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CN116849178A - 胎源性成年骨关节炎易感模型的构建方法、共性干预靶标及其应用 - Google Patents

胎源性成年骨关节炎易感模型的构建方法、共性干预靶标及其应用 Download PDF

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CN116849178A CN202310765193.9A CN202310765193A CN116849178A CN 116849178 A CN116849178 A CN 116849178A CN 202310765193 A CN202310765193 A CN 202310765193A CN 116849178 A CN116849178 A CN 116849178A
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陈廖斌
汪晖
谭杨
胡文
李庆贤
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Zhongnan Hospital of Wuhan University
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Abstract

本发明公开了一种胎源性成年骨关节炎的模型构建方法、共性干预靶标及其应用。正常受孕的大鼠，在孕全程每日给予强的松灌胃处理，自然生产获得子代。在PPE模型中发现，雌性子代软骨表型基因及PGC‑1α表达水平均较正常对照组显著降低，且两者呈现显著正相关，而雄性子代软骨表型基因及PGC‑1α表达没有显著改变。经关节腔注射PGC‑1α慢病毒过表达载体可显著逆转PPE所致雌性子代软骨细胞基质合成功能并改善软骨表型。因此，PPE可稳定诱导雌性子代骨关节炎易感，且PGC‑1α表达改变可作为胎源性成年骨关节炎的特异性防治靶点，为胎源性成年骨关节炎的治疗提供了一条新的途径。

Description

胎源性成年骨关节炎易感模型的构建方法、共性干预靶标及 其应用
技术领域
本发明涉及动物模型构建技术及应用技术领域，具体涉及一种胎源性成年骨关节炎易感模型的构建方法、共性干预靶标及其应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis)是最常见的年龄相关性慢性关节疾病，是全世界慢性疼痛、残疾和社会经济负担的主要来源，同时与多种代谢性疾病密切相关，尤其在女性更为突出。数据显示骨关节炎发病率随年龄递增且具有性别差异。据估计，60岁以上的人群中大约有18％的女性和10％的男性罹患骨关节炎[1]。值得警惕的是骨关节炎发病已出现年轻化趋势。最近的研究发现，生命早期的环境应激可引起软骨发育不良，导致肢体短缩并增加早年罹患骨关节炎的风险，表明成年骨关节炎的发生可追溯到宫内发育时期[2,3]。
近年来基于回顾性流行病学研究，人们提出“健康和疾病的发育起源(Developmental Origins of Health and Disease,DOHaD)”学说，认为生命早期的器官发育易受到不良环境暴露的影响，并可能介导成人慢性疾病的发生[4]。强的松(prednisone)是一种人工合成类糖皮质激素(GC)，其在临床上被广泛应用于治疗怀孕期间的多种自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等[5]。然而，近年来妊娠期强的松治疗的负面效应越来越受到人们的关注。研究显示，妊娠期长期、重复使用强的松治疗的患者，其胎儿早产率增高且出生体重降低[6]。生理情况下，无生物活性的强的松可以在孕妇肝脏内经11β-羟基类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)转化为有活性的强的松龙(prednisolone,Pred)而发挥药理作用；而胎盘11β-HSD2也可将Pred转化为无活性的强的松，以阻止Pred进入胎儿体内[7]。外界环境可干扰胎盘11β-HSD2活性，导致胎儿过度暴露于Pred[7,8]，从而影响胎儿发育。迄今为止，孕期强的松暴露(prenatal prednisone exposure,PPE)对胎儿器官发育及远期潜在风险仍然未知，其是否以及如何影响子代出生后的骨关节炎易感性，目前尚未见报道。
软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞成分，其主要通过合成Ⅱ型胶原(collagentype II alpha1chain,COL2A1)、聚集蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)等在内的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，以维持软骨基质正常结构和功能稳态，而软骨ECM合成代谢障碍则是软骨发育不良和骨关节炎进展的最主要原因之一[1,2,9]。研究发现，尽管软骨细胞在无血管环境(如低氧、低营养)中生存，却具有很高的ECM合成水平，这主要依赖于线粒体代谢，以维持其高合成需求[10]。线粒体是软骨细胞的代谢中心，被认为是软骨细胞中最重要的细胞器之一。研究表明，线粒体功能障碍在骨关节炎进展中起关键作用。在骨关节炎软骨细胞中，炎症因子可引起线粒体生物发生受损、呼吸链活性抑制、活性氧(reactiveoxygen species,ROS)增多以及细胞凋亡增加，而线粒体功能障碍不仅阻止了软骨ECM合成及修复进程，还可反过来加剧氧化应激、炎症和ECM降解，进一步加速骨关节炎的进展[11]。长距离跑步刺激是已知的诱导骨关节炎发生及评估骨关节炎敏感性的重要方法[12]。线粒体生物发生伴随着线粒体大小、数量和功能的变化，而线粒体的正常功能对维持线粒体代谢过程至关重要[13]。PGC-1α是线粒体生物发生的主要调控因子，通过促进下游TFAM等转录因子表达而诱导线粒体生物发生，并作为细胞代谢的中枢调节剂而影响细胞分化及命运[14]。然而，线粒体生物发生是否介导PPE所致的子代成年后骨关节炎易感的发生，以及PGC-1α是否可作为胎源性骨关节炎的防治靶点，仍有待进一步探索。
骨关节炎模型是骨关节炎发病机制研究和骨关节炎新药研发的重要载体，同时也为骨关节炎的诊断治疗提供珍贵的研究资料。然而，传统的骨关节炎模型如前交叉韧带切断、木瓜蛋白酶注射等具有操作繁琐，对动物损伤大，小动物难以操作等问题，且无法很好地体现骨关节炎的退变机制。此外，现在的骨关节炎动物模型仍然没有明确的药物干预靶标，尤其是共性干预靶标。
参考文献：
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发明内容
为了解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明根据孕期外源物暴露可致子代出现骨发育迟缓表现以及成年后骨关节炎发生，其目的在于构建一种简便、高效和稳定的胎源性成年骨关节炎易感模型，并确定PGC-1α表达改变与胎源性成年骨关节炎之间的相互关系，提供PGC-1α激活剂和慢病毒过表达质粒在制备改善胎源性成年骨关节炎药物中的应用，即过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)作为药物靶标在筛选改善胎源性成年骨关节炎药物中的应用。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种PPE诱导的胎源性成年骨关节炎易感模型的构建方法，包含以下步骤：
步骤S1：选取正常受孕的大鼠，从孕0～20天，每日给予强的松0.25mg/kg灌胃处理，孕鼠自由饮食。
步骤S2：上述步骤1给予强的松处理的孕鼠自然生产，获得F1子代，出生后第一天将每窝母鼠的数量统一调整为14只，雌雄各半，每个实验组12窝。4周断奶后，每窝取一只雌性子代大鼠和一只雄性大鼠，分成一组继续饲养至出生后12周(postnatal week,PW12)，获得PW12子代大鼠。
步骤S3：出生后雌性子代大鼠长距离跑步：在上述步骤S2出生后子代中，每窝选一只雌性大鼠，分成一组继续饲养至PW22，在PW22～28期间使用专用跑步机进行为期6周的长距离跑步实验。实验分为6个周期，每个周期7天。第1天，10min，速度10m/min；第2天，15min，速度12m/min；第3天，20min，速度15m/min；第4天，30min，速度18m/min；第5天，35min，速度为20m/min。在第5天及之后，以20m/min的速度每天跑步55分钟，前10分钟包括12m/min的热身。累计里程30km。该步骤获得PW28跑步大鼠。
步骤S4：对所述PW12子代大鼠和PW28跑步大鼠膝关节软骨质量相关指标进行检测，软骨质量相关指标发生改变，则所述F1子代大鼠为PPE诱导的胎源性成年骨关节炎易感大鼠模型；
所述步骤S4中，软骨质量相关指标发生改变具体是指，番红固绿染色呈关节软骨染色着色变淡、关节软骨各层结构紊乱、分界不清、关节软骨表层磨损、软骨基质合成相关蛋白的mRNA及蛋白表达均降低；
所述软骨基质合成相关蛋白的mRNA及蛋白表达包括COL2A1和ACAN；
所述大鼠为SPF级Wistar或SD大鼠。
第二方面，本发明提供一种如上述的模型在筛选胎源性成年骨关节炎药物靶标中的应用，所述的胎源性成年骨关节炎易感模型是指孕期强的松暴露(PPE)的啮齿类动物模型。
所述的应用，包含以下步骤：
步骤s1：在上述步骤S1中，给予强的松处理的孕鼠自然生产，获得F1子代，出生后第一天将每窝母鼠的数量统一调整为14只，雌雄各半，每个实验组12窝；
步骤s2：4周断奶后，每窝取一只雌性子代大鼠，分成一组继续饲养至PW8；
步骤s3：从正常对照组和PPE组每窝随机挑选1-2只用于关节腔慢病毒注射干预实验。大鼠在第1、2周进行关节腔注射PPARGC1A慢病毒载体，4周后(PW12)获得慢病毒干预大鼠；
步骤s4：对所述慢病毒干预大鼠的膝关节软骨质量相关指标进行检测，软骨质量相关指标、线粒体生物发生相关指标恢复正常，则PGC-1α是PPE诱导的胎源性成年骨关节炎易感的干预靶标。
所述步骤s4中，软骨质量相关指标恢复正常具体是，番红固绿染色呈关节软骨染色着色恢复正常、软骨基质合成相关蛋白表达恢复正常；线粒体生物发生相关指标恢复正常具体是指，PGC-1α及电压依赖性阴离子选择性通道1(voltage-dependent anion-selective channel 1,VDAC1)蛋白表达恢复正常。
所述的关节腔注射的慢病毒PPARGC1A慢病毒载体。
第三方面，本发明提供一种如上述应用得到的药物靶标，所述药物靶标是指过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α，基因别名：PPARGC1A)。
第四方面，本发明提供一种如上述药物靶标(PGC-1α)在筛选/制备改善胎源性成年骨关节炎或胎源性成年骨质疏松症药物中的应用，PGC-1α的慢病毒载体可应用在制备改善胎源性成年骨关节炎治疗靶向药物中。
第五方面，本发明提供一种PGC-1α作为胎源性成年骨关节炎的“共性”干预靶标，所述PGC-1α的表达在孕期糖皮质激素暴露雌性子代软骨中均被抑制。
本发明的技术原理及研究过程如下：
本发明基于前述的胎源性骨关节炎“二次打击”理论[2,15]，首次成功建立了PPE大鼠模型和出生后长距离跑步模型，并进一步探讨PPE是否通过抑制PGC-1α介导的线粒体生物发生途径导致宫内软骨发育不良及成年后骨关节炎易感。此外，本发明前期稳定构建了孕期地塞米松暴露(PDE，外源性GC过暴露)及孕期咖啡因暴露(PCE，内源性GC过暴露)大鼠模型[2,15]，这两种模型都可诱导雌性子代软骨发育不良及成年骨关节炎易感，在本发明中，本发明利用这两种模型，进一步探究PGC-1α作为胎源性骨关节炎的“共性”靶点的潜在价值，为指导强的松孕期合理用药和探寻胎源性成年骨关节炎的早期防治策略提供理论与实验依据。
本发明利用整体动物实验，通过在GD0～20期间，孕鼠每日给予强的松0.25mg/kg灌胃，构建了胎源性成年骨关节炎模型。在此胎源性成年骨关节炎模型中发现，在子代出生后第12周(postnatal week 12，PW12)，与正常对照组相比，PPE组软骨表型基因COL2A1和ACAN的mRNA表达及蛋白表达水平显著下降。在长距离跑步后，PPE组较正常对照组软骨ECM含量显著降低，软骨Mankin’s评分明显升高。在孕20天时(gestational day 20,GD20)，PPE组雌性胎鼠体长及后肢长度明显缩短，且软骨发育及骨化延迟，且软骨ECM含量下降。提示，PPE可致雌性子代成年软骨质量低下及骨关节炎易感性增高，且上述现象源于宫内软骨发育不良。
同时，本发明利用体外细胞实验，使用不同浓度强的松和Pred处理雌性胎鼠原代软骨细胞，观察强的松和Pred对胎鼠原代软骨细胞的影响。发现0～2000nM范围内的强的松处理48和72h对胎软骨细胞无明显毒性，而>500nM的Pred处理对胎软骨细胞具有明显毒性。进一步发现，0～250nM强的松处理48h对胎软骨ECM含量无明显影响，而Pred则可浓度依赖性降低ECM含量，且250nM Pred可显著抑制胎软骨细胞COL2A1和ACAN的mRNA及蛋白表达。提示，Pred而不是强的松可能在PPE所致子代胎软骨发育不良及ECM合成功能障碍中发挥作用。
随后，本发明在动物和细胞水平检测PPE或Pred处理后软骨的氧化应激水平。本发明发现，在GD20和PW12，PPE均可导致雌性子代软骨DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxyguanosine,8-OHdG)水平升高。体外实验表明，Pred引起细胞ROS、氧化型谷胱甘肽水平升高而还原型谷胱甘肽水平降低。这表明PPE可通过Pred导致雌性子代软骨氧化应激水平增高。
进一步，本发明证实PPE组或Pred组胎软骨细胞出现线粒体数量减少及线粒体功能障碍。与体外水平一致，在整体动物水平发现，出生前后PPE组胎软骨PGC-1α表达水平、mtDNA拷贝数等线粒体生物量指标均较正常对照组均明显降低。表明PPE可致雌性子代软骨线粒体生物发生受损。
此外，本发明在体外激活软骨细胞PGC-1α表达，可逆转Pred所致的线粒体生物发生抑制及线粒体功能障碍，减轻了细胞氧化应激水平，并恢复了软骨ECM水平。
最后，在整体动物水平，本发明进一步探究关节腔靶向干预PGC-1α是否可改善PPE所致雌性子代成年软骨质量低下，以明确PGC-1α作为PPE所致雌性子代成年骨关节炎易感的早期干预靶标，初步探讨PGC-1α作为胎源性成年骨关节炎的“共性”靶标的潜在价值。结果显示，与空载组相比，关节腔注射PPARGC1A慢病毒过表达载体(LV-PPARGC1A)可恢复PPE组软骨ECM水平，并逆转PGC-1α和VDAC1等线粒体生物发生相关指标。此外，PPE雄性成年子代软骨PGC-1α及ACAN的表达在正常对照组和PPE组之间均未出现显著差异。而本课题组前期稳定构建的孕期地塞米松暴露和孕期咖啡因暴露大鼠模型中，雌性成年子代软骨PGC-1α蛋白表达水平均较正常对照组均明显降低，与PPE模型一致。这表明，PPARGC1A的过表达可通过线粒体生物发生途径改善PPE雌性子代软骨ECM合成，并有望作为潜在的早期干预靶点；其次，PPE对子代软骨PGC-1α表达的影响具有性别差异性，且软骨PGC-1α表达抑制可能是胎源性成年骨关节炎的“共性”机制。
因此，PGC-1α表达改变可作为胎源性成年骨关节炎的早期“共性”防治靶点，为胎源性成年骨关节炎的治疗提供了一条新的途径。
本发明的优点及有益效果如下：
1、本发明的技术构思较为新颖，强的松这种外源物临床应用广泛，用强的松建立孕期母体暴露的动物模型更贴近临床，更具备广泛适用性和临床意义。
2、本发明的造模方法简单可靠，母本孕期全程每日给予强的松以建立PPE模型，其子代通过长距离跑步刺激，能够模拟骨关节炎的疾病进展过程，检测软骨组织病理学和基因表达能够模拟骨关节炎患者软骨的病理改变。本模型指标稳定性好，可重复性强，为胎源性成年骨关节炎易感模型的构建提供了一种可靠的方法。
3、本发明确定了PGC-1α基因表达改变作为PPE所致成年骨关节炎的重要发病机制和干预靶标，首次为探索胎源性成年骨关节炎的“共性”干预靶标提供理论和实验依据。
4、基于本发明构建的胎源性成年骨关节炎易感模型，可用于指导孕期临床合理用药、探讨胎源性成年骨关节炎的发生发展机制、早期预警及干预靶标中的应用。
附图说明
图1.PPE雌性子代出生后OA易感性增加。
图1中：a.软骨组织番红O-固绿染色的代表性图像及其IOD值，比例尺＝100μm，n＝10。b.PW12软骨COL2A1和ACAN的基因表达，n＝12。c.PW12软骨COL2A1和ACAN的IHC染色代表性图像及其IOD值，比例尺＝50μm，n＝10。d.软骨组织番红O-固绿染色的代表性图像，比例尺＝100μm；软骨组织COL2A1的IHC染色代表性图像，比例尺＝50μm，n＝10.e.软骨组织番红O-固绿染色的IOD值。f.软骨的Mankin’s评分。g.软骨组织COL2A1的IHC染色的IOD值。PW12，出生后12周。
图2.PPE导致雌性子代胎鼠软骨发育不良。
图2中：a.使用阿利新蓝和茜素红对雌性胎鼠进行骨架染色并将后肢进行分离，n＝3。b：胎鼠软骨番红O-固绿染色代表性图像，×40，×100，n＝10。c.关节软骨总长度(TL)。d.增殖区长度(PZ)。e.增殖区比例(PZ/TL)。f.肥大长度(HZ)。g.番红O-固绿染色的IOD值。h.胎软骨COL2A1和ACAN的mRNA表达，n＝12。i：胎软骨组织COL2A1的IHC染色代表性图像及其定量(IRS分级)，×100，×200，n＝10。j：ACAN的IHC染色代表性图像及其IOD值，×100，×200，n＝10。GD20，孕20天。
图3.Pred抑制胎软骨ECM合成。
图3中：a.不同浓度强的松处理胎软骨细胞后，阿利新蓝染色代表性图像及其IOD值，比例尺＝50μm，n＝6。b.不同浓度Pred处理胎软骨细胞后，阿利新蓝染色代表性图像及其IOD值，比例尺＝50μm，n＝6。c.不同浓度Pred处理胎软骨后，细胞番红O染色代表性图像及其IOD值，比例尺＝50μm，n＝6。d.不同浓度Pred处理胎软骨细胞后的COL2A1和ACAN的mRNA表达，n＝6。
图4.Pred诱导胎儿软骨细胞氧化应激。
图4中：a.胎软骨及成年子代软骨8-OHdG的IHC染色代表性图像及其定量(IRS分级)，×100，×200，n＝10。b.Pred处理胎软骨细胞后，ROS的DCFH-DA染色代表性图像及其IOD值，比例尺＝50μm，n＝6。c.Pred处理胎软骨细胞后的T-GSH和GSSG含量，n＝6。
图5.PPE导致雌性子代软骨线粒体形态与功能异常。
图5中：a-c.Mito-Tracker Red CMXRos染色分析Pred处理后线粒体形态、数量及分布密度，比例尺＝50μm，n＝6。d-g.胎软骨及胎软骨细胞的透射电镜代表性图像及线粒体嵴密度、数量和直径分析，×5000，×8000，n＝10。h.成年子代软骨PGC-1α的IHC染色代表性图像及其定量(IRS分级)，×200，n＝10。i.成年子代软骨线粒体DNA拷贝数，n＝12。j.胎软骨PGC-1α的IHC染色代表性图像及其定量(IRS分级)，×200，n＝10。k.胎软骨线粒体DNA拷贝数，n＝12。l.不同浓度Pred处理胎软骨细胞后，PGC-1α的mRNA表达，n＝6。m.Pred处理胎软骨细胞后，胎软骨线粒体DNA拷贝数，n＝6。n.PPE子代胎鼠软骨线粒体氧化磷酸化编码基因表达，n＝12。o.PPE成年子代软骨线粒体氧化磷酸化编码基因表达，n＝12。p.Pred处理胎软骨细胞后线粒体氧化磷酸化编码基因表达，n＝6。q.Pred处理胎软骨细胞后的ATP水平，n＝6。
图6.激活PGC-1α可改善Pred所致ECM合成降低。
图6中：a.Pred或Pred联合ZLN005处理胎软骨细胞后的线粒体拷贝数，n＝6。b.Pred或Pred联合ZLN005处理胎软骨细胞后，线粒体膜电位JC-1染色代表性图像及其IOD值，比例尺＝50μm，n＝6。c.Pred或Pred联合ZLN005处理胎软骨细胞后COL2A1和ACAN的mRNA表达，n＝6。d.Pred或Pred联合ZLN005处理胎软骨细胞后，COL2A1的IF染色代表性图像及其IOD值，比例尺＝50μm，n＝6。
图7.PPARGC1A过表达可恢复PPE雌性子代软骨表型。
图7中：a.关节腔注射带有eGFP标签的慢病毒后，用IF检测软骨区域eGFP蛋白表达。比例尺＝50μm，n＝3。b.软骨组织番红O-固绿染色的代表性图像及其IOD值，×40，×200，n＝10。c-e.软骨组织COL2A1和ACAN的IHC染色代表性图像及其IOD值，比例尺＝50μm，n＝10。f,g.软骨组织PGC-1α的IHC染色代表性图像及其IOD值，比例尺＝50μm，n＝10。
图8.孕期GC暴露所致子代骨关节炎易感中的PGC-1α表达特点。
图8中：a.PPE所致雄性成年子代软骨组织的PGC-1α的IHC染色代表性图像及其IRS分级，比例尺＝50μm，n＝10。b.PPE所致雄性成年子代软骨组织的ACAN的mRNA表达，n＝8。c.PDE所致雌性成年子代软骨组织的PGC-1α的IHC染色代表性图像及其IRS分级，比例尺＝50μm，n＝10。d.PCE所致雌性成年子代软骨组织的PGC-1α的IHC染色代表性图像及其IRS分级，比例尺＝50μm，n＝10。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述的主题的范围仅限于以下的实例。基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的内容。
【实施例1】PPE诱导的胎源性骨关节炎易感模型的构建
1、实验动物
SPF级Wistar大鼠(许可证号：SCXK2019-0010)，雌性(9周龄，No.110324210100821442)和雄性(10周龄，No.110324210100788048)购买自SPF生物技术有限公司(中国北京)。所有动物实验程序均由武汉大学动物实验中心/ABSL-III实验室机构动物保护和使用委员会批准(IACUC，No.WP20210060)。
2、动物处理
动物饲养在标准条件(室温：2322℃；湿度：55210％；光周期：12h明暗周期；每小时换气10～15次)的空调房内，并允许大鼠自由进食食物和自来水。所有实验大鼠在实验前进行为期7天的适应性喂养，然后将雌性大鼠和雄性大鼠按照数量2：1进行合笼交配。次日上午8：00对合笼后的雌性大鼠进行阴道涂片并在显微镜下观察。发现精子则确认成功受孕，交配当天记为孕0天(gestational day,GD0)。受孕雌鼠单笼饲养，并随机分为正常对照组和PPE组。将醋酸强的松片碾碎成粉末，与0.5％的羧甲基纤维素钠混合制成悬浮液，最终浓度为0.025mg/ml。在GD0～20期间，PPE组大鼠每天上午8：00给予强的松0.25mg/kg灌胃，正常对照组给予等量的0.5％羧甲基纤维素钠。
获取雌性胎鼠：在GD20，用2～3％异氟醚麻醉并处死部分孕鼠，选择每窝产仔数为12～18只的孕鼠用于实验。每窝选择一只雌性子代，每组12窝。在解剖显微镜下分离雌性子代大鼠膝关节。右肢固定于4％多聚甲醛溶液中进行后续形态学观察，左肢保存于-80℃冰箱中用于后续基因检测。
获取出生后雌性和雄性子代大鼠：当自然分娩的怀孕大鼠较多时，在出生后第一天将每窝母鼠的数量统一调整为14只，雌雄各半，每个实验组12窝。断奶后，每窝取一只雌性子代大鼠和一只雄性大鼠，分成一组继续饲养至出生后12周(postnatal week,PW12)。所有大鼠均用2～3％异氟醚麻醉后处死。
出生后雌性子代大鼠长距离跑步：在上述出生后子代中，每窝选一只雌性大鼠，分成一组继续饲养至PW22，在PW22～28期间使用专用跑步机进行为期6周的长距离跑步实验。实验分为6个周期，每个周期7天。第1天，10min，速度10m/min；第2天，15min，速度12m/min；第3天，20min，速度15m/min；第4天，30min，速度18m/min；第5天，35min，速度为20m/min。在第5天及之后，以20m/min的速度每天跑步55分钟，前10分钟包括12m/min的热身。累计里程30km。在PW28跑完后2～3％异氟醚麻醉处死大鼠，获取双膝关节标本，进行后续的组织学分析。
3、骨组织番红O-固绿染色
将骨组织固定、脱钙、包埋及切片后，将切片脱蜡、复水，接着将膝关节骨组织切片用固绿染液染色5～10min，自来水缓慢冲洗后，放入番红染液中染色15～30s，最后在三缸无水乙醇中快速脱水，脱水后的切片使用干净的二甲苯进行透明5min，最后用中性树胶封片后分析。
4、胎鼠阿利新蓝-茜素红骨架染色
GD20胎鼠用95％乙醇固定1～2周，接着用镊子小心将胎鼠的皮肤和内脏剥离后，将组织完全浸泡在丙酮中48h，然后取出胎鼠骨架，用阿利新蓝和茜素红染液染色2～3天，将样品放入20％甘油中透明1周，直到骨骼和肌肉接近透明，在10cm直径培养皿中加入50％甘油，把上述染色后的骨架放入其中并拍照。
5、骨组织免疫组织化学染色
将石蜡切片脱蜡复水，使用含EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)进行抗原修复，用3％BSA封闭后添加一抗，一抗稀释比例为anti-COL2A1(1:200)、anti-ACAN(1:200)。将添加一抗后的切片放置于湿盒内，于4℃冰箱中避光孵育过夜。次日用PBST清洗3次，每次持续时间10min，然后滴加与一抗相应种属的二抗，室温避光孵育1h。用PBST清洗3次，每次10min，然后使用HRP山羊抗兔IgG(H+L)抗体(1:50)在常温条件下孵育30～60min。用PBST清洗3次，每次持续10min，然后添加DAB显色剂进行免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)显色，时间3～10min，随后用自来水冲洗终止显色反应。苏木素复染，然后用自来水润洗3～4次，梯度酒精脱水及二甲苯透明后，中性树脂封片后分析。
6、基因表达检测
提取GD20宫内胎鼠、PW12成年大鼠软骨和体外培养软骨细胞的总RNA，之后逆转录为cDNA，并通过RT-PCR进行定量分析相关基因表达情况。各基因引物序列如表1所示：
表1.用于实时定量聚合酶链反应的引物.
ACAN,aggrecan；COL2A1,collagen type II alpha 1chain；GAPDH,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
7、细胞番红O及阿利新蓝染色
倒去培养液，用PBS漂洗3次，用4％多聚甲醛固定15min，然后用PBS润洗3次，用番红O染液或阿利新蓝染液染色3～5min。倒去染液，用PBS清洗3次后，在显微镜下观察、拍照并计算染色强度。
8、实验结果
8.1PPE导致雌性成年子代大鼠软骨质量低下及骨关节炎易感
首先，本发明检测了PPE对雌性成年子代(PW12)关节软骨表型的影响。SafraninO/Fast Green染色结果显示，与正常对照组相比，PPE组软骨糖胺聚糖(glycosaminoglycan,sGAG)含量显著降低(图1中a)。RT-qPCR及免疫组织化学染色结果表明，软骨表型基因COL2A1和ACAN的mRNA及蛋白表达水平(图1中b-d)也显著下降。进一步发现，子代大鼠从PW22开始进行为期6周的长距离跑步后，正常对照组软骨层没有被明显破坏，但Safranin O染色不均匀(图1中d)；相比之下，PPE组软骨Safranin O染色密度显著降低，软骨层的厚度显著减小甚至出现严重磨损，Mankin’s评分明显升高，同时COL2A1含量显著降低(图1中d-g)。以上结果提示，PPE可致雌性子代成年软骨质量低下及骨关节炎易感性增高。
8.2PPE导致雌性子代胎鼠软骨发育不良及ECM合成功能障碍
随后，为探究PPE导致雌性子代骨关节炎易感性增高是否源于宫内发育时期，本发明观察了GD20胎软骨的发育情况。Alcian blue and alizarin red骨架染色结果显示，与正常对照组相比，PPE组胎鼠体长及后肢长度明显缩短、骨化延迟(图2中a)。Safranin O/Fast Green染色显示，PPE组软骨层总长度(TL)、软骨增殖区长度(PZ)、PZ与TL的比值(PZ/TL)均较正常对照组显著减小(图2中b-e)，而肥大区(HZ)明显增宽(图2中b,f)。同时，与正常对照组相比，PPE组关节软骨的Safranin O染色明显变浅，定量分析结果显示，sGAG含量(图2中b,g)下降，COL2A1和ACAN的mRNA及蛋白表达均显著降低(图2中h-j)。这些结果表明，PPE所致的雌性子代骨关节炎易感性增高源于宫内发育时期。
8.3PPE通过Pred而不是强的松发挥软骨毒性作用
进一步，本发明确定是强的松还是Pred主要参与PPE对雌性子代软骨发育的影响。Alcan Blue和Safranin O染色结果显示，0-250nM强的松处理48h对胎软骨ECM无明显影响(图3中a)，而Pred则可浓度依赖性降低ECM水平(图3中b,c)，且250nM Pred可显著抑制胎软骨细胞COL2A1和ACAN的mRNA表达(图3中d)。以上结果提示，Pred(而不是强的松)在PPE所致胎软骨发育不良及ECM合成功能障碍中起主要作用。
【实例2】PPE抑制雌性子代大鼠软骨PGC-1α表达导致线粒体生物发生受损及氧化应激水平增高
1、mRNA表达检测
提取GD20宫内胎鼠、PW12成年大鼠软骨和体外培养软骨细胞的总RNA，之后逆转录为cDNA，并通过RT-PCR进行定量分析相关基因表达情况。各基因引物序列如表2所示：
表2.用于实时定量聚合酶链反应的引物.
ACAN,aggrecan；ATP(6,8),adenosine triphosphate(6,8)；COL2A1,collagentype II alpha 1chain；COX(1-2),respiratory chain complex(I-II)；GAPDH,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；ND(1-6),NADH dehydrogenase(1-6)；PGC1-α(PPARGC1A),peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1-alpha.
2、细胞免疫荧光染色
药物处理后的软骨细胞用冰冷的PBS润洗2～3次，然后加入4％多聚甲醛固定液，室温下固定15min。倒掉固定液，用冰冷PBS润洗2次，随后加入0.2％的Triton X-100溶液(胞膜蛋白可不加)，在室温下透膜15min。用冰冷PBS洗涤2次后，滴加3％BSA，在室温下封闭30min。按照1：200的稀释比例添加一抗，放入湿盒，37℃环境下避光孵育2～2.5h。弃去一抗，用TBST充分润洗3次，每次10min，然后加入Alexa fluor 488-偶联山羊抗兔IgG(H+L)荧光二抗，常温下避光孵育1h。用PBST润洗3次，每次10min，然后滴加即用型DAPI染液，常温下避光孵育5～10min，最后用PBST润洗2次。加入1ml PBS，使用共聚焦显微镜采集图像并计算样本的荧光强度。
3、Mito-Tracker Red CMXRos线粒体示踪染色
1)Mito-Tracker Red CMXRos储存液的配制：取适量Mito-Tracker Red CMXRos原液，加入无水二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)，充分混匀后，即得到浓度为200μM的Mito-Tracker Red CMXRos储存液。分装后避光保存于-20℃；
2)Mito-Tracker Red CMXRos工作液的配制：取少量200μM Mito-Tracker RedCMXRos储存液按照1：1000的比例加入到细胞培养液中，使最终浓度为200nM，然后将Mito-Tracker Red CMXRos工作液放入37℃中预温育；
3)软骨细胞的线粒体染色：弃去细胞培养皿中的细胞培养液，加入Mito-TrackerRed CMXRos工作液，37℃孵育20min；
4)随后去除Mito-Tracker Red CMXRos工作液，加入新鲜的细胞培养基；
5)用激光共聚焦显微镜进行观察及采集图像。
4、线粒体DNA拷贝数检测
1)收获软骨组织(预先充分研磨)或软骨细胞，重悬于200μl PBS中；
2)往样品管中加入20μl蛋白酶K，Vortex混匀；
3)加入200μl样品裂解液B，Vortex混匀，70℃孵育10min；
4)加入200μl无水乙醇，Vortex混匀；
5)把步骤4中的混合物加入到DNA纯化柱内。8000rpm离心1min。倒弃废液收集管内液体；
6)加入500μl洗涤液I，8000rpm离心1min。倒弃废液收集管内液体；
7)加入600μl洗涤液II，8000rpm离心1min。倒弃废液收集管内液体；
8)12000rpm再离心1min，以充分去除残留的乙醇；
9)将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50～200μl洗脱液。室温放置1～3min。然后12000rpm离心1min，所得液体即为纯化得到的总DNA；
10)使用RT-qPCR检测核基因18S RNA及线粒体基因ND1的DNA表达水平，引物序列如表3：
表3.线粒体DNA拷贝基因的扩增引物序列.
ochondrially encoded NADH:ubiquinone oxidoreductase core subunit 1.
用下列公式计算线粒体DNA的相对拷贝数：ΔCT＝CT(ND1)-CT(18S)，线粒体DNA拷贝数＝2×2-ΔCT。
5、线粒体膜电位检测(JC-1)
配制JC-1染色工作液：取适量JC-1(200×)，按照每5μl JC-1(200×)加入1ml JC-1染色缓冲液的比例稀释JC-1。吹打混匀后即为JC-1染色工作液。使用共聚焦培养皿培养细胞，药物处理后，吸除培养液，用PBS洗涤细胞1次，加入1ml细胞培养液，再加入1ml JC-1染色工作液，充分混匀，37℃细胞培养箱中孵育20min；孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次；加入1ml细胞培养液，在激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。
6、ATP含量检测
吸除细胞培养液，随后用PBS洗涤细胞3次。用等量的细胞裂解液充分裂解细胞，以4℃12000×g离心5min。取上清液进行后续测定。根据制造商说明书(南京建成，货号A059-1-1)中的步骤准备所需的试剂。最后，在636nm波长处测定样品的吸光度。
7、GSH及GSSG含量检测
使用六孔板培养细胞，准备所需的试剂和耗材，并按照说明按照制造商的说明书(南京建成，货号A061-1-2)处理细胞样本，在405nm波长处读出吸光度，按规定公式计算T-GSH、GSSG和GSH的含量。
8、骨组织番红O-固绿染色
将骨组织固定、脱钙、包埋及切片后，将切片脱蜡、复水，接着将膝关节骨组织切片用固绿染液染色5～10min，自来水缓慢冲洗后，放入番红染液中染色15～30s，最后在三缸无水乙醇中快速脱水，脱水后的切片使用干净的二甲苯进行透明5min，最后用中性树胶封片后分析。
9、骨组织免疫组织化学染色
将石蜡切片脱蜡复水，使用含EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)进行抗原修复，用3％BSA封闭后添加一抗，一抗稀释比例为anti-PGC-1α(1:200)、anti-COL2A1(1:200)和anti-8-OHdG(1:200)。将添加一抗后的切片放置于湿盒内，于4℃冰箱中避光孵育过夜。次日用PBST清洗3次，每次持续时间10min，然后滴加与一抗相应种属的二抗，室温避光孵育1h。用PBST清洗3次，每次10min，然后使用HRP山羊抗兔IgG(H+L)抗体(1:50)在常温条件下孵育30～60min。用PBST清洗3次，每次持续10min，然后添加DAB显色剂进行IHC显色，时间3～10min，随后用自来水冲洗终止显色反应。苏木素复染，然后用自来水润洗3～4次，梯度酒精脱水及二甲苯透明后，中性树脂封片后分析。
10、实验结果
10.1PPE可致雌性子代软骨氧化应激水平增高
动物水平的结果显示，在GD20和PW12，PPE组胎软骨的8-hydroxyguanosine(8-OHdG，一种DNA氧化损伤的生物标志物)水平明显增高(图4中a)。体外结果显示，Pred可引起细胞内活性氧(ROS)水平(图4中b)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)(图4中c)显著升高，而总谷胱甘肽(T-GSH)水平明显下降(图4中c)。这表明，PPE可致雌性子代软骨氧化应激水平增高。
10.2PPE可抑制子代软骨线粒体生物发生受损
Mito-Tracker Red CMXRos染色显示，体外Pred处理后胎软骨细胞线粒体染色变浅，表明线粒体膜电位降低，同时线粒体数量明显减少(图5中a,b)，线粒体密度显著降低(图5中a,c)。透射电镜(TEM)的结果显示，PPE组胎软骨细胞的线粒体嵴断裂、嵴密度降低(图5d,e)、线粒体数量减少(图5中d,f)，同时线粒体直径明显增宽并伴有水肿(图5中d,g)。这表明，PPE可致雌性子代胎软骨细胞线粒体形态异常。在体内动物水平，PPE组胎软骨PGC-1α的蛋白表达水平均较正常对照组明显降低(图5中h,i)，同时，mtDNA拷贝数明显减少(图5中i)。在PW12，本发明也观察到一致的结果(图5中j,k)。在体外，Pred可浓度依赖性抑制PGC-1α的mRNA水平(图5中l)，并降低mtDNA拷贝数(图5中m)。进一步检测线粒体功能发现，GD20和PW12时PPE组软骨中参与氧化磷酸化和呼吸链的线粒体编码基因表达均受到明显抑制(图5中n,o)。体外实验也表明，Pred可显著抑制线粒体编码基因并降低ATP含量(图5中p,q)。这表明，PPE可致雌性子代软骨线粒体生物发生受损及线粒体功能障碍。
10.3体外水平激活PGC-1α可逆转Pred对软骨细胞的影响
随后，本发明进一步验证PGC-1α在Pred所致软骨线粒体生物发生抑制及ECM合成中的关键作用。结果显示，PGC-1α的转录激活剂ZLN005可以逆转Pred所致的mtDNA拷贝数及线粒体膜电位降低(图6中a,b)。此外，激活PGC-1α可改善Pred处理下COL2A1的mRNA和蛋白水平(图6中c,d)。以上结果证明，PPE通过抑制PGC-1α表达导致胎软骨细胞线粒体生物发生障碍，从而引起软骨ECM合成障碍。
10.4关节腔注射PPARGC1A慢病毒过表达载体可改善PPE雌性子代软骨表型
为进一步确定PGC-1α作为出生后早期潜在干预靶点的可行性，本发明在PW8将大鼠随机分为6组，Control组(Blank,LV-NC,LV-PPARGC1A)、PPE组(Blank,LV-NC,LV-PPARGC1A)。IF结果显示软骨组织成功转染慢病毒(图7中a)。Safranin O/Fast Green结果显示，PPE+Blank组或PPE+LV-NC组的sGAG水平较Control+Blank组或Control+LV-NC组明显降低(图7中b)，与前文结果一致。而与PPE+LV-NC组相比，PPE+LV-PPARGC1A组sGAG水平明显升高并可恢复至正常水平(图7中b)。进一步检测表型指标及线粒体生物发生相关指标。与前一致，PPE+LV-NC组COL2A1和ACAN、PGC-1α的蛋白水平较Control+LV-NC组明显降低(图7中c-g)，而这可被过表达PPARGC1A所逆转(图7中c-g)。这些结果证实，PPARGC1A的过表达可通过线粒体谷氨酰胺代谢途径改善PPE雌性子代软骨ECM合成，由此提示，PPARGC1A有望作为PPE所致雌性子代骨关节炎易感的潜在早期干预靶点。
【实例3】PGC-1α是胎源性骨关节炎的“共性”干预靶点
1、mRNA表达检测
提取PPE模型GD20宫内胎鼠、PW12成年大鼠软骨和体外培养软骨细胞的总RNA，之后逆转录为cDNA，并通过RT-PCR进行定量分析相关基因表达情况。各基因引物序列如表4所示：
表4.用于实时定量聚合酶链反应的引物.
ACAN,aggrecan；GAPDH,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
2、骨组织番红O-固绿染色
将骨组织固定、脱钙、包埋及切片后，将切片脱蜡、复水，接着将膝关节骨组织切片用固绿染液染色5～10min，自来水缓慢冲洗后，放入番红染液中染色15～30s，最后在三缸无水乙醇中快速脱水，脱水后的切片使用干净的二甲苯进行透明5min，最后用中性树胶封片后分析。
3、骨组织免疫组织化学染色
将石蜡切片脱蜡复水，使用含EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)进行抗原修复，用3％BSA封闭后添加一抗，一抗稀释比例为anti-PGC-1α(1:200)。将添加一抗后的切片放置于湿盒内，于4℃冰箱中避光孵育过夜。次日用PBST清洗3次，每次持续时间10min，然后滴加与一抗相应种属的二抗，室温避光孵育1h。用PBST清洗3次，每次10min，然后使用HRP山羊抗兔IgG(H+L)抗体(1:50)在常温条件下孵育30～60min。用PBST清洗3次，每次持续10min，然后添加DAB显色剂进行免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)显色，时间3～10min，随后用自来水冲洗终止显色反应。苏木素复染，然后用自来水润洗3～4次，梯度酒精脱水及二甲苯透明后，中性树脂封片后分析。
4、孕期咖啡因暴露(PCE)和孕期地塞米松暴露(PDE)模型
PCE大鼠模型：SPF级Wistar大鼠(许可证号：SCXK2015-0018，No.42000600014526)饲养在标准条件(室温：2322℃；湿度：55210％；光周期：12h明暗周期；每小时换气10～15次)的空调房内，并允许大鼠自由进食食物和自来水。所有实验大鼠在实验进行为期7天的适应性喂养，然后将雌性大鼠和雄性大鼠按照数量2：1进行合笼交配。次日上午8：00对合笼后的雌性大鼠进行阴道涂片并在显微镜下观察。发现精子则确认成功受孕，交配当天记为GD0。受孕雌鼠单笼饲养，并随机分为正常对照组和孕期咖啡因暴露(prenatal caffeineexposure,PCE)组。PCE组从GD9～20开始给予咖啡因灌胃(120mg/kg·d)处理，正常对照组给予等体积的生理盐水灌胃处理。给药体积均为每千克体重1ml。孕鼠自然分娩，按照雌雄各半原则调整每组子代窝仔数，每组8窝，断奶后从每窝中分别挑选一只雌性大鼠合并为一组，然后继续饲养至PW12。所有雌性大鼠用2～3％异氟烷麻醉后处死，取膝关节后用4％多聚甲醛固定，并进行后续的脱钙、包埋、切片及组织学检测。
PDE大鼠模型：SPF级别Wistar大鼠(许可证号:SCXK2012-2014，No.42000600002258)，饲养在标准条件(室温：2322℃；湿度：55210％；光周期：12h明暗周期；每小时换气10～15次)的空调房内，并允许大鼠自由进食食物和自来水。所有实验大鼠在实验进行为期7天的适应性喂养，然后将雌性大鼠和雄性大鼠按照数量2：1进行合笼交配。次日上午8：00对合笼后的雌性大鼠进行阴道涂片并在显微镜下观察。发现精子则确认成功受孕，交配当天记为GD0。受孕大鼠被随机分为正常对照组和孕期地塞米松暴露(prenatal dexamethasone exposure,PDE)组。GD9～20时，PDE组和正常对照组每天早上8点皮下分别注射0.2mg/kg·d地塞米松或等量生理盐水。孕鼠自然分娩，按照雌雄各半原则调整每组子代窝仔数，每组8窝，断奶后从每窝中分别挑选一只雌性大鼠合并为一组，然后继续饲养至PW8。所有雌性大鼠用2～3％异氟烷麻醉后处死，取膝关节后用4％多聚甲醛固定，并进行后续的脱钙、包埋、切片及组织学检测。
5、实验结果
为进一步揭示PGC-1α作为潜在干预靶点的特征，本发明检测了不同性别和模型中PGC-1α的表达。本发明发现与正常对照组相比，PPE组雄性后代PW12时软骨PGC-1α及ACAN的表达均未出现显著差异(图8中a,b)，提示PPE对子代软骨的影响具有性别差异性(个性)。在孕期地塞米松暴露(PDE，外源性GC过暴露)及孕期咖啡因暴露(PCE，内源性GC过暴露)大鼠模型中，雌性成年子代软骨PGC-1α蛋白表达水平较正常对照组均明显降低(图8中c,d)，与PPE模型一致。提示，孕期GC(无论外源性还是内源性)暴露对雌性子代软骨PGC-1α表达均有抑制作用(共性)。

Claims (9)

1.一种胎源性成年骨关节炎易感模型的构建方法，其特征在于：所述胎源性成年骨关节炎由PPE诱导，其构建方法包含以下步骤：
S1：选取正常受孕的大鼠，从孕0～20天，每日给予强的松0.25mg/kg灌胃处理，孕鼠自由饮食；
S2：上述步骤S1给予强的松处理的孕鼠自然生产，获得F1子代，出生后第一天将每窝母鼠的数量统一调整为14只，雌雄各半，每个实验组12窝；4周断奶后，每窝取一只雌性子代大鼠和一只雄性大鼠，分成一组继续饲养至出生后12周，获得PW12子代大鼠；
S3：出生后雌性子代大鼠长距离跑步：在上述步骤S2出生后子代中，每窝选一只雌性大鼠，分成一组继续饲养至PW22，在PW22～28期间使用专用跑步机进行为期6周的长距离跑步实验；实验分为6个周期，每个周期7天；第1天，10min，速度10m/min；第2天，15min，速度12m/min；第3天，20min，速度15m/min；第4天，30min，速度18m/min；第5天，35min，速度为20m/min；在第5天及之后，以20m/min的速度每天跑步55分钟，前10分钟包括12m/min的热身；累计里程30km；该步骤获得PW28跑步大鼠；
S4：对所述PW12子代大鼠和PW28跑步大鼠膝关节软骨质量相关指标进行检测，软骨质量相关指标发生改变，则所述F1子代大鼠为PPE诱导的胎源性成年骨关节炎易感模型。
2.根据权利要求1所述的胎源性成年骨关节炎易感模型的构建方法，其特征在于：
所述步骤S4中，软骨质量相关指标发生改变具体是指，番红固绿染色呈关节软骨染色着色变淡、关节软骨各层结构紊乱、分界不清、关节软骨表层磨损、软骨基质合成相关蛋白的mRNA及蛋白表达均降低；
所述软骨基质合成相关蛋白的mRNA及蛋白表达包括COL2A1、ACAN；
所述大鼠为SPF级Wistar或SD大鼠。
3.一种如权利要求1或2所述的模型在筛选胎源性成年骨关节炎药物靶标中的应用，其特征在于：所述胎源性成年骨关节炎易感模型是指孕期强的松暴露即PPE的啮齿类动物模型。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：包含以下步骤：
s1：在权利要求1所述的步骤S1中，给予强的松处理的孕鼠自然生产，获得F1子代，出生后第一天将每窝母鼠的数量统一调整为14只，雌雄各半，每个实验组12窝；
s2：4周断奶后，每窝取一只雌性子代大鼠，分成一组继续饲养至PW8；
s3：从正常对照组和PPE组每窝随机挑选1-2只用于关节腔慢病毒注射干预实验；大鼠在第1、2周进行关节腔注射PPARGC1A慢病毒载体，4周后获得慢病毒干预大鼠；
s4：对所述慢病毒干预大鼠的膝关节软骨质量相关指标进行检测，软骨质量相关指标、线粒体生物发生相关指标恢复正常，则PGC-1α是PPE诱导的胎源性成年骨关节炎易感的干预靶标。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包含以下步骤：
所述步骤s4中，软骨质量相关指标恢复正常具体是，番红固绿染色呈关节软骨染色着色恢复正常、软骨基质合成相关蛋白表达恢复正常；线粒体生物发生相关指标恢复正常具体是指，PGC-1α及电压依赖性阴离子选择性通道1蛋白表达恢复正常。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的关节腔注射的慢病毒PPARGC1A慢病毒载体。
7.一种如权利要求3至6中任一所述应用得到的药物靶标，其特征在于：所述药物靶标是指过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α即PGC-1α。
8.一种如权利要求7所述药物靶标在制备改善胎源性成年骨关节炎药物中的应用。
9.一种PGC-1α作为胎源性成年骨关节炎的“共性”干预靶标，其特征在于：所述PGC-1α的表达在孕期糖皮质激素暴露雌性子代软骨中均被抑制。
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