - 一种鉴定牛tdp-43基因启动子活性区域的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴定牛TDP‑43基因启动子活性区域的方法，包括以下步骤：(1)牛TDP‑43基因启动子的克隆；(2)牛TDP‑43启动子5’端系列缺失片段荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定；(3)牛TDP‑43基因启动子系列缺失片段转录活性分析及核心启动子区确定；(4)牛TDP‑43核心启动子区转录因子结合位点预测及筛选。通过本发明，为进一步筛选调控牛TDP‑43基因表达的转录因子、研究调控TDP‑43基因转录的具体机制提供了一种便捷高效的方法。
Description
技术领域
本发明属于奶牛育种基因工程领域，具体涉及一种鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
牛奶及其制品营养丰富，被列为健康和均衡饮食的重要组成部分。乳脂含量影响牛奶的营养价值和风味，是评定牛奶品质的重要指标之一。提高乳脂含量是当前奶牛育种工作的一个重要方向。牛乳腺上皮细胞中甘油三脂的合成和分泌是影响牛奶乳脂含量的关键因素。
TDP-43基因也称为TARDBP基因，编码多功能的DNA和RNA结合蛋白TAR DNA-binding protein 43(TDP-43)。TDP-43蛋白属于核不均一核糖核蛋白家族(hnRNP)，它通过识别并结合DNA中富含TG的序列或RNA中富含UG的序列，以多种方式调控基因的表达，包括对基因转录、pre-mRNA选择性剪接、mRNA稳定性等过程的调控。TDP-43具有广泛的生物学功能，它不仅在乳腺再生及乳腺上皮细胞增殖中发挥重要作用，并且TDP-43通过调控与乳脂滴分泌相关蛋白基因Btn1a1和Xdh的mRNA稳定性在乳腺上皮细胞乳脂分泌过程中发挥关键作用。然而，TDP-43基因在乳腺上皮细胞中的转录调控机制尚不清楚。
基因在不同组织、不同细胞中的差异表达造就了生物体细胞和器官的表型及功能差异。基因转录水平调控是影响基因表达的重要环节，研究基因的转录调控对理解家畜重要经济性状形成的分子机理具有重要意义。因此，阐明TDP-43基因在牛乳腺上皮细胞中的转录调控机制，有助于拓宽对乳脂分泌过程基因调控网络的认识，为奶牛分子育种工作提供科学依据。
发明内容
针对上述问题，本发明基于双荧光素酶报告基因检测系统，分析牛TDP-43基因的启动子活性，确定牛TDP-43基因启动子核心区域，为进一步筛选调控牛TDP-43基因表达的转录因子、研究调控TDP-43基因转录的具体机制提供了一种便捷高效的方法。
具体的，本发明提供如下的技术方案：提供一种鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，包括如下步骤：
(1)克隆牛TDP-43基因启动子片段：依据牛TDP-43基因参考序列，设计引物扩增该基因5’端上游2000bp左右的启动子片段，并进行TA克隆构建牛TDP-43启动子片段的克隆载体；
(2)构建牛TDP-43基因启动子5’端系列缺失片段的荧光素酶报告基因载体：
a.首先设计5’端系列缺失片段的扩增引物：固定TDP-43基因启动子下游引物，综合考虑引物设计对序列的要求和TDP-43基因启动子序列特征，使上述TDP-43基因启动子5’端每次截短250～400bp左右，设计上游引物，并在上、下游引物序列5’端添加酶切位点；
b.以上述(1)中的克隆载体菌液为模板，加入a中引物进行PCR扩增得到所述5’端系列缺失片段；
c.回收上述5’端系列缺失片段并与pGL3-Basic连接，经转化感受态菌、挑单克隆摇菌后提取质粒；通过双酶切和测序鉴定获得该5’端系列缺失片段的重组载体；
(3)分析牛TDP-43基因启动子系列缺失片段的活性并鉴定核心启动子区：将上述(2)构建的5’端系列缺失片段的重组载体与内参质粒pRL-TK共转染奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T，通过检测双荧光素酶活性分析上述启动子系列缺失片段的转录活性，确定核心启动子区；
(4)牛TDP-43基因核心启动子区转录因子的筛选：利用在线软件AnimalTFDB4和TRANSFAC2.0预测分析牛TDP-43启动子区转录因子结合位点，从中筛选调控乳脂代谢相关转录因子结合位点。
上述鉴定方法中，本发明构建了6个牛TDP-43基因启动子5’端缺失片段的荧光素酶报告基因载体：pGL3-P1(-1893/+61)、pGL3-P2(-1473/+61)、pGL3-P3(-1118/+61)、pGL3-P4(-793/+61)、pGL3-P5(-554/+61)、pGL3-P6(-227/+61)；即所述载体分别针对启动子片段-1893～+61、-1473～+61、-1118～+61、-793～+61、-554～61、-227～+61区域进行启动子活性分析；在该实施方式中，本发明还提供如下优选的技术方案：
步骤(1)中，考虑到TDP-43基因参与调控乳脂分泌的功能，本发明优选采用奶牛样品，如荷斯坦牛的样品，开展研究；以荷斯坦牛DNA为模板，根据GenBank提供的牛TDP-43(TARDBP)基因序列，将该基因mRNA序列(NM_001046485.2)的第一个碱基作为该基因的转录起始位点即+1位置，向5’方向延伸2000bp左右序列，使用Primer Premier 5.0软件在该基因转录起始位点(+1)上、下游设计扩增5’端2000bp左右片段的引物。
PCR扩增得到所述牛TDP-43基因启动子片段；胶回收启动子片段，并与pMD-19T载体连接，通过转化感受态菌、菌液涂板培养、挑单克隆、摇菌、测序鉴定，获得TDP-43基因启动子克隆载体。具体的，引物的序列如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示。
步骤(2)中，所述载体构建的步骤如下：
以步骤(1)获得的TDP-43基因启动子克隆载体菌液为模板，PCR扩增得到6个启动子缺失片段：-1893～+61、-1473～+61、-1118～+61、-793～+61、-554～+61、-227～+61，胶回收PCR产物，用KpnI和HindIII内切酶对回收产物和pGL3-Basic空载质粒进行双酶切、纯化回收，将带黏性末端的系列缺失片段与pGL3-Basic线性化空载进行连接、转化大肠杆菌感受态，菌液涂板培养、挑单克隆、摇菌，菌液扩繁后提取质粒，使用KpnI和HindIII双酶切鉴定后，将对应阳性菌液测序鉴定。鉴定正确的质粒即为所述系列缺失片段荧光素酶报告基因载体，依次命名为pGL3-P1(-1893/+61)、pGL3-P2(-1473/+61)、pGL3-P3(-1118/+61)、pGL3-P4(-793/+61)、pGL3-P5(-554/+61)、pGL3-P6(-227/+61)；所述启动子缺失片段的扩增引物如SEQ ID NO:3-9所示。
步骤(1)和步骤(2)中，PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s,55℃30s,72℃2min10s，35个循环；72℃10min；4℃10min。
步骤(3)中，待奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T生长至80％左右融合度，共转染上述荧光素酶报告基因载体质粒和内参质粒pRL-TK，转染48h后检测细胞中双荧光素酶活性，即萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性；所述系列缺失片段的启动子活性＝萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值，通过统计学方法单因素方差分析对系列缺失片段的启动子活性进行差异显著性检验。
基于上述差异显著性检验结果，本领域技术人员可从系列启动子缺失片段中确定牛TDP-43基因启动子具有转录活性的区域及核心启动子区；本发明采用上述方法，最终确认牛TDP-43基因的核心启动子区位于-554～-227片段中。
基于上述步骤(4)，通过软件预测分析在TDP-43核心启动子区存在参与乳脂代谢相关重要转录因子SP1、PPARG、PPARD的结合位点。
本领域技术人员可根据预测结果进行定点突变和转录因子结合相关试验验证即可确认对应结合位点是否为牛TDP-43基因启动子转录调控元件，并获得该基因在乳腺上皮细胞中的转录调控机制，拓宽乳脂分泌过程基因调控网络。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为牛TDP-43基因启动子扩增产物凝胶电泳检测结果；
其中，泳道M为DL2000 plus Marker；泳道1为PCR产物；
图2为TDP-43启动子系列缺失片段扩增产物凝胶电泳检测结果；
其中，泳道M为DL2000 plus Marker；泳道1～6分别为系列缺失片段PCR产物；
图3为双酶切鉴定6个重组质粒电泳图；
其中，泳道M为DL2000 plus Marker；泳道1～6分别为系列缺失片段重组质粒双酶切产物；
图4为牛TDP-43基因启动子5’端系列缺失片段活性分析；
其中，pGL3-Basic为荧光素酶报告基因空载体；LUC不同缺失片段荧光素酶报告基因载体；均值左上角A,B,C,D表示差异极显著(P≤0.01)；
图5为牛TDP-43基因核心启动子区预测乳脂代谢相关转录因子结合位点；
其中，方框内的序列为转录因子结合位点。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
1.牛TDP-43基因启动子的克隆
1.1引物设计及PCR扩增
依据GenBank提供的牛TDP-43(TARDBP)基因序列(NC_037343.1)，将该基因mRNA序列(NM_001046485.2)的第一个碱基作为该基因的转录起始位点即+1位置，向5’方向延伸2000bp左右，使用Primer Premier 5.0软件在该基因转录起始位点(+1)上、下游设计扩增5’方向2000bp左右片段的引物。引物序列如下：
上游引物为F：5’-GCAAAGGGATAGAGGGAA-3’(SEQ ID NO:1)
下游引物为R：5’-CAGGGCGTCCTTAGTGAG-3’(SEQ ID NO:2)
以荷斯坦牛血液基因组DNA为模板进行PCR扩增，25μL反应体系：DNA模板(20ng/μL)2μL，LA Taq酶0.25μL，上、下游引物(10μmol/μL)各0.5μL，2×GC Buffer I 12.5μL，dNTPMixture(2.5mM each)4μL，ddH2O 5.5μL。
PCR反应程序：95℃5min；95℃30s,55℃30s,72℃2min10s，35个循环；72℃10min；4℃10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2克隆载体的连接
胶回收PCR产物中的目的片段，目的片段与pMD19-T克隆载体于16℃过夜连接，之后转化DH5α大肠杆菌感受态，菌液涂板培养12～16h，挑单克隆，摇菌，测序鉴定，获得目的启动子片段克隆载体，保存测序正确菌液。
2.牛TDP-43启动子5’端系列缺失片段荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定
2.1引物设计及系列缺失片段扩增
固定牛TDP-43启动子序列下游引物，使用Primer Premier 5.0软件设计5’端系列缺失引物，并分别在上、下游引物序列5’端添加KpnI和HindIII酶切位点，引物信息见表1，其中斜体表示所添加酶切位点序列。
表1.TDP-43启动子5’端系列缺失片段引物信息
以步骤1.2获得的测序正确克隆载体菌液为模板，分别扩增TDP-43启动子系列缺失片段，反应体系：菌液2μL，LA Taq酶0.25μL，上、下游引物(10μmol/μL)各0.5μL，2×GCBuffer I 12.5μL，dNTP Mixture(2.5mM each)4μL，ddH2O 5.5μL。PCR反应程序同步骤1.1。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
2.2系列缺失片段荧光素酶报告基因载体构建及鉴定
将步骤2.1获得的PCR产物进行胶回收，用KpnI和HindIII内切酶分别对回收产物和pGL3-Basic空载质粒进行双酶切、纯化回收。将带黏性末端的系列缺失片段与pGL3-Basic线性化空载进行连接、转化DH5α感受态菌，涂板、挑单克隆、摇菌，菌液扩繁后提取质粒，使用KpnI和HindIII双酶切鉴定后，将阳性菌液测序鉴定。鉴定正确的菌液进行扩繁，使用去内毒素试剂盒提取质粒。获得牛TDP-43基因启动子5’端系列缺失片段萤火虫荧光素酶报告基因载体，依次命名为pGL3-P1(-1893/+61)、pGL3-P2(-1473/+61)、pGL3-P3(-1118/+61)、pGL3-P4(-793/+61)、pGL3-P5(-554/+61)、pGL3-P6(-227/+61)。
3.牛TDP-43基因启动子系列缺失片段转录活性分析
3.1细胞培养及质粒转染
奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T培养于含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM-F12培养基中，培养箱温度为37℃、二氧化碳浓度为5％。转染前一天，将生长状态良好的MAC-T细胞接种于24孔培养板中，接种密度1×105个细胞/孔。待细胞生长至80％左右融合度时，将2.2获得的系列缺失片段荧光素酶报告基因重组质粒转染细胞，同时pGL3-Basic空载质粒作为阴性对照，pRL-TK质粒作为内参。每个质粒每次转染3个孔，实验重复3次。根据InvitrogenLipofectamine3000说明书进行转染操作，每孔具体如下：
(1)配置溶液I：25μL opti-MEM+1μL Lipofectamine 3000(轻柔吹打混匀)；
(2)配置溶液II：25μL opti-MEM+20ng pRL-TK+500ng pGL3+1μL P3000(质粒加入混匀后，再加入P3000轻柔吹打混匀)；
(3)溶液I和II各静置5min后，合并混匀，静置10～15min。将50μL混悬液滴加入培养基中；转染48h左右检测双荧光素酶活性。
3.2双萤光素酶活性检测
根据Dual-Luciferase报告基因检测系统操作指南，具体步骤如下：
3.2.1准备试剂
(1)配置LARII：用Luciferase Assay Buffer II溶解Luciferase AssaySubstrate，并分装于1.5mL棕色PE管，-80℃冰箱保存备用。
(2)配置Stop&Glo:将1倍体积Stop&Glo Substrate(50×)与50倍体积的Stop&GloBuffer混合，24孔板每孔配置100μL。
(3)配置被动裂解缓冲液1×PLB：用蒸馏水将5×Passive Lysis Buffer(PLB)稀释至1×PLB，24孔板每孔配置100μL。
3.2.2裂解细胞
弃掉转染48小时左右24孔板中培养基，用1×PBS洗一遍细胞后，每孔加入100μL 1×PLB，将24孔板置于37℃摇床中缓慢晃动裂解细胞15min。
3.2.3检测双荧光素酶活性
每个孔依次按照如下步骤检测：在干净1.5mL PE管中加入100μL LARII，吸取20μL细胞裂解液混匀后使用萤光发光仪检测萤火虫荧光素酶活性值，继续向管中加入100μLStop&Glo，检测海肾荧光素酶活性值。
萤火虫荧光素酶活性值与海肾荧光素酶活性值的比值为启动子系列缺失片段的相对转录活性。对系列缺失片段的相对转录活性进行统计分析，采用单因素方差分析进行差异显著性检验，实验结果以均值±标准差表示，P≤0.05为差异显著，P≤0.01为差异极显著。
4.牛TDP-43基因启动子区转录因子结合位点预测
利用AnimalTFDB4(bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB4)和TRANSFAC2.0(https://genexplain.com/transfac-2-0/)在线分析程序分析预测牛TDP-43启动子区转录因子结合位点，筛选出与乳脂代谢相关转录因子结合位点。
5.实验结果
5.1牛TDP-43基因启动子扩增
如图1所示，PCR扩增获得1954bp牛TDP-43基因启动子片段。将目的片段回收并连接T载后，测序比对结果与GenBank数据库中提供的TDP-43基因5’侧翼序列一致。即成功克隆获得牛TDP-43基因启动子序列。
5.2TDP-43基因启动子系列缺失片段荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定
以上述获得的T载体菌液为模板，利用5’端系列缺失引物，PCR扩增获得带酶切位点的6个缺失片段，条带大小依次为1954bp、1534bp、1179bp、854bp、615bp、288bp(图2)。将6个片段与pGL3-Basic质粒的双酶切产物分别胶回收后，通过连接获得重组质粒pGL3-P1(-1893/+61)、pGL3-P2(-1473/+61)、pGL3-P3(-1118/+61)、pGL3-P4(-793/+61)、pGL3-P5(-554/+61)、pGL3-P6(-227/+61)。如图3为双酶切鉴定6个重组质粒电泳图，图中每个泳道各有两条带，其中一条为线性化pGL3-Basic空载，约4.8Kb，第二条依次为1954bp、1534bp、1179bp、854bp、615bp、288bp的目的片段。通过测序验证连接序列均正确。即构建获得6个系列缺失片段的萤火虫荧光素酶报告基因载体。
5.3牛TDP-43基因启动子系列缺失片段转录活性分析及核心启动子区确定
牛TDP-43基因启动子5’端系列缺失片段转录活性分析结果如图4所示，pGL3-Basic空载体的活性几乎为0，而pGL3-P1(-1893/+61)的启动子活性值大于30，极显著(P≤0.01)高于pGL3-Basic载体，表明TDP-43基因1954bp(-1893/+61)5’侧翼片段具有较强启动子活性，即克隆得到的1954bp片段中包含牛TDP-43基因的功能启动子。pGL3-P1(-1893/+61)的启动子活性极显著(P≤0.01)高于pGL3-P2(-1473/+61)，说明缺失-1893～-1473之间的片段后启动子转录活性降低，提示该片段中存在促进TDP-43转录活性的正调控元件。pGL3-P2(-1473/+61)、pGL3-P3(-1118/+61)和pGL3-P4(-793/+61)之间的启动子活性差异不显著(P＞
0.05)，提示-1473～-793区域对TDP-43基因的转录活性没有显著作用。
pGL3-P4(-793/+61)启动子活性极显著(P≤0.01)低于pGL3-P5(-554/+61)，表明-793～-554之间存在抑制TDP-43基因转录的负调控元件，并且-554/+61片段转录活性最高。值得关注的是缺失-554～-227片段后，启动子活性丧失，表现为pGL3-P6(-227/+61)与pGL3-Basic的启动子活性无显著差异(P＞0.05)，表明-554～-227片段为TDP-43的核心启动子区。
软件分析显示牛TDP-43核心启动子区存在SP1、PPARG、PPARD等乳脂代谢相关重要转录因子结合位点(图5)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)克隆牛TDP-43基因启动子片段：依据牛TDP-43基因参考序列，设计引物扩增该基因5’端上游2000bp左右的启动子片段，并进行TA克隆构建牛TDP-43启动子片段的克隆载体；
(2)构建牛TDP-43基因启动子5’端系列缺失片段的荧光素酶报告基因载体：
a.首先设计5’端系列缺失片段的扩增引物：固定TDP-43基因启动子下游引物，综合考虑引物设计对序列的要求和TDP-43基因启动子序列特征，使上述TDP-43基因启动子5’端每次截短250～400bp左右，设计上游引物，并在上、下游引物序列5’端添加酶切位点；
b.以上述(1)中的克隆载体菌液为模板，加入a中所述的扩增引物进行PCR扩增得到5’端系列缺失片段；
c.回收b中5’端系列缺失片段并与pGL3-Basic连接，经转化感受态菌、挑单克隆摇菌后提取质粒；通过双酶切和测序鉴定获得该5’端系列缺失片段的重组载体；
(3)分析牛TDP-43基因启动子系列缺失片段的活性并鉴定核心启动子区：将(2)构建的5’端系列缺失片段的重组载体与内参质粒pRL-TK共转染奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T，通过检测双荧光素酶活性分析所述5’端系列缺失片段的转录活性，确定核心启动子区；
(4)牛TDP-43基因核心启动子区转录因子的筛选：利用在线软件AnimalTFDB4和TRANSFAC2.0预测分析牛TDP-43启动子区转录因子结合位点，从中筛选调控乳脂代谢相关转录因子结合位点。
2.如权利要求1所述鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，步骤(1)中，以荷斯坦牛DNA为模板，根据GenBank提供的牛TDP-43基因序列，将该基因mRNA序列的第一个碱基作为该基因的转录起始位点，向5’方向延伸2000bp左右序列，使用PrimerPremier 5.0软件在该基因转录起始位点上、下游设计扩增5’端2000bp左右片段的引物，所述引物序列如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求2所述鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，采用所述引物扩增得到牛TDP-43基因启动子片段；胶回收启动子片段，并与pMD-19T载体连接，通过转化感受态菌、菌液涂板培养、挑单克隆、摇菌、测序鉴定，获得牛TDP-43启动子片段的克隆载体。
4.如权利要求1所述鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述5’端系列缺失片段的扩增引物，其序列如SEQ ID NO:3-9所示。
5.如权利要求4所述鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，采用所述引物扩增得到6个启动子缺失片段：-1893～+61、-1473～+61、-1118～+61、-793～+61、-554～+61、-227～+61，胶回收PCR产物，用KpnI和HindIII内切酶对回收产物和pGL3-Basic空载质粒进行双酶切、纯化回收，将带黏性末端的系列缺失片段与pGL3-Basic线性化空载进行连接、转化大肠杆菌感受态，菌液涂板培养、挑单克隆、摇菌，菌液扩繁后提取质粒，使用KpnI和HindIII双酶切鉴定后，将对应阳性菌液测序鉴定；鉴定正确的质粒即为所述系列缺失片段荧光素酶报告基因载体，依次命名为pGL3-P1(-1893/+61)、pGL3-P2(-1473/+61)、pGL3-P3(-1118/+61)、pGL3-P4(-793/+61)、pGL3-P5(-554/+61)、
pGL3-P6(-227/+61)。
6.如权利要求1所述鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s,55℃30s,72℃2min10s，35个循环；72℃10min；4℃10min。
7.如权利要求1所述鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，步骤(3)中，待奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T生长至80％左右融合度，共转染上述荧光素酶报告基因载体质粒和内参质粒pRL-TK，转染48h后检测细胞中双荧光素酶活性。
8.如权利要求7所述鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，所述荧光素酶活性即萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性；所述5’端系列缺失片段的启动子活性＝萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值，通过统计学方法单因素方差分析对所述启动子活性进行差异显著性检验。
9.如权利要求8所述鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，所述牛TDP-43基因的核心启动子区位于-554～-227片段中。
10.如权利要求9所述鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，基于步骤(4)的方法鉴定所述核心启动子区中，包括重要转录因子SP1、PPARG、PPARD的结合位点。
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