CN116813728B

CN116813728B - 一种真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白突变体及其应用

Info

Publication number: CN116813728B
Application number: CN202310831499.XA
Authority: CN
Inventors: 刘国栋; 赵芹芹; 肖子扬; 高丽伟; 曲音波
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2023-07-07
Filing date: 2023-07-07
Publication date: 2024-08-09
Anticipated expiration: 2043-07-07
Also published as: CN116813728A

Abstract

本发明公开了一种真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白的突变体及其应用，其中所述突变体命名为A873Y，是将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的野生型调控蛋白XYR1的第873位氨基酸由丙氨酸突变为酪氨酸得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了所述突变体在生产木质纤维素降解酶中的应用。实验证实，通过在真菌菌株中表达所述调控蛋白突变体A873Y，可以显著提升半纤维素酶和纤维素酶的产量，对于规模化生产和提高木质纤维素降解酶产量、降低生产成本具有重要意义，在饲料、纺织、生物能源用酶等领域具有良好的应用前景。

Description

一种真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白的突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

纤维素酶、半纤维素酶等木质纤维素降解酶可以将木质纤维素降解为寡糖或者单糖，在饲料、纺织、造纸等领域具有广泛用途。利用木质纤维素降解酶将秸秆等农作物残余物转化为单糖，进而生产乙醇、乳酸等燃料或化学品，对于减缓石油等不可再生资源的消耗、支持经济社会的可持续发展具有重要意义。

里氏木霉等丝状真菌具有强大的表达分泌木质纤维素降解酶的能力，进一步提升其产酶能力对于降低木质纤维素降解酶的使用成本具有重要意义。

XYR1是子囊真菌中保守的木质纤维素降解酶转录激活因子，它含有与GAL4转录因子超家族的锌簇相似的锌双核簇结构域。在黑曲霉中，XYR1的同源蛋白XlnR调控了多种木聚糖降解酶的表达。在里氏木霉中，多种纤维素酶或半纤维素酶基因的启动子上都存在XYR1的结合位点，XYR1编码基因的失活可以导致这些木质纤维素降解酶表达的严重下降。相应的，XYR1的过表达可以提升木质纤维素降解酶的表达水平。

通过在XYR1靠近C末端的的保守序列引入氨基酸点突变(如V821F或A824V)，可使得木质纤维素降解酶的表达呈现持续激活现象，在葡萄糖等阻遏性碳源条件下细胞也能够表达较高水平的纤维素酶和半纤维素酶，并且在纤维素等木质纤维素降解酶表达的诱导性碳源条件下，产酶能力也有进一步提升(Derntl et al.Biotechnology for Biofuels2013,6:62；et al.Biotechnology for Biofuels 2017,10:30)。因此，对XYR1的表达量及活性进行改造，已成为提升真菌木质纤维素降解酶产量的有效策略。从蛋白质结构决定功能的角度来看，XYR1的C端区段内可能还存在其他能够赋予该调控蛋白持续激活功能的突变体，但目前这方面的报道还比较少见。

检索发现，有关使半纤维素酶、纤维素酶的诱导强化及持续激活表达以及突破葡萄糖对木质纤维素降解酶表达的阻遏作用和显著提高木质纤维素降解酶产量的真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1第873位氨基酸突变体还未见报道，该突变体的表达使真菌菌株在非诱导条件下产生木质纤维素降解酶，且在诱导条件下也能够显著提高木质纤维素降解酶的产量的实践也未见报道。

发明内容

针对目前真菌木质纤维素降解酶产量有待提高的现状，本发明的目的是提供一种真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1的突变体及其应用。

本发明所述的真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体，其特征在于：所述突变体命名为A873Y，是将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的野生型调控蛋白XYR1的第873位氨基酸由丙氨酸突变为酪氨酸得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

其中：所述的调控蛋白XYR1突变体A873Y来自于里氏木霉(Trichoderma reesei)。

本发明提供了一种编码上述真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体的基因，其特征在于：所述调控蛋白XYR1突变体A873Y基因的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体在实现半纤维素酶、纤维素酶的诱导强化及持续激活表达中的应用。

本发明所述真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体在突破葡萄糖对木质纤维素降解酶表达的阻遏作用中的应用。

本发明所述真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体在生产木质纤维素降解酶中的应用。

本发明提供了一种重组真菌菌株，其特征在于：所述重组真菌菌株是由权利要求3所述的编码基因转化里氏木霉制得，命名为里氏木霉菌株A873Y。

上述重组真菌菌株在验证半纤维素酶、纤维素酶的诱导强化及持续激活表达中的应用。

上述重组真菌菌株在生产木质纤维素降解酶中的应用。

实验证实，本发明提供的应用编码上述真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体基因构建的重组里氏木霉菌A873Y，半纤维素酶和纤维素酶的产量均与出发株相比有显著提升。在纤维素为碳源的诱导条件下，携带突变体A873Y编码基因的重组菌株的木聚糖酶产量相对于出发菌株提高了7.9倍，纤维二糖水解酶产量提高了45％。在葡萄糖为碳源的培养条件下，携带突变体A873Y编码基因的重组菌株的木聚糖酶产量相对于出发菌株提高了56.7倍，纤维二糖水解酶产量提高了3.3倍。通过在真菌菌株中表达本发明所述真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1的突变体，可以获得木质纤维素降解酶产量大幅提高的重组菌株，该表达XYR1突变体A873Y的重组菌株不仅提升了诱导条件下木质纤维素降解酶的产量，而且突破了葡萄糖对木质纤维素降解酶表达的阻遏作用，这使得在工业发酵过程中通过流加葡萄糖等可溶性碳源生产木质纤维素降解酶成为可能，对于提高木质纤维素降解酶产量、降低生产成本具有重要意义。在饲料、纺织、生物能源等领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为表达木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体的菌株在纤维素为碳源培养基上培养时的胞外半纤维素酶产量。

图2为表达木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体的菌株在纤维素为碳源培养基上培养时的胞外纤维素酶产量及蛋白质浓度。

图3为表达木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体的菌株在葡萄糖为碳源培养基上培养120h时的胞外半纤维素酶产量。

图4为表达木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体的菌株在葡萄糖为碳源培养基上培养120h时的胞外纤维素酶产量。

图5为表达木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体的菌株分别在微晶纤维素及葡萄糖为碳源培养基上培养120h时的SDS-PAGE结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

一般性说明：

实施例所用培养基及储备液：

生孢培养基(马铃薯葡萄糖琼脂，PDA)：称取去皮土豆200g，切碎后，加入不超过1L的水煮沸30min，经8层纱布过滤，取滤液加15g葡萄糖和5g蔗糖，定容1L，添加2％(w/v)琼脂粉，115℃灭菌30min。

种子培养基(/L)：葡萄糖20g、(NH₄)₂SO₄ 5g、KH₂PO₄ 15g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、CaCl₂0.6g，蛋白胨2g，10000×微量元素母液100μL，115℃灭菌30min。

10000×微量元素母液(/L)：FeSO₄·7H₂O 50g、MnSO₄·H₂O 17g、ZnSO₄·2H₂O 14g、CoCl₂·6H₂O 20g。

实施例中培养尿嘧啶缺陷型菌株的培养基中均加入浓度为1g/L的尿嘧啶。

实施例所用试剂：

南京诺唯赞公司Max Super-Fidelity DNA Polymerase、2×Taq MasterMix；Sigma公司细胞壁裂解酶Lysing enzymes；OMEGA公司琼脂糖胶回收试剂盒；鼎国昌盛生物科技有限公司Goldview^TM核酸染料；上海源叶生物科技有限公司山毛榉木聚糖；Sigma公司对硝基苯-β-木糖苷(pNPX)；Sigma公司对硝基苯-α-阿拉伯糖苷(pNPA)；Sigma公司对硝基苯-β-纤维二糖苷(pNPC)。其他常规生化试剂购自国药集团化学试剂有限公司等单位。

实施例所用仪器：

超净工作台(AIRTECH)、PCR仪(BioRad)、层析实验冷柜(YC-1型)、电磁炉、电泳仪(DYY-11B)、霉菌培养箱(MJX智能型)、叠加式震荡培养箱、高压灭菌锅(德强仪器)、电热鼓风干燥箱(GFL-125)、超微分光光度计、酶标仪、电子分析天平、大型冷冻离心机(Eppendorf5804R)、小型台式离心机(Eppendorf MiniSpin)、酸度计、蓝光/紫外凝胶成像仪、蓝光透射切胶仪等。

本发明木聚糖酶活力、β-木糖苷酶活力、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶活力、滤纸酶活力测定方法均为本领域的常规技术手段，且并非发明要点，在此不做赘述。

本发明使用了基因工程、分子生物学、基因编辑领域常规的技术和方法。本领域的技术人员可以在本发明提供的实施方式的基础上采用本领域其它常规技术、方法和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下述具体实施例阐述了对里氏木霉来源的转录调控蛋白XYR1进行序列突变而提高木质纤维素降解酶的方法。在实际应用中，木质纤维素降解酶调控蛋白XYR1的来源不限于里氏木霉，还包括哈茨木霉、绿色木霉、长枝木霉、贵州木霉、草酸青霉、绳状青霉、产黄青霉、黑曲霉、米曲霉、烟曲霉、棘孢曲霉、嗜热毁丝霉、特异腐质霉等，其氨基酸序列特征在于与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的一致度不低于70％，或具备与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第873位丙氨酸附近局部序列的保守特征，具体表现为：该第873位丙氨酸的N端连接氨基酸通常为碱性氨基酸，包括赖氨酸或精氨酸；该第873位丙氨酸的C端连接氨基酸通常为半胱氨酸。

下述具体实施例阐述了在里氏木霉中表达XYR1的突变体A873Y而提高木质纤维素降解酶产量的方法。在实际应用中，被改造的出发真菌不限于里氏木霉，还包括哈茨木霉、绿色木霉、长枝木霉、贵州木霉、草酸青霉、绳状青霉、产黄青霉、黑曲霉、米曲霉、烟曲霉、棘孢曲霉、嗜热毁丝霉、特异腐质霉等。

下述具体实施例阐述了将里氏木霉木质纤维素降解酶调控蛋白XYR1的第873位丙氨酸突变为酪氨酸而提高木质纤维素降解酶产量的方法。在实际应用中，该丙氨酸及调控蛋白XYR1同源蛋白保守位置的丙氨酸还可被替换为与酪氨酸具有相似结构或化学性质的氨基酸，包括苯丙氨酸和色氨酸。

下面结合实例对本发明的内容作具体阐述。

实施例1：里氏木霉木质纤维素降解酶调控蛋白XYR1突变体部分编码基因片段的构建

菌株：里氏木霉QMP，该菌株为在里氏木霉QM9414(美国模式菌种收集中心保藏号ATCC 26921)中敲除pyr4基因得到的尿嘧啶营养缺陷型菌株。此菌株已在申请人先前申请获得授权的专利“一种将木质纤维素水解液回用于发酵生产纤维素酶液的方法”(专利号：ZL 202111041885.6)中公开。

里氏木霉中XYR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

以里氏木霉QMP的基因组DNA为模板，使用引物xyr1-873m-UF和xyr1-873m-UR扩增XYR1的第873位氨基酸对应密码子的前端部分编码片段；使用引物xyr1-873m-MF和xyr1-873m-MR扩增XYR1的自第873位氨基酸对应密码子的后端编码片段至终止密码子后144bp处的片段，并引入使第873位丙氨酸突变为其他氨基酸的NNK序列；使用引物xyr1-873m-DF和xyr1-873m-DR扩增XYR1自终止密码子后第145个碱基至其下游共980bp的片段，并引入黑曲霉pyrG来源的一段序列CATTAGGTCTGACTGACAGCACGGCGCCATGC，用于后续菌株PCR验证。

上述扩增过程使用的引物序列为(5’至3’)：

xyr1-873m-UF:GGGCCATAGGGAGCCTTGACGAC

xyr1-873m-UR:GATGACGCTTGGAGACGCTTCGG

xyr1-873m-MF:GCAGGCCGAAGCGTCTCCAAGCGTCATCAAANNKTGCGAGACCATTGTTAGGGCAC(下划线序列引入序列突变)

xyr1-873m-MR:GCATGGCGCCGTGCTGTCAGTCAGACCTAATGCCAAAACACACCCTTGCCGACAAATG(下划线序列引入pyrG片段)

xyr1-873m-DF:CATTAGGTCTGACTGACAGCACGGCGCCATGCTTTTGATTTGTTCACGGTGTTGG(下划线序列引入pyrG片段)

xyr1-873m-DR:CTTCTCCTGCTCGTCAGATTCTG

片段扩增的PCR程序为：

预变性95℃3min，每个循环包括95℃15s、60℃15s、72℃1.5min，共31个循环，彻底延伸72℃10min。

参照文献报道(Fungal Genetics and Biology 2004,41:973-981)，使用重叠延伸PCR方法将扩增得到的xyr1前端部分编码片段、携带序列突变的xyr1的后端编码片段及终止密码子后下游片段融合在一起。片段融合的PCR程序为：

预变性95℃3min，每个循环包括95℃15s、55℃5min、72℃3min，共16个循环，彻底延伸72℃10min。

最终使用重叠延伸PCR的产物为模板，使用xyr1-873m-UF和xyr1-873m-DR两条引物扩增得到调控蛋白突变体的部分编码基因片段，长度为2.5kb。

实施例2：里氏木霉XYR1编码基因的体内突变

将实施例1中得到XYR1突变体部分编码基因片段通过原生质体转化方法转入QMP菌株，实现对xyr1基因的原位序列编辑，具体实验方法参照文献报道(PLoS ONE 2015,10(7):e0133085)。选择的间隔序列及PAM序列(下划线)为：AGCGTCTCCAAGCGTCATCAAGG。

使用里氏木霉5S rRNA启动子(Biotechnology Letters 2021,43:495-502)驱动引导RNA的表达。参照文献报道(Fungal Genetics and Biology 2004,41:973-981)，使用重叠延伸PCR方法将5S rRNA启动子与引导RNA骨架两个片段融合在一起，中间引入间隔序列。扩增5SrRNA启动子的引物为5S-sgRNA-UF和5S-sgRNA-UR，扩增引导RNA骨架的引物为sgRNA-DF和sgRNA-DR。引物序列如下：

5S-sgRNA-UF:GCTGTTTCCGCTGAGGGTTTAATCACATACGACCATATCCATTAGAG

5S-sgRNA-UR:TGATGACGCTTGGAGACGCTGGTGTTTCGTCCTTTCATACAACAG

sgRNA-DF:CCAGCGTCTCCAAGCGTCATCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

sgRNA-DR:CTGCTGTCTCGGCTGAGGTCTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC

使用试剂配方为：

原生质体转化缓冲液：

转化液S1：1.2M山梨醇，0.1M KH₂PO₄，pH调至8.0。

转化液S2：1M山梨醇，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH调至7.5。

转化液S3：25％(w/v)PEG6000，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH调至7.5。

以上转化缓冲液均需灭菌备用。

转化上层培养基(/L)：山梨醇182g、葡萄糖10g、柠檬酸三钠二水3g、(NH₄)₂SO₄6g、MgSO₄·7H₂O 1g、KH₂PO₄10g、琼脂糖0.6％、10000×微量元素母液100μL。115℃灭菌30min。

转化下层培养基(/L)：葡萄糖10g、柠檬酸三钠二水3g、(NH₄)₂SO₄6g、MgSO₄·7H₂O1g、1.2％(w/v)琼脂粉、10000×微量元素母液100μL。115℃灭菌30min。

原生质体的制备方法为：

1)倒PDA平板，等其凝固后铺上一层玻璃纸(灭菌)，然后吸取100μL(约10⁷)新鲜的孢子悬液加到玻璃纸上，均匀涂布后，30℃静置培养12-15h。待玻璃纸上面长出菌丝，玻璃纸由透明转变成半透明。

2)菌丝裂解液配制。在超净台中称取适量的裂解酶加入到转化液S1中，充分溶解后得到5‰(w/v)的菌丝裂解液。

3)菌丝裂解。吸取2.5mL菌丝裂解液加入到无菌平板中，然后将带有菌丝的玻璃纸放到装有裂解液的平板中，长有菌丝的一面朝上，玻璃纸与玻璃纸之间加有2.5mL的菌丝裂解液，最后一层玻璃纸长有菌丝的一面朝下，之后将培养皿用封口膜封好，将平板置于30℃条件下，裂解1h。

4)原生质体的获取。将装有裂解后菌丝的平板取出，用镊子将菌丝从玻璃纸上刮入裂解液中，然后用转化液S1冲洗玻璃纸上残余菌丝。

5)用灭菌的放有5层擦镜纸的漏斗过滤裂解液，将得到的滤液移入50mL离心管中，4℃，2500rpm，离心10min。

6)离心完成后，弃上清，用5mL预冷的转化液S2缓慢吹打使沉淀重悬，4℃，2500rpm离心10min。

7)保留200μL上清体系，缓慢吹打使沉淀重悬，置于冰上备用，即为原生质体。

8)取样在显微镜下镜检，可以看到呈圆形、半透明的原生质体。

原生质体的转化方法为：

1)依次加入200μL原生质体，6μL XYR1突变体部分编码基因片段，6μL编码SpCas9和上述引导RNA并携带尿嘧啶营养缺陷型回补基因pyrG的质粒，以及25μL转化液S3，用移液器缓慢混匀以上组分，放置于冰上反应20min。

2)将加热好的下层培养基倒入平板中，冷却凝固。

3)冰上反应结束后，向反应体系中加入2mL转化液S3，轻轻晃动离心管使溶液充分混匀，室温静置5min。加入2mL转化液S2并充分混匀，终止反应。

4)微波炉加热融化转化上层培养基，待其冷却至50℃左右时，将转化体系转移至上层培养基中混匀，倒入提前准备好的加有下层培养基的平板中。待转化上层凝固后，用封口膜封住平板，30℃静置培养5至7天，即可得到转化子。

里氏木霉转化子的鉴定：

将得到的转化子在筛选培养基平板上划线，纯化单孢形成的菌落，然后小量提取里氏木霉基因组DNA。

里氏木霉基因组DNA提取的方法：

1)从筛选培养基的菌落中取适量孢子或菌丝接入装有800μL液体种子培养基的1.5mL离心管中，200rpm，30℃，培养24至36h。

2)之后在12000rpm，4℃，离心10min，吸干液体培养基。

3)加入适量石英砂涡旋振荡2min，加入500μL基因抽提缓冲液涡旋振荡2min；65℃水浴10min。

4)加入200μL 10M乙酸铵，颠倒混匀，冰浴10min，12000rpm，4℃，离心10min。

5)收集上清至新的1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后-20℃放置20min，12000rpm，4℃，离心10min，弃上清。

6)加入200μL 70％乙醇洗涤沉淀，加入30μL ddH₂O溶解沉淀，-20℃储存。

使用引物对donor-UYF/donor-UYR和引物对donor-DYF/donor-DYR扩增并进行DNA电泳，确认转化子基因组的XYR1编码区域被突变体编码基因片段所替换。正确替换的转化子能够扩增到长度分别为1.7kb及1.0kb的条带，而出发株及XYR1编码区域未被替换的转化子扩不出条带。

转化子鉴定使用的引物序列为：

donor-UYF:CCGTCGGCGAGGAGCAAGGTCTG

donor-UYR:CATGGCGCCGTGCTGTCAGTCAG

donor-DYF:GGTCTGACTGACAGCACGGCGC

donor-DYR:CACTTGACTTGCGCTTTCGGGG

对于XYR1编码区域成功被突变体编码基因片段所替换的转化子，使用引物donor-UYF和donor-DYR扩增基因组片段，将所得片段使用873-YF引物进行测序，发现第873位丙氨酸对应的密码子GCT突变为多种其他密码子，与预期相符。

引物序列为：

873-YF:CATGACGGAGAGCGAGATCCAG

实施例3：XYR1编码基因突变菌株胞外蛋白产量的评价与突变体基因序列测定

将实施例2中得到的调控蛋白XYR1编码基因突变菌株的孢子接种到种子培养基中，终浓度为10⁶/mL，200rpm，30℃培养30至36h，吸取10％(v/v)种子培养液转接于装有50mL纤维素培养基的300mL摇瓶中，200rpm，30℃培养120h。取发酵液，经12000rpm，4℃离心10min后，使用Bradford方法测定上清液中的蛋白质浓度，并与出发株QMP进行比较。

纤维素培养基的配方为(/L)：微晶纤维素20g、CaCl₂ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、KH₂PO₄5g、(NH₄)₂SO₄ 5g、玉米浆20g。115℃灭菌30min。

从多株第873位丙氨酸对应的密码子发生突变的转化子菌株中，挑选到一株胞外蛋白浓度与出发株相比提高61％的转化子，提取基因组DNA后，使用引物donor-UYF和donor-DYR扩增，将所得片段使用873-YF引物进行测序，发现第873位丙氨酸对应的密码子GCT突变为TAC，编码酪氨酸。

引物序列为：

donor-UYF:CCGTCGGCGAGGAGCAAGGTCTG

donor-DYR:CACTTGACTTGCGCTTTCGGGG

873-YF:CATGACGGAGAGCGAGATCCAG

所得到的突变体为里氏木霉木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1的突变体，该突变体命名为A873Y，是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的调控蛋白XYR1的第873位氨基酸由丙氨酸突变为酪氨酸形成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码A873Y的基因核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。所得到的含有该突变体的里氏木霉菌株也命名为A873Y。

实施例4：XYR1突变体A873Y表达菌株在纤维素培养基中的产酶能力测定

将实施例3中得到的里氏木霉菌株A873Y的孢子接入种子培养基培养，然后按照实施例3所述方法转入纤维素培养基，定时取发酵液，经12,000rpm，4℃离心10min后测定上清液中的酶活力，并与出发株QMP进行比较。

在纤维素培养基中培养168h后，表达XYR1突变体A873Y的重组菌株A873Y发酵上清液的木聚糖酶活力为2900.0U/mL，是出发菌株QMP的8.9倍(图1)。此时，A873Y发酵上清液的β-木糖苷酶活力和α-阿拉伯呋喃糖苷酶分别达到20.6U/mL和3.0U/mL，分别是出发菌株的102.1倍和6.7倍(图1)。以上结果说明，XYR1的A873Y氨基酸突变显著提升了纤维素培养基上木聚糖降解相关的半纤维素酶的表达。

在纤维素培养基中培养168h后，A873Y发酵上清液的纤维二糖水解酶活力为出发株QMP的1.45倍，滤纸酶活力提升幅度较小，胞外蛋白浓度提升42％(图2)。以上结果说明，XYR1的A873Y氨基酸突变对纤维素培养基上纤维素酶的表达也具有促进作用。

实施例5：XYR1突变体A873Y表达菌株在葡萄糖培养基中的产酶能力测定

按照实施例3所述方法，将里氏木霉菌株A873Y的孢子接入种子培养基后，转入葡萄糖培养基，培养120h后取发酵液，经12,000rpm，4℃离心10min后测定上清液中的酶活力，并与出发株QMP进行比较。

葡萄糖培养基的配方为(/L)：葡萄糖20g、CaCl₂ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、KH₂PO₄ 5g、(NH₄)₂SO₄ 5g、玉米浆20g。115℃灭菌30min。

在葡萄糖培养基中培养120h后，表达XYR1突变体A873Y的重组菌株A873Y发酵上清液的木聚糖酶活力和β-木糖苷酶活力分别为445.4U/mL和1.6U/mL，而出发株QMP发酵上清液中几乎检测不到上述酶活力(图3)。以上结果说明，XYR1的A873Y氨基酸突变实现了木聚糖降解相关的半纤维素酶的持续激活表达。同时，A873Y发酵上清液的纤维二糖水解酶活力和滤纸酶活力与出发株相比也表现出显著提升(图4)。

对等体积发酵上清液的SDS-PAGE分析显示，纤维素培养基上A873Y发酵上清液中多种蛋白的含量与出发株QMP相比呈现明显提升；在葡萄糖培养基上，出发株胞外蛋白很少，而A873Y发酵上清液中含有多条与纤维素培养基上诱导出的蛋白位置相同的条带(图5)。以上结果进一步说明，XYR1的A873Y氨基酸突变实现了半纤维素酶、纤维素酶的诱导强化及持续激活表达。

总的来说，表达XYR1突变体A873Y的重组菌株不仅提升了诱导条件下木质纤维素降解酶的产量，而且突破了葡萄糖对木质纤维素降解酶表达的阻遏作用，这使得在工业发酵过程中通过流加葡萄糖等可溶性碳源生产木质纤维素降解酶成为可能，对于提高木质纤维素降解酶产量、降低生产成本具有重要意义。

Claims

1.一种真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体，其特征在于：所述突变体命名为A873Y，是将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的野生型调控蛋白XYR1的第873位氨基酸由丙氨酸突变为酪氨酸得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种编码权利要求1所述的真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体的基因，其特征在于：所述调控蛋白XYR1突变体A873Y基因的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.权利要求1所述真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体在实现半纤维素酶、纤维素酶的诱导强化及持续激活表达中的应用。

4.权利要求1所述真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体在突破葡萄糖对半纤维素酶、纤维素酶表达的阻遏作用中的应用。

5.权利要求1所述真菌木质纤维素降解酶合成调控蛋白XYR1突变体在生产半纤维素酶、纤维素酶中的应用。

6.一种重组真菌菌株，其特征在于：所述重组真菌菌株是由权利要求2所述的编码基因转化里氏木霉制得。

7.权利要求6所述重组真菌菌株在验证半纤维素酶、纤维素酶的诱导强化及持续激活表达中的应用。

8.权利要求6所述重组真菌菌株在生产半纤维素酶、纤维素酶中的应用。