CN116832023A - 一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用及其组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用及其组合物，涉及医药和化妆品领域，所述小分子化合物为邻苯二甲酸二异辛酯或其药学上可接受的盐，或包含有邻苯二甲酸二异辛酯的中药提取物。本发明以脱发关键致病的雄激素受体为靶点，利用计算机虚拟分子对接和分子动力学模拟技术筛选潜在抑制作用的小分子化合物DIOP，其可以通过局部抑制雄激素与雄激素受体结合治疗脱发，且通过脱发动物模型实验验证了DIOP具有优异的治疗脱发的疗效。

Description

一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用及其 组合物

技术领域

本发明涉及医药和化妆品领域，具体涉及一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用及其组合物。

背景技术

脱发是一种常见的皮肤病，包括脱发、斑秃、拔毛癖、休止期脱发、老年性脱发等，主要表现是额颞部和头顶部毛囊微型化，毛发减少和脱落，可发生在任何年龄段的男性和女性，给脱发者造成严重的精神负担。脱发的发病原因多与激素、遗传、免疫、局部炎症反应、神经和环境因素等有关。雄激素性脱发(Androgenetic alopecia，AGA)是发病率最高的脱发类型。雄激素，是一系列激素的总称，具体包括睾酮、雄烯二酮和去氢表雄酮，其中产量最多、作用最强的是睾酮。雄激素由睾丸产生，另外，肾上腺皮质、卵巢也能分泌少量的雄激素。根据目前研究报道，脱发的发病率和流行率与年龄和性别密切相关，30岁白人男性中脱发的发病率达30％，50岁男性中脱发患病率高达50％，70岁以上男性和女性中脱发患病率分别为80％和53％。在我国，脱发的发病率男性为21.3％，女性为6.0％，是一种常见的多发性疾病。

目前，针对脱发的治疗手段有药物治疗、毛发移植手术、低能量激光治疗、中胚层疗法、注射自体富血小板血浆疗法以及中医药治疗等。其中，药物治疗是使用人数最多且有效的治疗方法，已被美国FDA批准用于治疗脱发的药物仅有米诺地尔(minoxidil)和非那雄胺(finasteride)。米诺地尔是一种血管扩张剂，可以外用诱导局部血管扩张和血管内皮生长因子的过度表达，增加局部血液循环，营养毛囊细胞，从而增加毛发基质角质形成细胞的有丝分裂，促进毛发生长和增加毛发直径，延长毛囊生长期，刺激毛囊启动新的生长周期等；研究表明，虽然外用米诺地尔对脱发有一定的疗效，但其本身也存在着一定的局限性包括：(1)需要长期使用以维持疗效。(2)在外用时，少量药液可通过头皮吸收，即可引起心率加快、水钠潴留等症状。(3)部分人群在使用过程中会出现头皮干燥、多毛症和接触性皮炎等症状。(4)效果存在明显的个体差异。非那雄胺是一种Ⅱ型5-α还原酶抑制剂，其能抑制5-α还原酶，从而降低血清和头皮中主要导致雄激素性脱发发生的雄激素二氢睾酮(dihy-drotestosterone，DHT)的水平。虽然非那雄安针对AGA有着一定的治疗效果，但是该药物也存在着突出的不良反应，如：性功能障碍(性欲下降、勃起功能障碍、射精障碍)及心理问题。

鉴于治疗脱发的药物米诺地尔和非那雄胺存在的问题，本发明提供一种一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用及其组合物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用及其组合物。目的是针对脱发关键致病靶点雄激素受体，利用计算机虚拟分子对接和分子动力学模拟技术筛选潜在抑制作用的小分子，通过抑制雄激素与雄激素受体结合实现脱发的治疗。

本发明为了解决上述技术问题，第一个目的是提供一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用，所述小分子化合物为邻苯二甲酸二异辛酯或其药学上可接受的盐，所述邻苯二甲酸二异辛酯的结构如通式(Ⅰ)所示：

其中，邻苯二甲酸二异辛酯(Diisooctyl phthalate，DIOP)，CAS编号：27554-26-3，邻苯二甲酸二异辛酯的中文别名还包括邻酞酸二异辛酯、二异辛基邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸二异辛酯-D、邻苯二甲酸二异辛酯(DIBP)；其英文别名还包括Corflex 880，alkylphthalates，isooctylphthalate，Phthalate Dioctyl，Isooctyl phthalate，diisooctyl phthalate，DIISOOCTYL PHTHALATE，diiso-octyl phthalate，Di-iso-octylphthalate，Flexol plasticizer diop，diiso-octyl orthophthalate，Bis(6-methylheptyl)phthalate，diisooctyl phthalate，mixed isomers，1，2-Benzenedicarboxylic Acid Diisoctyl Ester，bis(6-methylheptyl)benzene-1，2-dicarboxylate。

本发明的有益效果是：本发明以脱发关键致病的雄激素受体为靶点，利用计算机虚拟分子对接和分子动力学模拟技术筛选潜在抑制作用的小分子化合物DIOP，其可以通过局部抑制雄激素与雄激素受体结合治疗脱发，且通过雄激素性脱发动物模型实验验证了DIOP具有优异的治疗脱发的疗效。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，在脱发药物中，所述小分子化合物的有效浓度为10μM～2.5M。

进一步，在脱发药物中，所述小分子化合物的有效浓度为239mM～2.39M。

进一步，所述小分子化合物为从巴戟天，大蓟，党参，广藿香，木贼，人参，三七或山茱萸等中药中提取或者人工合成得到。其它的中药提取得到本申请的小分子化合物邻苯二甲酸二异辛酯，及其包含它的中药提取物也属于本发明的保护范围。

其中巴戟天的根芯中邻苯二甲酸二异辛酯含量最多。

更进一步的，提取的方法是用石油醚回流提取。例如巴戟天的根皮和根芯脂溶性成分的提取：30℃干燥至恒重的根皮和根芯材料分别粉碎后过40目筛，准确称取各20.00g置于索氏提取器中，以石油醚为溶剂回流提取8h，旋转蒸馏回收溶剂，分别得到亮黄色具特殊气味的清亮油状液体0.37g和0.55g，邻苯二甲酸二异辛酯的得率分别为1.9％和2.8％。

进一步，在脱发药物中，所述脱发药物为抑制雄激素与雄激素受体结合的脱发药物。

本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，含有上述所述的小分子化合物或其药学上可接受的盐。

所述药物组合物中的活性成分(本发明的小分子化合物为DIOP或其药学上可接受的盐)的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。

进一步，所述药物组合物的剂型包括乳剂、膏剂、酊剂、油剂、喷剂中的至少一种。

所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型均可。所述药物组合物的适合给药剂量，根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。

本发明的第三个目的是提供一种药物组合物的应用，所述药物组合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用。

进一步，所述药物组合物在制备防治或治疗抑制雄激素与雄激素受体结合的脱发药物中的应用。

附图说明

图1为本发明分子模拟体系50ns的RMSD图，其中，紫色为MOL000073轨迹，绿色为MOL001689，蓝色为MOL002879，橘黄色为MOL002882，黄色为DHT；

图2为本发明DIOP与雄激素受体的相互作用三维结构图，其中，红色为DIOP，绿色蛋白为雄激素受体；

图3为本发明空白对照组、AGA对照组、低剂量DIOP治疗组、高剂量DIOP治疗组的小鼠和HE和Masson染色结果图；

图4为本发明空白对照组、米诺地尔治疗组、低剂量DIOP治疗组、高剂量DIOP治疗组的小鼠和HE和Masson染色结果图；

图5为本发明AGA对照组与低剂量和高剂量DIOP组的生发差异比较图，其中左边为AGA与低剂量DIOP组的比较图，右边为AGA与高剂量DIOP组的比较图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：虚拟筛选和分子动力学模拟

1.分析导致脱发的关键靶点

脱发的发病机制复杂，目前发现雄激素受体(Androgen receptor，AR)和5-α还原酶是导致脱发发病的主要候选基因。其中，雄激素受体与雄激素结合，会过度激活下游信号通路，可导致毛囊损伤和毛囊细胞减少，雄激素受体的基因与40％的脱发遗传风险有关，被认为是脱发的高风险基因。因此，本发明以雄激素受体为靶点进行小分子筛选。

2.虚拟筛选过程

虚拟筛选是一种基于计算机模拟分子对接(Molecular Docking，MD)的药物筛选策略，该策略可在分子水平上有效模拟配体-受体的相互作用，并快速的识别出具有治疗价值的小分子化合物。分子动力学模拟(Molecular Dynamics simulation，MDs)则是一种在力场条件下的动态评估分子与受体蛋白构象作用的系统，可进一步对筛选出的小分子并进行打分计算，提高筛选策略的精准度。

2.1防治或治疗脱发的小分子化合物筛选的方法

本实施例涉及的防治或治疗脱发的小分子化合物筛选的方法，包括如下具体步骤：

1)对接数据的前期处理。本发明以雄激素受体为靶点，首先通过PDB数据库检索并下载人雄激素受体的蛋白结构(PDBID：2AMA)，保存为PDB格式。下载TCMSP数据库中用于对接的小分子化合物的三维结构，并通过Openbabal软件进行格式转换，保存为pdbqt格式。

2)将靶点蛋白雄激素受体与小分子化合物对接。分子对接采用的软件为AutoDockvina，先通过雄激素与雄激素受体的结合位置确定活性口袋，结果显示配体睾酮(Dihydrotestosterone，DHT)与雄激素受体的ASN-705、ARG-752形成了氢键，提示这两个氨基酸残基在雄激素与雄激素受体结合中具有重要作用。再通过读取步骤1)中准备的前期数据，开始将小分子化合物与雄激素受体进行逐一对接，并计算雄激素受体与每个小分子化合物的最低结合能。最后初步筛选出与雄激素受体稳定相互作用的小分子化合物，得到候选的小分子化合物。

3)雄激素受体与候选的化合物小分子的分子动力学模拟。采用NAMD软件对雄激素受体和初步筛选出的候选的小分子化合物进行分子动力学模拟。采用Amber18的ff12SB力场处理蛋白质，水分子，氯离子及钠离子，对上述对接后体系分别进行50ns分子动力学模拟。利用VMD软件对模拟轨迹结果进行分析，利用MM-GBSA模块对筛选出的潜在化合物小分子进行结合自由能的计算，结合能相对最低的化合物小分子更可能较强竞争性抑制雄激素与雄激素受体的结合。

2.2筛选的结果

2.2.1分子对接

通过采用AutoDock vina对接软件进行筛选。首先进行雄激素受体与配体睾酮(DHT)的对接，识别对接口袋。然后进行雄激素受体与TCMSP数据库小分子化合物对接，筛选较好的对接构象复合物，并计算雄激素受体与化合物小分子的最低结合能，结合能打分见表1。进而筛选出与雄激素受体稳定相互作用的候选的小分子化合物，即：MOL001689(金合欢素)、MOL000073(表儿茶素)、MOL002879(邻苯二甲酸二异辛酯，DIOP)、MOL002882(甘油单油酸脂)。

表1化合物与AR对接结合能

2.2.2动力学模拟

基于上述分子对接结果，进一步对雄激素受体和筛选出的候选的小分子化合物进行分子动力学模拟。分子动力学模拟采用NAMD完成。采用Amber18的ff12SB力场处理蛋白质，水分子，氯离子及钠离子，对上述对接体系分别进行50ns分子动力学模拟。均方根偏差(RMSD)值是体系中蛋白质所有骨架C原子运动偏移的平均值，已知RMSD值的跨度(即纵坐标最大值减去最小值)不超过2埃为分子动力学模拟结果的稳定指标。通过对RMSD数值分析体系的稳定性，如图1所示，在五个对接体系中，RMSD值升高后均逐渐趋于平稳，说明这五个体系最终都能达到稳定状态。

2.2.3自由结合能计算

基于上述RMSD分析结果，分别截取五个体系平衡后的轨迹，利用MM-GBSA方法计算各对接体系的自由结合能，结果如表2所示。表2结果显示，MOL002879体系的结合能相对最低。利用Pymol软件绘制DIOP与雄激素受体的相互作用图，结果如图2所示，分析其结合方式结果表明，DIOP和雄激素受体结合位置与配体睾酮和雄激素受体结合位置相似，进一步验证了DIOP能够竞争性抑制作用阻断雄激素受体与其配体睾酮的结合。

表2五个体系自由结合能结果

实施例2：动物模型实验

1.小鼠脱发模型构建及DIOP药物效果评估方法

依据小鼠脱发造模相关文献(胡俊,张敬芳,候圣祥,姚依韬,冯振国,李小溪,潘梦佳,魏强,陈天禹.三七总皂苷对雄激素性脱发小鼠的改善作用及机制研究[J].中国麻风皮肤病杂志,2021,37(09):555-560.)，选择8w周龄、体重25-27g、雄性的C57BL/6杂交系小鼠，在适应性喂养一周后，通过皮下和腹腔交替注射丙酸睾酮(杭州兽药厂)5mg/kg.d进行脱发小鼠模型的构建，最后得到脱发小鼠模型。

设立五个组别：空白对照组、脱发模型对照组(AGA)、米诺地尔治疗组、低剂量DIOP治疗组(DIOP low)、高剂量DIOP治疗组(DIOP high)，其中脱发模型对照组2只小鼠，其余组别均有3只小鼠，评估DIOP对脱发的保护作用。

空白对照和模型对照组不给予药物干预，米诺地尔治疗组和DIOP(高/低)剂量治疗组则统一通过体外涂抹方式进行每日给药；米诺地尔治疗组为5％米诺地尔，DIOP低剂量治疗组为239mM(换算后与5％米诺地尔对照组的摩尔浓度相同)，高剂量组为2.39M。

5周后处死动物，先进行拍照，取背部皮肤固定于多聚甲醛溶液，然后进行Masson和HE染色，图像使用IX61 FL荧光显微镜获得，采用Image-Pro Plus法检测毛囊，t检验对比毛囊数量，用于判断药物的疗效。

2.DIOP药物效果评估结果

Masson和HE染色结果及拍照结果如图3和4，通过动物局部生发观察结果：低剂量DIOP治疗组和高剂量DIOP治疗组的小鼠背部毛发范围和毛量较脱发模型对照组明显增多。与市售米诺地尔治疗效果比较结果：低剂量DIOP治疗组和高剂量DIOP治疗组的小鼠背部生发效果均较米诺地尔治疗组好。

在镜下对比毛囊数量观察结果如图5所示，Masson和HE染色发现单位面积皮肤内的DIOP(低/高)剂量治疗组小鼠的毛囊数量要显著多于脱发模型(AGA)对照组(p＝0.044<0.05/p＝0.037<0.05)。

综上可知，本发明以脱发关键致病的雄激素受体为靶点，利用计算机虚拟分子对接和分子动力学模拟技术筛选潜在抑制作用的小分子化合物DIOP，其可以通过局部抑制雄激素与雄激素受体结合治疗脱发，且通过雄激素性脱发动物模型实验验证了DIOP具有优异的治疗脱发的疗效。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用，其特征在于，所述小分子化合物为邻苯二甲酸二异辛酯或其药学上可接受的盐，所述邻苯二甲酸二异辛酯的结构如通式(Ⅰ)所示：

2.根据权利要求1所述一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用，其特征在于，在脱发药物中，所述小分子化合物的有效浓度为10μM～2.5M。

3.根据权利要求1所述一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用，其特征在于，在脱发药物中，所述小分子化合物的有效浓度为239mM～2.4M。

4.根据权利要求1所述一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用，其特征在于，在脱发药物中，所述小分子化合物的有效浓度为2.39M。

5.根据权利要求1所述一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用，所述小分子化合物为从巴戟天，大蓟，党参，广藿香，木贼，人参，三七或山茱萸中提取或者人工合成得到。

6.根据权利要求1所述一种小分子化合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用，其特征在于，所述脱发药物为抑制雄激素与雄激素受体结合的脱发药物。

7.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1至6任一项所述的小分子化合物或其药学上可接受的盐，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

8.根据权利要求7所述一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括乳剂、膏剂、酊剂、油剂、喷剂中的至少一种。

9.基于权利要求7至8任一项所述药物组合物的应用，其特征在于，所述药物组合物在制备防治或治疗脱发药物中的应用。

10.根据权利要求9所述药物组合物的应用，其特征在于，所述药物组合物在制备防治或治疗抑制雄激素与雄激素受体结合的脱发药物中的应用。