CN116874566B - 一种阿托西班烷基化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物检测领域，具体涉及一种阿托西班烷基化方法。在阿托西班的二硫键还原烷基化反应中使用介孔材料。所述介孔材料包括分子筛、MOFs材料中的一种或多种。所述分子筛为KIT‑6分子筛；所述MOFs材料为MIL‑101(Gr)。本发明KIT‑6分子筛和/或MIL‑101(Gr)加入到阿托西班还原烷基化反应中可通过限域作用缩短反应时间。

Description

一种阿托西班烷基化方法

技术领域

本发明属于药物检测领域，具体涉及一种阿托西班烷基化方法。

背景技术

多肽药物(Peptidedrugs)是由氨基酸通过肽键相连构成的一类化合物，自1922年推出胰岛素以来，已有80多种多肽药物进入市场，用于治疗多种疾病，包括糖尿病、癌症、骨质疏松症、多发性硬化症、艾滋病毒感染和慢性疼痛。与化学药相比，多肽药物对体内靶点识别具有更高的特异性，同时也更加高效、安全，已经成为新药开发的新方向。然而，由于多肽药物合成步骤繁琐、理化性质不稳定，对其结构及其杂质结构的鉴定是十分有必要的。高分辨质谱具有分辨率高、质量精度高等优势，已经成为鉴定多肽药物结构最有力的工具之一。二硫键是蛋白质最重要翻译后修饰之一，其通过链间或链内的半胱氨酸连接，对于稳定蛋白质的高级结构并调节蛋白质的生物学功能至关重要。因此，多肽药物的结构中也常需要构建二硫键添加交联来稳定折叠构象，从而发挥其体内活性。然而，由于具有二硫键的多肽或蛋白质在质谱检测中显示出抗断裂性，二硫键还原仍然是质谱通过低能碰撞诱导裂解(CID)进行结构分析的必要条件。因此，通过质谱鉴定多肽药物的首要条件是对其二硫键进行还原烷基化。

阿托西班，1，2，4和8位修饰的缩宫素分子，是催产素加压素竞争性拮抗剂，由于副作用较低，临床上常用于治疗早产保胎，其结构为c[Mpr-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2，是由9个氨基酸缩合而成的二硫键型的环状多肽，其中1位3-巯基丙酸的巯基与6位半胱氨酸的巯基形成二硫键，稳定结构并发挥生物功能。在检验工作中，我们对阿托西班原料样品进行还原烷基化处理，得到样品后通过高分辨质谱来检测，结果发现双烷基化的阿托西班占比例较低，低丰度的双烷基化碎片致使阿托西班的结构解析十分困难。针对这一问题我们查阅相关文献，发现阿托西班结构中的二硫键是由1位的3-巯基丙酸与6位半胱氨酸间的巯基形成，而通常多肽药物或蛋白质分子的链内和链间的二硫键均是由两个半胱氨酸的巯基相连而成。因此，两个不同活性的巯基在发生还原烷基化时可能会出现还原烷基化效率不同，1位的3-巯基丙酸难以形成烷基化产物，从而导致形成双烷基化的阿托西班较为困难。没有被还原或者没有被烷基化成功将会直接影响质谱的检测效率，从而影响阿托西班的结构及杂质检测。

分子筛的主要特征是狭窄、对称的中孔尺寸分布，目前已被广泛用作多相催化、选择性吸附和控制药物释放的载体。多孔材料中所谓的约束效应会强烈影响扩散、相变、催化性能等。分子筛KIT-6作为一种介孔材料，具有具有均匀的、互穿的、双连续的三维圆柱形孔隙网络初级孔隙孔径分布较窄，孔径为7～8nm。目前，已被证明是催化反应的有效载体。

MIL-101(Gr)是一种金属-有机骨架材料(Metal-OrganicFrameworks，MOF s)，MOFs具有高孔隙率、大比表面积、孔道规则等优点，并且其具有的金属离子也有一定的催化活性。已有研究使用UIO-66-NH₂用于地龙蛋白的消化。

发明内容

进一步优化阿托西班的还原烷基化条件，使其具有最佳的双烷基化效率对于阿托西班或结构类似于阿托西班的多肽药物的结构鉴定是十分有利的。

本发明通过研究发现，为了有效缩短阿托西班还原烷基化的反应时间，采用介孔纳米材料作为固相是一种很好的选择。发明人认为介孔材料可以效地吸附反应物，并加快阿托西班还原烷基化的反应进程。

本发明通过KIT-6分子筛/MIL-101(Gr)型MOF吸附阿托西班后，再加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行二硫键的还原烷基化反应，缩短反应时间。此外，双烷基化的阿托西班占比高，高丰度的双烷基化碎片致使阿托西班的结构解析更加准确。

本发明提供一种阿托西班烷基化方法，在阿托西班的巯基还原烷基化反应中使用介孔材料。

进一步的，所述介孔材料包括多孔碳材料、MOFs、介孔分子筛和多孔有机聚合物材料中的一种或多种。

进一步的，所述分子筛为KIT-6分子筛、MCM-41、SBA-15、MCM-22；所述MOFs材料为MIL-101(Gr)。

本发明提供一种阿托西班烷基化方法，包括如下步骤：

S1：将阿托西班溶液加入到介孔材料中，充分震荡，使阿托西班进入介孔材料的空穴；

S2：加入巯基还原剂，进行还原反应；

S3：将还原完成后的阿托西班放置室温，在黑暗环境下加入烷基化试剂，进行烷基化反应；

进一步的，上述方法还包括：

S4：烷基化反应后，向反应溶液中加入有机溶剂水溶液，促使还原烷基化反应后的阿托西班从介孔材料中释放，分离反应溶液与介孔材料。

进一步的，上述的方法所述巯基还原剂为DTT、TCEP或BME，所述烷基化试剂为碘乙酰胺、氯乙酰氨、环磷酰胺。

本发明提供一种阿托西班烷基化方法，所述方法包括：

S1：将阿托西班溶液加入到KIT-6分子筛中，使分子筛的浓度为10mg/mL，充分震荡，使阿托西班进入分子筛的空穴，

S2：加入DTT溶液，在一定温度下进行还原反应；

S3：将还原完成后的阿托西班放置室温，在黑暗环境下加入IAM溶液，在室温下避光震荡烷基化反应一定时间；

S4：向反应后的溶液中加入50％的乙腈-水溶液，涡旋，使还原烷基化后的阿托西班完全从分子筛中释放出来，离心使分子筛与溶液分离，使用50％的乙腈-水溶液稀释分离上清。

本发明提供一种阿托西班烷基化方法，所述方法包括：

S1：将阿托西班溶液加入到MOFs材料MIL-101(Gr)中，使MOFs材料的浓度为10mg/mL，充分震荡，使阿托西班进入MOFs材料的空穴中，

S2：加入DTT溶液，在一定温度下进行还原反应；

S3：将还原完成后的阿托西班放置室温，在黑暗环境下加入IAM溶液，在室温下避光震荡烷基化反应一定时间；

S4：之后，向反应后的溶液中加入50％的乙腈-水溶液，涡旋，使还原烷基化后的阿托西班完全从分子筛中释放出来，离心使分子筛与溶液分离，使用50％的乙腈-水溶液稀释分离上清。

本发明提供一种阿托西班烷基化方法，所述方法包括：

S1：将阿托西班溶液加入到由MOFs材料MIL-101(Gr)与KIT-6分子筛组成的介孔材料混合物中，使介孔材料的浓度为10mg/mL，充分震荡，使阿托西班进入介孔材料的空穴中；

S2：加入DTT溶液，在一定温度下进行还原反应；

S3：将还原完成后的阿托西班放置室温，在黑暗环境下加入IAM溶液，在室温下避光震荡烷基化反应一定时间；

S4：向反应后的溶液中加入50％的乙腈-水溶液，涡旋，使还原烷基化后的阿托西班完全从分子筛中释放出来，离心使分子筛与溶液分离，使用50％的乙腈-水溶液稀释分离上清；

进一步的，所述介孔材料混合物中MIL-101(Gr)与KIT-6分子筛的比例为1:1m/m。

进一步的，上述阿托西班烷基化方法，巯基还原剂DTT的8-15mM，还原温度为50-60℃，还原时间为5-30min,优选为5min；烷基化试剂碘乙酰胺浓度为10-30mM，烷基化时间为3-15min，优选为3min。

本发明有益效果在于：1)KIT-6分子筛和/或MIL-101(Gr)加入到阿托西班还原烷基化反应中可通过限域作用缩短反应时间；2)优化确定阿托西班还原反应中DTT浓度，还原时间及还原温度；烷基化反应中IAM浓度及烷基化时间。

附图说明

图1.不加入KIT-6阿托西班还原烷基化还原试剂浓度(a)还原时间(b)和还原温度(c)的影响；

图2.不加入KIT-6阿托西班还原烷基化烷基化试剂浓度(a)和烷基化时间(b)的影响；

图3.加入KIT-6后阿托西班还原烷基化还原时间(a)和烷基化时间(b)的影响；

图4.加入MIL-101后阿托西班还原烷基化还原时间(a)和烷基化时间(b)的影响；

图5.加入KIT-6和MIL-101后阿托西班还原烷基化还原时间(a)和烷基化时间(b)的影响；

图6.阿托西班还原烷基化反应优化前(a)、与基于KIT-6分子筛促进地的还原烷基化条件优化后(b)的质谱总离子流图；

图7(a)1位和6位烷基化的阿托西班总离子流图及其对应的二级质谱图；

图7(b)阿托西班在未被还原(a)、还原(b)、单烷基化(c)、双烷基化(d)时的质谱图。

具体实施方式

实施例1

实施例1为对比实验。

本专利对不含KIT-6分子筛的阿托西班还原烷基化反应中DTT的最佳浓度进行考察，控制除DTT浓度外其他参数不变，考察DTT浓度为8mM、10mM、12mM和15mM时，阿托西班的双烷基化效率；如图1a所示，当DTT的浓度为8mM时，仍有较多的阿托西班没被还原，双烷基化的阿托西班相对峰面积仅为87.37％。当DTT的浓度为15mM时，几乎所有的阿托西班都被还原，双烷基化的阿托西班相对峰面积为99.57％。

本专利对不含KIT-6分子筛的阿托西班还原烷基化反应中的最佳温度进行考察，控制除还原温度外其他参数不变，考察还原温度为50℃、55℃和60℃时，阿托西班的双烷基化效率；如图1c所示，当反应温度为55℃，可以获得最佳的还原烷基化效率。

本专利对不含KIT-6分子筛的阿托西班还原烷基化反应中的最佳还原时间进行考察，控制除还原时间外其他参数不变，考察还原时间为15min、30min、45min和60min时，阿托西班的双烷基化效率；结果表明，随着还原时间的延长，双烷基化的阿托西班相对峰面积逐步增加，直至还原时间为45min时，几乎全部的阿托西班均以双烷基化的形式存在，双烷基化的阿托西班占总峰面积的98.6％(图1b)。

本专利对不含KIT-6分子筛的阿托西班还原烷基化反应中IAM的最佳浓度进行考察，控制除IAM浓度外其他参数不变，考察IAM浓度为10mM、15mM、20mM、25mM和30mM时，阿托西班的双烷基化效率；结果表明，随着IAM的浓度增加，阿托西班的还原烷基化效率也随之增加(图2a)，这与先前的报道一致。直至IAM的浓度达到30mM时，几乎所有的阿托西班均转变为双烷基化状态，相对峰面积达到99.57％。

本专利对不含KIT-6分子筛的阿托西班还原烷基化反应中的最佳烷基化时间进行考察，控制除烷基化时间外其他参数不变，考察烷基化时间为15min、20min、25min和30min时，阿托西班的双烷基化效率，结果表明(图2b)，当烷基化时间为15min时，仍有部分单烷基化、未烷基化的阿托西班存在，双烷基化的阿托西班相对峰面积仅为87.23％，而当时间延长至20min时，阿托西班的双烷基化效率显著提高，相对峰面积达98.91％。

实施例2

为了进一步缩短反应时间本专利加入KIT-6分子筛，考察了还原时间及烷基化时间。

结果表明，KIT-6分子筛促进地的还原烷基化条件优化后双烷基化效率明显提高(见图3)：

1阿托西班还原反应5min，10min,20min和30min四个时间。结果表明，还原时间为5min时，双烷基化的产物即可达到99.69％(见图3(a))。

2阿托西班烷基化反应3min，5min，10min和15min四个时间。结果表明，

烷基化时间为3min时，双烷基化的产物即可达到94.39％(见图3(b))。

3加入KIT-6分子筛后可极大地缩短阿托西班烷基化时间(还原时间从45min缩短至5min；烷基化时间从20min缩短至3min；还原烷基化总时间由65min缩短至8min。)

实施例3

MIL-101(Gr)是一种金属-有机骨架材料(Metal-OrganicFrameworks，MOFs)，具有高孔隙率、大比表面积、孔道规则等优点。因此，MIL-101(Gr)有望促进阿托西班还原烷基化反应的效率。为了进一步缩短烷基化反应时间，本实施例对MIL-101(Gr)促进下，阿托西班的还原时间和烷基化时间进行了考察。结果表明，

1)阿托西班还原反应5min，10min和15min四个时间。结果表明，还原5min时，双烷基化的产物即可达到98.88％(见图4(a))。

2)阿托西班烷基化反应3min，5min，10min和15min四个时间。结果表明，烷基化时间3min时，双烷基化的产物即可达到99.19％(见图4(b))。

3)加入MIL-101(Gr)后可极大地缩短阿托西班烷基化时间(65min缩短至8

min)。

实施例4

基于前期的实验表明，KIT-6分子筛和MIL-101(Gr)均可用于促进阿托西班的还原烷基化反应，缩短反应时间，因此进一步考察了KIT-6分子筛和MIL-101(Gr)共同(1:1m/m)参与阿托西班还原烷基化反应的影响结果表明，KIT-6分子筛和MIL-101(Gr)共同促进还原烷基化，在条件优化后双烷基化效率明显提高(见图5)。

1加入KIT-6分子筛和MIL-101(Gr)后，阿托西班还原反应5min和10min四个时间。结果表明，还原5min时，双烷基化的产物即可达到99.77％

(见图5(a))。

2加入KIT-6分子筛和MIL-101(Gr)后，阿托西班烷基化反应3min，4min和5min四个时间。结果表明，烷基化时间3min时，双烷基化的产物即可达到99.65％(见图5(b))。

3加入KIT-6分子筛和MIL-101(Gr)后，还原烷基化总时间由65min缩短至8min。

实施例5

阿托西班还原烷基化反应优化前与基于KIT-6分子筛促进地的还原烷基化条件优化后烷基化效率对比：

本实施例对优化前、优化后的阿托西班还原烷基化产物进行质谱全扫描检测，结果如图6所示，其中图6中5.92min(6a)和5.89min(6b)的总离子流峰为双烷基化的阿托西班，分子量为1110.5068；图6a中6.26min和6.69min的总离子流峰为单烷基化的阿托西班，分子量为1053.4840；图6a中7.07min的总离子流峰为二硫键被还原的阿托西班，分子量为996.4630；图6a中7.28min的总离子流峰为未被还原的阿托西班，分子量为994.4474。优化前，双烷基化阿托西班产率很低，仅占40％左右，而优化后几乎全为双烷基化阿托西班，成功解决了阿托西班特殊二硫键难以还原烷基化的问题。

实施例6

1-位单烷基化和6-位单烷基化阿托西班保留时间的确定：

为了探究阿托西班难以形成烷基化产物是否与阿托西班结构中特殊的二硫键有关，本发明对质荷比为1053.48的单烷基化阿托西班的质谱峰进行了二级碎裂。结果表明(图7)，1位的3-巯基丙酸形成的烷基化产物(RT:6.25min)显著少于6位半胱氨酸形成的烷基化产物(RT:6.66min)。这表明1位的3-巯基丙酸与6位半胱氨酸活性不同，导致形成产物的比例不同。1位的3-巯基丙酸在烷基化反应中的活性较低可能是导致阿托西班难以形成双烷基化产物的原因。

Claims (4)

1.一种阿托西班烷基化方法，其特征在于，所述方法包括：

S1：将阿托西班溶液加入到KIT-6分子筛中，使分子筛的浓度为10mg/mL，充分震荡，使阿托西班进入分子筛的空穴；

S2：加入DTT溶液，在一定温度下进行还原反应；

S3：将还原完成后的阿托西班放置室温，在黑暗环境下加入IAM溶液，在室温下避光震荡烷基化反应一定时间；

S4：向反应后的溶液中加入50％的乙腈-水溶液，涡旋，使还原烷基化后的阿托西班完全从分子筛中释放出来，离心使分子筛与溶液分离，使用50％的乙腈-水溶液稀释分离上清。

2.一种阿托西班烷基化方法，其特征在于，所述方法包括：

S1：将阿托西班溶液加入到MOFs材料MIL-101(Gr)中，使MOFs材料的浓度为10mg/mL，充分震荡，使阿托西班进入MOFs材料的空穴中；

S2：加入DTT溶液，在一定温度下进行还原反应；

S3：将还原完成后的阿托西班放置室温，在黑暗环境下加入IAM溶液，在室温下避光震荡烷基化反应一定时间；

S4：之后，向反应后的溶液中加入50％的乙腈-水溶液，涡旋，使还原烷基化后的阿托西班完全从分子筛中释放出来，离心使分子筛与溶液分离，使用50％的乙腈-水溶液稀释分离上清。

3.一种阿托西班烷基化方法，其特征在于，所述方法包括：

S1：将阿托西班溶液加入到由MOFs材料MIL-101(Gr)与KIT-6分子筛组成的介孔材料混合物中，使介孔材料的浓度为10mg/mL，充分震荡，使阿托西班进入介孔材料的空穴中；

S2：加入DTT溶液，在一定温度下进行还原反应；

S3：将还原完成后的阿托西班放置室温，在黑暗环境下加入IAM溶液，在室温下避光震荡烷基化反应一定时间；

S4：向反应后的溶液中加入50％的乙腈-水溶液，涡旋，使还原烷基化后的阿托西班完全从分子筛中释放出来，离心使分子筛与溶液分离，使用50％的乙腈-水溶液稀释分离上清；所述介孔材料混合物中MIL-101(Gr)与KIT-6分子筛的比例为1:1m/m。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，巯基还原剂DTT为8-15mM，还原温度为50-60℃，还原时间为5-30min；烷基化试剂碘乙酰胺浓度10-30mM，烷基化时间为3-15min。