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CN116854838A - 低分子多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

低分子多糖及其制备方法与应用 Download PDF

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CN116854838A
CN116854838A CN202310801471.1A CN202310801471A CN116854838A CN 116854838 A CN116854838 A CN 116854838A CN 202310801471 A CN202310801471 A CN 202310801471A CN 116854838 A CN116854838 A CN 116854838A
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CN
China
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low molecular
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polysaccharide
heparin
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Application number
CN202310801471.1A
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张岩岩
尹怀君
吕佳
李加耀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Wangye Pharmaceutical Research Co ltd
Original Assignee
Chongqing Wangye Pharmaceutical Research Co ltd
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种低分子多糖及其制备方法与应用。本发明以牛肠粘膜为起始原料，经过酶解、蛋白变性、纳滤、离子交换、乙醇分级沉淀、氢氧化钠解聚、过氧化氢氧化、过滤除杂、除重金属和冷冻干燥，得到一种新型低分子多糖。该低分子多糖的重均分子量为10000‑15000Da；抗Xa活性≥180iu/mg；抗Xa/抗IIa比值＞1.5；比旋光度≥+60°，与现有市场上流通的肝素钠及低分子肝素的结构不同，且相比于普通肝素有更强的抗血栓作用，更小的出血性及血小板副作用，可开发为新型的抗凝、抗栓的多糖产品。本发明的低分子多糖的制备工艺简单方便，产品纯度好，收率高，适合工业化生产。

Description

低分子多糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种低分子多糖及其制备方法与应用。
背景技术
肝素钠(Heparin Sodium)是肝素的钠盐形式产物。肝素广泛存在于动物体液以及肝、肺、小肠粘膜等组织中，在生物体内一般肝素与蛋白质结合形成蛋白质-多糖复合物而存在。肝素具有多种生化和生理功能，用途非常广泛，主要用于治疗血管栓塞、爆发性流脑、败血症、肾炎、急性心肌梗塞、动脉硬化等疾病，还具有澄清血浆脂质，降低胆固醇等作用。
肝素是一类糖胺聚糖，由糖醛酸和葡萄糖胺以1→4键连接起来的重复二糖单位组成的多糖链的混合物。肝素含10-30个二糖单位不等，分子量为4000-20000，平均分子量为12000。2-0硫酸-α-L艾杜糖醛酸及6-0-硫酸-N-硫酸-α-D葡萄糖胺是其中的主要单糖，由它们组成的三硫酸二糖的重复单位构成了肝素的所谓“规则区”，是肝素结构的主要部分。另外的单糖残基，如α-L-艾杜糖醛酸，6-O-硫酸N-乙酰-α-D葡萄糖胺，β-D葡萄糖醛酸及3-6-双-O-硫酸N硫酸-α-D葡萄糖胺以很低的频率出现于“非规则区”。一定数目的6位无硫酸化的葡萄糖胺及2-0-硫酸-α-D葡萄糖醛酸的存在，使得肝素中出现了10种不同的单糖，包括4种糖醛酸和6种葡萄糖胺，从而使得肝素的整个结构变得异常复杂。到目前为止，肝素的精确结构还不清楚。
抗凝血酶Ⅲ是由肝脏合成的一种抗凝血酶，可与凝血因子Ⅹa结合，也可与凝血因子Ⅱa结合，并抑制凝血因子Ⅹa和凝血因子Ⅱa的凝血作用。抗凝血酶Ⅲ对Xa的抑制只需要构象的变化，因而只需五糖序列，而对Ⅱa的抑制不仅需要五糖序列,至少还需要五糖序列附近的13个糖残基，这样长度的肝素链才能作为桥梁，使ATⅢ与Ⅱa都结合上形成一个三元复合体，加速对Ⅱa的抑制。因而聚合度小于18的肝素，在抗Ⅱa及通用的抗凝检测上活性很低。而Xa抑制的增强,只需要ATⅢ构象的变化，并不需要Xa的结合。因而聚合度小于18的肝素及合成的肝素五糖具有很高的抗Xa活性，但不能通过ATⅢ增强对Ⅱa的抑制。根据上述机理制成的低分子量肝素，含有各种聚合度大于18和低于18的不同肝素分子的混合物，具有较强的抗Xa作用和较弱的抗Ⅱa作用，其体外特性常以抗Xa/APTT(或抗Xa/IIa)值表示，由于低分子量肝素具有更高的抗Xa/抗Ⅱa比值，减少了由完整肝素的抗凝活性带来的出血及血小板减少等负作用，成为新一代抗栓良药。
然而低分子肝素的单位抗凝活性低于普通肝素，在临床应用中需多次给药，增加了患者痛苦及多次给药的风险。为了克服上述问题，本申请提出了一种新型低分子多糖产品的生产工艺以及结构不同于现有低分子肝素产品的新型低分子多糖，该新型低分子多糖相比于普通肝素有更强的抗血栓作用，更小的出血性及血小板副作用。现有技术中，公开号为CN101711771B的发明专利公开了一种肝素衍生的多糖混合物及其制法和药物组合物，该肝素衍生的多糖混合物是肝素或肝素酯或肝素酯盐的降解产物，而这些混合物的构成多糖中，在其一端具有不饱和的4,5-葡糖醛酸2-O-硫酸酯结构单元。该专利公开了另一种结构的多糖混合物及其制法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有高D型糖含量的低分子多糖，该低分子多糖采用本发明的新型发明工艺进行制备，与普通的肝素钠及低分子肝素的结构不同，该低分子多糖多了ΔIVA(GlcA)的特征二糖峰。本发明为新型抗凝、抗栓的多糖产品的研发提供了技术支持。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
具有高D型糖含量的低分子多糖，所述低分子多糖含有特征结构峰ΔIVA(GlcA)，其含量为所述低分子多糖的5％-20％；所述ΔIVA(GlcA)为D-葡萄糖胺与D-葡萄糖醛酸。
进一步，所述低分子多糖的重均分子量为10000Da-15000Da，抗Xa活性≥180iu/mg，抗Xa/抗IIa比值＞1.5，比旋光度≥+60°。
普通肝素是一种由D-葡萄糖胺和糖醛酸(L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸)交替组成的粘多糖，其中D型结构占绝大部分，这是因为自然界存在的单糖多属D型糖，或以作为多糖的组分及糖甙的形式广存于自然界中，而且机体代谢的主要构型为D型。而普通肝素中仍有部分L构型，不利于人体吸收代谢。基于此性质本申请开发了一种新型低分子多糖，进一步降低L-艾杜糖醛酸含量，使D-葡萄糖胺与D-葡萄糖醛酸的组分进一步提升。并且，由于低分子肝素的单位抗凝活性低于普通肝素，在临床应用中需多次给药，增加患者痛苦及多次给药的风险。本申请提供的新型低分子多糖，抗Xa活性≥180IU/mg，不弱于普通肝素，而抗Xa/抗IIa活性比值＞1.5，降低了普通肝素引起的出血及血小板减少等负作用。D-葡萄糖胺、糖醛酸与D-葡萄糖醛酸交替组成的粘多糖结构式如下：
式中，R1、R3、R4为SO3Na或者-H；R2为SO3Na或者R5为CO2Na，R6为H或者R5为H，R6为CO2Na。
本发明的目的之二在于提供一种具有高D型糖含量的低分子多糖的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
低分子多糖的制备方法，以牛肠粘膜为起始原料，依次经过酶解、蛋白变性、纳滤、离子交换、乙醇分级沉淀、氢氧化钠解聚、过氧化氢氧化、过滤除杂、除重金属、冷冻干燥，获得所述低分子多糖。
进一步，包括以下步骤：
(1)采用胰酶对牛肠粘膜进行酶解，获得酶解液；
(2)采用高温对步骤(1)所得酶解液进行蛋白变性，获得蛋白变性液；
(3)将步骤(2)所得蛋白变性液进行纳滤后，加入吸附树脂进行离子交换，收集洗脱液；
(4)采用乙醇对步骤(3)所得洗脱液进行两次醇沉、复溶，获得复溶液2；
(5)采用氢氧化钠对步骤(4)所得复溶液2进行解聚，结束后再次加入乙醇进行第三次醇沉，复溶获得复溶液3；
(6)向步骤(5)所得复溶液3中加入过氧化氢进行氧化，结束后过滤并加入无水亚硫酸钠进行中和；
(7)在步骤(6)中和后所得料液中加入螯合树脂除重金属，冷冻干燥制得所述低分子多糖。
进一步，步骤(1)中，酶解前，先将起始原料和肠衣盐加入水中搅拌溶解，并调节料液pH值为8.5±1.5。
进一步，步骤(1)中，添加所述胰酶使料液的酶浓度含量为0.05％-0.5％ W/V；酶解温度为50±10℃；酶解时间为4±2小时。
进一步，步骤(2)中，蛋白变性温度为90±5℃，时间为20±5分钟。
进一步，步骤(3)中，所述纳滤为：将蛋白变性液加入陶瓷膜机进料罐，过陶瓷膜后，收集透过液，用实验用水清洗残余物料，洗液以CPC方法检测无沉淀，则洗涤结束。
作为优选，所述陶瓷膜孔径≤30000Da，进口压力为0.7-08Mpa；流量为4.5m3/h。
进一步，所述离子交换中，先采用纯化水和低盐溶液进行洗涤；再采用高盐洗脱溶液进行洗脱；所述低盐溶液的浓度为0.5％-6.0％ W/V；所述高盐洗脱溶液的浓度为9％-20％ W/V。
进一步，所述离子交换包括以下步骤：
1.吸附：调节纳滤所得溶液的pH值为8.0-10.0，保温40℃-60℃；加入吸附树脂，上柱进行吸附；
2.洗涤：向吸附树脂内加入吸附树脂使用量0.5-3.0倍体积的纯化水；而后加入低盐溶液；洗涤温度控制在10℃-55℃，总洗涤次数为2-5次；
3.洗脱：将高盐洗脱溶液加入到已吸附的树脂中，洗脱时间2-12小时；共洗脱两次，一次洗脱完成后，用滤布过滤树脂，收集洗脱液；然后进行第二次洗脱，将两次洗脱液混合，即得。
作为优选，步骤2中，总洗涤次数为2-3次。
进一步，步骤(4)具体包括以下步骤：
1.一次醇沉：向洗脱液中加入乙醇，搅拌5-60min，后静置沉淀2-24h，醇沉结束后，将上清转移；
2.一次复溶：醇沉结束后，向醇沉固体中加入纯化水溶解，同时加入氯化钠溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50±10℃，搅拌溶解，时间为2-4h，获得复溶液1。
3.二次醇沉和二次复溶：向步骤2的料液中加入乙醇进行二次醇沉和二次复溶，方法同步骤1和步骤2。
更进一步，三次醇沉和复溶的方法与一次醇沉和一次复溶的方法相同。
更进一步，醇沉过程中，使乙醇理论浓度达到35±5％；维持搅拌16±10分钟并保持温度在30±8℃，静置醇沉12±4小时，可得到醇沉固体。
更进一步，在一次和二次复溶过程中，用水工艺参数范围在3L/kg-10L/kg粗品肝素钠；理论盐度工艺参数控制在2.0±1.0％。
进一步，所述解聚为：在复溶液2中加入料液体积比为10％-15％的乙酸钠；溶解后再加入料液体积比为0.06％±0.02％的硼氢化钠；最后加入料液体积比为20％-30％的氢氧化钠进行解聚；解聚温度为50℃±10℃；解聚时间为1h-2h。
进一步，步骤(6)中，所述过氧化氢的总用量为2.0％-3.0％ W/V；所述无水亚硫酸钠的用量为过氧化氢总用量的0.25±0.1倍。
作为优选，过氧化氢采用分多次添加，加入时间间隔为2-3h。
进一步，步骤(6)中，所述氧化为：先调节复溶液3温度至20℃-30℃，pH值至9-12，向料液中加入过氧化氢进行氧化，加入完毕，后静置氧化，氧化时间为8h-48h。
进一步，氧化完成后，氧化液先使用0.22um-2um滤膜进行过滤，冲洗容器后液体也进行过滤，完成过滤后，一并混合搅拌均匀，然后再进行中和。
进一步，步骤(6)中，所述中和为：向过滤后的滤液中加入无水亚硫酸钠，搅拌1-3h，期间控制pH为8.5-9.5，控制温度为25-35℃。
进一步，步骤(7)中，除重金属后，需用0.22-2um滤膜进行过滤；所得滤液再经过二次过滤；所述二次过滤为：滤芯使用前用乙醇浸泡30-60分钟；筒式过滤器安装好，装入过滤介质：滤芯；孔径范围≤0.45μm，过滤结束，收集滤液并用少量水清洗滤芯并收集。二次过滤后再进行三次过滤：使用0.22-2um的滤膜将二次过滤所得料液进行过滤，收集滤液。
进一步，步骤(7)中，所述冷冻干燥为：将三次过滤后的滤液转移至冷冻干燥间中，进行装盘冻干。冻干程序为：预冻：设置-40℃以下；持续时间≥180min；升华：设置-5～5℃；持续时间≥1800min；干燥：设置5～60℃；持续时间≥480min。
作为优选，干燥温度设置50℃～60℃，持续时间≥240min。
作为优选的技术方案，低分子多糖的制备方法如下：
1、酶解：反应器中加入水，开启搅拌，同时加入起始原料及肠衣盐进行溶解，调节料液pH至8.5±1.5，加入胰酶进行酶解，完毕后继续维持在温度50±10℃搅拌酶解4±2小时。
2、蛋白变性：步骤1结束后，使料液温度升至90±5℃，维持此温度并保温20±5分钟进行蛋白变性。
3、纳滤：将蛋白变性液加入陶瓷膜机进料罐，过30000Da陶瓷膜后，收集透过液，用实验用水清洗残余物料，洗液以CPC方法检测无沉淀，则洗涤结束。
4、吸附：在步骤3的溶液中调节pH至8.0-10.0，保温40-60℃，加入吸附树脂，上柱进行吸附。
5、洗涤：向步骤4的吸附树脂内加入吸附树脂使用量0.5-3.0倍体积的纯化水，后加入低盐溶液，洗涤温度控制在10-55℃，总洗涤次数为2-3次。
6、洗脱：配制洗脱液，将配制好的盐溶液加入到步骤5的已吸附的树脂中，洗脱时间2-12小时。一次洗脱完成后，用滤布过滤树脂，收集洗脱液。共洗脱两次。第二次洗脱完成后，将两次洗脱液混合。
7、一次醇沉：向步骤6的洗脱液中加入乙醇，搅拌5-60min，后静置沉淀2-24h，醇沉结束后，将上清转移。
8、一次复溶：醇沉结束后，向步骤7的醇沉固体加入纯化水溶解，同时加入氯化钠溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50±10℃，搅拌溶解，时间为2-4h。
9、二次醇沉：向步骤8的料液中加入乙醇，搅拌5-60min，后静置沉淀2-24h，醇沉结束后，将上清转移。
10、二次复溶：醇沉结束后，向步骤9的醇沉固体加入纯化水溶解，同时加入氯化钠溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50±10℃，搅拌溶解，时间为2-4h。
11、解聚：向步骤10料液中加入料液体积10％-15％(w/v)的乙酸钠溶解完成，再加入料液体积0.06％的硼氢化钠溶解完成，再加入料液体积20％-30％氢氧化钠进行解聚，解聚过程控制料液温度50±10℃，反应1-2h。
12、三次醇沉：步骤11反应完成后，用盐酸调节料液pH至中性后，加入乙醇，搅拌5-60min，后静置沉淀2-24h，醇沉结束后，将上清转移。
13、三次复溶：醇沉结束后，向步骤12的醇沉固体加入纯化水溶解，同时加入氯化钠溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50±10℃，搅拌溶解，时间为2-4h。
14、一次氧化：调节步骤13的复溶液温度至20-30℃，并调节pH至9-12，向料液中加入过氧化氢进行氧化，加入完毕，后静置氧化，氧化时间为8-48h。
15、一次过滤：氧化完成后，将步骤14中的氧化液进行过滤，使用滤膜0.22-2um，冲洗容器后液体也进行过滤，完成过滤后，一并混合搅拌均匀。
16、中和：向步骤15中加入无水亚硫酸钠，加入完毕后，搅拌1-3h，期间控制pH为8.5-9.5，控制温度为25-35℃。
17、除重金属：在步骤16的溶液中加入螯合树脂除重金属，完成后用0.22-2um滤膜进行过滤。
18、二次过滤：步骤17的料液收集后，在滤芯使用前用乙醇浸泡30-60分钟。筒式过滤器安装好，装入过滤介质：滤芯；孔径范围≤0.45μm，过滤结束，收集滤液并用少量水清洗滤芯并收集。
19、三次过滤：使用0.22-2um的滤膜将步骤18的料液进行过滤，收集滤液。
20、冷冻干燥：将步骤19中的滤液收集，并转移至冷冻干燥间中，进行装盘冻干。预冻：设置-40℃以下；持续时间≥180min；升华：设置-5～5℃；持续时间≥1800min；干燥：设置5～60℃；持续时间≥480min。
21、粉碎装袋：将冻干后物料用万能粉碎机粉碎后装袋，密封保存。
本发明的目的之三在于提供一种所述低分子多糖在制备抗凝和/或抗栓的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的新型低分子多糖及其生产工艺，降低了普通肝素的抗凝活性带来的出血及血小板减少等负作用，改善了普通肝素被人体吸收代谢的效果，而且抗凝效果不次于普通肝素的效果，抗栓效果与低分子肝素效果相当，降低了低分子肝素多次给药的风险，而且新型低分子多糖的杂质含量低，效价高，具有工艺简单方便、效果好的特点，采用本发明方法纯化制得的产品颜色白，纯度好，效价高，收率高，适合工业化生产。
附图说明
图1为二糖图谱，其中，a曲线为正常肝素经肝素酶全酶解的二糖图谱，b曲线与c曲线为本发明的新型低分子多糖经经肝素酶全酶解的二糖图谱；其中黑框内为本发明的低分子多糖的特征二糖峰ΔIVA(GlcA)，正常肝素未有此峰。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
实施例1
新型低分子多糖的制备方法如下：
1、酶解：反应器中加入2000L水，开启搅拌，同时加入2000根牛肠黏膜液及60kg肠衣盐进行溶解，调节料液pH至8.0，加入胰酶进行酶解，胰酶用量使料液的酶浓度含量为0.05％(W/V)，完毕后继续维持在温度55℃-58℃搅拌酶解3小时。
2、蛋白变性：步骤(1)结束后，使料液温度升至90℃，维持此温度并保温22分钟进行蛋白变性。
3、纳滤：将蛋白变性液加入陶瓷膜机进料罐，过30000Da陶瓷膜后，进口压力：0.7-08MPa流量：4.5m3/h，收集透过液，用实验用水清洗残余物料，洗液以CPC方法检测无沉淀，则洗涤结束。
4、吸附：在步骤(3)的溶液中调节pH至9.0，保温40-60℃，加入100L罗门哈斯FPA98Cl树脂上柱进行吸附5-6h，直至吸附残液检测无抗凝活性。
5、洗涤：向步骤(4)的吸附树脂内加入吸附树脂使用量50L体积的纯化水，后加入低盐溶液，洗涤温度控制在25-30℃，重复洗涤2次。
6、洗脱：配制100L洗脱液，将配制好的50L 10％(W/V)的盐溶液加入到步骤(5)的已吸附的树脂中，洗脱时间5小时。一次洗脱完成后，用滤布过滤树脂，收集洗脱液。共洗脱两次。第二次洗脱完成后，将两次洗脱液混合。
7、一次醇沉：向步骤(6)的洗脱液中加入39L乙醇，搅拌30min，后静置沉淀16h，醇沉结束后，将上清转移。
8、一次复溶：醇沉结束后，向步骤(7)的醇沉固体加入10L纯化水溶解，同时加入氯化钠0.2kg溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50℃，搅拌溶解，时间为3h。
9、二次醇沉：向步骤(8)的料液中加入3.6L乙醇，搅拌30min，后静置沉淀18h，醇沉结束后，将上清转移。
10、二次复溶：醇沉结束后，向步骤(9)的醇沉固体加入8L纯化水溶解，同时加入氯化钠0.16kg溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50℃，搅拌溶解，时间为3h。
11、解聚：向步骤(10)料液中加入料液体积960g的乙酸钠溶解完成，再加入料液体积4.8g的硼氢化钠溶解完成，再加入料液体积2000g氢氧化钠进行解聚，解聚过程控制料液温度50℃-55℃，反应1.5h。
12、三次醇沉：步骤(11)反应完成后，用盐酸调节料液pH至中性后，加入20L乙醇，搅拌30min，后静置沉淀10h，醇沉结束后，将上清转移。
13、三次复溶：醇沉结束后，向步骤(12)的醇沉固体加入7L纯化水溶解，同时加入氯化钠0.14kg溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50±10℃，搅拌溶解，时间为2-4h。
14、一次氧化：调节步骤(13)的复溶液温度至28℃，并调节pH至10，向料液中加入70ml过氧化氢进行氧化，加入完毕，后静置氧化，氧化时间为15h。
15、一次过滤：氧化完成后，将步骤(14)中的氧化液进行过滤，使用滤膜0.22um，冲洗容器后液体也进行过滤，完成过滤后，一并混合搅拌均匀。
16、中和：向步骤(15)中加入210g无水亚硫酸钠，加入完毕后，搅拌1h，期间控制pH为8.5-9.5，控制温度为25-35℃。
17、除重金属：在步骤(16)的溶液中加入14g螯合树脂除重金属，完成后用0.22um滤膜进行过滤。
18、二次过滤：步骤(17)的料液收集后，在滤芯使用前用乙醇浸泡50分钟。筒式过滤器安装好，装入过滤介质：滤芯；孔径范围≤0.45μm，过滤结束，收集滤液并用少量水清洗滤芯并收集。
19、三次过滤：使用0.22um的滤膜将步骤(18)的料液进行过滤，收集滤液。
20、冷冻干燥：将步骤(19)中的滤液收集，并转移至冷冻干燥间中，进行装盘冻干；冻干程序如下：
预冻：设置-40℃以下；持续时间≥180min；
升华：设置-5℃～5℃；持续时间≥1800min；
干燥：设置5℃～60℃；持续时间≥480min；
粉碎装袋：将冻干后物料用万能粉碎机粉碎后装袋，密封保存。
结果：冻干完成后，新型低分子多糖的收率为1533根/亿，按照表1的质量标准检测进行检测，结果如表1所示。二糖的检测数据如表2所示，正常肝素峰未有5号二糖峰(ΔIVA(GlcA))，该结果表明肝素糖链中含有L-艾杜糖醛酸经过碱性水解脱硫酸根后发生异构化生成D-葡萄糖醛酸。此峰为本发明的低分子多糖的特征结构峰。
表1.实施例1制得的新型低分子多糖的检测结果表
表2.实施例1制得的新型低分子多糖的二糖检测数据结果表
实施例2
新型低分子多糖的制备方法如下：
1、酶解：反应器中加入3000L水，开启搅拌，同时加入3000根牛肠黏膜液及90kg肠衣盐进行溶解，调节料液pH至8.0，加入胰酶进行酶解，胰酶用量使料液的酶浓度含量为0.05％(W/V)，完毕后继续维持在温度55-58℃搅拌酶解3小时。
2、蛋白变性：步骤(1)结束后，使料液温度升至90℃，维持此温度并保温25分钟进行蛋白变性。
3、纳滤：将蛋白变性液加入陶瓷膜机进料罐，过30000Da陶瓷膜后，进口压力：0.7-08MPa流量：4.5m3/h，收集透过液，用实验用水清洗残余物料，洗液以CPC方法检测无沉淀，则洗涤结束。
4、吸附：在步骤(3)的溶液中调节pH至9.0，保温40-60℃，加入150L罗门哈斯FPA98Cl树脂上柱进行吸附5-6h(直至吸附残液检测无抗凝活性)。
5、洗涤：向步骤(4)的吸附树脂内加入吸附树脂使用量75L体积的纯化水，后加入低盐溶液，洗涤温度控制在25-30℃，重复洗涤2次。
6、洗脱：配制150L洗脱液，将配制好的75L 10％(W/V)的盐溶液加入到步骤(5)的已吸附的树脂中，洗脱时间5小时。一次洗脱完成后，用滤布过滤树脂，收集洗脱液。共洗脱两次。第二次洗脱完成后，将两次洗脱液混合。
7、一次醇沉：向步骤(6)的洗脱液中加入58L乙醇，搅拌30min，后静置沉淀18h，醇沉结束后，将上清转移。
8、一次复溶：醇沉结束后，向步骤(7)的醇沉固体加入15L纯化水溶解，同时加入氯化钠0.3kg溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50℃，搅拌溶解，时间为3h。
9、二次醇沉：向步骤(8)的料液中加入5.5L乙醇，搅拌30min，后静置沉淀20h，醇沉结束后，将上清转移。
10、二次复溶：醇沉结束后，向步骤(9)的醇沉固体加入12L纯化水溶解，同时加入氯化钠0.24kg溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50℃，搅拌溶解，时间为3h。
11、解聚：向步骤(10)料液中加入料液体积1560g的乙酸钠溶解完成，再加入料液体积7.2g的硼氢化钠溶解完成，再加入料液体积3000g氢氧化钠进行解聚，解聚过程控制料液温度50-55℃，反应1.5h。
12、三次醇沉：步骤(11)反应完成后，用盐酸调节料液pH至中性后，加入30L乙醇，搅拌30min，后静置沉淀8h，醇沉结束后，将上清转移。
13、三次复溶：醇沉结束后，向步骤(12)的醇沉固体加入10.5L纯化水溶解，同时加入氯化钠0.21kg溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50±10℃，搅拌溶解，时间为3h。
14、一次氧化：调节步骤(13)的复溶液温度至28℃，并调节pH至10，向料液中加入105ml过氧化氢进行氧化，加入完毕，后静置氧化，氧化时间为15h。
15、一次过滤：氧化完成后，将步骤(14)中的氧化液进行过滤，使用滤膜0.22um，冲洗容器后液体也进行过滤，完成过滤后，一并混合搅拌均匀。
16、中和：向步骤(15)中加入315g无水亚硫酸钠，加入完毕后，搅拌1h，期间控制pH为8.5-9.5，控制温度为25-35℃。
17、除重金属：在步骤(16)的溶液中加入21g螯合树脂除重金属，完成后用0.22um滤膜进行过滤。
18、二次过滤：步骤(17)的料液收集后，在滤芯使用前用乙醇浸泡50分钟。筒式过滤器安装好，装入过滤介质：滤芯；孔径范围≤0.45μm，过滤结束，收集滤液并用少量水清洗滤芯并收集。
19、三次过滤：使用0.22um的滤膜将步骤(18)的料液进行过滤，收集滤液。
20、冷冻干燥：将步骤(19)中的滤液收集，并转移至冷冻干燥间中，进行装盘冻干。
冻干程序如下：
预冻：设置-40℃以下；持续时间≥180min；
升华：设置-5℃～5℃；持续时间≥1800min；
干燥：设置5℃～60℃；持续时间≥480min；
粉碎装袋：将冻干后物料用万能粉碎机粉碎后装袋，密封保存。
结果：冻干完成后，新型低分子多糖的收率为1592根/亿，按照按照表3的质量标准检测进行检测，结果如表3所示。二糖的检测数据如表4所示，正常肝素峰未有5号二糖峰(ΔIVA(GlcA))，该结果表明肝素糖链中含有L-艾杜糖醛酸经过碱性水解脱硫酸根后发生异构化生成D-葡萄糖醛酸。此峰为本发明的低分子多糖的特征结构峰。
表3.实施例2制得的新型低分子多糖的检测结果表
表4.实施例2制得的新型低分子多糖的二糖检测数据结果表
实施例3
新型低分子多糖的制备方法如下：
1、酶解：反应器中加入2500L水，开启搅拌，同时加入2500根牛肠黏膜液及75kg肠衣盐进行溶解，调节料液pH至8.0，加入胰酶进行酶解，胰酶用量使料液的酶浓度含量为0.05％(W/V)，完毕后继续维持在温度55-58℃搅拌酶解3小时。
2、蛋白变性：步骤(1)结束后，使料液温度升至90℃，维持此温度并保温21分钟进行蛋白变性。
3、纳滤：将蛋白变性液加入陶瓷膜机进料罐，过30000Da陶瓷膜后，进口压力：0.7-08MPa流量：4.5m3/h，收集透过液，用实验用水清洗残余物料，洗液以CPC方法检测无沉淀，则洗涤结束。
4、吸附：在步骤(3)的溶液中调节pH至9.0，保温40-60℃，加入125L罗门哈斯FPA98Cl树脂上柱进行吸附5-6h(直至吸附残液检测无抗凝活性)。
5、洗涤：向步骤(4)的吸附树脂内加入吸附树脂使用量62.5L体积的纯化水，后加入低盐溶液，洗涤温度控制在25-30℃，重复洗涤2次。
6、洗脱：配制125L洗脱液，将配制好的62.5L 10％(W/V)的盐溶液加入到步骤(5)的已吸附的树脂中，洗脱时间5小时。一次洗脱完成后，用滤布过滤树脂，收集洗脱液。共洗脱两次。第二次洗脱完成后，将两次洗脱液混合。
7、一次醇沉：向步骤(6)的洗脱液中加入49L乙醇，搅拌30min，后静置沉淀16h，醇沉结束后，将上清转移。
8、一次复溶：醇沉结束后，向步骤(7)的醇沉固体加入12.5L纯化水溶解，同时加入氯化钠0.25kg溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50℃，搅拌溶解，时间为3h。
9、二次醇沉：向步骤(8)的料液中加入4.5L乙醇，搅拌30min，后静置沉淀18h，醇沉结束后，将上清转移。
10、二次复溶：醇沉结束后，向步骤(9)的醇沉固体加入10L纯化水溶解，同时加入氯化钠0.20kg溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50℃，搅拌溶解，时间为3h。
11、解聚：向步骤(10)料液中加入料液体积1200g的乙酸钠溶解完成，再加入料液体积7.2g的硼氢化钠溶解完成，再加入料液体积2500g氢氧化钠进行解聚，解聚过程控制料液温度50-55℃，反应1.5h。
12、三次醇沉：步骤(11)反应完成后，用盐酸调节料液pH至中性后，加入25L乙醇，搅拌30min，后静置沉淀10h，醇沉结束后，将上清转移。
13、三次复溶：醇沉结束后，向步骤(12)的醇沉固体加入8.75L纯化水溶解，同时加入氯化钠0.175kg溶解，加热使搪瓷桶内溶解温度达到50±10℃，搅拌溶解，时间为2-4h。
14、一次氧化：调节步骤(13)的复溶液温度至28℃，并调节pH至10，向料液中加入88ml过氧化氢进行氧化，加入完毕，后静置氧化，氧化时间为15h。
15、一次过滤：氧化完成后，将步骤(14)中的氧化液进行过滤，使用滤膜0.22um，冲洗容器后液体也进行过滤，完成过滤后，一并混合搅拌均匀。
16、中和：向步骤(15)中加入260g无水亚硫酸钠，加入完毕后，搅拌1h，期间控制pH为8.5-9.5，控制温度为25-35℃。
17、除重金属：在步骤(16)的溶液中加入17.5g螯合树脂除重金属，完成后用0.22um滤膜进行过滤。
18、二次过滤：步骤(17)的料液收集后，在滤芯使用前用乙醇浸泡50分钟。筒式过滤器安装好，装入过滤介质：滤芯；孔径范围≤0.45μm，过滤结束，收集滤液并用少量水清洗滤芯并收集。
19、三次过滤：使用0.22um的滤膜将步骤(18)的料液进行过滤，收集滤液。
20、冷冻干燥：将步骤(19)中的滤液收集，并转移至冷冻干燥间中，进行装盘冻干。
冻干程序如下：
预冻：设置-40℃以下；持续时间≥180min；
升华：设置-5℃～5℃；持续时间≥1800min；
干燥：设置5℃～60℃；持续时间≥480min；
粉碎装袋：将冻干后物料用万能粉碎机粉碎后装袋，密封保存。
结果：冻干完成后，新型低分子多糖的收率为1498根/亿，按照表5的质量标准检测进行检测，结果如表5所示。二糖检测数据如表6所示，正常肝素峰未有5号二糖峰(ΔIVA(GlcA)，该结果表明肝素糖链中含有L-艾杜糖醛酸经过碱性水解脱硫酸根后发生异构化生成D-葡萄糖醛酸。此峰为本发明的低分子多糖的特征结构峰。
表5.实施例3制得的新型低分子多糖的检测结果表
表6.实施例3制得的新型低分子多糖的二糖检测数据结果表
表6中的5号峰为双糖，由两个单糖(D-葡萄糖胺与D-葡萄糖醛酸)构成；而正常肝素的IVA也是由两个单糖(D-葡萄糖胺与L-葡萄糖醛酸)组成，本发明通过降解把IVA中的L-葡萄糖醛酸碱性水解成了D-葡萄糖醛酸，从而就变成了ΔIVA(GlcA)。根据以上实施例的二糖结果可以发现，本申请制得的低分子多糖中D-葡萄糖胺与D-葡萄糖醛酸的组分含量上升，机体代谢的主要构型为D型。而普通肝素中仍有部分L构型，不利于人体吸收代谢，此组分含量的上升，表明此种低分子肝素的比普通肝素的吸收代谢更快，副作用小。

Claims (10)

1.具有高D型糖含量的低分子多糖，其特征在于，所述低分子多糖含有特征结构峰ΔIVA(GlcA)，其含量为所述低分子多糖的5％-20％；所述ΔIVA(GlcA)为D-葡萄糖胺与D-葡萄糖醛酸。
2.根据权利要求1所述的低分子多糖，其特征在于，所述低分子多糖的重均分子量为10000Da-15000Da，抗Xa活性≥180iu/mg，抗Xa/抗IIa比值＞1.5，比旋光度≥+60°。
3.权利要求1所述的低分子多糖的制备方法，其特征在于，以牛肠粘膜为起始原料，依次经过酶解、蛋白变性、纳滤、离子交换、乙醇分级沉淀、氢氧化钠解聚、过氧化氢氧化、过滤除杂、除重金属、冷冻干燥，获得所述低分子多糖。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用胰酶对牛肠粘膜进行酶解，获得酶解液；
(2)采用高温对步骤(1)所得酶解液进行蛋白变性，获得蛋白变性液；
(3)将步骤(2)所得蛋白变性液进行纳滤后，加入吸附树脂进行离子交换，收集洗脱液；
(4)采用乙醇对步骤(3)所得洗脱液进行两次醇沉、复溶，获得复溶液2；
(5)采用氢氧化钠对步骤(4)所得复溶液2进行解聚，结束后再次加入乙醇进行第三次醇沉，复溶获得复溶液3；
(6)向步骤(5)所得复溶液3中加入过氧化氢进行氧化，结束后过滤并加入无水亚硫酸钠进行中和；
(7)在步骤(6)中和后所得料液中加入螯合树脂除重金属，冷冻干燥制得所述低分子多糖。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，添加所述胰酶使料液的酶浓度含量为0.05％-0.5％W/V；酶解温度为50±10℃；酶解时间为4±2小时。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，蛋白变性温度为90±5℃，时间为20±5分钟。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离子交换中，先采用纯化水和低盐溶液进行洗涤；再采用高盐洗脱溶液进行洗脱；所述低盐溶液的浓度为0.5％-6.0％W/V；所述高盐洗脱溶液的浓度为9％-20％W/V。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述解聚为：在复溶液2中加入料液体积比为10％-15％的乙酸钠；溶解后再加入料液体积比为0.06％±0.02％的硼氢化钠；最后加入料液体积比为20％-30％的氢氧化钠进行解聚；解聚温度为50℃±10℃；解聚时间为1h-2h。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述过氧化氢的总用量为2.0％-3.0％W/V；所述无水亚硫酸钠的用量为过氧化氢总用量的0.25±0.1倍。
10.权利要求1所述的低分子多糖在制备抗凝和/或抗栓的药物中的应用。
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