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CN116773824A - Des基因作为特异性标记基因在鉴别睾丸组织细胞类型中的应用 - Google Patents

Des基因作为特异性标记基因在鉴别睾丸组织细胞类型中的应用 Download PDF

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CN116773824A CN202310751161.3A CN202310751161A CN116773824A CN 116773824 A CN116773824 A CN 116773824A CN 202310751161 A CN202310751161 A CN 202310751161A CN 116773824 A CN116773824 A CN 116773824A
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杨世华
袁靖丽
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South China Agricultural University
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Abstract

本发明属于隐睾研究技术领域，公开了DES基因作为特异性标记基因在制备用于诊断隐睾症的产品中的应用。本研究通过这次的隐睾模型中相应的睾丸组织的表达量情况确定了这个DES作为标记基因的可行性，在后续应用中，就可以像本专利中提供的材料的第三个图中的那些标记基因一样，作为特异性Marker去分析定义其他研究中的睾丸组织里是否含有Myoid细胞。本研究采用隐睾症食蟹猴模型，利用单细胞转录组分析，探讨睾丸组织细胞中精子发生异常的分子基础，同时也为隐睾症所致男性不育的研究奠定基础，为临床治疗方案的研究提供新思路。

Description

DES基因作为特异性标记基因在鉴别睾丸组织细胞类型中的 应用
技术领域
本发明涉及隐睾研究技术领域，更具体的，涉及DES基因作为特异性标记基因在鉴别睾丸组织细胞类型中的应用。
背景技术
隐睾症是男性中最常见的生殖系统先天性异常之一，男性中约有1％～9％在出生时表现为至少有一个隐睾睾丸。隐睾症增加了男性不育、睾丸癌、生殖细胞丢失和精子发生受损的风险。30.8％的单侧隐睾患者存在少精子症；25％～89％双侧隐睾患者存在无精子症，不育者高达60％～100％。有32％的药物治疗者和46％的外科手术者发展为无精症，单方面隐睾症的无精症发生率为13％，而与患者是否接受治疗无关。目前使用腹腔镜辅助隐睾切除术或者睾丸固定术治疗隐睾。
目前有研究发现，紧密连接(TJ)相关分子的表达在人工隐睾或睾丸热处理后24～48h显著降低，而血-睾丸屏障(BTB)的通透性增加且在10d后恢复。该过程还伴随着TGF-β2和TGF-β3的表达增高，p38 MAPK和ERK/MAPK信号通路的激活。在隐睾生精过程的相关生物信息学鉴定中发现花生四烯酸途径和mTOR途径被认为是生精的重要途径，而RICTOR和GPX8被认为是参与隐睾症患者生精过程中的关键基因。但是，隐睾症的自身机制和分子通路等尚不清楚。
肌样细胞(Myoid Cell)是1996年公布的动物学名词。位于生精小管中的肌样细胞，是紧贴于生精小管基膜外的一种梭形细胞。其胞质内含有肌动蛋白微丝，能够进行节律性收缩，有助于运送精子。
精子发生是建立和维持雄性生殖的基础，精子发生异常会导致雄性不育。体细胞(睾丸间质细胞、肌样细胞和支持细胞)构成了睾丸的微环境，对于调节正常的精子发生至关重要。间质细胞是睾丸基质的重要组成部分，而管周肌样细胞是生精小管的主要细胞类型之一。
肾小管周围肌样细胞是生精小管壁的主要细胞成分，具有平滑肌样特征。一方面，肾小管周围肌样细胞可以与其他体细胞合作，协助精子发生，如：同支持细胞合作，形成生精小管中的基底层，为精原干细胞提供生态位，利于精原干细胞自我更新与维持睾丸中的干细胞池并分化为精细胞和精子；另一方面，当精子发生异常时，肾小管周围肌样细胞的结构和功能可以改变。在精子发生受损的男性中，肾小管壁的结构经常发生改变，细胞外基质沉积和肾小管周围细胞形态变化，意味着肾小管周围细胞的功能发生了根本性改变。间质细胞在精子发生过程中起到重要作用，对其的研究，有助于开发男性不育症的新治疗方法，对新的男性避孕药的开发也具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供基因DES的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
DES基因作为特异性标记基因在鉴别睾丸组织肌样细胞中的应用。
本发明通过Wilcoxon rank sum test，选择了几个细胞类型中表达显著高于其他细胞类型的基因。选取了所有细胞类型的1～2个标记基因。发现这些新的标记基因与典型标记基因同样适用。因此可以将其作为隐睾症的新的标记基因。
本发明还提供物质A在制备鉴别睾丸组织肌样细胞的功能产品中的应用，所述物质A用于检测细胞中DES的表达量。
优选的，所述物质A为抗人的重组Anti-C5a/C5a des Arg抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本研究通过这次的隐睾模型中相应的睾丸组织的表达量情况确定了这个DES作为标记基因的可行性，在后续应用中，就可以像标记基因那样，作为特异性Marker去分析定义睾丸组织里是否含有Myoid细胞。
本研究采用隐睾症食蟹猴模型，利用单细胞转录组分析，探讨睾丸组织细胞中精子发生丧失细胞的分子基础，同时也为隐睾症所致男性不育的研究奠定基础，为临床治疗方案的研究提供新思路。
附图说明
图1为经典基因标记鉴定食蟹猴睾丸中不同细胞类型；a:隐睾侧睾丸和阴囊侧睾丸组织样本的细胞UMAP分布图，CST表示两个阴囊侧睾丸组合后的所有细胞，UAT表示两个隐睾侧睾丸组合后的所有细胞，点表示细胞，颜色表示类群；b:DDX4阳性的生殖细胞，VIM阳性的体细胞，PTPRC阳性的免疫细胞，PECAM1阳性的内皮细胞；c:RGS5阳性的周细胞；d:ACTA2阳性的未分化的间质细胞；e:IGF2和INHBA阳性的肌样细胞；f:CD3D阳性的自然杀伤细胞和T细胞；g:LYZ阳性的M/DC细胞；h:INSL3和STAR阳性的间质细胞；i:SOX9和AMH阳性的支持细胞；j:VWF阳性的血管内皮细胞；k:PROX1阳性而VWF阴性的淋巴内皮细胞；l:SOHLH1、UTF1和ID4阳性的未分化的精原细胞和MKI67阳性的分化的精原细胞；m:PIWIL1和AURKA阳性的精母细胞；n:ACRV1和NME5阳性的圆形精子细胞；o:AKAP14和TNP2阳性的长形精子细胞；p:CRISP2和OAZ3阳性的精子；
图2为生殖细胞的伪时间排序，a：饼图显示了CST中6种主要生殖细胞类型的细胞群；b：逆时序分析和细胞类型的分布；c：饼图显示了UAT中4种主要生殖细胞类型的细胞群；d：在轨迹上绘制了与细胞增殖相关的标记基因MKI67；
图3为不同细胞类型的基因表达特征，其中a：每类细胞中前10个差异表达基因表达热图；b：TSNE图显示所选基因表达模式。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
一、实验动物的选择
本研究使用两只普通级生理状态良好的雄性食蟹猴，年龄为9岁和13岁。两只猴子均被单笼饲养在广东蓝岛生物技术有限公司，于每天早上十点及下午三点给予正餐，中午十二点和下午五点投喂瓜果蔬菜，自由饮水，并处于适宜温湿度控制下连续12小时交替明暗循环。在每个猴笼里都单独放置一些玩具，供实验猴消遣玩乐。所有动物程序均经广东蓝岛生物技术有限公司动物护理与使用专业委员会批准(IACUA审批同意书编号：LDACU20210310-01HE)。
二、外科手术
2只食蟹猴单侧隐睾手术均由一位经验丰富的临床兽医师完成。整个手术过程均为无菌操作。首先按0.02～0.04mL/kg的剂量肌注静灵(盐酸右美托咪定)(Dexmedetomidine HCl,Krasiv Russia Pharmaceuticals)对实验猴进行镇静处理，15min后，按5mg/kg的剂量肌注舒泰-50(#HC-DWYY-ST50，Virbac)做诱导麻醉，气管插管后使用呼吸麻醉机(#EZ-7000，E-Z Systems)进行呼吸麻醉，手术过程中异氟烷(Baxter HealthcareCorp,#153107015，GSY BIOTECHNOLOGY)浓度维持在2.5％。手术区域剃毛并用碘酒消毒，75％酒精脱碘。腹中线左侧1.5cm处开口，将左侧睾丸提至腹腔中，剪断韧带，使用5-0肠道可吸收线(Ethicon Inc,Somerville,NJ)缝合腹股沟及腹部切口，左侧睾丸为手术性隐睾，右侧睾丸保持不变用作对照。术后连续七天每天20mg/kg的剂量肌注头孢曲松钠。
三、睾丸组织取材、存储
在手术4周后，摘除隐睾和对侧正常睾丸，去除周围附属组织和脂肪，用生理盐水冲洗干净后用纱布擦干并称取睾丸的净重。之后放于加入2％双抗(#SV30010，Hyclone)的DMEM/F-12(#11330032，Gibco)培养液中，置于冰上，于15min紫外线照射过的超净台内进行睾丸组织分离和样本取材。
四、RT-PCR验证
1、NA抽提(枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶)
1)取匀浆管，加入1mL的RNA提取液，置冰上预冷。
2)取100mg组织，加入到匀浆管中。
3)研磨仪充分研磨直至无可见组织块，12000rpm离心10min取上清。
4)加入250μL三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
5)4℃下12000rpm离心10min。
6)将400mL上清转移到一个新的离心管中，加0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
7)-20℃放置15min。
8)4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
9)吸除液体，加入75％乙醇1.5mL洗涤沉淀。
10)4℃下12000rpm离心5min。
11)将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
12)加入15μL无RNA酶的水溶解RNA，55℃孵育5min。
13)使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μL待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
14)将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为100～500ng/μL。
2、转录(枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶)
1)逆转录反应体系配制(推荐20μL反应体系)，见表6.1。
2)轻轻混匀并离心。
3)逆转录程序设置，见表6.2。
表6.1逆转录反应体系
表6.2逆转录程序
3、定量PCR
1)取0.2mL PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
表6.3定量PCR反应体系
2)PCR扩增
表6.4PCR反应体系
4、结果处理
ΔΔCT法：
A＝CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)
B＝CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本)
K＝A-B
表达倍数＝2-K。
五、人工单侧隐睾模型睾丸组织生殖损伤的转录组学分析样本制备
为了探究隐睾组织与正常睾丸组织间的转录组差异，了解差异表达基因在功能、分类和代谢通路中的不同并研究隐睾中精子发生的机制，取大约60mg的睾丸组织样本置于空的冻存管中，立刻置于液氮中速冻，之后暂时存放在-80℃冰箱中，提取总RNA时，将适量组织加入研磨管中，然后加入1.5mLTrizol裂解液，放入TissueLyser II研磨机中，研磨30s，取出静置5min，4℃，12000g离心5min。将上清转入加有300μL氯仿/异戊醇(24:1)的EP管中，颠倒剧烈震荡混匀；4℃，12000g离心8min。将上清加入有600μL异丙醇的离心管中，颠倒混匀置于-20℃冰箱静置2h以上，4℃，17500g离心25min，弃上清，用0.9mL 75％乙醇洗涤，上下颠倒悬浮沉淀，4℃，17500g离心3min。弃上清，短暂离心后吸去残留液体，晾干3～5min，用30～200mL DEPC水溶解沉淀，检测其浓度，浓度大于40ng/μL时可进行建库测序分析。
六、人工单侧隐睾模型睾丸组织单细胞RNA测序样本制备
用于单细胞测序实验的睾丸组织样本，PBS缓冲液冲洗睾丸3次后，用无菌剪刀剪碎组织(每个组织块重量为500mg～1g)，放入组织保存液(Tissue StorageSolution，#130-100-008，Miltenyi)中，手术取样后48h内，使用组织解离试剂盒(Multi Tissue DissociationKit，#130-110-201，Miltenyi)对睾丸组织进行解离。解离时，首先离心去除组织保存液，并用DMEM/F-12(#11330032，Gibco)清洗3次，用剪刀快速将其剪成2～3mm的组织块。向gentleMACS C管中加入4.7mLDMEM、200μLEnzyme D、100μLEnzyme R和25μL EnzymeA，配置成酶解液后，加入剪碎后的组织，拧紧C管，置于组织处理器中37℃消化50min，显微镜下每5min检查一次消化进度，直到消化为单细胞悬浮液。结束后40μm过滤收集细胞悬液。清洗重悬并做裂红处理。再次清洗重悬，使用Dead Cell Removal Kit(#130-090-101，Miltenyi)去除死细胞和碎片，使用1×PBS(#70011-004，Gibco)清洗并用适量1×PBS重悬细胞，使用CellometerAuto 2000instrument(#SD-100,NexcelomBioscience)对重悬的细胞进行计数观察。最终细胞结团率小于10％且细胞活率大于80％时，准备进行单细胞RNA测序。
七、单细胞RNA测序文库构建及测序
为了最终捕获8000-10000个细胞，将总细胞量约12000个细胞的单细胞悬液加入到ChromiumTM Single Cell B芯片的一个通道(#1000073,10×Genomics)。按照TheChromium Single Cell 3'Library&Gel BeadKit v3(#1000075,10×Genomics)的说明制备测序文库，然后在IlluminaNovaseq 6000仪器上以2×150循环双端进行测序深度为4个亿读数的文库测序。
八、单细胞RNA测序数据分析
使用bcl2fastq2 tool v2.19.0.316(Illumina)对原始数据进行多路分解，以获得Fastq文件，然后使用Cell Ranger software v3.0.1(10×Genomics)进行数据对齐，再用Rpackage Seurat v3.1.3对得到的基因计数矩阵进行处理。过滤掉细胞数少于200或独特基因数多于6000的细胞，以及线粒体计数超过25％的细胞。同时，在低于3个细胞中表达的基因也被剔除掉。然后使用NormalizeData and ScaleData对数据进行归一化处理。用前2000个高变基因进行主成分(PCA)分析，并运用JackStraw程序来确定PCA成分的最佳数量。通过基于图的算法对PCA空间中的单个细胞进行聚类分析，并使用t-distributedstochastic neighbor embedding降维计数对数据进行可视化处理。使用FindAllMarkers函数识别每个簇内至少有20％的细胞表达，且最小logFC阈值为0.25的新标记基因。使用Seurat中的FindMarkers函数，将min.pct设置为0.20，将min.logfc设置为0.25，以寻找隐睾睾丸和正常睾丸之间相同细胞类型中的差异基因。
实施例1单侧隐睾食蟹猴睾丸的单细胞转录组数据分析
CST(阴囊侧睾丸)和UAT(隐睾侧睾丸)两个样本经10×Genomics平台分别获取的单细胞RNA测序数据组合后的所有细胞共有15个不同的细胞簇(图1a)。通过已知的细胞类型的特异性基因的表达来确定主要的细胞类型，其中Germ cells表达DDX4，Somatic cells表达VIM，免疫细胞表达PTPRC，内皮细胞表达PECAM1(图1b)。Pericyte cells既表达RGS5(图1c)，也表达ACTA2，ImmLeydig cells表达ACTA2(图1d),Myoid cells表达IGF2和INHBA(图1e)，免疫细胞分为两类，一类是表达CD3D的NK/T cells(图1f)，一类是表达LYZ的M/DCcells(图1g)，Leydig cells表达INSL3和STAR(图1h),Sertoli cells表达Sox9和AMH(图1i)，内皮细胞分类两类，一类是只表达VWF的VEC(图1j)，一类是共表达VWF和PROX1的LEC(图1k)，SPG被分为SPG-undiff和SPG-diff(图1l)，其中，SPG-undiff表达SOHLH1、UTF1和ID4，而MKI67仅在SPG-diff中表达。SPC表达PIWIL1和AURKA(图1m)，RS表达ACRV1和NME5(图1n)，ES表达AKAP14和TNP2(图1o)，Sperm表达CRISP2和OAZ3(图1p)。
根据前面的结果可知，隐睾睾丸中的各类生殖细胞所占的比例发生了很大的变化，调查了相比于CST，UAT中每种细胞类型的丰度。鉴定了6类生殖细胞：SPG_undiff、SPG_duff、SPC、RS、ES和SP。在CST中的相对丰度为2.6％、4.7％、20.5％、23.7％、36.0％和12.5％，在UAT中的相对丰度为7.45％、88.1％、3.5％、0、0和1.0％(图2a和2c)。采用X2检验评估两组间差异的显著性。通过使用P<0.05和Fold Change>2的标准，所有细胞类型的比例都发生了变化。为了进一步揭示6类生殖细胞之间的关系，进行了伪时间轨迹分析。使用基于转录相似性的生物学过程谱系重建算法以伪时间方式排列细胞(图2b)。发现所有的生殖细胞簇形成了一个连续的轨迹(图2b)。在轨迹上绘制了细胞增殖相关的MKI67这个标记基因(图2d)。
实施例2UAT和CST睾丸生殖细胞类型比例变化
之后的目标是发现每种细胞类型的新标记物。通过Wilcoxon rank sum test，选择了几个细胞类型中表达显著高于其他细胞类型的基因。图3的a图中显示了每个细胞类型的表达量前10的标记基因热图。选取了所有细胞类型的1～2个标记基因(图3b)。发现这些新的标记基因与典型标记基因同样适用。
从图中可以看出，DES可以作为特异性Marker去分析定义别人的睾丸组织里是否含有Myoid细胞。具体的，可以采用抗人的重组Anti-C5a/C5a des Arg抗体去检测细胞中DES的量。这里给出一种夹心ELISA实验操作步骤，操作如下：1、实验开始前，各试剂均应平衡至室温，提前配置好所有试剂。试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。如果样品浓度过高，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。2、加标准品或者待测样品100μL(样品需要稀释的，稀释方法请参照样品稀释原则)，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃孵育80分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。3、弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每孔用200μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，甩掉酶标板内的液体(或用洗板机进行洗板)。最后一次洗涤完成后，在吸水纸上将酶标板拍干。4、每孔加生物素抗体工作液100μL(可提前15分钟配制)，酶标板加上覆膜，37℃孵育50分钟。5、弃去孔内液体，洗板3次。每孔用200μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，甩掉酶标板内的液体(或用洗板机进行洗板)。最后一次洗涤完成后，在吸水纸上将酶标板拍干。6、每孔加酶结合物工作液100μL(可提前15分钟配制)，37℃孵育50分钟。7、弃去孔内液体，洗板5次。每孔用200μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，甩掉酶标板内的液体(或用洗板机进行洗板)。最后一次洗涤完成后，在吸水纸上将酶标板拍干。8、每孔加入TMB显色底物溶液90μL，37℃避光孵育20分钟(根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度蓝色时，即可终止)。9、每孔加入终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与显色剂的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，反应终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。10、立即用酶标仪在450nm波长的情况下测量各孔的光密度值(OD值)。仪器使用前应预热，并设置好检测程序。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.DES基因作为特异性标记基因在鉴别睾丸组织肌样细胞中的应用。
2.物质A在制备鉴别睾丸组织肌样细胞的功能产品中的应用，其特征在于，所述物质A用于检测细胞中DES的表达量。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述物质A为抗人的重组Anti-C5a/C5adesArg抗体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119287045A (zh) * 2024-12-16 2025-01-10 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种筛选牛睾丸不同细胞关键功能蛋白的方法及应用

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