CN116807971A - 一种克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏及其制备方法和应用，所述红霉素胶束型软膏由脂溶性酸改性的葡聚糖、红霉素、亲水凝胶基质材料和水组成；其中，脂溶性酸改性的葡聚糖与红霉素质量比为1∶1‑1∶10。本发明有效解决了红霉素对红霉素耐药菌的杀灭，并且也可有效减少非耐药菌的耐药现象的发生。

Description

一种克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏及其制备方法和应用。

背景技术

红霉素是一种大环内酯类抗生素。红霉素软膏常用于治疗由细菌引起的轻中度皮肤及软组织感染。随着药物使用频率的增加，红霉素的耐药问题也日趋严重。为了解决红霉素的耐药问题，研究者们陆续开发出了第二代大环内酯类抗生素，如罗红霉素、阿奇霉素，以及第三代大环内酯类抗生素，如泰利霉素和喹红霉素。

但是考虑到新型抗生素的研发速度远远不及耐药菌的产生速度，更有效地利用现有抗生素抵抗耐药菌株，可能是解决抗生素耐药问题的良好途径。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。

本发明提供了如下技术方案：一种克服红霉素多药耐药的新型红霉素胶束型软膏的制备，其包括，

疏水改性葡聚糖胶束的制备：将脂溶性酸溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，加入二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，搅拌过夜，DCC、DMAP与脂溶性酸的投料摩尔比为脂溶性酸∶DCC∶DMAP＝1∶1.5∶1.5；向反应体系中加入葡聚糖，室温搅拌反应24小时；反应结束后，将反应产物透析72小时，离心取上清液冷冻干燥，即得疏水改性葡聚糖。

载红霉素的疏水改性葡聚糖胶束型软膏的制备：称取适量疏水改性葡聚糖溶解于水，将溶解红霉素的热乙醇溶液滴入上述溶液，搅拌均匀后，加入羧甲基纤维素钠溶胀溶解后，即得载红霉素的疏水改性葡聚糖胶束型软膏。

作为本发明所述的一种克服红霉素多药耐药的新型红霉素胶束型软膏的制备的优选方法，所述的脂溶性酸包括十二碳酸、硬脂酸、维甲酸，其中优选维甲酸。

作为本发明所述的一种克服红霉素多药耐药的新型红霉素胶束型软膏的制备的优选方法，所述的葡聚糖分子量范围为1000-20000Da，其中优选分子量为1000Da。

作为本发明所述的一种克服红霉素多药耐药的新型红霉素胶束型软膏的制备的优选方法，所述的脂溶性酸与葡聚糖的连接摩尔比为1∶18.3-1∶4.3，优选连接比例为1∶1。

作为本发明所述的一种克服红霉素多药耐药的新型红霉素胶束型软膏的制备的优选方法，所述的红霉素与疏水改性葡聚糖的质量比为0.01-0.1，优选质量比为0.02。

本发明的有益效果：本发明有效解决了红霉素对红霉素耐药菌的杀灭，并且也可有效减少非耐药菌的耐药现象的发生。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为各种疏水改性葡聚糖的临界胶束浓度。

图2为葡聚糖分子量对疏水改性葡聚糖的临界胶束浓度的影响。

图3为维甲酸与葡聚糖单体连接比例对红霉素溶解度的影响。

图4为新型红霉素胶束型软膏的外观照片。

图5为红霉素耐药的金黄色葡萄球菌的诱导结果

图6为维甲酸连接比例对新型红霉素胶束型软膏对红霉素耐药的金黄色葡萄球菌的MIC影响

图7为葡聚糖分子量对新型红霉素胶束型软膏对红霉素耐药的金黄色葡萄球菌的MIC影响

图8为维甲酸改性葡聚糖与红霉素的质量比对新型红霉素胶束型软膏对红霉素耐药的金黄色葡萄球菌的MIC影响

图9为新型红霉素胶束型软膏对非耐药的金黄色葡萄球菌耐药性的诱导结果

图10为新型红霉素软膏对金黄色葡萄球菌的亲和性实验结果。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1：

疏水改性的葡聚糖的制备：将维甲酸溶解于二甲基亚砜(DMSO，100mM)中，加入二环己基碳二亚胺(DCC，150mM)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，150mM)，搅拌过夜；向反应体系中加入葡聚糖(80mg/mL，单体浓度为500mM)，室温搅拌反应24小时；反应结束后，将反应产物透析72小时，离心取上清液冷冻干燥，即得维甲酸改性葡聚糖。

维甲酸改性的葡聚糖的核磁共振图谱中，葡聚糖的特征吸收峰位于2.5、4.5、4.7、4.9和5.2ppm。维甲酸位于12ppm处可见明显的羧基特征峰。在维甲酸改性葡聚糖图谱中，同时可见葡聚糖和维甲酸的特征峰，并且维甲酸的羧基峰消失，表明维甲酸羧基与葡聚糖羟基形成了酯键连接。通过对最终产物中1.2ppm的来自维甲酸的六元环上甲基碳氢伸缩振动峰与3.3ppm的来自葡聚糖的亚甲基碳氢伸缩振动峰的丰度计算，在实施例1投料比条件下，维甲酸与葡聚糖单体连接的比例为1：10.4。

实施例2：

临界胶束浓度的测定：

将等体积的6.0×10^-7mol/L芘的丙醇溶液加到一系列10ml的西林瓶中，避光放置24h使丙酮完全挥发，加入1mL不同浓度、浓度范围为0.006到6mg/mL的维甲酸改性葡聚糖，使每个瓶中芘的最终浓度均为6.0×10^-7mol/L，涡旋震荡混合1min、超声5min后，使用F-4600荧光分光光度计测试芘的激发光谱，温度为25℃，最大发射波长为200nm，狭缝宽度为10nm，扫描速度为1200nm/min。图1为不同维甲酸改性葡聚糖浓度下芘的荧光强度，结果表明实施例1中维甲酸改性葡聚糖的荧光强度为0.06mg/mL。

实施例3：

葡聚糖分子量对改性葡聚糖的临界胶束浓度的影响：

改变实施例1中葡聚糖分子量，进而测定维甲酸改性的葡聚糖的临界胶束浓度，结果见图2。结果显示在1000-20000Da的分子量范围内，随着葡聚糖分子量的提升，维甲酸改性葡聚糖的临界胶束浓度值也不断升高。为了获取更低的临界胶束浓度，我们优选目前可得到的分子量最低的葡聚糖(分子量为1000Da)进行改性。

维甲酸与葡聚糖连接比例对改性葡聚糖的临界胶束浓度的影响：改变实施例1中葡聚糖的投料量，可对维甲酸与葡聚糖连接的比例进行调整。如表1所示，将投料中维甲酸与葡聚糖(按单体计算)摩尔比由1∶20提高到5∶1时，可得到二者连接比例介于1∶34和1∶1.2的改性葡聚糖。当二者连接摩尔比低于1∶18.3时，产物由于亲水性过强无法形成胶束；当二者连接摩尔比高于1∶1.5时，由于大量疏水基的引入，改性葡聚糖无法溶解于水。因此采用维甲酸对葡聚糖进行改性修饰时，二者连接比例介于1∶18.3和1∶4.3之间，并且在此范围内提高维甲酸的连接比例可有效降低产物的临界胶束浓度。

表1维甲酸与葡聚糖的连接比例对改性葡聚糖的临界胶束浓度的影响

实施例4：

配制20mg/mL的实施例3制备的不同的维甲酸改性葡聚糖胶束溶液，向其中加入加入100mg红霉素粉末，振摇24小时后，过0.22微米的微孔滤膜，测定体系中红霉素溶解度。图3显示随着改性葡聚糖中维甲酸连接比例的提高，改性葡聚糖对红霉素的增溶作用逐渐增强，这可能是由于维甲酸比例的提高为红霉素提供了更大的疏水性增溶空间。

实施例5：

新型红霉素胶束型软膏的制备：

称取200mg实施例1所述维甲酸改性葡聚糖溶解于5mL去离子水，将0.5mL红霉素的热乙醇溶液(红霉素浓度200mg/mL，50℃)滴入上述溶液，搅拌均匀后，加入0.2g羧甲基纤维素钠溶胀溶解后，加水补足总重至10g，即得均匀的半透明状载红霉素的疏水改性葡聚糖胶束型软膏(图4)。

实施例6：

红霉素耐药的金黄色葡萄球菌的诱导：

采用含不同浓度的红霉素(0.09、O.17、0.35、0.75、1.5、3、6、12、24、48和72μg/mL)的琼脂培养基培养金黄色葡萄球菌，选择在最高红霉素浓度的培养基上生长的多个单菌落，测量它们对红霉素的最小抑菌浓度(MIC)，然后将这些菌株在更高的红霉素浓度范围的琼脂培养基中培养，并再次选择最高浓度红霉素培养基中生长的菌落，重复此过程，直至金黄色葡萄球菌对红霉素的MIC大于16μg/mL，即得红霉素耐药的金黄色葡萄球菌。图5显示经过59天的耐药培养后，红霉素的MIC值升高至16μg/mL，表明金黄色葡萄球菌产生耐药性。

实施例7：

按照实施例1方法分别将维甲酸替换为十二烷酸、硬脂酸，制备十二烷酸和硬脂酸改性的葡聚糖。按照实施例5制备含1％红霉素的软膏。

采用K-B纸片法进行抑菌圈实验，取直径约为5mm滤纸片，无菌环境中将0.05g红霉素凝胶涂抹于纸片上用于抑菌圈实验。利用涂布平板法在每个琼脂板中加入0.25mL菌悬液(OD600＝0.5)，涂布均匀后放置加药烘干纸片，于37℃培养箱中培养24h后，用游标卡尺测定抑菌圈直径。表2为不同种类的疏水改性葡聚糖制备得到的红霉素软膏的抑菌圈值。结果可见未加入疏水改性葡聚糖的红霉素软膏和红霉素混悬液抑菌圈与纸片直径相同，均为5mm，表明二者对红霉素耐药的金黄色葡萄球菌无明显的抑制作用。而加入疏水改性葡聚糖后，红霉素软膏的抑菌圈均大于7mm，其中十二烷酸改性葡聚糖红霉素软膏的抑菌圈为8mm，硬脂酸改性葡聚糖红霉素软膏的抑菌圈为9mm，而维甲酸改性葡聚糖红霉素软膏的抑菌圈达14mm。

表3为不同种类的疏水改性葡聚糖制备得到的红霉素软膏对红霉素耐药的金黄色葡萄球菌的MIC值，结果与抑菌圈结果一致，以上结果同时表明对葡聚糖的疏水改性优选维甲酸。

对于敏感菌，维甲酸改性葡聚糖红霉素软膏的加入将红霉素的MIC值由0.3μg/mL提高到了0.6μg/mL，可能是由于胶束体系对红霉素与细菌的作用形成了物理屏障。

表2不同种类的疏水改性葡聚糖制备得到的红霉素软膏对红霉素耐药的金黄色葡萄球菌抑菌圈值

表3不同种类的疏水改性葡聚糖制备得到的红霉素软膏对红霉素耐药的金黄色葡萄球菌的MIC值

实施例8：

对实施例4制备得到的不同连接比例的维甲酸改性的葡聚糖按照实施例5制备红霉素软膏，测定其对红霉素的MIC值。如图6所示对于红霉素耐药的金黄色葡萄球菌，采用维甲酸与葡聚糖单体连接比例为1∶10.4的改性葡聚糖具有最低的MIC值，这可能是由于维甲酸连接过少时对红霉素的增溶作用较差，而维甲酸连接过多时，维甲酸形成的大量疏水内核对红霉素形成了稳定的包裹，一定程度减弱了红霉素与细菌的作用，这种现象在敏感菌中体现的更加明显，由1∶4.3比例的疏水改性葡聚糖制备的红霉素凝胶较其他样品具有最高的MIC值。以上结果表明维甲酸与葡聚糖单体的连接比例优选1∶10。

实施例9：

采用不同分子量的葡聚糖制备维甲酸改性的葡聚糖。图7为葡聚糖分子量对其制备得到的维甲酸改性葡聚糖红霉素软膏的抑菌MIC值。结果表明对于敏感菌和耐药菌，分子量为1000Da的葡聚糖制备得到维甲酸改性葡聚糖红霉素软膏具有最低的MIC值，这可能是由于葡聚糖分子量的增加提高了改性葡聚糖胶束的临界胶束浓度，进而影响了对红霉素的增溶作用。以上结果表明本发明公开的葡聚糖优选分子量为1000Da。

实施例10：

图8为采用不同的维甲酸改性葡聚糖与红霉素的质量比配制红霉素软膏的MIC值。由图可见在红霉素与维甲酸改性葡聚糖的质量比为1∶1-1∶10范围内，质量比为1∶2时，红霉素软膏具有最小的MIC值。其原因可能是当疏水改性葡聚糖加入量过少时，对红霉素的增溶作用会减弱，而疏水改性葡聚糖加入过多时，形成的胶束总量增加，单个胶束内的红霉素量会下降，当与细菌作用胶束量一定时，其内部红霉素量会随之下降。因此，红霉素与维甲酸改性葡聚糖的质量比优选1∶2。

实施例11：

采用实施例6所述方法，以实施例5制备的维甲酸改性葡聚糖红霉素软膏对金黄色葡萄球菌进行耐药诱导。图9为诱导结果。结果表明同红霉素原料相比，维甲酸改性葡聚糖红霉素软膏处理的红霉素耐药菌产生速度明显变慢，表明本发明公开的维甲酸改性葡聚糖红霉素软膏可有效减少红霉素使用中耐药菌的产生速度。

实施例12：

采用FITC与红霉素共搅拌过夜，制备FITC标记的红霉素。按照实施例5以维甲酸改性葡聚糖制备FITC标记的红霉素软膏。将该软膏加入红霉素耐药的金黄色葡萄球菌混悬液，作用2h后，离心分离细菌体，荧光倒置显微镜下观察。图10可见相比未加入维甲酸改性葡聚糖的FITC标记的红霉素软膏，维甲酸改性葡聚糖的加入明显提高了细菌内红霉素的荧光信号，这可能是由于细菌对于葡聚糖作为碳基类物质具有独特的摄取亲和性。并且本发明发现，相比十二烷酸或硬脂酸改性的葡聚糖，维甲酸改性的葡聚糖形成的红霉素软膏对细菌具有更高的亲和性。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏，其特征在于：所述红霉素胶束型软膏由脂溶性酸改性的葡聚糖、红霉素、亲水凝胶基质材料和水组成；其中，脂溶性酸改性的葡聚糖与红霉素质量比为1∶1-1∶10。

2.根据权利要求1所述的克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏，其特征在于：所述脂溶性酸改性的葡聚糖包括十二烷酸改性葡聚糖、硬脂酸改性葡聚糖、维甲酸改性葡聚糖中的一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏，其特征在于：所述脂溶性酸改性的葡聚糖中，脂溶性酸与葡聚糖单体接枝比例为1∶18.3-1∶4.3。

4.根据权利要求3所述的克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏，其特征在于：脂溶性酸与葡聚糖单体接枝比例为1∶10。

5.根据权利要求1或2所述的克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏，其特征在于：脂溶性酸改性的葡聚糖与红霉素质量比为1∶2。

6.根据权利要求1或2所述的克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏，其特征在于：葡聚糖的分子量为1000-20000Da。

7.权利要求1所述的克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏的制备方法，其特征在于：由以下步骤组成，将脂溶性酸改性的葡聚糖溶解于水中，滴加溶解红霉素的热乙醇溶液，搅拌均匀后，加入羧甲基纤维素钠溶胀溶解。

8.根据权利要求7所述的克服红霉素多药耐药的红霉素胶束型软膏的制备方法，其特征在于：所述脂溶性酸改性的葡聚糖，其制备方法为，将脂溶性酸溶解于二甲基亚砜中，加入DCC和DMAP，搅拌过夜，加入葡聚糖，室温搅拌反应24h，将反应产物透析，离心取上清液冷冻干燥。

9.权利要求1所述的红霉素胶束型软膏在制备抑制红霉素耐药菌的药物中的应用。