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CN116836269A - 抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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CN116836269A
CN116836269A CN202310250286.8A CN202310250286A CN116836269A CN 116836269 A CN116836269 A CN 116836269A CN 202310250286 A CN202310250286 A CN 202310250286A CN 116836269 A CN116836269 A CN 116836269A
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variable region
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CN202310250286.8A
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侯亚利
崔庆为
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Original Assignee
Shanxi Institute Of Higher Innovation
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Abstract

本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是呼吸道合胞病毒的诊断、预防和治疗领域。本发明涉及抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体，以及包含所述抗体的试剂盒和用途。所述抗体包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1‑3所示的重链可变区的互补决定区1‑3和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4‑6所示的轻链可变区的互补决定区1‑3。本发明的抗体可用于诊断、预防和治疗呼吸道合胞病毒的感染或由所述感染引起的疾病(例如，毛细支气管炎、哮吼)。

Description

抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，涉及呼吸道合胞病毒的诊断、预防和治疗，更具体涉及抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体，以及包含所述抗体的试剂盒和用途。
背景技术
尽管RSV严重威胁着全球人的健康，但却很少有预防和治疗RSV感染的措施，疫苗的研发也因福尔马林灭活的疫苗引起病情恶化而被阻碍。母体内的抗体在妊娠期最后几周会通过胎盘传给婴儿，可以提供保护性免疫，但这种保护每个月大约会衰退两倍，持久性差。目前没有疫苗和特效的治疗手段，唯一的预防措施是1998年获批的帕利珠单抗，虽然一定程度上能够减少婴幼儿的住院率和死亡率，但它免疫活性差，使用频率高，整个流行季节需要给先天性呼吸道循环系统障碍的早产儿免疫五次，这样的高成本和不便利使其不适用于所有的婴儿，也限制了对高风险婴儿的预防。因此，急需研制疫苗和抗体治疗性药物。
呼吸道合胞病毒属于副黏液病毒科，肺病毒属，是一种单股负链RNA病毒，有A、B两种抗原型。RSV表面的吸附蛋白(G)和融合蛋白(F)能够诱导中和抗体应答的唯一两种抗原。G蛋白是负责病毒粘附到细胞膜表面的蛋白，但它具有抗原多变性，很难产生一种广谱的保护性药物。F蛋白负责病毒与细胞融合的蛋白，呈现出更多的中和抗体靶向表位，是现在研发中大多数疫苗和免疫治疗药物的重要靶点，也是目前临床上通过palivizumab和motavizumab预防RSV疾病的靶点。F蛋白具有融合前(pre-fusion)和融合后(post-fusion)两种构象，大多数强中和表位都集中在融合前构象的F蛋白，所以目前急需能够中和融合前构象F蛋白的抗体。
迄今为止，中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法。目前已经上市的治疗和预防病毒感染的药物有预防小儿呼吸道合胞病毒(RSV)感染的palivizumab(Synagis)，治疗HIV感染的艾巴利珠单抗(Trogarzo)，以及用于狂犬病毒暴露后预防的Rabishield。此外，还有多种针对不同病毒的单抗处于临床研究的不同阶段(https://clinicaltrials.gov/)。抗体主要通过两方面起作用。一方面，具有中和活性的抗体可通过结合病毒囊膜蛋白，阻断病毒与细胞受体的结合，从而阻断病毒感染。另一方面，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)可募集巨噬细胞或是补体等免疫细胞和免疫分子，从而清除游离的病毒以及被感染的细胞。
因此，需要开发能够抗呼吸道合胞病毒的中和抗体，以提供有效预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的手段。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science242:423 426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879 5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，CancerImmunol.描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444 6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure2:1121 1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体SAARI009)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见Journal of virological methods,2009,158(1-2):171-179)。
如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或抗体片段。
如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体RV8、RV11)以小于大约10- 5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，呼吸道合胞病毒F蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
如本文中所使用的，术语“呼吸道合胞病毒”和“RSV”，二者具有相同的含义，可互换使用。
本发明人经过大量的实验研究后发现了一种抗体SAARI009，其能够特异性识别和靶向呼吸道合胞病毒的F蛋白，特别是融合前构象的F蛋白，显示出了高效的中和病毒的能力。因此，本发明的抗体特别适合用于诊断、预防和治疗呼吸道合胞病毒感染或与呼吸道合胞病毒感染相关的疾病(例如：毛细支气管炎、哮吼)。
在本申请的第一个方面，提供了单克隆抗体(SAARI009)或其抗原结合片段，其包含，SAARI009氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区(VH)互补决定区1-3(CDR1-3)；SAARI009氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示的轻链可变区(VL)互补决定区1-3(CDR1-3)。
(可变区的CDR)
在某些优选的实施方案中，所述的单克隆抗体SAARI009中包括如SEQ ID NO:7所示的重链可变区(VH)和如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区(VL)，(可变区)
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体在重链可变区的N端还具有前导序列。在某些优选的实施方案中，所述SAARI009前导序列具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。(前导序列)
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
在某些优选的实施方案中，所述的单克隆抗体SAARI009中还包括如SEQ ID NO:9所示重链恒定区(CH)的氨基酸序列和如SEQ ID NO:10所示的轻链恒定区(CL)的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述的单克隆抗体的轻链为κ型。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性结合呼吸道合胞病毒的融合蛋白(F蛋白)融合前的构象(pre-fusion)。在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够靶向呼吸道合胞病毒的融合蛋白(F蛋白)融合后的构象(post-fusion)。在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够抑制F蛋白介导的膜融合过程，抑制病毒对细胞的感染。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有中和能力(例如，能够中和呼吸道合胞病毒)。在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够抑制呼吸道合胞病毒感染或进入宿主细胞。由此，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够中和呼吸道合胞病毒，并由此预防和治疗呼吸道合胞病毒的感染。
本申请还提供了分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类核酸分子不受限于其产生的方法，并且可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。
因此，在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区(VH)的核苷酸序列，其中所述抗体SAARI009重链可变区具有如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区(VL)的核苷酸序列，其中所述抗体SAARI009轻链可变区具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在优选的实施方案中，所述核酸分子还包含编码前导序列的核苷酸序列，其位于所述能够编码抗体重链可变区的核苷酸序列的5’端。在某些优选的实施方案中，所述抗体SAARI009前导序列具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子包含第一多核苷酸，其包含编码前导序列的核苷酸序列和能够编码抗体重链可变区的核苷酸序列；以及，第二多核苷酸，其包含编码前导序列的核苷酸序列和能够编码抗体轻链可变区的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述分离的SAARI009的核酸分子包含第一多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；以及，第二多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子还包含，能够编码抗体重链恒定区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述SAARI009中能够编码抗体重链恒定区的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子还包含，能够编码抗体轻链恒定区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述SAARI009中能够编码抗体轻链恒定区的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子包含第一多核苷酸，其包含编码前导序列的核苷酸序列、能够编码抗体重链可变区的核苷酸序列和能够编码抗体重链恒定区的核苷酸序列；以及，第二多核苷酸，其包含编码前导序列的核苷酸序列、能够编码抗体轻链可变区的核苷酸序列和能够编码抗体轻链恒定区的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子包含第一多核苷酸，其中SAARI009中的第一多核苷酸包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序；以及，第二多核苷酸，SAARI009中的第二多核苷酸包含如SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体SAARI009是包括：氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的VH CDR1-3，如SEQ ID NO:4-6所示的VL CDR1-3，如SEQ ID NO:7所示的VH和如SEQ ID NO:8所示的VL，如SEQ ID NO:9所示的CH和如SEQ ID NO:10所示的CL。其中，VH CDR1氨基酸序列为：ADTFTNYW(SEQ ID NO：1)、VH CDR2的氨基酸序列为IYPGDSDT(SEQ ID NO：2)、VH CDR3的氨基酸序列为ARQVGGVVTTEDNNYLYGMDV(SEQ ID NO：3)；VL CDR1的氨基酸序列为QSISTF(SEQ ID NO：4)、VL CDR2的氨基酸序列为DTD(SEQ ID NO：5)、VLCDR3的氨基酸序列为QQSRFIPII(SEQ ID NO：6)。
在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含如上文所定义的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。
在另一个方面，还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
在另一个方面，本发明提供了检测呼吸道合胞病毒或其F蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括，使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的(例如，所述样品是来自患者的样品)，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了呼吸道合胞病毒的方法，其包括：使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检测呼吸道合胞病毒或其F蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。在某些优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗独特型抗体。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗独特型抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测呼吸道合胞病毒或其F蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了呼吸道合胞病毒。
在某些优选的实施方案中，所述样品包括但不限于来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的排泄物、口腔或鼻腔分泌物、肺泡灌洗液等。
使用抗体或其抗原结合片段来检测目标病毒或抗原(例如，呼吸道合胞病毒或其F蛋白)在样品中的存在或其水平的一般方法是本领域技术人员所熟知的。在某些优选的实施方案中，所述检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在另一个方面，本发明提供了用于中和样品中呼吸道合胞病毒的毒力的方法，其包括，将包含呼吸道合胞病毒的样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。此类方法可以用于治疗目的，或非治疗目的(例如所述样品是细胞样品，而不是患者或来自患者的样品)。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中呼吸道合胞病毒的毒力。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗独特型抗体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的呼吸道合胞病毒感染或与呼吸道合胞病毒感染相关的疾病(例如毛细支气管炎、哮吼)。
在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的呼吸道合胞病毒感染或呼吸道合胞病毒感染相关的疾病(例如毛细支气管炎、哮吼)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。
可通过任何适当的施用途径来将本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物施用给受试者。此类施用途径包括但不限于，口服、口腔、舌下、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、或鼻腔途径。
本发明所提供的药物和药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与其他药学活性剂(例如抗病毒药物)联合使用。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还含药学上可接受的载体。
本申请所涉及的部分序列的信息如下面的表1所示。
表1.部分序列的信息
有益效果
本申请的单克隆抗体能够以高亲和力与呼吸道合胞病毒F蛋白结合，并且对呼吸道合胞病毒具有很强的中和活性。例如，本发明SAARI009抗体对A2毒株融合前构象F蛋白的亲和力为≤0.0032nM，不结合融合后构象的F蛋白，对呼吸道合胞病毒的中和滴度(半抑制浓度，IC50)为0.02ng/mL。因此，本申请的单克隆抗体SAARI009具有预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的临床应用价值。
附图说明
图1显示了呼吸道合胞病毒融合前构象F蛋白的分子筛层析结果与SDS-PAGE检测结果。
图2显示了重组表达的SAARI009抗体的分子筛层析结果与SDS-PAGE检测结果，其中，凝胶图上的“-DTT”表示没有添加DTT(非还原性SDS-PAGE)；“+DTT”表示添加了DTT(还原性SDS-PAGE)。
图3显示了SAARI009抗体结合F蛋白的动力学曲线结果。
图4显示了不同浓度的SAARI009抗体对RSV活病毒的中和活性。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
为了获得具有保护效果的中和抗体，本申请发明人首先以293F瞬时表达RSV的F蛋白DS-Cav1作为抗原，通过流式分选术，从健康成年人外周血单核细胞(PBMCs)中筛选到能够特异性结合F蛋白DS-Cav1的记忆B细胞，然后，对筛选获得的单一B细胞进行RT-PCR，获得编码抗体可变区的序列。进一步，将编码抗体可变区的序列与恒定区基因连接至表达载体中，并在哺乳动物细胞中进行表达和纯化，从而获得抗体SAARI009。对抗体SAARI009进行一系列的功能检测，结果显示，抗体SAARI009都能够特异性结合融合前构象的F蛋白，抑制RSV对人细胞的感染，具有抗RSV感染的中和活性。
下面实施例中，除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：RSV病毒F蛋白的表达与纯化
使用NdeI和XhoI酶，将编码RSV毒株F蛋白DS-Cav1(其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示)的DNA片段连接到pCAGGS载体上，所述DNA片段在编码区的3'端还连接有编码6*组氨酸标签(6*His标签)的核苷酸序列及终止密码子。将连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中。然后，挑取单克隆，接种到5mL LB培养基中，培养6-8小时；然后再转接种到300mL的LB培养基中，培养12-16小时，收集菌体，用无内毒素大提质粒试剂盒(TIANGEN)提取DS-Cav1质粒，将提取的质粒转染293F细胞表达F蛋白。随后，通过亲和层析和分子筛层析法纯化F蛋白，其中，使用AKTA-purifier(GE)、HistrapTM HP、superdex200 Hiload 10/300柱子(GE)以及缓冲液A(20mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0)、B(20mM Tris,150mM NaCl,1MIminazole,pH 8.0)，并且在纯化过程中，同时监测280nm处的紫外吸收值，收取含有目的蛋白的级分。纯化结束后，通过SDS-PAGE鉴定目的蛋白(DS-Cav1)的纯度。结果如图1所示。图1的结果显示，获得了高纯度的F蛋白(DS-Cav1)，单体大小为50kDa。
实施例2：特异性识别F蛋白的记忆B细胞的分离
经过健康志愿者的知情同意下，采集20mL的血液，分离PBMCs。将分离的PBMCs以1*107/mL的密度与终浓度为400nM的DS-Cav1蛋白(如实施例1制备的)在冰上孵育结合半小时；然后用PBS(含2％FBS)洗2次，再与下列抗体(均购自BD)孵育：anti-human CD3/PE-Cy5，anti-human CD16/PE-Cy5，anti-human CD235a/PE-Cy5，anti-human CD19/APC-Cy7，anti-human CD27/Pacific Blue，anti-human CD38/APC，anti-human IgG/FITC，以及anti-His/PE。在冰上孵育半小时后，用PBS(含2％FBS)洗PBMCs 2次。随后，用FACSAria III分选PBMCs，收集PE-Cy5-APC-APC-Cy7+Pacific Blue+FITC+PE+的细胞(即B细胞)，直接将其收集到96孔板内，1细胞/孔。
实施例3：SAARI009抗体的分离和鉴定
使用Superscript III reverse transcriptase(Invitrogen)对实施例2获得的B细胞进行逆转录(在55℃，进行60分钟)，其中，所使用的逆转录引物如表2所示。
表2.所使用的逆转录引物的序列信息
引物 5′-3′序列
IgM-RT(SEQ) ATGGAGTCGGGAAGGAAGTC
IgD-RT TCACGGACGTTGGGTGGTA
IgE-RT TCACGGAGGTGGCATTGGA
IgA1-RT CAGGCGATGACCACGTTCC
IgA2-RT CATGCGACGACCACGTTCC
IgG-RT AGGTGTGCACGCCGCTGGTC
Cκ-new RT GCAGGCACACAACAGAGGCA
Cλ-new-ext AGGCCACTGTCACAGCT
以逆转录产物作为模板，用HotStar Tap Plus酶(QIAgen)进行第一轮PCR(PCRa)，扩增抗体可变区的序列；其中，所使用的引物如表3所示；所使用的反应条件如下：95℃，5min；35个循环的(95℃30s，55℃(重链/κ链)30s，72℃90s)；72℃，7min。随后，以该扩增产物作为模板再进行第二轮PCR(PCRb)；其中，所使用的引物如表4所示；所使用的反应条件如下：95℃，5min；35个循环的(95℃30s，58℃(重链)/60℃(κ链)/64℃(λ链)30s，72℃90s)；72℃，7min。
通过1％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物。回收条带大小在400-500bp的PCR产物，并送测序公司测序。测序结果用NCBI在线软件进行分析。
通过序列测定，获得一株抗体的序列，命名为SAARI009。SAARI009抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示(编码基因如SEQ ID NO:12所示)，轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8所示(编码基因如SEQ ID NO:13所示)。SAARI009抗体与胚系基因的序列一致性如下面的表5-6所示。
表3.第一轮PCR(PCRa)所使用的引物
引物名称 5’-3’
VH1-Ext CCATGGACTGGACCTGGAGG
VH2-Ext ATGGACATACTTTGTTCCA
VH3-Ext CCATGGAGTTTGGGCTGAGC
VH4-Ext ATGAAACACCTGTGGTTCTT
VH5-Ext ATGGGGTCAACCGCCATCCT
VH6-Ext ATGTCTGTCTCCTTCCTCAT
IgG-Ext CGCCTGAGTTCCACGACACC
Vκ1-2-Ext GCTCAGCTCCTGGGGCT
Vκ3-Ext GGAARCCCCAGCDCAGC
Vκ4-5-Ext CTSTTSCTYTGGATCTCTG
Vκ6-7-Ext CTSCTGCTCTGGGYTCC
Cκ-Ext GAGGCAGTTCCAGATTTCAA
Vλ1-Ext CCTGGGCCCAGTCTGTG
Vλ2-Ext CTCCTCASYCTCCTCACT
Vλ3-Ext GGCCTCCTATGWGCTGAC
Vλ31-Ext GTTCTGTGGTTTCTTCTGAGCTG
Vλ4ab-Ext ACAGGGTCTCTCTCCCAG
Vλ4c-Ext ACAGGTCTCTGTGCTCTGC
Vλ5-9-Ext CCCTCTCSCAGSCTGTG
Vλ6-Ext TCTTGGGCCAATTTTATGC
Vλ7-8-Ext ATTCYCAGRCTGTGGTGAC
Vλ10-Ext CAGTGGTCCAGGCAGGG
Cλ-new-Ext AGGCCACTGTCACAGCT
表4.第二轮PCR(PCRb)所使用的引物
表5.SAARI009抗体重链与胚系基因的比较
V-H等位基因 D-H等位基因 J-H等位基因 一致性(V-H)
SAARI009 5-51*01 3-3*01 6*04 93.2％
表6.SAARI009抗体轻链与胚系基因的比较
V-L等位基因 J-L等位基因 一致性(V-L)
SAARI009 1-39*01 5*01 92.60％
将分析得到的编码重链/轻链可变区的核苷酸序列分别与相应的编码重链/κ链的恒定区的核苷酸序列通过搭桥PCR进行连接，然后分别克隆至表达载体pCAGGS(购自Addgene)中，从而得到分别编码抗体重链和轻链的重组表达载体。表达重链和轻链的构建体的构建方案如下：
重链编码序列(5’-3’)：CMV启动子-EcoR I酶切位点-前导序列基因-VH基因-CH基因-Xho I酶切位点；
轻链(κ)编码序列(5’-3’)：CMV启动子-Sac I酶切位点-前导序列基因-VL基因-CL(κ)基因-Xho I酶切位点；
其中，前导序列的氨基酸序列如SED ID NO:11所示(编码基因如SEQ ID NO:16所示)，CH的氨基酸序列如SED ID NO:9所示(编码基因如SEQ ID NO:14所示)，CL的氨基酸序列如SED ID NO:10所示(编码基因如SEQ ID NO:15所示)。
实施例4：SAARI009抗体的表达纯化
使用293F细胞。用实施例3得到的分别编码抗体重链和轻链的重组表达载体共转染293F细胞。在24和72小时补加补料液，培养6天，收集上清。
将收集的上清以8000rpm离心120min，然后与含有20mM磷酸钠(pH 7.0)的缓冲液等体积混合，随后用0.22μm滤膜进行过滤，然后装载至protein A预装柱(5mL，GEHealthcare)。以100mM甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合至预装柱的蛋白。将洗脱蛋白浓缩，然后通过分子筛层析法进行纯化。随后，通过SDS-PAGE(还原性和非还原性)检测所纯化的目的蛋白，在非还原条件SDS-PAGE中抗体呈现单一条带，在还原条件下SDS-PAGE中抗体的Fc区二硫键被打开，从而显示为两个条带，且抗体纯度超过95％，结果如图2所示。
实施例5：SAARI009抗体与F蛋白的结合能力评估
在本实施例中，利用BLI(BioFort Octet)进行分子相互作用分析。具体步骤如下：
首先，将DS-Cav1固定在NTA-Ni Sensors上，50ug/mL。然后，以抗体捕获的方式，结合纯化的SAARI009抗体。另外，用PBST(加0.05％吐温-20)溶液连续倍比稀释SAARI009抗体。然后，将连续稀释的抗体依次加入96孔板各孔中(从低浓度开始逐一上样)。记录SAARI009抗体结合DS-Cav1蛋白的动力学曲线(图3)，并利用BLI data软件计算动力学常数，得到SAARI009抗体与F蛋白的结合动力学常数的KD为6.175E-11，(R2为0.9999)。结果显示，SAARI009抗体能够以较高的亲和力结合RSV的F蛋白。
实施例6：SAARI009抗体中和RSV活病毒的能力评估
将实施例4纯化的SAARI009抗体从25μg/mL开始倍比稀释至第11个梯度(0.0098μg/mL)，然后分别与半数组织培养感染剂量(TCID50)的BetaCoV/Shenzhen/SZTH-003/2020病毒(获自深圳市第三人民医院，GISAID号:EPI_ISL_406594)在37摄氏度混合孵育1小时。孵育后，将病毒加入到预先接种了Hep-2细胞的96孔板中孵育3小时，加入DMEM(含2％FBS)培养基并于37摄氏度，5％CO2培养箱中培养4天，观察致细胞病变效应(CPE)，并计算SAARI009抗体的中和滴度。结果如图4所示。图4显示了不同浓度的SAARI009抗体与palivizumab/Nirsevimab抗RSV活病毒的中和活性比较。结果显示，SAARI009抗体对A2、B型活病毒的中和滴度(半抑制浓度，IC50)为20ng/mL、120ng/mL。

Claims (10)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含，氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 1-3所示的重链可变区的互补决定区1-3；和/或，氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 4-6所示的轻链可变区的互补决定区1-3；
优选地，所述的单克隆抗体包括，如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和/或，如SEQ IDNO:8所示的轻链可变区；
优选地，所述单克隆抗体在重链可变区的N端还具有前导序列，和/或所述单克隆抗体在轻链可变区的N端还具有前导序列；
优选地，所述单克隆抗体的前导序列具有如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列；
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体；
优选地，所述的单克隆抗体还包括重链恒定区；优选地，所述SAARI009的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；
优选地，所述的单克隆抗体还包括轻链恒定区；优选地，所述SAARI009的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
2.分离的核酸分子，其编码权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段。
3.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中抗体重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:1-3分别所示的重链可变区的互补决定区1-3；
优选地，所述抗体重链可变区具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
更优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。
4.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中所述抗体轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO: 4-6的轻链可变区的互补决定区1-3;
优选地，所述抗体轻链可变区具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
更优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列。
5.一种载体，其包含权利要求2-4任一项的分离的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其包含权利要求2-4任一项的分离的核酸分子或权利要求5的载体。
7.一种试剂盒，其包括权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶；
更优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段或抗独特型抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶。
8.一种用于非诊断目的检测呼吸道合胞病毒或其F蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段进行检测；
例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，化学发光物质，有色物质和酶；
例如，所述方法还包括，使用携带可检测的标记(例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶)的第二抗体来检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段或抗独特型抗体；
优选地，所述样品为来自环境中的例如哺乳动物，优选人的排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液；所述样品是非来自患者的细胞样品；
所述检测方法使用酶联免疫吸附、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，所述药物组合物还包含其他药学活性剂，例如法匹拉韦，瑞德西韦，干扰素等。
10.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中呼吸道合胞病毒的毒力，或用于预防或治疗受试者的呼吸道合胞病毒感染或与呼吸道合胞病毒感染相关的疾病(例如毛细支气管炎、哮吼)；
优选地，所述受试者是哺乳动物，例如人；
优选地，所述药物单独使用，或与其他药学活性剂(例如法匹拉韦，瑞德西韦，干扰素等)联合使用；
所述药物施用途径包括但不限于，口服、口腔、舌下、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、或鼻腔途径。
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