CN116813627A - 一种天赐霉素类似物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种6‑烷氧基取代的天赐霉素类似物及其制备方法及其抗肿瘤应用。所述天赐霉素类似物的结构式如下：其中，R1为C1‑C6烷基。本发明中天赐霉素类似物是通过在天赐霉素A的6‑OH进行烷基化修饰得到的。本发明中的天赐霉素类似物针对正常细胞与两种肿瘤细胞A549，KPL‑4选择性提高，与天赐霉素A相比具有更大的治疗窗口。

Description

一种天赐霉素类似物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种6-烷氧基取代的天赐霉素类似物的制备方法及其抗肿瘤应用。

背景技术

烯二炔是迄今已知最为有效的细胞毒性小分子之一，具有独特的作用机制，可以通过引起DNA单链或双链断裂的方式，抑制肿瘤细胞中的DNA合成和复制。然而，由于单独使用时缺乏对肿瘤细胞的选择性杀伤，因此其临床应用受到了极大地限制。

蒽醌骈合型烯二炔包含一个蒽醌结构单元与一个十元环烯二炔结构单元(图1)。蒽醌结构单元在其与DNA的相互作用和生物活性中扮演着重要的角色。由于其结构简单且具有作为抗体偶联药物弹头分子的潜力，蒽醌骈合型烯二炔引起了广泛关注。自从1989年，第一个蒽醌骈合烯二炔Dynemicin(DYN)被发现以来，先后有Uncialamycin(UCM，2)/Tiancimycin(TNMs，3–5，9)/Yangpumicin(YPMs，6–8)和Sealutomicin(10)被发现(图1)。其中，天赐霉素A正在被积极研究，有望成为抗体偶联药物的弹头分子。但目前天赐霉素虽然对于肿瘤细胞有较好的抑制作用，但对正常细胞也存在较大的毒性，因此限制了其在药物上的应用。

发明内容

本发明旨在提供一种天赐霉素类似物，提供该化合物对肿瘤细胞的相对毒性。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种天赐霉素类似物，其结构式如下：

其中，R1为C1-C6烷基。

在其中一个优选的实施例中，R1为C1-C3烷基。

本发明还要求保护所述天赐霉素类似物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将天赐霉素A溶解后，加入碱性催化剂和亲电试剂；搅拌过夜；

S2、除去催化剂和溶剂，再重溶所得固体，经纯化，得到所述天赐霉素类似物；

所述亲电试剂为5-甲基-5H-二苯并[b,d]噻吩-5-鎓三氟甲磺酸盐、碘甲烷或(CH₃)₂SO₄。

本发明中，碳酸钾作为碱，与酚羟基化合物发生酸碱中和反应，生成酚羟基负离子，酚羟基负离子与亲电试剂发生亲电取代，得到烷基化产物。

在其中一个优选的实施例中，所述亲电试剂为5-甲基-5H-二苯并[b,d]噻吩-5-鎓三氟甲磺酸盐。

虽然5-甲基-5H-二苯并[b,d]噻吩-5-鎓三氟甲磺酸盐、碘甲烷和(CH₃)₂SO₄均能作为亲电试剂完成本发明的反应过程，但6-甲基-5H-二苯并[b,d]噻吩-5-鎓三氟甲磺酸盐具有与CH₃I和(CH₃)₂SO₄显著不同的反应性，取决于不同的空间阻碍离去基团。当使用CH₃I和(CH₃)₂SO₄时，会生成多个甲基取代产物，比如26-OH，17-OH，13-OH和6-OH烷基化产物。而使用甲基-5H-二苯并[b,d]噻吩-5-鎓三氟甲磺酸盐时仅生成6-OH烷基化产物，因此选择性更高，产率更高。

在其中一个优选的实施例中，天赐霉素A和催化剂的摩尔比为1:(1-3)。

在其中一个优选的实施例中，天赐霉素A和亲电试剂的摩尔比为1:(1-3)。

在其中一个优选的实施例中，天赐霉素A溶解在溶剂中。

在其中一个优选的实施例中，所述溶剂为乙腈、二氯甲烷/水＝20/1的混合溶剂、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯中的一种或多种。

本发明中，酚羟基的亲电取代反应需要适当的碱，这类反应需要在均相体系中进行，因此溶剂的选择是非常重要的。一般来说，反应需要选择非加氢溶剂并且需要全部的反应物可溶于反应溶剂，以保证反应的进行。根据本发明的反应体系，溶剂可以使用乙腈、二氯甲烷/水＝20/1的混合溶剂、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯中的一种或多种。

在其中一个优选的实施例中，通过过滤除去催化剂，通过减压蒸馏除去溶剂。

在其中一个优选的实施例中，所述催化剂为K₂CO₃、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯(DBN)、碳酸铯中任意一种。

本发明的反应需要碱作为催化剂，但是强碱会导致天赐霉素的环氧乙烷开环，然后烯二炔药效团发生bergman环化变质，失去药效，所以本发明的反应只能用K₂CO₃、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯(DBN)、碳酸铯中任意一种的碱，碱性程度合适，既能催化反应，也不会导致开环。

在其中一个优选的实施例中，所述重溶为用少量乙腈重溶固体。

在其中一个优选的实施例中，所述纯化为通过半制备HPLC纯化。

在其中一个优选的实施例中，步骤S2中，粗产物通过半制备HPLC在AQ-C18柱上使用等度MeCN(50％)/H₂O(50％)的溶剂系统纯化，得到纯度大于95％的天赐霉素类似物3b。

在其中一个优选的实施例中，所述步骤S2后还包括检测，所述检测包括高分辨质谱、核磁共振、高效液相色谱分析。

本发明进一步地提供所述天赐霉素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述肿瘤包括治疗鳞状上皮细胞癌，包括鳞状上皮细胞癌、皮肤癌、头颈部癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、阴道癌、阴茎癌、恶性淋巴瘤、脑瘤、甲状腺癌、生殖细胞瘤、恶性黑色素瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌及消化道肿瘤。

在其中一个优选的实施例中，所述肿瘤包括肺癌细胞系Jurkat、乳腺肿瘤细胞系KPL-4、急性T细胞白血病细胞系Jurkat。

下面对本发明做进一步的解释：

本发明提供了一种天赐霉素类似物，具体是通过对天赐霉素A的6-OH进行烷基化修饰得到的新的天赐霉素类似物；同时发现天赐霉素类似物使肿瘤细胞的生存能力大大降低，具有有效的杀死多种类型的肿瘤细胞系的能力。此外，化合物天赐霉素类似物对正常细胞的IC₅₀值是对KPL-4及Jurkat细胞的60倍，这种比天赐霉素及其类似物更高的选择性带来了更大的治疗窗口。在体内的抗肿瘤活性评价中，天赐霉素类似物表现出优异的体内抗肿瘤活性及很小的系统毒性。

本发明的天赐霉素类似物与现有的含有蒽醌骈合烯二炔结构的化合物相比具有如下明显的优势：

本发明中的天赐霉素类似物针对正常细胞与两种肿瘤细胞A549，KPL-4选择性提高，与天赐霉素A相比具有更大的治疗窗口。

附图说明

图1为过去三十年中发现的天然蒽醌骈合型烯二炔；

图2为3b高分辨质谱图；

图3为3b核磁共振氢谱；

图4为3b核磁共振碳谱；

图5为天赐霉素A和两种不同剂量的3b抑制肿瘤生长的情况；

图6为天赐霉素A和两种不同剂量的3b的血液常规检测结果；

图7为天赐霉素A和两种不同剂量的3b的器脏HE染色结果1；

图8为天赐霉素A和两种不同剂量的3b的器脏HE染色结果2。

具体实施方式

以下将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

天赐霉素类似物的制备

将天赐霉素A(4.8mg，0.01mmol)溶于2mL乙腈中，加入K₂CO₃(2.8mg，0.02mmol)和5-甲基-5H-二苯并[b,d]噻吩-5-鎓三氟甲磺酸盐(7.0mg，0.02mmol)，在室温下反应过夜。过滤除去K₂CO₃，减压蒸馏除溶剂，用少量乙腈重溶。粗产物通过半制备HPLC在AQ-C18柱上使用等度MeCN(50％)/H₂O(50％)的溶剂系统纯化，得到天赐霉素衍生物(4.0mg，收率＝80％)。

化合物的分析：

将天赐霉素衍生物进行分析，HRMS谱在LTQ-ORBITRAP-ETD仪器上记录。使用Brucker，500MHz质谱仪获得NMR谱。对于¹³C NMR谱，DMSO-d₆(δ＝40.0ppm)，对于¹H NMR于DMSO-d₆(δ＝3.40ppm)的ppm报告化学位移。得到结果如图2-图4所示:HRMS(ESI)m/z calcdfor C₂₈H₂₂NO₈,[M+H]⁺＝500.1345；Found:500.1335.¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ13.21(s,1H),9.85(s,1H),8.47(s,1H),8.07(d,J＝8.7Hz,1H),7.53(d,J＝8.9Hz,1H),6.05(d,J＝9.9Hz,1H),5.97(d,J＝9.9Hz,1H),5.16(s,1H),5.03(s,1H),4.31(s,1H),3.97(s,3H),3.82(s,3H),1.31(d,J＝6.4Hz,3H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ186.5,183.2,159.9,149.4,143.2,135.6,130.1,129.5,129.2,127.9,126.0,124.8,124.4,123.7,117.2,112.8,112.6,101.0,99.5,90.1,87.9,76.6,64.2,63.5,60.9,56.9,43.7,22.4.

结构分析说明：

天赐霉素衍生物通过全面的结构分析进行了完整的结构表征。由图2-图4可知，高分辨质谱(HRMS)分析得到天赐霉素衍生物的[M+H]⁺分子离子峰(m/z)为500.1335，与其标准分子式C₂₈H₂₁NO₈([C₂₈H₂₁NO₈+H]⁺，分子量为500.1345)的数值一致。¹H与¹³C核磁共振谱(NMR)，以及二维NMR的联合分析表征天赐霉素衍生物结构部分。结合¹H和¹³C以及2D谱进一步确认其结构。通过对其进行分离和结构鉴定(天赐霉素衍生物中H-8和6-OCH₃与C-6的强HMBC相关性支持甲氧基取代位置是C6)。

从而确定天赐霉素衍生物的结构式如下所示：

以下命名为3b。

实施例2

体外抗肿瘤活性测试

肿瘤是人类面临的重大健康问题之一，其发生率和死亡率对人类健康造成了严重威胁。2020年，全世界确诊的肿瘤病例估计为1929万例，其中，中国确诊病例为456.9万例，死亡病例为300.3万例，均位居全球第一。虽然包括手术、放疗和药物治疗在内的各种治疗策略已经发展成更精密、更精确的肿瘤治疗方法，但与肿瘤相关的死亡人数并没有明显下降。在本发明公开内容中，3b具有有效的杀死多种类型的肿瘤细胞系的能力。

现对本发明的3b和天赐霉素A及其类似物列举3种不同类型的人肿瘤细胞系：包括肺癌细胞系A549、乳腺肿瘤细胞系KPL-4、急性T细胞白血病细胞系Jurkat的体外抗肿瘤活性以及人类正常细胞系NCM460细胞毒性。NCM460细胞和Jurkat细胞在RPMI 1640培养基中培养，A549细胞和KPL-4细胞在DMEM培养基中培养。所有培养基均添加10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素。所有测试细胞在37℃和5％的湿化CO₂中孵育。用CCK-8法测定细胞活力。实验流程简单地说，将细胞接种于96孔板(每孔5×10³个细胞)中，稳定24h，然后用100μL含有不同浓度药物的培养基处理细胞。孵育72h后，每孔加入10μL CCK-8试剂，37℃，孵育0.5–2h。用酶标仪(Spark 10M Tecan,Grodig,Austria)在450nm处测定吸光度，评价细胞活力。用倒置荧光显微镜(DMIL-LED,Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)观察荧光，测定活细胞活力。IC₅₀值使用PRISM^TM软件，8.0版(GraphPad software,La Jolla,CA,USA)确定。

表1天赐霉素A及其类似物对正常细胞的IC₅₀与肿瘤细胞IC₅₀的比值

从数据的整体来看，3b针对所列举的3种肿瘤细胞系的细胞毒性达到纳摩尔级，说明可以有效杀死肿瘤细胞。尤其需要注意的是，与正常细胞NCM460(IC₅₀＝6.0nM)毒性相比，3b对两种肿瘤细胞Jurkat(IC₅₀＝0.1nM)，KPL-4(IC₅₀＝0.1nM)表现出较好的选择性杀伤，毒性相差60倍。而天赐霉素A针对正常细胞的毒性与两种肿瘤细胞Jurkat，KPL-4毒性相差仅有4和10倍，天赐霉素A及其衍生物对正常细胞的毒性明显大于3b，其选择性也明显差于3b。另外，C6位的乙氧基和丙氧基取代的天赐霉素类似物的相对毒性也明显优于天赐霉素A，其为25-50倍不等。

实施例3：3b和天赐霉素A体内抗乳腺癌活性评价

实验过程：6周龄无特定病原体(SPF)级雌性ICR小鼠，体重(25±2g)。所有小鼠均饲养在SPF级动物室内，环境温度为26℃，相对湿度为50％，光/暗周期为12h。从BALB/c裸鼠眼眶静脉采血，制备新鲜血清进行溶血分析。将5×10⁶个KPL-4细胞(50μLPBS+50μLMatrigel[BD Biocoat])接种于BALB/c裸鼠右侧腋下皮下，建立裸鼠皮下荷瘤模型。当每只BALB/c裸鼠肿瘤体积达到约100mm³时，将裸鼠随机分为4组(n＝5)：空白对照组(0.9％生理盐水)、药物组(天赐霉素A，0.05mg/kg)，3b药物低剂量组(3b，0.05mg/kg)、3b药物高剂量组(3b，0.2mg/kg)。两次给药间隔七天。

从给药时间开始每天测量肿瘤的长度(a)和宽度(b)。通过以下公式计算肿瘤体积V：V＝1/2ab²。最后，给药第14天后，处死所有BALB/c裸鼠，剥离出实体肿瘤，称重并照相记录。分离心，肝，脾，肺，肾、收集血液，然后置于10％中性甲醛固定制备石蜡切片供组织学检查(HE染色)，其余组织放入-80℃冷冻冰箱中保存备用。并将血液用于炎性分析，采用型号为迈瑞BC-2800vet的三分类血球仪分析。

HE染色的试验过程如下：

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。

2、苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。

3、伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。

4、脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。

5、显微镜镜检，图像采集分析。

染色后细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。

结果表明：通过皮下KPL-4人乳腺肿瘤异种移植研究的抗肿瘤活性。3b的注射剂量为0.2或0.05mg/kg。结果显示0.05mg/kg天赐霉素A和两种不同剂量的3b均有不同程度的抑制肿瘤生长的效果，其中3b(0.2mg/kg)对肿瘤的抑制作用最强，0.05mg/kg天赐霉素A和0.05mg/kg的3b组的肿瘤体积没有统计学差异。天赐霉素A在给药后导致小鼠体重的下降，然而，3b无论是高剂量还是低剂量对小鼠体重几乎没有影响，与生理盐水组之间没有统计学差异(图5)。脏器及血液常规检测结果显示，除了单核细胞(Mono)和中性粒细胞(Gran)轻微异常外，所有组的其他指标均在正常范围内。其中包括生理盐水组，TNM A(0.05mg/kg)和3b(0.2mg/kg)在内的三组小鼠出现了单核细胞(Mono)和中性粒细胞(Gran)轻微异常，表明炎症反应的发生(图6)。此外，各个脏器的HE染色结果表明，所有小鼠的脏器均无明显损伤(图7和图8)。

0.05mg/kg的C6位的乙氧基和丙氧基取代的天赐霉素类似物对肿瘤也有明显的抑制作用。

以上实验结果表明：天赐霉素类似物针对正常细胞与两种肿瘤细胞Jurkat和KPL-4选择性提高，与TNM A相比具有更大的治疗窗口，因此，该化合物作为有效的抗肿瘤化合物更有应用前景。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本实施例的各种等价形式的修改均落入本发明所附权利要求所限定的范围。

Claims (10)

1.一种天赐霉素类似物，其特征在于，其结构式如下：

其中，R1为C1-C6烷基。

2.根据权利要求1所述的天赐霉素类似物，其特征在于，R1为C1-C3烷基。

3.根据权利要求1所述的天赐霉素类似物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将天赐霉素A溶解后，加入碱性催化剂和亲电试剂；搅拌过夜；

S2、除去催化剂和溶剂，再重溶所得固体，经纯化，得到所述天赐霉素类似物；

所述亲电试剂为5-甲基-5H-二苯并[b,d]噻吩-5-鎓三氟甲磺酸盐、碘甲烷或(CH₃)₂SO₄。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，天赐霉素A和催化剂的摩尔比为1:(1-3)；

天赐霉素A和亲电试剂的摩尔比为1:(1-3)。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，天赐霉素A溶解在溶剂中。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为乙腈、二氯甲烷/水＝20/1

的混合溶剂、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯中的一种或多种。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂为K₂CO₃、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯(DBN)、碳酸铯中任意一种。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纯化为通过半制备HPLC纯化；优选的，步骤S2中，粗产物通过半制备HPLC在AQ-C18柱上使用等度MeCN(50％)/H2O(50％)的溶剂系统纯化，得到纯度大于95％的天赐霉素类似物3b。

9.根据权利要求1所述的天赐霉素类似物在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括治疗鳞状上皮细胞癌，包括鳞状上皮细胞癌、皮肤癌、头颈部癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、阴道癌、阴茎癌、恶性淋巴瘤、脑瘤、甲状腺癌、生殖细胞瘤、恶性黑色素瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌及消化道肿瘤。