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CN116848094A - 叔胺类脂质化合物及其应用 - Google Patents

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CN116848094A
CN116848094A CN202280005653.1A CN202280005653A CN116848094A CN 116848094 A CN116848094 A CN 116848094A CN 202280005653 A CN202280005653 A CN 202280005653A CN 116848094 A CN116848094 A CN 116848094A
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alkyl
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lipid
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熊梦华
张厚兵
鲍燕
罗智毅
王均
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South China University of Technology SCUT
Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
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South China University of Technology SCUT
Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
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Abstract

提供一种具有式（I）所示结构的叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者药学上可接受的盐，及其应用。所述化合物可以高效、高选择性地破坏细胞膜或者溶酶体膜，从而杀伤肿瘤细胞。

Description

叔胺类脂质化合物及其应用 技术领域
本发明涉及材料和药物技术领域，具体涉及一种叔胺类脂质化合物及其应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为威胁人类生命健康的一大杀手。目前的化疗、放疗、免疫治疗等抗肿瘤疗法虽然能在一定程度上抑制肿瘤生长、延长病人生存期甚至完全治愈肿瘤，但都面临着特异性不强、毒副作用大的问题，如化疗、放疗会导致正常组织损伤，免疫检查点疗法会导致免疫相关性毒副作用。
一些阳离子类高分子可通过破坏细胞膜或者细胞器膜的方式杀伤肿瘤细胞及细菌等病原体，具有广谱杀伤效果、不易产生耐药等优点，在肿瘤等疾病治疗中具有广阔应用前景。例如，LTX-315阳离子多肽通过瘤内注射应用于肿瘤治疗，可导致肿瘤细胞大量坏死，其联合易普利姆玛单抗、派姆单抗等药物，在黑色素瘤、头颈癌、淋巴瘤、乳腺癌中都取得了良好的效果，相关研究正处于临床一期实验(https://clinicaltrials.gov/)。LL-37多肽通过瘤内注射治疗黑色素瘤的研究也处于一期临床研究(https://clinicaltrials.gov/)。然而，由于这类药物不仅可以高效破坏肿瘤细胞及病原菌，也对正常组织细胞具有强细胞毒性，且多肽药物易被蛋白酶降解，多数药物均止步于临床研究，目前临床使用药物多为局部注射治疗。
因此，急需开发对正常组织、细胞无毒副作用，可以特异性杀伤肿瘤细胞的药物用于肿瘤治疗。
发明内容
基于此，本发明提供了一类叔胺类脂质化合物，该叔胺类脂质化合物在正常生理pH下，呈疏水电中性，可与DSPE-PEG等两亲性辅助脂质自组装成PEG为壳层的脂质纳米颗粒，细胞毒性低；在微酸的pH条件下，可以质子化，形成疏水结构域和阳离子结构域组成的两亲性结构，与细胞膜或细胞器膜具有强相互作用，从而产生较强的细胞毒性，特异性杀伤肿瘤细胞。
本发明包括如下技术方案。
具有式(I)所示结构的叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐在制备pH响应性破膜材料中的应用：
其中，各R 1分别独立选自：烷基、不饱和链烃基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳基取代的烷基、环烷基取代的烷基；
各R 2分别独立选自： 或者没有；
R 3和R 4分别独立选自：H、R 9取代或者未取代的烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、-R 2-R 1、 或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的3-20元杂环基；并且，当R 3直接与N相连时，R 3不为H；当R 4直接与N相连时，R 4不为H；
各R 5分别独立选自：亚烷基、环烷基、芳基；
各R 6分别独立选自：烷基、羟基取代的烷基、不饱和链烃基、烯基、芳基、芳基取代的烷基、
各R 7分别独立选自：烷基、羟基取代的烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、芳基取代的烷基、 或者R 6、R 7和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-8元杂环基；
各R 8分别独立选自：烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、烷基取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、芳基取代的烷基、环烷基取代的烷基、
R 9选自：羟基、芳基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、杂芳基；
各X分别独立地为O或者NH；
各q和各q’分别独立的为0、1或者2；
a为0或者1；
b为1、2、3、4或者5；
c为1、2、3、或者4；
d为2-12之间的整数。
所述叔胺类脂质化合物可以有如下式(II)所示结构：
所述叔胺类脂质化合物还可以有如下式(III)所示的结构：
R 4选自：R 9取代或者未取代的烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、
所述叔胺类脂质化合物还可以有如下式(IV)所示结构：
其中，n为1、2、3、4或者5；
R 3和R 4分别独立选自：C 1-C 10烷基、羟基取代的C 1-C 10烷基、C 1-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基，或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成3-8元杂环基。
所述叔胺类脂质化合物还可以有如下式(V)所示的结构：
n 1、n 2、n 3、n 4分别独立地选自：0、1、2、3或者4。
另一方面，本发明还提供了一种脂质纳米颗粒，由所述的叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，以及两亲性分子在水介质中自组装形成，所述两亲性分子为：两亲性聚乙二醇脂质分子，或者两亲性聚乙二醇脂质分子和磷脂的组合。
另一方面，本发明还提供了所述的脂质纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐溶于有机溶剂中，得叔胺类脂质化合物溶液；
将所述两亲性分子溶于有机溶剂中，得两亲性分子溶液；
取所述叔胺类脂质化合物溶液和所述两亲性分子溶液混合，得混合溶液；
在所述混合溶液中加入含水介质，并用移液枪反复吹打，即得所述脂质纳米颗粒；或者，将所述混合溶液在搅拌条件下缓慢滴加到含水介质中，继续搅拌，即得所述脂质纳米颗粒。
另一方面，本发明还提供了所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐，或者所述的脂质纳米颗粒的应用，包括如下技术方案。
所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
所述的脂质纳米颗粒在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐联合抗肿瘤药物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
所述的脂质纳米颗粒联合抗肿瘤药物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的药物，由活性成分和药学上可接受的辅料和/或载体制备得到，所述活性成分包括权所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐，和/或所述的脂质纳米颗粒。
另一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的联合用药物，其活性成分包括：
组分1：所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐，和/或所述的脂质纳米颗粒；以及，
组分2：组分1之外的抗肿瘤药物；
所述组分1和组分2分别成为独立的给药单元，或所述组分1和组分2共同形成组合的 给药单元。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种酸度可激活的抗肿瘤脂质叔胺小分子化合物，该小分子化合物由亲疏水性质可转变的三级胺头部及含疏水基团的尾部组成。在正常生理pH下，该脂质材料中的三级胺呈疏水电中性，三级胺头部呈疏水构象，并且，该脂质材料可以在DSPE-PEG等辅助脂质的辅助下自组装形成PEG为壳层的酸度可激活的抗肿瘤脂质纳米颗粒，与细胞膜的相互作用弱，从而使其在体内循环时具有对正常组织毒性小的优点，且PEG外壳能提高该脂质材料的生物相容性，延长其血液循环时间；在肿瘤组织微酸的pH条件下(大量研究显示，肿瘤细胞通常是采用糖酵解的代谢方式，产生更多的乳酸和二氧化碳，而由于实体肿瘤组织中淋巴回流堵塞代谢废物无法正常排出，导致实体瘤的外周环境pH比正常体液的pH更低，通常为6.4～7.0之间)，该分小分子化合物脂质材料的三级胺部分会发生质子化，从而使纳米颗粒形成疏水结构域和阳离子结构域组成的两亲性结构，从而使其与细胞膜或细胞器膜具有极强的相互作用，从而可以高效、高选择性地杀伤肿瘤细胞。本发明的叔胺小分子化合物和/或酸度可激活的抗肿瘤脂质纳米颗粒能够用于制备抗肿瘤药物，具有治疗效果好，选择性高，毒性小的优点。
附图说明
图1为丙烯酸正癸酯(C10)的核磁共振氢谱图。
图2为9-十八烯丙烯酸酯(C181)的核磁共振氢谱图。
图3为顺-9,12-十八碳二烯基丙烯酸酯(C182)的核磁共振氢谱图。
图4为苯基丁基丙烯酸酯(Cp4)的核磁共振氢谱图。
图5为实施例1制备的脂质纳米颗粒按400μg/mL与2％羊血孵育4h后的溶血率热图。
图6为实施例2制备的不同碳链长度的脂质纳米颗粒与小鼠结直肠癌MC38细胞在pH 7.4和6.8条件下共孵育24h后的细胞活度与pH的关系图。
图7为实施例2制备的不同碳链长度的脂质纳米颗粒与小鼠结直肠癌MC38细胞在pH 7.4和6.8条件下共孵育24h后的细胞活度与pH的关系图。
图8为实施例1制备的C8A45脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图9为实施例1制备的C8A49脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图10为实施例1制备的C12A27脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图11为实施例1制备的C12A33脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图12为实施例1制备的C14A33脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图13为实施例1制备的C16A34脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图14为实施例1制备的C181A17脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图15为实施例1制备的C181A23脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图16为实施例1制备的C181A24脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图17为实施例1制备的C181A28脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图18为实施例1制备的C182A17脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图19为实施例1制备的C182A23脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图20为实施例1制备的C182A24脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图21为实施例1制备的C182A28脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图22为实施例1制备的C8A16脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图23为实施例1制备的C8A19脂质化合物的核磁共振氢谱图。
图24为部分脂质纳米颗粒在pH 7.4和6.8条件下浓度依赖性的细胞毒性。
图25为部分脂质纳米颗粒在pH 7.4和6.8条件下浓度依赖性的细胞毒性。
图26为动态光散射仪检测的脂质纳米颗粒在水溶液中的粒径及其分布。
图27为叔胺脂质纳米颗粒在ICR小鼠身上检测的MTD。
图28为叔胺脂质纳米颗粒的质子化率随pH的变化及其pKa。
图29为C12A27脂质化合物与不同成分组装的脂质纳米颗粒在pH 7.4和6.8条件下浓度依赖性的细胞毒性；其中，a图为C12A27与不同PEG脂质按照1：1组装的脂质纳米颗粒在pH 7.4和pH 6.8下对MC38的细胞毒性；b图为DSPE-PEG与C12A27按照不同的质量比组装的脂质纳米颗粒在pH 7.4和pH 6.8下对MC38的细胞毒性；c图和d图分别为DSPE-PEG、C12A27与不同的辅助脂质按不同质量比组装的脂质纳米颗粒在pH 7.4和pH 6.8下对MC38的细胞毒性。
图30为C12A27脂质纳米颗粒在pH 6.8下对MC38细胞的细胞毒性的机制研究；其中，a图为C12A27脂质纳米颗粒在pH 6.8下、在不同温度条件下对MC38共同孵育4h的细胞毒性；b图为C12A27脂质纳米颗粒在pH 6.8下、在不同温度条件下与MC38细胞共同孵育4h后细胞质中ATP的泄露情况；c图为C12A27脂质纳米颗粒在pH 6.8下与MC38 GFP/mCherry细胞共同孵育后细胞质中mCherry泄露以及细胞膜上GFP的变化情况。
图31为C8A16脂质纳米颗粒、C8A19脂质纳米颗粒在pH 6.8下与MC38 GFP/mCherry细胞共同孵育后细胞质中mCherry泄露以及细胞膜上GFP的变化情况。
图32为C8A16脂质纳米颗粒、PI和Annexin-FITC在pH 6.8下与MC38共同孵育后的 细胞形态及细胞染色情况。
图33为C8A45脂质纳米颗粒、C8A49脂质纳米颗粒、C12A27脂质纳米颗粒和C12A33脂质纳米颗粒在pH 6.0下与Panc02 GFP/mCherry细胞共同孵育后细胞质中mCherry泄露以及细胞膜上GFP的变化情况。
图34为C12A27、C14A27、C16A27脂质纳米颗粒对小鼠胰腺癌模型Panc02的治疗实验给药示意图和实验结果。
图35为C8A16脂质纳米颗粒、C8A19脂质纳米颗粒、C8A45脂质纳米颗粒、C8A49脂质纳米颗粒、C12A27脂质纳米颗粒、C12A33脂质纳米颗粒以及C182A28脂质纳米颗粒对小鼠结直肠癌模型MC38的治疗实验给药示意图和实验结果。
图36为C8A45脂质纳米颗粒、C8A49脂质纳米颗粒、C12A27脂质纳米颗粒、C12A33脂质纳米颗粒对小鼠乳腺癌模型E0771的治疗实验给药示意图和实验结果。
图37为C12A27及C14A27脂质纳米颗粒联合免疫检查点抗体aPD-1对小鼠结直肠癌模型MC38的治疗实验给药示意图和实验结果。
图38为C12A27脂质纳米颗粒联合化疗药物脂质体阿霉素Doxil对小鼠乳腺癌模型EMT-6的治疗实验给药示意图和实验结果。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明所述化合物中，当任何变量(例如R 1、R 2等)在任何组分中出现超过一次，则其 每次出现的定义独立于其它每次出现的定义。同样，允许取代基及变量的组合，只要这种组合使化合物稳定。自取代基划入环系统的线表示所指的键可连接到任何能取代的环原子上。如果环系统为多环，其意味着这种键仅连接到邻近环的任何适当的碳原子上。要理解本领域普通技术人员可选择本发明化合物的取代基及取代型式而提供化学上稳定的并可通过本领域技术和下列提出的方法自可容易获得的原料容易合成的化合物。如果取代基自身被超过一个基团取代，应理解这些基团可在相同碳原子上或不同碳原子上，只要使结构稳定。短语“任选被一个或多个取代基取代”被认为与短语“任选被至少一个取代基取代”相当且在此情况下优选的实施方案将具有0-3个取代基。
本文所用术语“烷基”意指包括具有特定碳原子数目的支链的和直链的饱和脂肪烃基。例如，“C 1-C 6烷基”中“C 1-C 6”的定义包括以直链或支链排列的具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。例如，“C 1-C 6烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基。
术语“不饱和链烃基”指具有特定碳原子数目的支链的和直链的不饱和脂肪烃基，即非环状的不饱和链状烃基，并且碳链中含有1个或者多个碳碳双键，或者含有碳碳三键，如：CH 2＝CHCH 2- ，-(CH 2) 8(CH＝CH)CH 3，-(CH 2) 7CH＝CH 2，-(CH 2) 8CH＝CH 2、顺-9,12-十八碳二烯基等。
术语“杂环基”为饱和或者部分不饱和的单环、稠环、螺环、桥环等环状取代基，其中一个或多个环原子选自N、O或S(O)m(其中m是0-2的整数)的杂原子，其余环原子为碳，例如：哌啶基、吡咯烷基等。
本发明所述的“酸度可激活的抗肿瘤脂质”是指在特定酸度条件下可以特异性激活抗肿瘤活性以杀伤肿瘤细胞的脂质。
本发明所述的“pH响应性破膜材料”是指在特定酸度条件下可以激活其破膜活性的材料。
本发明所述的“叔胺类脂质化合物”或者“脂质”或者“小分子化合物”或者“小分子脂质化合物”或者“叔胺小分子化合物”均指本发明式(I)-式(V)所示结构范围内的化合物。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种具有式(I)所示结构的叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐在制备pH响应性破膜材料中的应用：
其中，各R 1分别独立选自：烷基、不饱和链烃基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳基取代的烷基、环烷基取代的烷基；
各R 2分别独立选自： 或者没有；
R 3和R 4分别独立选自：H、R 9取代或者未取代的烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、-R 2-R 1、 或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的3-20元杂环基；并且，当R 3直接与N相连时，R 3不为H；当R 4直接与N相连时，R 4不为H；
各R 5分别独立选自：亚烷基、环烷基、芳基；
各R 6分别独立选自：烷基、羟基取代的烷基、不饱和链烃基、烯基、芳基、芳基取代的烷基、
各R 7分别独立选自：烷基、羟基取代的烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、芳基取代的烷基、 或者R 6、R 7和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-8元杂环基；
各R 8分别独立选自：烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、烷基取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、芳基取代的烷基、环烷基取代的烷基、
R 9选自：羟基、芳基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、杂芳基；
各X分别独立地为O或者NH；
各q和各q’分别独立的为0、1或者2；
a为0或者1；
b为1、2、3、4或者5；
c为1、2、3、或者4；
d为2-12之间的整数。
在其中一些优选地实施例中，所述叔胺类脂质化合物具有如下式(II)所示结构：
在其中一些优选地实施例中，所述叔胺类脂质化合物具有如下式(III)所示的结构：
R 4选自：R 9取代或者未取代的烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、
在其中一些优选地实施例中，R 4选自：C 1-C 22烷基、R 9取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 3-C 22环烷基、3-22元杂环基、R 8取代的3-22元杂环基、C 2-C 22烯基、C 2-C 22炔基、C 6-C 22芳基、
在其中一些优选地实施例中，R 4选自：C 1-C 10烷基、R 9取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、R 8取代的3-8元杂环基、C 2-C 10烯基、C 2-C 10炔基、苯基、萘基、蒽基、
在其中一些优选地实施例中，各R 5分别独立选自：C 1-C 22亚烷基、C 3-C 8环烷基、C 6-C 14芳基。
在其中一些优选地实施例中，各R 5分别独立选自：C 1-C 10亚烷基、C 3-C 8环烷基、苯基、萘基、蒽基。
在其中一些优选地实施例中，各R 5分别独立选自：C 1-C 6亚烷基、C 3-C 8环烷基。
在其中一些优选地实施例中，各R 5分别独立选自：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、
在其中一些优选地实施例中，各R 6分别独立选自：C 1-C 22烷基、羟基取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 2-C 22烯基、C 6-C 14芳基、C 6-C 14芳基取代的C 1-C 8烷基、
各R 7分别独立选自：C 1-C 22烷基、羟基取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 3-C 22环烷基、3-22元杂环基、R 8取代的3-22元杂环基、C 2-C 22烯基、C 2-C 22炔基、C 6-C 14芳基、C 6-C 14芳基取代的C 1-C 8烷基、 或者R 6、R 7和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-8元杂环基；
各R 8分别独立选自：C 1-C 22烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 3-C 22环烷基、3-22元杂环基、C 1-C 8烷基烷基取代的3-22元杂环基、C 2-C 22烯基、C 2-C 22炔基、C 6-C 14芳基、C 6-C 14芳基取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 22环烷基取代的C 1-C 8烷基、
在其中一些优选地实施例中，各R 6分别独立选自：C 1-C 10烷基、羟基取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 10不饱和链烃基、C 2-C 10烯基、苯基、萘基、蒽基、苯基取代的C 1-C 8烷基、萘基取代的C 1-C 8烷基、蒽基取代的C 1-C 8烷基、
各R 7分别独立选自：C 1-C 10烷基、羟基取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、R 8取代的3-8元杂环基、C 2-C 10烯基、C 2-C 10炔基、苯基、萘基、蒽基、苯基取代的C 1-C 8烷基、萘基取代的C 1-C 8烷基、蒽基取代的C 1-C 8烷基、 或者R 6、R 7和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-8元杂环基；
各R 8分别独立选自：C 1-C 10烷基、C 2-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、C 1-C 6烷基烷基取代的3-8元杂环基、C 2-C 10烯基、C 2-C 10炔基、苯基、萘基、蒽基、苯基取代的C 1-C 8烷基、萘基取代的C 1-C 8烷基、蒽基取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 8环烷基取代的C 1-C 8烷基、
在其中一些优选地实施例中，各R 6分别独立选自：C 1-C 6烷基；羟基取代的C 1-C 6烷基、
各R 7分别独立选自：C 1-C 6烷基、羟基取代的C 1-C 6烷基、 或者R 6、R 7和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-8元杂环基；
各R 8分别独立选自：C 1-C 6烷基、5-8元杂环基、C 1-C 6烷基取代的5-8杂环基、苯基、 苯基取代的C 1-C 3烷基、
在其中一些优选地实施例中，R 9选自：羟基、C 6-C 14芳基、C 3-C 22环烷基、3-22元杂环基、R 8取代的3-22元杂环基、5-10元杂芳基。
在其中一些优选地实施例中，R 9选自：羟基、苯基、萘基、蒽基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、R 8取代的3-8元杂环基、5-8元杂芳基。
在其中一些优选地实施例中，R 4选自：C 1-C 8烷基、R 9取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 8环烷基、苯基取代的C 1-C 3烷基、萘基取代的C 1-C 3烷基、蒽基取代的C 1-C 3烷基、3-8元杂环基、R 8取代的5-8元杂环基、 取代的环己基；
R 5选自：C 1-C 4亚烷基；
各R 6分别独立选自：C 1-C 6烷基、羟基取代的C 1-C 6烷基、-CH 2-R 2-R 1；
各R 7分别独立选自：C 1-C 6烷基、羟基取代的C 1-C 6烷基、-CH 2-R 2-R 1；
各R 8分别独立选自：C 1-C 6烷基、苯基、苯基取代的C 1-C 3烷基、
R 9选自：羟基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、R 8取代的3-8元杂环基、5-8元杂芳基。
在其中一些优选地实施例中，R 4选自：C 4-C 6烷基、二甲胺基取代的丁基、二乙胺基取代的丁基、哌啶基取代的正丙基、R 9取代的C 1-C 3烷基、C 4-C 8环烷基、苄基、5-8元杂环基、R 8取代的5-6元杂环基、 取代的环己基；
各R 5分别独立选自：C 1-C 3亚烷基；
R 6选自：C 3-C 4烷基；
各R 7分别独立选自：C 3-C 4烷基；
各R 8分别独立选自：C 1-C 6烷基、苄基、
R 9选自：
在其中一些优选地实施例中，所述叔胺类脂质化合物具有如下式(IV)所示结构：
其中，n为1、2、3、4或者5；
R 3和R 4分别独立选自：C 1-C 10烷基、羟基取代的C 1-C 10烷基、C 1-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基，或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成3-8元杂环基。
在其中一些优选地实施例中，R 3和R 4分别独立选自：C 1-C 6烷基、羟基取代的C 1-C 6烷基、C 1-C 6不饱和链烃基，或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成5-8元杂环基。
在其中一些优选地实施例中，所述叔胺类脂质化合物具有如下式(V)所示的结构：
n 1、n 2、n 3、n 4分别独立地选自：0、1、2、3或者4。
在其中一些优选地实施例中，各R 1分别独立选自：C 1-C 22烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 3-C 22环烷基、C 2-C 22烯基、C 2-C 22炔基、C 6-C 22芳基、C 6-C 14芳基取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 22环烷基取代的C 1-C 8烷基。
在其中一些优选地实施例中，各R 1分别独立选自：C 8-C 20烷基、C 8-C 20不饱和链烃基、C 5-C 20环烷基、C 8-C 20烯基、C 8-C 20炔基、苯基、萘基、蒽基、苯基取代的C 1-C 6烷基、萘基取代的C 1-C 6烷基、蒽基取代的C 1-C 6烷基、C 5-C 20环烷基取代的C 1-C 6烷基。
在其中一些优选地实施例中，各R 1分别独立选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊烷基、异戊烷基、正己基、异己烷基、正庚基、异庚基、正辛基、异辛基、正壬烷基、异壬烷基、正癸烷基、异癸烷基、十一烷基、正十二烷基、异十二烷基、环十二烷基、十三烷基、异十三烷基、正十四烷基、十五烷基、正十六烷基、异十六烷基、十七烷基、 正十八烷基、异十八烷基、二十二烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二基、环十二基甲基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基丙基、环丙基丁基、环丁基甲基、环丁基甲基、环丁基丙基、环丁基丁基、环戊基甲基、环戊基乙基、环戊基丙基、环戊基丁基、环己基甲基、环己基乙基、环己基丙基、环己基丁基、环己基戊基、环己基己基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、癸烯基、十二烯基、十四烯基、十六烯基、十八烯基、二十二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、辛炔基、癸炔基、十二炔基、十四炔基、十六炔基、十八炔基、二十二炔基、亚麻基、苯基、萘基、蒽基、苄基、苯乙基、苯丙基、苯丁基、苯己基、苯辛基、萘甲基、萘乙基、萘丙基、萘丁基、萘己基、萘辛基、蒽甲基、蒽乙基、蒽丙基、蒽丁基、蒽己基、蒽辛基、顺-9,12-十八碳二烯基、9-十八烯基。
在其中一些优选地实施例中，各R 1分别独立选自：正辛基、异癸基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、9-十八烯基、顺-9,12-十八碳二烯基、2-苯基乙基、或者苯基丁基。
在其中一些优选地实施例中，各R 2分别独立选自： 或者没有，其中，c为1或者2；d为2-6之间的整数。
在其中一些优选地实施例中，R 3和R 4分别独立选自：H、R 9取代或者未取代的C 1-C 22烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 3-C 22环烷基、3-22元杂环基、R 8取代的3-22元杂环基、C 2-C 22烯基、C 2-C 22炔基、C 6-C 22芳基、C 6-C 14芳基取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 22环烷基取代的C 1-C 8烷基、-R 2-R 1、 或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的3-10元杂环。
在其中一些优选地实施例中，R 3和R 4分别独立选自：H、R 9取代或者未取代的C 1-C 10烷基、C 2-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、R 8取代的3-8元杂环基、C 2-C 10烯基、C 2-C 10炔基、苯基、萘基、蒽基、苯基取代的C 1-C 6烷基、萘基取代的C 1-C 6烷基、蒽基取代的C 1-C 6烷基、C 3-C 8环烷基取代的C 1-C 6烷基、-R 2-R 1、 或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-10元杂环基。
在其中一些优选地实施例中，R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成如下基团：
在其中一些优选地实施例中，所述叔胺类脂质化合物选自如下化合物：
其中，各R 1分别独立地为：正辛基、异癸基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、9-十八烯基、顺-9,12-十八碳二烯基、2-苯基乙基、或者苯基丁基。
在其中一些优选地实施例中，所述叔胺类脂质化合物选自如下化合物：
在本发明的一实施方式中，还提供了一种脂质纳米颗粒，由所述的叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，以及两亲性分子在水介质中自组装形成，所述两亲性分子为：两亲性聚乙二醇脂质分子，或者两亲性聚乙二醇脂质分子和磷脂的组合。
其中，所述两亲性聚乙二醇脂质分子可以选自但不限于：聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇、2-(聚乙二醇)-N,N-二十四烷基乙酰胺、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸酯；优选地，所述两亲性聚乙二醇脂质分子中的聚乙二醇的分子量为500g/mol～20000 g/mol。
所述磷脂可以选自但不限于：胆固醇、大豆磷脂、氢化大豆磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、高纯蛋黄卵磷脂、二月桂酰基卵磷脂、二芥酰磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰基卵磷脂、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基卵磷脂、二硬脂酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2油酰基磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺、棕榈酰溶血卵磷脂、肉豆蔻酰溶血卵磷脂、硬脂酰溶血卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐、1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷、(R)-2,3-双(油酰基氧基)丙基氢磷酸2-[(2-氨基乙基)氨基]乙基酯。
在其中一些优选的实施例中，所述脂质纳米颗粒由所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，两亲性聚乙二醇脂质分子和1,2-棕榈酰磷脂酰甘油在水介质中自组装形成；或者由所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，和两亲性聚乙二醇脂质分子在水介质中自组装形成；优选地，所述两亲性聚乙二醇脂质分子为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
在其中一些优选的实施例中，所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，与所述两亲性聚乙二醇脂质分子的质量比为1：0.2-8，优选为1：0.5-4，更优选为1：0.5-2，更优选为1：0.8-1.2；最优选为1：1。
在其中一些优选的实施例中，所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，与所述1,2-棕榈酰磷脂酰甘油的质量比为1：0.5-1.5，优选为1：0.8-1.2。
在本发明的一实施方式中，还提供了一种所述脂质纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐溶于有机溶剂中，得叔胺类脂质化合物溶液；
将所述两亲性分子溶于有机溶剂中，得两亲性分子溶液；
取所述叔胺类脂质化合物溶液和所述两亲性分子溶液混合，得混合溶液；
在所述混合溶液中加入含水介质，并用移液枪反复吹打，即得所述脂质纳米颗粒；或者，将所述混合溶液在搅拌条件下缓慢滴加到含水介质中，继续搅拌，即得所述脂质纳米颗粒。
在其中一些优选的实施例中，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或者四氢呋喃。
在其中一些优选的实施例中，所述叔胺类脂质化合物的浓度为10mg/mL-100mg/mL，更优选为40mg/mL-60mg/mL；所述两亲性分子溶液的浓度为20mg/mL-200mg/mL，更优选为50mg/mL-100mg/mL。
在其中一些优选的实施例中，所述混合溶液与所述含水介质的体积比为1:1-20，更优选为1：2-10。
在本发明的一实施方式中，还提供了所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
在本发明的一实施方式中，还提供了所述的脂质纳米颗粒在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
在本发明的一实施方式中，还提供了所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐联合抗肿瘤药物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
在本发明的一实施方式中，还提供了所述的脂质纳米颗粒联合抗肿瘤药物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
在其中一些优选的实施例中，所述抗肿瘤药物为免疫检查点抑制剂和/或化疗药物。
在其中一些优选的实施例中，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂。
在其中一些优选的实施例中，所述化疗药物为阿霉素。
在其中一些优选的实施例中，所述肿瘤为胰腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、舌鳞癌、宫颈癌、卵巢癌、骨肉瘤、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢上皮癌、鼻咽癌、脑癌。
在本发明的一实施方式中，还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的药物，由活性成分和药学上可接受的辅料和/或载体制备得到，所述活性成分包括所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐，和/或所述的脂质纳米颗粒。
在本发明的一实施方式中，还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的联合用药物，其活性成分包括：
组分1：所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐，和/或所述的脂质纳米颗粒；以及，
组分2：组分1之外的抗肿瘤药物；
所述组分1和组分2分别成为独立的给药单元，或所述组分1和组分2共同形成组合的给药单元。
在其中一些优选的实施例中，所述组分2为免疫检查点抑制剂和/或化疗药物。
在其中一些优选的实施例中，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂。
在其中一些优选的实施例中，所述化疗药物为阿霉素。
本发明的式(Ⅰ)-式(V)化合物可以与已知的其它抗肿瘤药物联用。联合给药时，式(Ⅰ)-式(V)化合物和已知药物可以分别成为独立的给药单元，或共同形成组合的给药单元；式(Ⅰ)-式(V)化合物可以与已知的其它抗肿瘤药物同时给药或者分别给药。当式(Ⅰ)-式(V)化合物与其它一种或几种药物同时服用时，优选使用同时含有一种或几种已知药物和式(Ⅰ)-式(V)化合物的药用组合物。药物联用也包括在重叠的时间段服用式(Ⅰ)-式(V)化合物与其它一种或几种已知药物。当式(Ⅰ)-式(V)化合物与其它一种或几种已知药物进行药物联用时，式(Ⅰ)-式(V)化合物或已知药物的剂量可以与单独用药剂量相同，也可以比它们单独用药时的剂量更低。
可以与式(Ⅰ)-式(V)化合物进行药物联用的药物或活性成分包括但不局限为：免疫检查点抑制剂、雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、视网膜样受体调节剂、细胞毒素/细胞抑制剂、抗增殖剂、蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白激酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞增殖及生存信号抑制剂、干扰细胞周期关卡的药物和细胞凋亡诱导剂、细胞毒类药物、酪氨酸蛋白抑制剂、EGFR抑制剂、VEGFR抑制剂、丝氨酸/苏氨酸蛋白抑制剂、Bcr-Abl抑制剂、c-Kit抑制剂、Met抑制剂、Raf抑制剂、MEK抑制剂、MMP抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、组氨酸去乙酰化酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、CDK抑制剂，Bcl-2家族蛋白抑制剂、MDM2家族蛋白抑制剂、IAP家族蛋白抑制剂、STAT家族蛋白抑制剂、PI3K抑制剂、AKT抑制剂、整联蛋白阻滞剂、干扰素-α、白介素-12、COX-2抑制剂、p53、p53激活剂、VEGF抗体、EGF抗体等。
在其中一些实施方案中，可以与式(Ⅰ)-式(IV)化合物进行药物联用的药物或活性成分包括但不局限为：阿地白介素、阿仑膦酸、干扰素、阿曲诺英、别嘌醇、别嘌醇钠、帕洛诺司琼盐酸盐、六甲蜜胺、氨基格鲁米特、氨磷汀、氨柔比星、安丫啶、阿纳托唑、多拉司琼、aranesp、arglabin、三氧化二砷、阿诺新、5-氮胞苷、硫唑嘌呤、卡介苗或tice卡介苗、贝他定、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸钠制剂、贝沙罗汀、硫酸博来霉素、溴尿甘、bortezomib、白消安、降钙素、阿来佐单抗注射剂、卡培他滨、卡铂、康士得、cefesone、西莫白介素、柔红霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、克拉屈滨、氯屈磷酸、环磷酰胺、阿糖胞昔、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素脂质体、地塞米松、磷酸地塞米松、戊酸雌二醇、地尼白介素2、狄波美、地洛瑞林、地拉佐生、己烯雌酚、大扶康、多西他奇、去氧氟尿苷、阿霉素、屈大麻酚、钦-166-壳聚糖复合物、eligard、拉布立酶、盐酸表柔比星、阿瑞吡坦、表阿霉素、 阿法依伯汀、红细胞生成素、依铂、左旋咪唑片、雌二醇制剂、17-β-雌二醇、雌莫司汀磷酸钠、炔雌醇、氨磷汀、羟磷酸、凡毕复、依托泊甙、法倔唑、他莫昔芬制剂、非格司亭、非那司提、非雷司替、氟尿苷、氟康唑、氟达拉滨、5-氟脱氧尿嘧啶核苷一磷酸盐、5-氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、福麦斯坦、1-β-D-阿糖呋喃糖胞噻啶-5’-硬脂酰磷酸酯、福莫司汀、氟维司群、丙种球蛋白、吉西他滨、吉妥单抗、甲磺酸伊马替尼、卡氮芥糯米纸胶囊剂、戈舍瑞林、盐酸格拉尼西隆、组氨瑞林、和美新、氢化可的松、赤型-羟基壬基腺嘌呤、羟基脲、替坦异贝莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素α、干扰素-α2、干扰素α-2A、干扰素α-2B、干扰素α-nl、干扰素α-n3、干扰素β、干扰素γ-la、白细胞介素-2、内含子A、易瑞沙、依立替康、凯特瑞、硫酸香菇多糖、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、亮丙瑞林醋酸盐、左旋四咪唑、左旋亚叶酸钙盐、左甲状腺素钠、左甲状腺素钠制剂、洛莫司汀、氯尼达明、屈大麻酚、氮芥、甲钴胺、甲羟孕酮醋酸酯、醋酸甲地孕酮、美法仑、酯化雌激素、6-琉基嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、氨基乙酰丙酸甲酯、米替福新、美满霉素、丝裂霉素C、米托坦、米托葱醌、曲洛司坦、柠檬酸阿霉素脂质体、奈达铂、聚乙二醇化非格司亭、奥普瑞白介素、neupogen、尼鲁米特、三苯氧胺、NSC-631570、重组人白细胞介素1-β、奥曲肽、盐酸奥丹西隆、去氢氢化可的松口服溶液剂、奥沙利铂、紫杉醇、泼尼松磷酸钠制剂、培门冬酶、派罗欣、喷司他丁、溶链菌制剂、盐酸匹鲁卡品、毗柔比星、普卡霉素、卟吩姆钠、泼尼莫司汀、司替泼尼松龙、泼尼松、倍美力、丙卡巴脐、重组人类红细胞生成素、雷替曲塞、利比、依替膦酸铼-186、美罗华、力度伸-A、罗莫肽、盐酸毛果芸香碱片剂、奥曲肽、沙莫司亭、司莫司汀、西佐喃、索布佐生、唬钠甲强龙、帕福斯酸、干细胞治疗、链佐星、氯化锶-89、左旋甲状腺素钠、他莫昔芬、坦舒洛辛、他索那明、tastolactone、泰索帝、替西硫津、替莫唑胺、替尼泊苷、丙酸睾酮、甲睾酮、硫鸟嘌呤、噻替哌、促甲状腺激素、替鲁膦酸、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲奥舒凡、维A酸、甲氨喋呤片剂、三甲基密胺、三甲曲沙、乙酸曲普瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、优福定、尿苷、戊柔比星、维司力农、长春碱、长春新碱、长春酰胺、长春瑞滨、维鲁利秦、右旋丙亚胺、净司他丁斯酯、枢复宁、紫杉醇蛋白质稳定制剂、acolbifene、干扰素r-lb、affinitak、氨基喋呤、阿佐昔芬、asoprisnil、阿他美坦、阿曲生坦、BAY 43-9006、阿瓦斯丁、CCI-779、CDC-501、西乐葆、西妥昔单抗、克立那托、环丙孕酮醋酸酯、地西他滨、DN-101、阿霉素-MTC、dSLIM、度他雄胺、edotecarin、依氟鸟氨酸、依喜替康、芬维A胺、组胺二盐酸盐、组氨瑞林水凝胶植 入物、钬-166 DOTMP、伊班膦酸、干扰素γ、内含子-PEG、ixabepilone、匙孔形血蓝蛋白、L-651582、兰乐肽、拉索昔芬、libra、lonafamib、米泼昔芬、米诺屈酸酯、MS-209、脂质体MTP-PE、MX-6、那法瑞林、奈莫柔比星、新伐司他、诺拉曲特、奥利默森、onco-TCS、osidem、紫杉醇聚谷氨酸酯、帛米酸钠、PN-401、QS-21、夸西洋、R-154、雷洛昔芬、豹蛙酶、13-顺维A酸、沙铂、西奥骨化醇、T-138067、tarceva、二十二碳六烯酸紫杉醇、胸腺素αl、嘎唑呋林、tipifarnib、替拉扎明、TLK-286、托瑞米芬、反式MID-lo7R、伐司朴达、伐普肽、vatalanib、维替泊芬、长春氟宁、Z-100和唑来麟酸或它们的组合。
本发明的用于预防和/或治疗肿瘤的药物可以用于非人哺乳动物或者人。
本发明的用于预防和/或治疗肿瘤的药物中所用的药学上可接受的辅料指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。
“相容性”在此指的是组合物中各组分能和本发明的活性成分(式I-式VII所示的叔胺类脂质化合物)以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
本发明的用于预防和/或治疗肿瘤的药物所用的药学上可接受的辅料包括但不限于如下材料中的一种或多种：溶剂、赋形剂、填料、增容剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收加速剂、吸附剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、润滑剂、润湿剂、悬浮剂、矫味剂和香料中的至少一种。
药学上可以接受的辅料部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温 )、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。
在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：
(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；
(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；
(c)保湿剂，例如，甘油；
(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；
(e)缓溶剂，例如，石蜡；
(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；
(g)润湿剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；
(h)吸附剂，例如，高岭土；和
(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
以下为具体实施例。
实施例1：丙烯酸酯与胺类分子反应得到的叔胺类脂质化合物的制备
本实施例制备了含不同种类疏水基团及三级胺结构的叔胺类脂质化合物。这些脂质通过 含不同疏水碳链的丙烯酸酯(C8、C10、C10i、C12、C14、C16、C18、C181、C182、Cp2、Cp4)和含伯胺和/或仲胺的胺分子(A1～A51，共51个)通过迈克尔加成反应合成，其中C8、C10、C10i、C12、C14、C16、C18、C181、C182、Cp2、Cp4依次为正辛基丙烯酸酯(C8)、正癸基丙烯酸酯(C10)、异癸基丙烯酸酯(C10i)、正十二烷基丙烯酸酯(C12)、正十四烷基丙烯酸酯(C14)、正十六烷基丙烯酸酯(C16)、正十八烷基丙烯酸酯(C18)、9-十八烯丙烯酸酯(C181)、顺-9,12-十八碳二烯基丙烯酸酯(C182)、2-苯基乙基丙烯酸酯(Cp2)、苯基丁基丙烯酸酯(Cp4)；A1～A51依次为：
即，本实施例通过丙烯酸酯和含伯胺的分子的迈克尔加成反应合成了式(VIII)所示的一系列叔胺类脂质化合物。反应式如下：
其中，R 1为：正辛基、异癸基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、9-十八烯基、顺-9,12-十八碳二烯基、2-苯基乙基、或者苯基丁基。
其中，R 3选自以下基团：
通过丙烯酸酯和含仲胺的分子的迈克尔加成反应合成了一系列叔胺类脂质化合物。示例性反应式如下：
其中，R 1为：正辛基、异癸基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、9-十八烯基、顺-9,12-十八碳二烯基、2-苯基乙基、或者苯基丁基。
通过丙烯酸酯和同时含伯胺及仲胺的分子的迈克尔加成反应合成了一系列叔胺类脂质化合物。示例性反应式如下：
其中，R 1为：正辛基、异癸基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八 烷基、9-十八烯基、顺-9,12-十八碳二烯基、2-苯基乙基、或者苯基丁基。
迈克尔加成反应所需的丙烯酸酯正癸酯、9-十八烯丙烯酸酯、顺-9,12-十八碳二烯基丙烯酸酯和苯基丁基丙烯酸酯由实验室合成，核磁见图1-图4；其余丙烯酸酯和含伯胺或/和仲胺的分子为直接购买获得，未经纯化直接使用。
具体步骤如下：
将100mg(0.20mmol-0.60mmol)丙烯酸酯(分别为C8、C10i、C10、C12、C14、C16、C18、C181、C182、Cp2、Cp4)置于反应容器中，按丙烯酸酯与胺分子的可反应位点数(伯胺含两个反应位点，仲胺含一个反应位点)的摩尔比为1.1：1分别加入A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20、A21、A22、A23、A24、A25、A26、A27、A28、A29、A30、A31、A32、A33、A34、A35、A36、A37、A38、A39、A40、A41、A42、A43、A44、A45、A46、A47、A48、A49、A50、A51，混合均匀后，在90℃下密闭反应3天。反应结束后收集产物直接使用。
本实施例制备的叔胺类脂质化合物的简称为C nA n，其中C n指原料中的丙烯酸酯，A n指原料中的胺分子，例如C 8A 1是指由R 1为正辛基的丙烯酸酯(C8)与胺分子(A1)按上述反应制备得到的叔胺类脂质化合物。
实施例2脂质纳米颗粒的制备
实施例1合成的叔胺类脂质化合物具有疏水碳链部分及pH 7.4下疏水的三级胺部分，在二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG)辅助下可在水中自组装形成纳米颗粒。
具体操作如下：取叔胺类脂质化合物溶于乙醇中，得浓度为50mg/mL的脂质溶液；取DSPE-PEG 2000溶于乙醇中，得浓度为50mg/mL的DSPE-PEG 2000溶液；取50μL脂质溶液和50μLDSPE-PEG 2000溶液混合于1.5mL离心管中，得混合溶液；取20μL混合溶液至另一个1.5mL离心管中，用移液枪加入180μL去离子水或者1×PBS，迅速加入到上述混合溶液中，并用移液枪反复吹打，即得脂质纳米颗粒；或者取3mL纯水或者1×PBS于10mL圆底烧瓶中，用移液枪取1mL上述混合溶液在搅拌的条件下缓慢滴加到水中，搅拌10min后得到脂质纳米颗粒；转移到截留分子量为14000Da的透析袋中，于纯水中透析除去乙醇。
实施例3脂质纳米颗粒的溶血活性
本实施例检测了实施例2制备的系列脂质纳米颗粒的溶血活性，筛选出浓度为400μg/mL、孵育4h下溶血活性低于5％的脂质材料。
具体实验步骤如下：取羊血用1×PBS洗涤2遍至离心后上清液澄清透明无色，然后将羊血用1×PBS稀释到4％；取16μL实施例2中用1×PBS制备的脂质纳米颗粒于184孔细 胞培养板中，加入34μL 1×PBS后，再加入50μL4％的羊血，37℃培养箱中孵育4h；3000rpm离心10min，然后吸50μL上清液于另一块384孔板中，用多功能酶标仪检测576nm下的吸光度；另外设置不含脂质纳米颗粒的PBS对照组(50μL 1×PBS+50μL 4％的羊血)、只含脂质纳米颗粒的纳米颗粒对照组和含0.2％triton X的阳性对照组(50μL 0.2％c+50μL 4％的羊血)。
测试结果如图5所示，可看出大部分脂质纳米颗粒的溶血活性较低(<5％)，少部分脂质纳米颗粒的溶血活性较高(≥5％),表明大部分脂质纳米颗粒的溶血毒性较低。选择溶血率低于5％的脂质纳米颗粒进行下一步的实验。
实施例4脂质纳米颗粒在正常组织和肿瘤组织特征pH下的细胞毒性
本实施例通过CCK8法(Cell Counting Kit-8)评估药物在pH 7.4和pH 6.8条件下对肿瘤细胞的杀伤效果，研究了实施例2制备的系列脂质纳米颗粒在正常组织和肿瘤组织特征pH下的细胞毒性。
具体实验步骤如下：使用6mol/L的HCl溶液调节DMEM培养基至pH＝6.8和7.4备用，并加入25mM HEPES维持pH稳定。将小鼠结直肠癌细胞系MC38(购自ATCC)在含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中培养。在pH 7.4及pH 6.8下，将实施例2制备的脂质纳米颗粒(100μg/mL)与细胞(浓度为1×10 6个/mL)在96孔板中进行孵育，在37℃、二氧化碳培养箱中分别培养24小时后弃去原培养基，加入CCK8(5μL CCK-8原液+95μL DMEM培养基)溶液，置于37℃、二氧化碳培养箱中继续培养2小时，使用酶标仪测试OD 450nm吸光值并计算细胞存活率，细胞存活率计算方式如下： 其中OD 背景为不含细胞、只含CCK-8的空白孔， 为含细胞和CCK-8、不用药物处理的对照组。
测试结果如图6和图7所示：本发明制备的脂质纳米颗粒对肿瘤细胞的细胞毒性基本都在图中位于y＝x这条曲线的下方，说明这些脂质纳米颗粒在pH＝7.4下的细胞毒性低于pH＝6.8下的细胞毒性,表明本发明的脂质纳米颗粒具有pH响应的细胞毒性。
实施例5柱层析纯化优选的叔胺类脂质化合物
根据实施例4的细胞毒性结果筛选出在pH 6.8下的细胞毒性比在pH 7.4下的细胞毒性高出50％的脂质纳米颗粒，将其对应的叔胺类脂质化合物进行柱层析纯化和表征。
以硅胶作为柱填料，以二氯甲烷：甲醇＝2.5％～10％为洗脱剂进行梯度洗脱，纯化上述优选出的叔胺类脂质化合物，其核磁表征如图8～图23所示，分析显示得到较纯的目标产物C8A16、C8A19、C8A45、C8A49、C12A27、C12A33、C14A33、C16A34、C181A17、C181A23、C181A24、C181A28、C182A17、C182A23、C182A24、C182A28。
将纯化后的叔胺类脂质化合物按照实施例2所述方法制备成脂质纳米颗粒。利用动态光散射仪检测脂质纳米颗粒在水溶液中的粒径及其分布，结果显示组装的脂质纳米颗粒的平均粒径在200nm左右(图26)。
按实施例4所述的方法测试本实施例制备的脂质纳米颗粒在正常组织和肿瘤组织特征pH下浓度依赖的细胞毒性：将脂质纳米颗粒按照不同浓度与MC38细胞在pH＝6.8和pH＝7.4的条件下孵育24h，利用MTT法检测其细胞毒性。结果如图24和图25所示，与实施例4的结果一致，以纯化后的叔胺类脂质化合物制备的脂质纳米颗粒具备pH响应的肿瘤细胞杀伤能力，即在pH＝7.4的条件下细胞毒性较低，而在pH＝6.8条件下细胞毒性较高，表明这类脂质纳米颗粒确实具有pH激活的细胞毒性，同时存在剂量依赖性。
实施例6叔胺类脂质纳米颗粒在不同pH下的质子化情况
将实施例4优选的叔胺类脂质化合物按照实施例2的方法制备成脂质纳米颗粒，然后将脂质纳米颗粒与不同pH的缓冲液和TNS溶液进行混合，取100μL的溶液加入到黑色平底96孔板中，随后使用全波长微孔板分光光度计测量其荧光强度，并通过模拟其变化曲线计算出其质子化程度及pKa，具体方法如下:
缓冲液配置:先用超纯水配置含有20mM HEPES、20mM MES、20mM乙酸铵、260mM NaCl的缓冲溶液，随后取用四份25mL的2×缓冲溶液，向其中分别加入2mL、1mL的1M HCl溶液(1号和2号)以及2mL、1mL的1M NaOH(3号和4号)溶液，最后用超纯水补足至50mL。最后分别使用1号和4号溶液、2号和3号溶液通过相互滴定配置pH值为6.5-10、2.5-6.5的缓冲溶液；
测量方法：分别取980μL不同pH的缓冲液加入1.5mL EP管中，随后按顺序向其中加入10μL的2.5mg/mL脂质纳米颗粒以及100μM的TNS水溶液，混合均匀后取100μL的溶液加入到黑色平底96孔板中，使用全波长微孔板分光光度计测量其在激发波长和发射波长分别为321nm和445nm下的荧光强度。
计算方法：将测量的数据导入至Origin中，使用S型函数模拟中的Boltzmann函数进行分析，定义曲线中荧光强度最大点为质子化率100％，曲线中荧光强度最小点为质子化率0％，随后将其归一化，得到模拟曲线图，图中质子化率为50％时对应的pH值则为此脂质纳米颗粒的pKa。
测试结果如图27所示：结果表明碳链长度以及三级胺的种类都显著影响脂质在不同pH下的质子化率和pKa；同时，除C8A45之外，其余脂质纳米颗粒的pka都在6.0～7.0之间，表明这些脂质纳米颗粒可以在该pH范围内实现质子化，从而激活细胞膜破坏介导的抗肿瘤活性。
实施例7脂质纳米颗粒在ICR小鼠体内的最大耐受剂量
本实施例通过测试在小鼠体内的最大耐受剂量(MTD)研究本发明脂质纳米颗粒的毒性，将实施例4优选的脂质纳米颗粒通过尾静脉注射到ICR小鼠体内，每种材料均从100mg/kg体重开始给药，直至出现死亡实验鼠，将连续给药5只小鼠后未出现死亡小鼠的最大剂量记为小鼠的最大耐受剂量，并作图，如图28所示：C8A45、C8A49、C12A33和C14A33的MTD均大于200mg/kg，而C16A34、C181A17、C181A23、C181A24、C181A28、C182A17、C182A23、C182A24的MTD小于100mg/kg，此外C12A27和C182A28的MTD分别为120和140mg/kg。
实施例8脂质纳米颗粒的组分对其在正常组织和肿瘤组织特征pH下细胞毒性的影响
(1)聚乙二醇脂质的种类对脂质纳米颗粒的细胞毒性的影响
以C12A27为例，选择临床批准的3种聚乙二醇脂质研究PEG脂质种类以及其与C12A27的比例对脂质纳米颗粒在不同pH下的细胞毒性的影响。将C12A27分别与DSPE-PEG、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG)、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)按照实施例2中所述组分用量和实验步骤制备脂质纳米颗粒，按实施例5中所述步骤研究脂质纳米颗粒在正常组织和肿瘤组织特征pH下的细胞毒性。
结果如图28中的a所示：三种PEG脂质对所得脂质纳米颗粒在pH 6.8下的细胞毒性无影响，但是对其在pH 7.4下的细胞毒性有影响；具体而言,含DSPE-PEG的脂质纳米颗粒在pH 7.4下的细胞毒性最小，DMG-PEG次之，ALC-0159毒性最大。
(2)DSPE-PEG与C12A27的比例对所得脂质纳米颗粒的细胞毒性的影响
将DSPE-PEG和C12A27按照质量比为0.2：1、0.5：1、1：1、2：1、4：1、8：1，并按照实施例2中的实验步骤制备脂质纳米颗粒，然后参照实施例4所述方法检测脂质纳米颗粒的细胞毒性。
结果如图29中的b所示：DSPE-PEG和C12A27的质量比≤4：1时，对脂质纳米颗粒在pH 6.8下的细胞毒性无显著影响；DSPE-PEG和C12A27的质量比为8：1时，会显著降低脂质纳米颗粒在pH 6.8下的细胞毒性；DSPE-PEG和C12A27的质量比为0.2：1时，脂质纳米颗粒在pH 7.4下的细胞毒性增加，DSPE-PEG和C12A27的质量比≥0.5：1时，则对脂质纳米颗粒在pH 7.4下的细胞毒性无显著影响。
(3)其他辅助脂质的种类对脂质纳米颗粒的细胞毒性的影响
以胆固醇(Chol)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、DSPE以及1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)为其他辅助脂质，按实施例2所述步骤，在叔胺类脂质化合物和DSPE-PEG中分别加入上述辅助脂质制备脂质纳米颗粒，具体操作如下：取叔胺类脂质化合物C12A27溶于乙醇中，得浓度为50mg/mL的脂质溶液；取DSPE-PEG 2000溶于乙醇中，得浓度为50mg/mL的 DSPE-PEG 2000溶液；取其他辅助脂质，溶于乙醇中，得浓度为50mg/mL的辅助脂质溶液；取50μL脂质溶液、50μL DSPE-PEG 2000溶液和25μL(或者50μL)辅助脂质溶液混合于1.5mL离心管中，得混合溶液；取20μL混合溶液至另一个1.5mL离心管中，用移液枪加入180μL去离子水，迅速加入到上述混合溶液中，并用移液枪反复吹打，即得脂质纳米颗粒；转移到截留分子量为14000Da的透析袋中，于纯水中透析除去乙醇。
然后按照实施例4所述方法检测所得脂质纳米颗粒的细胞毒性。结果如图29中的c和d所示：掺入不同的辅助脂质对脂质纳米颗粒在pH 6.8下的细胞毒性无显著影响，但是加入Chol、DOPC、DSPE反而会增加脂质纳米颗粒在pH 7.4下的细胞毒性，加入DPPG对脂质纳米颗粒在pH 7.4下的细胞毒性无明显影响。
实施例9脂质纳米颗粒在肿瘤组织特征pH下杀伤肿瘤细胞的机制
将C12A27脂质纳米颗粒与MC38肿瘤细胞在pH＝6.8，温度为37℃或4℃的条件下共同孵育，用CCK8对4h时细胞的活性进行了检测，发现低温不会抑制C12A27脂质纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤(图30中的a图)，表明这个杀伤过程是不依赖于能量的。同时还发现C12A27可以导致肿瘤细胞快速释放细胞质中的ATP(图30中的b图)，这提示C12A27可能是通过破坏肿瘤细胞膜对肿瘤细胞进行杀伤。
进一步将C12A27脂质纳米颗粒与细胞膜表达GFP、细胞质表达mCherry的MC38 GFP/mCherry在pH 6.8的培养基中共同孵育，在激光共聚焦显微镜下观察，随着时间的推移，细胞的红色荧光(mCherry)逐渐减弱，在3h时几乎完全消失，且明场下可以观察到大量细胞的细胞膜出现胀大并吐泡的现象(图30中的c图)，表明本发明的脂质纳米颗粒通过破坏肿瘤细胞的细胞膜，导致细胞膜损伤，细胞内容物释放，从而达到杀伤肿瘤细胞的作用。利用C8A16脂质纳米颗粒、C8A19脂质纳米颗粒与MC38 GFP/mCherry细胞在pH 6.8的培养基中共同孵育，并利用高内涵成像系统进行观察也发现类似的现象(图31)。将C8A16脂质纳米颗粒与碘化丙啶(PI)、Annexin-V-FITC在pH 6.8下与MC38细胞共孵育，并利用高内涵成像系统进行观察，C8A16脂质纳米颗粒与MC38孵育2小时后导致细胞快速死亡，出现PI和Annexin-V-FITC染色双阳性(图32)。此外，本发明的脂质纳米颗粒对Panc02 GFP/mCherry细胞也具有类似的破膜导致细胞质内容物快速释放的杀伤机制(图33)。
实施例10脂质纳米颗粒的体内抑瘤实验
通过C57小鼠胰腺癌肿瘤皮下模型(Panc-02细胞)、C57小鼠结直肠癌肿瘤皮下模型(MC38细胞)、C57小鼠乳腺癌模型(E0771细胞)的体内实验验证脂质纳米颗粒的肿瘤抑制效果。操作如下：
在雌性小鼠(C57BL/6，6-8周)背部皮下注射1×10 7个/mL Panc02细胞悬液(100μL)， 以建立胰腺癌皮下肿瘤模型；在雌性小鼠(C57BL/6，6-8周)背部皮下注射1×10 7个/mL MC38细胞悬液(100μL)，以建立结直肠癌皮下肿瘤模型，在雌性小鼠(C57BL/6，6-8周)右侧第二乳房垫注射1×10 7个/mL E0771细胞悬液(100μL)，以建立乳腺癌原位肿瘤模型。待肿瘤长至50～100mm 3(肿瘤体积＝长×宽×宽/2)，通过尾静脉给药，给药剂量如下，Panc02模型：C12A27(20mg/kg)、C14A27(50mg/kg)、C16A27(67mg/kg)；MC38模型：C8A16(100mg/kg)、C8A19(100mg/kg)、C8A45(100mg/kg)、C8A49(100mg/kg)、C12A27(30mg/kg)；E0771模型：C8A45(80mg/kg)、C8A49(80mg/kg)、C12A27(30mg/kg)、C12A33(80mg/kg)。另设阴性对照组，仅注射等体积的PBS溶液。使用游标卡尺测量肿瘤大小，记录小鼠体重。
Panc02模型的体内抑瘤效果如图34所示，根据肿瘤生长曲线可以看出，相较于PBS组，三个给药组的肿瘤体积均得到一定程度的抑制，其中C12A27脂质纳米颗粒给药组的肿瘤体积的增长显著减缓。同时小鼠经历整个治疗周期后，实验组与PBS对照组的体重无差异。在MC38肿瘤模型中(图35)，C8A16脂质纳米颗粒、C8A19脂质纳米颗粒、C8A45脂质纳米颗粒、C8A49脂质纳米颗粒、C12A27脂质纳米颗粒均对肿瘤生长有一定的抑制效果，其中C8A49脂质纳米颗粒的治疗效果最好，同时该治疗方案对小鼠体重也没有显著影响。脂质纳米颗粒对小鼠乳腺癌E0771也具有较好的治疗效果，其中C8A49脂质纳米颗粒、C12A27脂质纳米颗粒可以导致所有小鼠肿瘤消退，C8A45脂质纳米颗粒、C12A33脂质纳米颗粒则可以导致部分小鼠的肿瘤消退(图36)。
实施例11脂质纳米颗粒联合免疫检查点抑制剂的体内抑瘤实验
通C57小鼠结直肠癌肿瘤皮下模型(MC38细胞)的体内实验验证脂质纳米颗粒联合免疫检查点抗体——抗细胞程序性死亡受体1的抗体(αPD-1)的肿瘤抑制效果。操作如下：
在雌性小鼠(C57BL/6，6-8周)背部皮下注射1×10 7个/mL MC38细胞悬液(100μL)，以建立结直肠癌皮下肿瘤模型。待肿瘤长至50～100mm 3(肿瘤体积＝长×宽×宽/2)，通过尾静脉给药，给药剂量如下：C12A27(20mg/kg)、C14A27(50mg/kg)，αPD-1(0.75mg/kg)。另设阴性对照组，仅注射等体积的PBS溶液。使用游标卡尺测量肿瘤大小，记录小鼠体重。
从小鼠肿瘤生长曲线(图37)可以看出，C12A27和C14A27脂质纳米颗粒和αPD-1联合治疗都可以增强αPD-1的治疗疗效，其中C14A27联合αPD-1的抑瘤效果最好，4只小鼠的肿瘤都完全消失了，C12A27联合组有2只小鼠的肿瘤完全消失，同时该治疗方案对小鼠体重也没有显著影响。上述结果表明本发明的脂质纳米颗粒可以增强临床用的免疫检查点抗体的疗效，从而提高肿瘤患者对免疫检查点抗体的响应率，提高抗肿瘤效果。
实施例12脂质纳米颗粒联合化疗药物的体内抑瘤实验
通Balb/c小鼠乳腺癌原位模型(EMT-6细胞)的体内实验验证脂质纳米颗粒联合化疗药物脂质体阿霉素Doxil的肿瘤抑制效果。操作如下：
在雌性小鼠(Balb/c，6-8周)右侧第二乳房垫注射3×10 6个/mL EMT-6细胞悬液(100μL)，以建立乳腺癌皮下肿瘤模型。待肿瘤长至50～100mm 3(肿瘤体积＝长×宽×宽/2)，通过尾静脉给药，给药剂量如下：C12A27(20mg/kg)、C14A27(50mg/kg)，Doxil(2.5mg/kg)。另设阴性对照组，仅注射等体积的PBS溶液。使用游标卡尺测量肿瘤大小，记录小鼠体重。
从小鼠肿瘤的生长曲线(图38)可以看出，C12A27脂质材料联合Doxil可以显著增强抗肿瘤疗效，联合组所有小鼠的肿瘤均完全消失。上述结果表明本发明的脂质纳米颗粒可以增强化疗药物的抗肿瘤疗效。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (46)

  1. 具有式(I)所示结构的叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐在制备pH响应性破膜材料中的应用：
    其中，各R 1分别独立选自：烷基、不饱和链烃基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳基取代的烷基、环烷基取代的烷基；
    各R 2分别独立选自： 或者没有；
    R 3和R 4分别独立选自：H、R 9取代或者未取代的烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、-R 2-R 1、 或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的3-20元杂环基；并且，当R 3直接与N相连时，R 3不为H；当R 4直接与N相连时，R 4不为H；
    各R 5分别独立选自：亚烷基、环烷基、芳基；
    各R 6分别独立选自：烷基、羟基取代的烷基、不饱和链烃基、烯基、芳基、芳基取代的烷基、
    各R 7分别独立选自：烷基、羟基取代的烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、芳基取代的烷基、 或者R 6、R 7和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-8元杂环基；
    各R 8分别独立选自：烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、烷基取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、芳基取代的烷基、环烷基取代的烷基、
    R 9选自：羟基、芳基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、杂芳基；
    各X分别独立地为O或者NH；
    各q和各q’分别独立的为0、1或者2；
    a为0或者1；
    b为1、2、3、4或者5；
    c为1、2、3、或者4；
    d为2-12之间的整数。
  2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述叔胺类脂质化合物具有如下式(II)所示结构：
  3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述叔胺类脂质化合物具有如下式(III)所示的结构：
    R 4选自：R 9取代或者未取代的烷基、不饱和链烃基、环烷基、杂环基、R 8取代的杂环基、烯基、炔基、芳基、
  4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，R 4选自：C 1-C 22烷基、R 9取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 3-C 22环烷基、3-22元杂环基、R 8取代的3-22元杂环基、C 2-C 22烯基、C 2-C 22炔基、C 6-C 22芳基、
  5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，R 4选自：C 1-C 10烷基、R 9取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、R 8取代的3-8元杂环基、C 2-C 10烯基、C 2-C 10炔基、苯基、萘基、蒽基、
  6. 根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，各R 5分别独立选自：C 1-C 22亚烷基、C 3-C 8环烷基、C 6-C 14芳基。
  7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，各R 5分别独立选自：C 1-C 10亚烷基、C 3-C 8环烷基、苯基、萘基、蒽基。
  8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，各R 5分别独立选自：C 1-C 6亚烷基、C 3-C 8环烷基。
  9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，各R 5分别独立选自：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、
  10. 根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，各R 6分别独立选自：C 1-C 22烷基、羟基取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 2-C 22烯基、C 6-C 14芳基、C 6-C 14芳基取代的C 1-C 8烷基、
    各R 7分别独立选自：C 1-C 22烷基、羟基取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 3-C 22环烷基、3-22元杂环基、R 8取代的3-22元杂环基、C 2-C 22烯基、C 2-C 22炔基、C 6-C 14芳基、C 6-C 14芳基取代的C 1-C 8烷基、 或者R 6、R 7和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-8元杂环基；
    各R 8分别独立选自：C 1-C 22烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 3-C 22环烷基、3-22元杂环基、C 1-C 8烷基烷基取代的3-22元杂环基、C 2-C 22烯基、C 2-C 22炔基、C 6-C 14芳基、C 6-C 14芳基取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 22环烷基取代的C 1-C 8烷基、
  11. 根据权利要求10所述的应用，其特征在于，各R 6分别独立选自：C 1-C 10烷基、羟基取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 10不饱和链烃基、C 2-C 10烯基、苯基、萘基、蒽基、苯基取代的C 1-C 8烷基、萘基取代的C 1-C 8烷基、蒽基取代的C 1-C 8烷基、
    各R 7分别独立选自：C 1-C 10烷基、羟基取代的C 1-C 8烷基、C 2-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、R 8取代的3-8元杂环基、C 2-C 10烯基、C 2-C 10炔基、苯基、萘基、蒽基、苯基取代的C 1-C 8烷基、萘基取代的C 1-C 8烷基、蒽基取代的C 1-C 8烷基、 或者R 6、R 7和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-8元杂环基；
    各R 8分别独立选自：C 1-C 10烷基、C 2-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、C 1-C 6烷基烷基取代的3-8元杂环基、C 2-C 10烯基、C 2-C 10炔基、苯基、萘基、蒽基、苯基取代的C 1-C 8烷基、萘基取代的C 1-C 8烷基、蒽基取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 8环烷基取代的C 1-C 8烷基、
  12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于，各R 6分别独立选自：C 1-C 6烷基；羟基 取代的C 1-C 6烷基、
    各R 7分别独立选自：C 1-C 6烷基、羟基取代的C 1-C 6烷基、 或者R 6、R 7和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-8元杂环基；
    各R 8分别独立选自：C 1-C 6烷基、5-8元杂环基、C 1-C 6烷基取代的5-8杂环基、苯基、苯基取代的C 1-C 3烷基、
  13. 根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，R 9选自：羟基、C 6-C 14芳基、C 3-C 22环烷基、3-22元杂环基、R 8取代的3-22元杂环基、5-10元杂芳基。
  14. 根据权利要求13所述的应用，其特征在于，R 9选自：羟基、苯基、萘基、蒽基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、R 8取代的3-8元杂环基、5-8元杂芳基。
  15. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，R 4选自：C 1-C 8烷基、R 9取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 8环烷基、苯基取代的C 1-C 3烷基、萘基取代的C 1-C 3烷基、蒽基取代的C 1-C 3烷基、3-8元杂环基、R 8取代的5-8元杂环基、 取代的环己基；
    R 5选自：C 1-C 4亚烷基；
    各R 6分别独立选自：C 1-C 6烷基、羟基取代的C 1-C 6烷基、-CH 2-R 2-R 1；
    各R 7分别独立选自：C 1-C 6烷基、羟基取代的C 1-C 6烷基、-CH 2-R 2-R 1；
    各R 8分别独立选自：C 1-C 6烷基、苯基、苯基取代的C 1-C 3烷基、
    R 9选自：羟基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、R 8取代的3-8元杂环基、5-8元杂芳基。
  16. 根据权利要求15所述的应用，其特征在于，R 4选自：C 4-C 6烷基、二甲胺基取代的丁基、二乙胺基取代的丁基、哌啶基取代的正丙基、R 9取代的C 1-C 3烷基、C 4-C 8环烷基、苄基、5-8元杂环基、R 8取代的5-6元杂环基、 取代的环己基；
    各R 5分别独立选自：C 1-C 3亚烷基；
    R 6选自：C 3-C 4烷基；
    各R 7分别独立选自：C 3-C 4烷基；
    各R 8分别独立选自：C 1-C 6烷基、苄基、
    R 9选自：
  17. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述叔胺类脂质化合物具有如下式(IV)所示结构：
    其中，n为1、2、3、4或者5；
    R 3和R 4分别独立选自：C 1-C 10烷基、羟基取代的C 1-C 10烷基、C 1-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基，或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成3-8元杂环基。
  18. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，R 3和R 4分别独立选自：C 1-C 6烷基、羟基取代的C 1-C 6烷基、C 1-C 6不饱和链烃基，或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成5-8元杂环基。
  19. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述叔胺类脂质化合物具有如下式(V)所示的结构：
    n 1、n 2、n 3、n 4分别独立地选自：0、1、2、3或者4。
  20. 根据权利要求1-5、权利要求17-19任一项所述的应用，其特征在于，各R 1分别独立选自：C 1-C 22烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 3-C 22环烷基、C 2-C 22烯基、C 2-C 22炔基、C 6-C 22芳基、C 6-C 14芳基取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 22环烷基取代的C 1-C 8烷基。
  21. 根据权利要求20所述的应用，其特征在于，各R 1分别独立选自：C 8-C 20烷基、C 8-C 20不饱和链烃基、C 5-C 20环烷基、C 8-C 20烯基、C 8-C 20炔基、苯基、萘基、蒽基、苯基取代的C 1-C 6烷基、萘基取代的C 1-C 6烷基、蒽基取代的C 1-C 6烷基、C 5-C 20环烷基取代的C 1-C 6烷基。
  22. 根据权利要求21所述的应用，其特征在于，各R 1分别独立选自：甲基、乙基、丙 基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊烷基、异戊烷基、正己基、异己烷基、正庚基、异庚基、正辛基、异辛基、正壬烷基、异壬烷基、正癸烷基、异癸烷基、十一烷基、正十二烷基、异十二烷基、环十二烷基、十三烷基、异十三烷基、正十四烷基、十五烷基、正十六烷基、异十六烷基、十七烷基、正十八烷基、异十八烷基、二十二烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二基、环十二基甲基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基丙基、环丙基丁基、环丁基甲基、环丁基甲基、环丁基丙基、环丁基丁基、环戊基甲基、环戊基乙基、环戊基丙基、环戊基丁基、环己基甲基、环己基乙基、环己基丙基、环己基丁基、环己基戊基、环己基己基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、癸烯基、十二烯基、十四烯基、十六烯基、十八烯基、二十二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、辛炔基、癸炔基、十二炔基、十四炔基、十六炔基、十八炔基、二十二炔基、亚麻基、苯基、萘基、蒽基、苄基、苯乙基、苯丙基、苯丁基、苯己基、苯辛基、萘甲基、萘乙基、萘丙基、萘丁基、萘己基、萘辛基、蒽甲基、蒽乙基、蒽丙基、蒽丁基、蒽己基、蒽辛基、顺-9,12-十八碳二烯基、9-十八烯基。
  23. 根据权利要求22所述的应用，其特征在于，各R 1分别独立选自：正辛基、异癸基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、9-十八烯基、顺-9,12-十八碳二烯基、2-苯基乙基、或者苯基丁基。
  24. 根据权利要求1-5、权利要求17-19任一项所述的应用，其特征在于，各R 2分别独立选自： 或者没有，其中，c为1或者2；d为2-6之间的整数。
  25. 根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于，R 3和R 4分别独立选自：H、R 9取代或者未取代的C 1-C 22烷基、C 2-C 22不饱和链烃基、C 3-C 22环烷基、3-22元杂环基、R 8取代的3-22元杂环基、C 2-C 22烯基、C 2-C 22炔基、C 6-C 22芳基、C 6-C 14芳基取代的C 1-C 8烷基、C 3-C 22环烷基取代的C 1-C 8烷基、-R 2-R 1、 或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的3-10元杂环。
  26. 根据权利要求25所述的应用，其特征在于，R 3和R 4分别独立选自：H、R 9取代或者未取代的C 1-C 10烷基、C 2-C 10不饱和链烃基、C 3-C 8环烷基、3-8元杂环基、R 8取代的3-8元杂环 基、C 2-C 10烯基、C 2-C 10炔基、苯基、萘基、蒽基、苯基取代的C 1-C 6烷基、萘基取代的C 1-C 6烷基、蒽基取代的C 1-C 6烷基、C 3-C 8环烷基取代的C 1-C 6烷基、-R 2-R 1、 或者R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成R 8取代或者未取代的5-10元杂环基。
  27. 根据权利要求26所述的应用，其特征在于，R 3、R 4和与其相连的氮原子一起形成如下基团：
  28. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述叔胺类脂质化合物选自如下化合物：
    其中，各R 1分别独立地为：正辛基、异癸基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、9-十八烯基、顺-9,12-十八碳二烯基、2-苯基乙基、或者苯基丁基。
  29. 根据权利要求28所述的应用，其特征在于，所述叔胺类脂质化合物选自如下化合物：
  30. 权利要求1-29任一项中所述的叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐。
  31. 一种脂质纳米颗粒，其特征在于，由权利要求1-29任一项中所述的叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，以及两亲性分子在水介质中自组装形成，所述 两亲性分子为：两亲性聚乙二醇脂质分子，或者两亲性聚乙二醇脂质分子和磷脂的组合。
  32. 根据权利要求31所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述磷脂选自胆固醇、大豆磷脂、氢化大豆磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、高纯蛋黄卵磷脂、二月桂酰基卵磷脂、二芥酰磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰基卵磷脂、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基卵磷脂、二硬脂酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2油酰基磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺、棕榈酰溶血卵磷脂、肉豆蔻酰溶血卵磷脂、硬脂酰溶血卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐、1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷、(R)-2,3-双(油酰基氧基)丙基氢磷酸2-[(2-氨基乙基)氨基]乙基酯；和/或，
    所述两亲性聚乙二醇脂质分子选自聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇、2-(聚乙二醇)-N,N-二十四烷基乙酰胺、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚乳酸-乙醇酸酯；优选地，所述两亲性聚乙二醇脂质分子中的聚乙二醇的分子量为500g/mol～20000g/mol。
  33. 根据权利要求31或32所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，由所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，两亲性聚乙二醇脂质分子和1,2-棕榈酰磷脂酰甘油在水介质中自组装形成；或者由所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，和两亲性聚乙二醇脂质分子在水介质中自组装形成；优选地，所述两亲性聚乙二醇脂质分子为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
  34. 根据权利要求33所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，与所述两亲性聚乙二醇脂质分子的质量比为1：0.2-8，优选为1：0.5-4，更优选为1：0.5-2，更优选为1：0.8-1.2；
    所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐，与所述1,2-棕榈酰磷脂酰甘油的质量比为1：0.5-1.5，优选为1：0.8-1.2。
  35. 一种权利要求31-34任一项所述的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
    将所述叔胺类脂质化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐溶于有机溶剂中，得叔胺类脂质化合物溶液；
    将所述两亲性分子溶于有机溶剂中，得两亲性分子溶液；
    取所述叔胺类脂质化合物溶液和所述两亲性分子溶液混合，得混合溶液；
    在所述混合溶液中加入含水介质，并用移液枪反复吹打，即得所述脂质纳米颗粒；或者，将所述混合溶液在搅拌条件下缓慢滴加到含水介质中，继续搅拌，即得所述脂质纳米颗粒；
    优选地，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或者四氢呋喃；
    优选地，所述叔胺类脂质化合物的浓度为10mg/mL-100mg/mL；所述两亲性分子溶液的浓度为20mg/mL-200mg/mL；
    优选地，所述混合溶液与所述含水介质的体积比为1:1-20。
  36. 权利要求1-29任一项中所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
  37. 权利要求31-34任一项所述的脂质纳米颗粒在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
  38. 权利要求1-29任一项所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐联合抗肿瘤药物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
  39. 权利要求31-34任一项所述的脂质纳米颗粒联合抗肿瘤药物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
  40. 根据权利要求38或39所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为免疫检查点抑制剂和/或化疗药物。
  41. 根据权利要求40所述的应用，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂；和/或，所述化疗药物为阿霉素。
  42. 根据权利要求36-39任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为胰腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、舌鳞癌、宫颈癌、卵巢癌、骨肉瘤、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢上皮癌、鼻咽癌、脑癌。
  43. 一种预防和/或治疗肿瘤的药物，其特征在于，由活性成分和药学上可接受的辅料和/或载体制备得到，所述活性成分包括权利要求1-29任一项中所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐，和/或权利要求31-34任一项所述的脂质纳米颗粒。
  44. 一种预防和/或治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于，其活性成分包括：
    组分1：权利要求1-29任一项所述的叔胺类脂质化合物或者其立体异构体或者其药学上可接受的盐，和/或权利要求31-34任一项所述的脂质纳米颗粒；以及，
    组分2：组分1之外的抗肿瘤药物；
    所述组分1和组分2分别成为独立的给药单元，或所述组分1和组分2共同形成组合的 给药单元。
  45. 根据权利要求44所述的预防和/或治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于，所述组分2为免疫检查点抑制剂和/或化疗药物。
  46. 根据权利要求45所述的预防和/或治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂；和/或，所述化疗药物为阿霉素。
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