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CN116836153A - 一种CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂及其应用 - Google Patents

一种CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂及其应用 Download PDF

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CN116836153A
CN116836153A CN202310726482.8A CN202310726482A CN116836153A CN 116836153 A CN116836153 A CN 116836153A CN 202310726482 A CN202310726482 A CN 202310726482A CN 116836153 A CN116836153 A CN 116836153A
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cdk9
cyclin
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cells
protein interaction
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CN202310726482.8A
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吴桐
方美娟
高桂萍
李嘉祎
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Xiamen University
Original Assignee
Xiamen University
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Abstract

一种CDK9‑Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂及其应用，用于制备治疗与CDK9、CDK9/Cyclin T1活性或表达量相关疾病的药物。通过靶向结合CDK9，破坏CDK9与Cyclin T1的蛋白互作，进而调控相关的信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。因此，本发明公开的CDK9‑Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂可以用于癌症或相关疾病的治疗。

Description

一种CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及化学药物技术领域，尤其涉及一种CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂及其应用。
背景技术
周期素依赖性激酶9(Cyclin dependent kinase 9,CDK9)是CDK家族的一个重要成员，在转录调控中起着至关重要的作用。CDK9/cyclin复合物参与多种细胞功能，而CDK9-Cyclin T1复合物参与形成正转录延伸因子b(P-TEFb)，在调节转录延伸中起着至关重要的作用。越来越多的研究表明，CDK9的异常表达和功能异常与肿瘤发生发展密切相关，是治疗癌症的重要药物靶点。现有研究表明，CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂在体内外可显著抑制三阴性乳腺癌(TNBC)的细胞增殖和迁移。因此，开发靶向CDK9-Cyclin T1相互作用的新型CDK9抑制剂是肿瘤治疗的一个有效策略。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂及其应用。
本发明的首要目的在于提供一种通式(Ⅰ)所示的化合物或其立体异构体、其水合物、其溶剂化物、其氘代物、其前药、其代谢产物、其中间体，及其药学上可接受的盐或共晶，以及药学上可接受的载体。
其中，X优选Cl、H；Linker优选-CH2-、羰基、R1为哌啶基团或2-甲氨基乙醇或哌嗪基团，优选4-羟基哌啶、N-甲基哌嗪、N-乙基哌嗪、N-异丙基哌嗪、4-甲基哌啶、3-甲基哌啶、2-甲氨基乙醇、4-氨基哌啶、4-叔丁氧羰基氨基哌啶、4-甲醇哌啶、3-甲醇哌啶；R2为H、卤素、烷基、烷氧基，优选H、4-F、4-CH3、4-OCH3、4-CF3、4-OCH2CH3、2-CH3、3-CH3、3-OCH3。
一种药物组合物，含有本发明通式(Ⅰ)所述的化合物或其立体异构体、其水合物、其溶剂化物、其氘代物、其前药、其代谢产物、其中间体，及其药学上可接受的盐或共晶，以及药学上可接受的载体。
所述在药学上可接受的盐为通式(Ⅰ)化合物与酸生成的在药学上可接受的加成盐。其中用于成盐的酸包括无机酸及有机酸，优选的无机酸和有机酸为：盐酸、硫酸、磷酸和甲磺酸，有机酸包括乙酸、三氯乙酸、丙酸、丁酸、马来酸、对甲苯磺酸、苹果酸、丙二酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、樟脑酸、二葡糖酸、天冬氨酸和酒石酸。
所述药学上可接受的载体指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的赋形剂或稀释剂。
本文所述的任一化合物或其立体异构体、其水合物、其溶剂化物、其氘代物、其前药、其代谢产物、其中间体，及其药学上可接受的盐或共晶，以及药学上可接受的载体用于治疗CDK9、CDK9/Cyclin T1相关疾病，如肿瘤，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、宫颈癌等。
相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：
本发明公开的CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂，通过靶向结合CDK9，破坏CDK9与Cyclin T1的蛋白互作，进而调控相关的信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。因此，本发明公开的CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂可以用于癌症或相关疾病的治疗。
附图说明
图1为实施例3中部分公开化合物抑制CDK9磷酸化RNApolⅡ(S2)作用的检测结果。
图2为实施例4中化合物B19选择性抑制CDK9与Cyclin T1相互作用的检测结果。
图3为实施例5中化合物B19与CDK9特异结合的检测结果。
图4为实施例6中化合物B19发挥CDK9依赖性生物学功能的检测结果。
图5为实施例8中不同浓度B19对CDK9下游因子水平的影响的检测结果。
图6为实施例9中化合物B19对MDA-MB-231细胞增殖、细胞凋亡的影响的检测结果。
图7为实施例10中化合物B19对MDA-MB-231细胞迁移的影响的检测结果。
图8为实施例11中化合物B19联合Olaparib协同杀伤MDA-MB-231肿瘤细胞的检测结果。
图9为实施例12中化合物B19急性毒性研究中小鼠的体重变化的检测结果。
图10为实施例13中大鼠腹腔注射50mg/kg B19的血药浓度-时间曲线(药时曲线)。
图11为实施例14中化合物B19显著抑制裸鼠体4T1移植瘤生长的检测结果。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。本发明的保护范围包括但是不限于此。
本发明提供的CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂的具体合成路线如下：
在本发明优选实施方案中，其中X优选为Cl、H；Linker优选为-CH2-、-C＝O-、-C＝OCH2-、-C＝OCH2CH2-；R1为哌啶基团或2-甲氨基乙醇或哌嗪基团，优选4-羟基哌啶、N-甲基哌嗪、N-乙基哌嗪、N-异丙基哌嗪、4-甲基哌啶、3-甲基哌啶、2-甲氨基乙醇、4-氨基哌啶、4-叔丁氧羰基氨基哌啶、4-甲醇哌啶、3-甲醇哌啶；R2为H、卤素、烷基、烷氧基，优选H、4-F、4-CH3、4-OCH3、4-CF3、4-OCH2CH3、2-CH3、3-CH3、3-OCH3等。
本发明提供的CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂的制备方法如下：
将原料(1)4-溴-2-氟吡啶或2-氟-4-碘-5-氯吡啶与不同的氨基以DMF为溶剂，无水碳酸钾作为碱，升温回流进行亲核取代反应得到取代或未取代的N-苄基-4-溴吡啶-2-胺、4-(4-溴吡啶-2-基)胺衍生物、1-(5-氯-4-碘吡啶-2-基)哌啶-4-醇、(1-(5-氯-4-碘吡啶-2-基)哌啶-4-基)甲醇等中间体(2)将4-(4-溴吡啶-2-基)胺衍生物、1-(5-氯-4-碘吡啶-2-基)哌啶-4-醇、(1-(5-氯-4-碘吡啶-2-基)哌啶-4-基)甲醇等中间体与联硼酸频那醇酯反应制得中间体硼酸酯(3)。以原料(4)4-甲氧基苯乙酸或4-甲氧基苯丙酸原料，氯化亚砜为溶剂，搅拌并升温至回流，生成4-甲氧基苯乙酰氯或4-甲氧基苯丙酰氯，将原料(5)2-氨基-4-溴吡啶或5-氯-4-碘-吡啶-2氨以四氢呋喃为溶剂，以吡啶作为碱，在冰浴条件下搅拌状态缓慢滴加上述酰氯或取代或未取代的苯甲酰氯进行酰胺缩合反应得到取代或未取代的N-(4-溴吡啶-2-基)-4-氟苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-3-氯4-氟苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-4-甲基苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-3,5-二氯苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-4-三氟甲基苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-2-甲基苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-3-甲基苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-3-甲氧基苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-4-乙氧基苯甲酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺、N-(4-溴吡啶-2-基)-3-(4-甲氧基苯基)丙酰胺、N-(5-氯-4-碘吡啶-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺等中间体(7)。将中间体硼酸酯(3)与中间体取代/未取代的N-苄基-4-溴吡啶-2-胺或中间体(7)分别进行Suzuki偶联反应得到目标化合物(8)。
表1.本发明所述化合物的结构、氢谱(1H NMR)及高分辨质谱(HRMS)表征数据
实施例1：N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B19)的制备
本实施例以B19的合成为例来说明本发明所公开化合物的合成，具体步骤如下：
(1)中间体N-(4-溴吡啶-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺的合成：在干燥的50mL反应瓶中，冰浴条件下，依次加入2-氨基-4-溴吡啶(500mg,2.89mmol)，吡啶(684.93mg,8.67mmol)，THF(10mL)，继续搅拌0.5h；再在搅拌状态缓慢滴加4-甲氧基苯甲酰氯(591.60mg,3.74mmol)的THF混合溶液，在冰浴条件下反应1h。TLC监测反应已结束，停止反应，将溶剂减压真空浓缩后加入冰水搅拌，析出固体，抽滤，得滤饼(粗产物)。得到的粗产物用硅胶柱层析分离(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1,v/v)，得白色N-(4-溴吡啶-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺649mg，收率73％。
(2)中间体1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-4-醇的合成：在干燥的50mL反应瓶中，将2-氟-4-溴吡啶(1.00g，11.36mmol)与4-羟基哌啶(1.41g，13.63mmol)溶于25mL的DMF中，加入无水碳酸钾(4.71g，34.09mmol)，氮气置换反应体系后，升温至90℃反应3h，TLC检测原料反应完全后，停止加热，将反应液搅拌下倒入100mL冰水中，析出固体，抽滤，取滤饼，干燥后得白色固体1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-4-醇2.54g，收率83％
(3)1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)吡啶-2-基)哌啶-4-醇的合成：在干燥的100mL反应瓶中将上步所得1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-4-醇(2.54g，9.88mmol)、联硼酸频那醇酯(3.76g，14.82mmol)、1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.1mmol)、以及干燥的无水醋酸钾(2.91g，29.64mmol)加入30mL干燥的1,4-二氧六环中，置换氮气，于氮气保护下升温至110℃反应4h，TLC检测1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-4-醇反应完全后，减压浓缩除去溶剂，用乙酸乙酯与水萃取三次(3*100mL)，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤后，有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相减压浓缩后的残留物硅胶拌样，再用柱层析硅胶色谱分离纯化(等度洗脱方法，二氯甲烷：甲醇＝20:1，v/v)，得白色粉末中间体1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)吡啶-2-基)哌啶-4-醇2.23g，收率74％
(4)N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B19)：取50mL圆底烧瓶，称取中间体N-(4-溴吡啶-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(300mg,0.97mmol)与中间体1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)吡啶-2-基)哌啶-4-醇(444.20mg,1.47mmol)以及无水碳酸钾(414mg，3mmol)和1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(30mg)溶于5mL溶剂(乙二醇二甲醚：水＝4:1)中，氮气置换3次，升温至80℃反应过夜，TLC检测反应已平衡，停止反应，减压浓缩除去溶剂后，残留物硅胶拌样，利用柱层析色谱分离纯化(等度洗脱方法，石油醚/乙酸乙酯＝1：1，v/v)，得到化合物N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺，白色固体125mg，收率32％。
表1所列举的其他化合物：
4-氟-N-(2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B1)、4-甲基-N-(2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B2)、3,4-二氯-N-(2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B3)、N-(2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(B4)、4-甲氧基-N-(2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B5)、4-氟-N-(2'-(3-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B6)、4-甲氧基-N-(2'-(4-甲基哌嗪-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B7)、N-(2'-(3-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲基苯甲酰胺(B8)、N-(5-氯-2'-(3-(羟甲基)哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲基苯甲酰胺(B9)、N-(2'-(3-(羟甲基)哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B10)、第三丁基(1-(2'-(4-甲氧基苯甲酰胺)-[4,4'-联吡啶]-2-基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯(B11)、N-(2'-(4-氨基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B12)、N-(2'-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B13)、N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-2-甲基苯甲酰胺(B14)、2-氯-N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B15)、N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-3-甲基苯甲酰胺(B16)、N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲基苯甲酰胺(B17)、N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(B18)、N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B19)、3,5-二氯-N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B20)、N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺(B21)、4-乙氧基-N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B22)、N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-3-甲氧基苯甲酰胺(B23)、N-(5-氯-2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲基苯甲酰胺(B25)、4-氟-N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B24)、N-(5'-氯-2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B26)、4-氟-N-(2'-(4-(羟甲基)哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B27)、N-(2'-(4-(羟甲基)哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B28)、N-(5'-氯-2'-(4-(羟甲基)哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B29)、3-氯-4-氟-N-(2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B30)、3,5-二氯-N-(2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B31)、N-(2'-(4-乙基哌嗪-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-氟苯甲酰胺(B32)、N-(2'-(4-乙基哌嗪-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B33)、N-(2'-(4-异丙基哌嗪-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(B34)、4-氟-N-(2'-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B35)、3-氯-4-氟-N-(2'-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)苯甲酰胺(B36)、1-(2'-((4-甲氧基苄基)氨基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)哌啶-4-醇(C1)、N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺(C2)、N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-3-(4-甲氧基苯基)丙酰胺(C3)、2-((2'-(苄基氨基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)(甲基)氨基)乙烷-1-醇(C4)、N-(4-氟苄基)-2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-胺(C5)、N-苄基-2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-胺(C6)、1-(2'-(苄基氨基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)哌啶-4-醇(C7)与化合物B19合成方法类似。
实施例2：本发明中化合物抗肿瘤细胞增殖活性评价(IC50)
取对数期细胞MDA-MB-231,A549,Hela,LO2分别接种于96孔板,37℃培养过夜。将待测化合物溶液以20μM为初始浓度，使用三倍稀释法稀释化合物，加入各孔中，每组设置3个复孔，以同比例稀释DMSO溶液为对照，继续培养72h后，加入工作浓度为0.5mg/mL的MTT，37℃培养3-4h，弃上清，每孔加入100μL DMSO，振板10min以充分溶解甲臜，而后酶标仪检测492nm处吸光值。实验测得数据以公式：计算抑制率，根据各浓度的抑制率计算半抑制浓度IC50，实验结果见表2，实验结果表明本发明中化合物对肿瘤细胞增殖有着显著的抑制作用，且化合物对LO2(人正常肝细胞)的抑制活性普遍低于癌细胞，具有较好的安全性。
表2.本发明中部分化合物抗肿瘤细胞增殖活性评价
实施例3：本发明化合物对CDK9磷酸化RNApolⅡ(S2)的抑制活性评价
无论是CDK9的激酶活性被抑制还是CDK9与Cyclin T1相互作用被打断，其体内RNA聚合酶的丝氨酸二号位的磷酸化会被抑制，且基于MTT的结果，候选化合物在人非小型细胞肺癌细胞系A549；人宫颈癌细胞系Hela，三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，其对MDA-MB-231的抑制活性显著优于A549和Hela，因此，本发明在MDA-MB-231细胞系中评估了优选化合物对RNA聚合酶的丝氨酸二号位的磷酸化蛋白表达水平。
Western Blot实验：取对数期细胞MDA-MB-231接种于12孔板中，37℃培养过夜，以1μM的ICDK9为阳性对照，换含1μM化合物的培养基继续培养24h后，弃培养基，预冷的1×PBS润洗3次，加入细胞裂解液，冰上裂解30min，12000g，4℃离心15min，取上清，加入loadingbuffer，100℃，煮样10min获得蛋白样品，蛋白样品经Western blot检测。实验结果及其定量分析如图1所示。结果表明了优选化合物在一定层度下可以抑制CDK9磷酸化RNApolⅡ(S2)的蛋白表达，其中化合物B19显著抑制RNApolⅡ(S2)的磷酸化水平。
图1A是测试化合物影响RNA polⅡ(S2)的磷酸化水平(P-ser2)的Western blot分析图。
图1B和1C是图1A Western blot中P-ser2条带的定量分析。
上述表明，化合物B19可以抑制RNA polⅡ(S2)的磷酸化水平。
实施例4：化合物B19通过破坏CDK9与Cyclin T1相互作用发挥生物学功能
外源性CO-IP实验：在HEK293t细胞中转染flag-CDK9质粒，转染24h后，弃上清，用预冷的1×PBS洗两次，再加入预冷的细胞裂解液，冰上裂解30min，用刮刀将所有细胞刮下，转移至预冷的1.5mL ep管中。将细胞裂解物放于低温离心机，4℃，12000g，离心15min。收集上清，用1μM和3μM B19处理裂解液8h，取10％蛋白上清，加入loading buffer，100℃煮样10min，作Input。向剩余蛋白上清中加入1μg Flag抗体原液，然后置于垂直混匀器，4℃孵育过夜。按照每个样品加入15μL protein A/G琼脂糖珠子(protein A/G琼脂糖珠子用1×PBS洗三次)，然后置于垂直混匀器，4℃孵育3-4h，使抗体与琼脂糖珠子偶联。免疫沉淀反应后，4℃，3000rpm，离心5min，将上清小心吸去，留在管底的琼脂糖珠子用裂解液洗3-4遍，最后一遍尽量吸去残留上清，向沉淀的琼脂糖磁珠中加入20μL的2×loading buffer，100℃，煮样10min。蛋白样品通过Western blot实验检测。在HEK293t细胞中转染CDK7质粒，其他步骤同上。
内源性CO-IP：使用15cm皿培养MDA-MB-231细胞,以3μM的ICDK9作为阳性对照，分别用1μM、3μM的化合物B19处理MDA-MB-231细胞8h,弃上清，其他步骤同上。实验结果及其定量分析，实验结果如图2所示。
图2A是在外源性的co-ip中，B19浓度依赖的抑制CDK9与Cyclin T1的相互作用。
图2B是图2A Western blot中Cyclin T1、Cyclin K条带的定量分析。
图2C是在外源性co-ip中化合物B19不影响CDK7与Cyclin H的相互作用。
图2D是图2C Western blot中Cyclin H条带的定量分析。
图2E是在MDA-MB-231细胞中，加药处理内源性的co-ip，表明化合物B19浓度依赖的抑制CDK9与CyclinT1的相互作用，且阳性对照ICDK9不影响CDK9与Cyclin T1的相互作用。
图2F是图2E Western blot中Cyclin T1条带的定量分析。
所述表明，化合物B19可以通过抑制CDK9-CyclinT1相互作用发挥生物学功能。
实施例5：化合物B19特异的与CDK9结合
CETSA(Cellular Thermal Shift Assay，细胞热转移实验)是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验，其原理是靶蛋白与药物分子结合时通常会变得稳定。即随着温度的升高，蛋白会发生降解；当蛋白结合药物后，相同温度下，未降解蛋白的量会提高，该复合蛋白的热熔曲线会右移。
CETSA实验：在HEK293t细胞中转染flag-CDK9质粒，转染24h后，弃上清，用预冷的1×PBS洗两次，再加入预冷的细胞裂解液，冰上裂解30min，用刮刀将所有细胞刮下，转移至ep管中,4℃，12000g，离心15min。收集上清，加入1μM的B19，4℃孵育6h，将上清平均分到6个PCR管中，将PCR管置于PCR仪中梯度加热，温度分别设置为45℃、46.4℃、50.2℃、56.8℃、62℃、63.6℃、65℃，加热30s，室温静置2min,4℃，12000g，离心15min。收集上清，等比例加入4×loading buffer，金属浴煮样变性后续进行Western Blot检测化合物与蛋白结合能力。
培养15cm皿MDA-MB-231细胞，用1μM B19处理MDA-MB-231细胞8h，弃上清，用预冷的1×PBS洗两次，再加入预冷的细胞裂解液，冰上裂解30min，用刮刀将所有细胞刮下，转移至ep管中,4℃，12000g，离心15min，收集上清,,将上清平均分到6个PCR管中,将PCR管置于PCR仪中梯度加热，温度分别设置为45℃、46.4℃、50.2℃、56.8℃、62℃、63.6℃、65℃，加热30s，室温静置2min，4℃，12000g，离心15min。收集上清，等比例加入4×loading buffer，金属浴煮样变性后续进行Western Blot检测化合物与蛋白结合能力。实验结果如图3所示。
图3A是在293t细胞裂解液中加药处理做GETSA实验的Western Blot分析图，表明B19可以结合在CDK9上，稳定CDK9蛋白。
图3B是图3A Western blot条带中CDK9的条带定量分析。
图3C是在MDA-MB-231细胞中加药处理，Western Blot检测在CDK家族中B19可以特异的结合在CDK9上。
图3D是图3C Western blot条带中CDK9的条带定量分析。
上述表明化合物B19可以特异的结合在CDK9上发挥生物学功能。
实施例6：化合物B19依赖CDK9发挥生物学功能
使用sh-RNA技术在MDA-MB-231细胞系中敲低CDK9，得到MDA-MB-231-shCDK9细胞株，取对数生长期的MDA-MB-231-WT与MDA-MB-231-shCDK9铺于六孔板分别加入1μM的B19，，使用Western Blot检测下游蛋白表达。MTT实验检测野生型MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231-shCDK9细胞在不同浓度的化合物B19处理72h后的细胞活力。结果如图4所示。
图4A是野生型MDA-MB-231和sh-CDK9的MDA-MB-231细胞(DMSO或B19)药物处理后Western Blot检测CDK9下游因子的表达情况，表明B19依赖于CDK9发挥生物学功能。
图4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H分别是图4A Western blot中CDK9、Cyclin T1、p-ser2、C-myc、Mcl-1、Bcl-2、Cleaved-parp条带的定量分析。
图4I是在野生型MDA-MB-231和sh-CDK9的MDA-MB-231中不同浓度B19处理72h，使用MTT实验检测化合物在两株细胞的IC50，结果表明相比于野生型MDA-MB-231细胞，在sh-CDK9的MDA-MB-231细胞中B19的抗增殖能力减弱。
图4J是图4I中细胞IC50的数值比较直方图。
上述表明：化合物B19依赖CDK9发挥生物学功能。
实施例7：B19显著抑制三阴性乳腺癌细胞系增殖
取对数生长期细胞MDA-MB-231、BT549、Hs578t、4T1、A498、HepG2、A549、Hela、LO2、HK2、MCF-10A铺于96孔板，进行MTT实验，检测化合物抗癌细胞增殖活性(IC50)，用以评估化合物B19的抗癌活性。
结果如表3所示，化合物B19抑制三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、BT549、Hs578t、4T1)增殖显著优于宫颈癌Hela、肺癌A549、肾癌A498、肝癌HepG2等其他癌种细胞系和正常细胞系(MCF-10A、LO2、HK2)，表明化合物B19对三阴性乳腺癌细胞系具有一定的选择性。
表3.化合物B19显著抑制三阴性乳腺癌细胞系增殖
实施例8：B19浓度依赖的抑制CDK9下游蛋白
CDK9的主要下游调控蛋白为Mcl-1、C-myc等，这些蛋白参与细胞生长和细胞周期的进程，控制肿瘤细胞的增殖和存活。
取对数生长期细胞MDA-MB-231铺于6孔板，待细胞贴壁，换含有不同浓度的化合物B19的培养基，24h后弃上清，遇冷的1×PBS洗三次，加入预冷的细胞裂解液，操作同上，进行Western Blot实验，检测蛋白表达结果如图5所示。
图5A是Western Blot检测CDK9下游蛋白及凋亡相关蛋白，表明在B19浓度依赖的抑制CDK9下游从而诱导凋亡。
图5B、5C、5D、5E、5F、5G分别是图5A Western blot中p-ser2、p-ser5、C-myc、Mcl-1、Bcl-2、Cleaved-parp条带的定量分析。
综上所述：B19浓度依赖的抑制CDK9下游蛋白。
实施例9：B19浓度依赖的抑制MDA-MB-231细胞增殖，诱导细胞凋亡
(1)细胞集落形成实验：通过细胞集落形成来测定化合物B19抑制细胞增殖的能力。取对数期MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，37℃培养48h，加入含不同浓度(12、37、111、333、1000nM)B19的培养基继续培养十天后，弃培养基，1×PBS洗3次，甲醇室温固定15min，弃甲醇，1×PBS洗3次，晾干后加入0.5％结晶紫溶液(用PBS稀释)染色，室温染色10-15min，移除染液，用超纯水洗至培养皿无背景颜色，用显微镜观察集落计数，拍照记录(图6A)并进行定量分析(图6B)。
(2)Western Blot实验：取对数生长期的MDA-MB-231细胞铺于六孔板，待细胞贴壁，换含有不同浓度化合物B19的培养基，24h后弃上清，预冷的1×PBS洗三次，加入遇冷的细胞裂解液，同上进行Western Blot实验(图6C)，细胞发生凋亡后，与其相关的蛋白表达会明显变化。PARP蛋白在细胞发生早期凋亡时，会产生切割，因此PARP切割可作为早期凋亡的标志。对其条带通过灰度分析进行定量(图6D)。
(3)Annexin V-FITC细胞凋亡检测实验：通过流式细胞仪检测化合物B19对细胞凋亡的影响。取对数期细胞MDA-MB-231接种于6孔板中，37℃培养过夜，以ICDK9为阳性对照，分别加入含不同浓度(37、111、333、1000nM)B19的培养基继续培养72h后，弃培养基，预冷1×PBS润洗，胰酶消化后将细胞收集至预冷的1.5mL ep管中，2500rpm，5min离心后移除上清，预冷PBS洗两次，离心后移除上清，轻轻弹击管壁以避免细胞成团，利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，室温避光染色20min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验结果如图6E和6F所示。
图6A是不同浓度B19处理MDA-MB-231的细胞克隆形成实验，表明B19浓度依赖的抑制MDA-MB-231增殖。
图6B是图6A结晶紫溶解的定量分析。
图6C是检测不同浓度B19处理Western Blot检测凋亡标志物parp和Cleaved-parp表达，表明B19浓度依赖的诱导parp切割。
图6D是图6C Western Blot中Cleaved-Parp的定量分析。
图6E是检测不同浓度B19处理流式检测细胞凋亡率，表明B19浓度依赖的诱导细胞凋亡。
图6F是图6E中凋亡细胞的定量分析。
上述表明：B19浓度依赖的抑制MDA-MB-231细胞增殖，诱导细胞凋亡。
实施例10：B19浓度依赖和时间依赖的抑制MDA-MB-231迁移
(1)细胞划痕实验：取对数生长期的MDA-MB-231细胞铺于六孔板，待形成单层致密细胞后用200μl枪头画直线，用PBS清洗细胞碎片，加入含有0.1μM的化合物B19无血清培养基培养，分别在0h、6h、12h、24h四个时间点在倒置显微镜观察划痕愈合情况，并用image J进行定量。
(2)Transwell实验:Transwell下室加入含10％胎牛血清的培养基,取对数生长期的MDA-MB-231细胞铺于上室，上室换含有不同浓度化合物B19的无血清培养基，以1μM的ICDK9为阳性对照，培养24h，取出Transwell小室，PBS轻轻冲洗，晾干，多聚甲醛固定，0.1％结晶紫染色，去离子水洗净晾干，倒置显微镜观察视野中细胞的迁移、情况，并用image J进行定量。实验结果如图7所示。
图7A是0.1μM B19处理进行划痕实验，不同时间点进行拍照，检测其迁移水平，表明B19时间依赖的抑制MDA-MB-231迁移。
图7B是图7A的迁移能力定量分析。
图7C是不同浓度B19处理MDA-MB-231细胞24h进行Transwell实验，检测其侵袭能力。表明B19浓度依赖的抑制MDA-MB-231侵袭。
图7D是图7C的结晶紫溶解定量分析。
上述表明：B19浓度依赖和时间依赖的抑制MDA-MB-231迁移和侵袭。
实施例11：化合物B19联合olaparib协同杀伤肿瘤细胞
CI(联合指数分析)：CompuSyn是一款根据Chou-Talalay数学模型建立的应用软件，能够根据导入的数据直接计算出CI值，方便快捷。通过CI值的大小即可确定两药联合的作用效果:当CI<1时，两药为协同作用效果:当CI＝1时，两药为叠加作用效果；当C>1时，两药为拮抗作用效果。与此同时，CompuSy软件会根据所得数据绘制等价剂量效应比的Fa-CI图。
取对数生长期细胞MDA-MB-231铺于96孔板，B19于1.33μM为初始浓度，三倍稀释，olaparib于16.67μM为初始浓度，三倍稀释，以及联合加入B19和Olaparib，处理48h，进行MTT实验，检测化合物细胞抑制增殖活性，使用CompuSyn计算联合指数，实验结果如图8所示。图8结果表明，B19与Olaparib联合用药具有协同作用，为临床上治疗TNBC提供了理论基础。
实施例12：化合物B19的小鼠急性毒性研究
根据厦门大学动物护理和使用委员会的指导方针，批准了小鼠急性毒性研究方案。优选化合物B19在4-6周龄(20 g)的小鼠中进行了急性毒性学评估。化合物配制在10％DMSO、2％T-80和88％超纯水中，并以62.5 mg/kg、125 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg、750mg/kg、1000 mg/kg的剂量腹腔注射化合物B19(每组5只)，观察两周。
表4显示了化合物B19的小鼠急性毒性研究情况，给予最高剂量(1000 mg/kg)的小鼠全部死亡，较高剂量(750 mg/kg)有2只小鼠死亡，其余的剂量组小鼠没有死亡。使用Probit方法计算化合物B19的中位致死剂量LD50为537 mg/kg。
图9显示了化合物B19急性毒性研究中小鼠的体重变化图，较高剂量组(750 mg/kg)在给药后5天之内精神状态下滑，未死亡的3只小鼠5天以后精神状态恢复良好，体重增长较缓慢，而其他剂量组小鼠体重更加明显的增长，精神状态良好。
上述表明：化合物B19具有较好的安全性。
表4.化合物B19的小鼠急性毒性评价
实施例13：化合物B19的大鼠药代动力学研究
根据厦门大学动物护理和使用委员会的指导方针，批准了药代动力学研究方案。优选化合物B19在10-14周龄(200-220g)的Sprague-Dawley大鼠中进行了药代动力学评估。化合物配制在10％ DMSO、2％ T-80和88％超纯水中，并以25mg/kg的剂量腹膜内注射(i.p.)。雌性SD大鼠随机分为每组3只，给药后于0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h用含有肝素钠(10mg/mL，30μL)的试管储存血样。在4℃(100μL)下以4000r/min离心10min后，将血浆与血液分离。使用以正电喷雾模式运行的ABI 3200QTRAP三重四极杆系统，通过LC/MS/MS测定血浆样品中的化合物B19水平。化合物B19的药代动力学参数通过DAS3.0软件进行拟合。
表5显示了化合物B19的药代动力学性质；图10显示了大鼠腹腔注射50mg/kg B19的血药浓度-时间曲线(药时曲线)图。结果表明，化合物B19以腹腔注射到大鼠体内后的达峰时间为0.5h,Cmax为15471±952.84μg/L，半衰期为1.67±0.02h，AUC(0-t)为17042.05±1878.12ug/L*h，AUMC(0-t)为21387.42±2260.07h*h*μg/L。
表5.化合物B19的大鼠药代动力学参数
实施例14：化合物B19可以抑制三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤的生长
在裸鼠右侧前腋部皮下注射4T1细胞悬液。设置对照组(溶剂)，低剂量给药组(12.5mg/kg)和高剂量给药组(25.0mg/kg)，连续给药14天。给药结束后，断颈处死裸鼠，剥离肿瘤，拍照并称重。结果如图11A-11E所示。
图11A实验期各组小鼠的体重变化，表明化合物B19在给药期间并没有引起裸鼠体重的显著减轻，没有明显毒性。
图11B显示了实验期各组小鼠移植瘤体积的变化，表明化合物B19能够显著性抑制4T1细胞移植瘤的生长。
图11C显示了第14天时各组小鼠移植瘤重量，化合物B19能够显著性抑制4T1细胞移植瘤的重量。经化合物B19治疗后，裸鼠的肿瘤生长受到明显的抑制，12.5mg/kg剂量组平均肿瘤重量为0.453±0.08g，25mg/kg剂量组平均肿瘤重量为0.174±0.08g，显著低于控制组的平均肿瘤肿瘤1.249±0.29g。
图11D显示了第14天时各组小鼠移植瘤大小，表明化合物B19能够显著抑制4T1细胞移植瘤的生长。
图11E显示了对照组与给药组小鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织的H&E染色情况，显示化合物B19对肿瘤组织产生了明显的杀伤效果，但在器官中并没有出现明显的损伤，表明化合物B19能够有效抑制裸鼠体内肿瘤的生长，同时对组织器官并未产生明显毒性。
综上，化合物B19在12.5mg/kg和25mg/kg的剂量时都能够显著抑制4T1细胞移植瘤的生长，抑制率(TGI)分别为63.1％和86.1％；且具有一定的体内安全性。

Claims (7)

1.一种CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂，其特征在于具有以下式(I)所示的结构化合物：
其中，X为H或卤素；Linker为-CH2-、羰基、R1为哌啶基或2-甲氨基乙醇或哌嗪基；R2为H、卤素、烷基、烷氧基。
2.如权利要求1所述的一种CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂，其特征在于：X为Cl、H；R1为4-羟基哌啶、N-甲基哌嗪、N-乙基哌嗪、N-异丙基哌嗪、4-甲基哌啶、3-甲基哌啶、2-甲氨基乙醇、4-氨基哌啶、4-叔丁氧羰基氨基哌啶、4-甲醇哌啶、3-甲醇哌啶；R2为H、4-F、4-CH3、4-OCH3、4-CF3、4-OCH2CH3、2-CH3、3-CH3、3-OCH3。
3.如权利要求1所述的一种CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制剂，其特征在于，式(I)所示的结构化合物选自如下：
4.一种药物组合，其特征在于：含有权利要求1～3中任一所述的式(I)所示的结构化合物或其立体异构体、其水合物、其溶剂化物、其氘代物、其前药、其代谢产物、其中间体，及其药学上可接受的盐或共晶，以及药学上可接受的载体。
5.权利要求1～3任一项所述的一种CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制以及权利要求4所述的药物组合的应用，其特征在于：在用于制备治疗与CDK9、CDK9/Cyclin T1活性或表达量相关疾病的药物中的应用。
6.权利要求1～3任一项所述的一种CDK9-Cyclin T1蛋白相互作用抑制以及权利要求4所述的药物组合的应用，其特征在于：在用于制备治疗与抑制或降解CDK9相关疾病中的应用。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述的疾病包括乳腺癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、肾癌。
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