CN116762801A - 山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用及使用方法；本发明属于畜禽繁殖技术领域，具体公开了山奈酚可以提高山羊精子与中性粒细胞发生免疫反应后的精子质量。经验证：山羊中性粒细胞能够释放典型的NETs结构捕获精子、降低精子质量，而山奈酚可以显著提高精子质量，为山奈酚用作山羊精液质量增强剂提高反刍动物配种成功率提供了实验依据。用本发明的山奈酚作为山羊精液质量增强剂来改善因生殖道炎症或损伤时大量炎性细胞浸润导致精子质量下降的现象，该增强剂应用方法简便快速，可以起到保护精子，解决因生殖道炎症或损伤引起的精子质量下降问题，该方法也可用于大规模人工繁殖和生产中。
Description
技术领域
本发明涉及山奈酚作为山羊精液质量增强剂的制备及其应用方法属于畜牧繁殖技术领域，用于山羊人工授精时能够保护精子，可减少精子被大量中性粒细胞捕获进而导致精子质量下降的现象，具体而言，涉及山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用及使用方法。
背景技术
山羊精液冷冻保存技术目前虽然已进入生产应用阶段，但冷冻精液人工授精受胎率不高仍是限制山羊冷冻精液进行生产和推广的重要因素之一。然而，在生产实践中，山羊精液常温稀释保存和鲜精人工授精技术仍广泛应用。影响山羊精液常温稀释保存效果的因素较多。稀释比例和方法直接决定了稀释后的精液质量，较差的精液质量更受生殖道免疫状态影响人工授精的成功率。目前，精液稀释液的主要成分为营养剂和保护剂，其中营养剂可以减少精子自身能量消耗以便延长精子寿命，保护剂的主要成分是电解质，发挥缓冲作用。在山羊精液常温保存过程中，往往伴随氧化应激的发生，酸性代谢产物和活性氧含量增加，导致精液保存时间和精子活力大幅下降。山奈酚是一种黄酮类中药单体，可以中和酸，具有一定的抗氧化作用。山羊的精液极易发生应激反应，精子的代谢和运动加快，消耗大量的代谢基质。山奈酚有望延长精子存活时间和提高精子的质量。母羊生殖道黏膜免疫是雌性动物与生俱来的一种抵抗异物的免疫防线。精子作为一种异物，会引起生殖道免疫反应，释放大量炎性细胞捕获、杀伤精子，进而影响精子质量，甚至降低母羊受孕率。因此，研制增强山羊精液质量的精液稀释剂，提高精子活力的同时又可以降低生殖道免疫系统对精子的损伤作用具有极其重要的意义。
发明内容
本发明提供了山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用及使用方法，具体技术方案如下：
山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用，将山羊精液用加入所述山羊精液质量增强剂的培养基稀释，所述山羊精液质量增强剂主要由山奈酚制备而成。
进一步地，所述山羊精液质量增强剂的主要配比为：将山奈酚溶于50mL培养基，所述山奈酚的添加量包括25μM、50μM、100μM中的任一一种。
进一步地，所述培养基为无酚红1640培养基。
进一步地，使用所述培养基对山羊精液进行十倍稀释。
进一步地，所述山羊精液质量增强剂的制备方法包括以下步骤：
(1)无菌条件下，将无酚红1640培养基37℃预热,0.22μm孔径无菌滤器过滤，4℃保存备用；
(2)无菌条件下，按比例将山奈酚(25μM、50μM、100μM)溶解于50mL无酚红1640培养基，充分溶解20min以上，超声混匀，0.22μm孔径无菌滤器过滤获得山羊精液质量增强剂，-20℃避光保存备用。
进一步地，所述山羊精液质量增强剂的制备方法还包括以下步骤：
使用时，将所述步骤(2)的贮液放于室温化冻后，与山羊精液混合均匀。
进一步地，所述步骤(2)解冻后保存温度为2-5℃。
进一步地，所述步骤(2)保存期限为3-5周。
进一步地，所述步骤(2)中的山羊精液质量增强剂的保存方式替换为2-5℃保存。
本技术方案还提供了山奈酚作为山羊精液质量增强剂使用方法，所述使用方法为将山羊精液质量增强剂预热至35-37℃，再与山羊精液进行混合使用。
本发明的有益效果是:本发明是山奈酚可提高精子活力的同时又可以降低生殖道免疫系统对精子的损伤，所述精液质量增强剂包含山奈酚，能作为抗氧化物质或质膜保护剂，维持精液中抗氧化剂的储备，提高精液抗应激反应能力，清除精液在应激环境条件下生成的ROS，同时还可以降低生殖道免疫系统对精子的损伤，进而延长山羊精子在生殖道的存活时间。本发明的山羊精液质量增强剂能更好提高精液质量，提高精子活力的效果。
附图说明
图1是本发明的cck-8细胞活力检测的结果图表；
图2是本发明的NETs的结构分析图；
图3是本发明的定量分析NETs的释放水平的测试结果图表；
图4是本发明的ROS检测的测试结果图表；
图5是本发明的精子顶体完整性检测试验的测试结果图表；
图6是本发明的精子质膜完整性测定的测试结果图表；
图7是本发明的精子活率和活力检测的测试结果图表；
图8是本发明的抗氧化酶检测的测试结果图表。
具体实施方式
为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明一实施例中的山奈酚作为山羊精液质量增强剂的功效应用，将山羊精液用加入所述山羊精液质量增强剂的培养基稀释，所述山羊精液质量增强剂的主要配比为：将山奈酚(25μM、50μM、100μM)溶于50mL培养基，用该培养基对精液进行十倍稀释。
所述山羊精液质量增强剂的制备方法，所述方法包括以下步骤:
(1)无菌条件下，将无酚红1640培养基37℃预热,0.22μm孔径无菌滤器过滤，4℃保存备用；
(2)无菌条件下，按比例准确将山奈酚(25μM、50μM、100μM)溶解于50mL无酚红1640培养基，充分溶解20min以上，超声混匀，0.22μm孔径无菌滤器过滤获得山羊精液质量增强剂，-20℃避光保存备用；
(3)使用时，将步骤(2)的贮液放于室温化冻后，与山羊精液混合均匀。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)解冻后保存温度为2-5℃。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)保存期限为3-5周。
在其中一个实施例中，步骤(2)所述山羊精液质量增强剂2-5℃保存。
在其中一个实施例中，所述山羊精液质量增强剂的使用方法:将山羊精液质量增强剂预热至35-37℃，再与山羊精液进行混合。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
本实施例所采用的药品和试剂分别为：羊中性粒细胞分离试剂盒：天津灏洋；山奈酚：索莱宝，货号：SK8030，基础液：索莱宝，货号：90022；CCK-8试剂盒：碧云天，货号：C0017；抗组蛋白一抗：Life Span BioSciences，货号：LS-C353149；抗髓过氧化物酶一抗：Biorbyt，货号：Orb16003；FITC标记羊抗兔二抗：SytoxOrange：Thermo；货号：C10493；PicoGreen dsDNA：Thermo，货号：P11495。
3只山羊(40-50kg，雌性，未孕)用作供血动物，安置于适宜环境正常饲喂，适应环境3天，颈静脉采血，分离中性粒细胞；商品化销售的山羊冻精用作刺激物。
1.cck-8细胞活力检测
将提取到的中性粒细胞以2×10^5个/孔接种到96孔板中，贴壁30min，再将添加了山奈酚(25μM、50μM、100μM)的精液质量增强剂100μL/孔加入到含有中性粒细胞的96孔板中，在37°条件下孵育90min。同时用添加了山奈酚(25μM、50μM、100μM)的精液质量增强剂稀释精子(2×10^5个/孔)，按照中性粒细胞/精子(1：1)比例，以100μL/孔加入到另一组含有中性粒细胞的96孔板中，在37°条件下孵育90min，每100μL的孵育液中加入10μL CCK-8溶液，根据cck-8试剂盒说明书对孵育液进行测定。
由图1可知：以中性粒细胞作为对照组，添加了山奈酚(25μM、50μM、100μM)的山羊中性粒细胞组细胞活力随着浓度逐渐上升(P值代表概率，P值<0.05代表有统计学差异，说明细胞活力变化显著。0.01<*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，说明山奈酚可以提高中性粒细胞活力。以中性粒细胞和精子共孵育组作为对照组，添加了山奈酚(50μM、100μM)的山羊精子和山羊中性粒细胞的共同孵育组细胞活力随着浓度逐渐上升，说明山奈酚可以提高精子和中性粒细胞总体活力，并不会对精子和中性粒细胞有毒性作用。
2.NETs的结构分析
无酚红1640培养基重悬中性粒细胞，将干净的爬片放入24孔板中，2×10^5个/孔接种于爬片上，温箱贴壁孵育30min。空白组(PMN)加无酚红1640培养基，刺激组(Sperm+PMN)按照中性粒细胞/精子(1：1)比例加入精液，酵母聚糖(Zymason)组加入1mg/mL酵母聚糖(酵母聚糖可作为标准的阳性对照物)。山奈酚(50μM)组加入按照中性粒细胞/精子(1：1)比例的精液质量增强剂(50μM山奈酚)稀释的精液，共孵育90min。之后加4％多聚甲醛固定20min，再用PBS清洗爬片，再加1％的曲达通透化20min，再用PBS清洗后加3％的山羊血清封闭2小时，封闭一抗(MPO和组蛋白)，4℃过夜孵育。孵育相应二抗；Sytox Orange室温25℃孵育10min；甘油封片。采用激光共聚焦(Olympus FluoView FV1000)观察样品并采集图像，如图2所示，图中：箭头指示为形成的NETs；Optical image为光学图像；H3表示组蛋白3(citH3)；NE表示中性粒细胞弹性蛋白酶。Zymason表示酵母聚糖，可作为一种标准的阳性刺激物。DNA为脱氧核糖核酸；Merge为合成图像；PMN为中性粒细胞；PMN+Sperm为中性粒细胞+精子；PMN+Zymason为酵母聚糖组；PMN+Sperm+kaempferol为山奈酚组。
由图2关于组蛋白citH3、NE与DNA骨架共定位于NETs结构所示，捕获精子的NETs具有典型胞外诱捕网的结构特征，主要由组蛋白、NE与DNA骨架构成，同时也进一步证实山羊中性粒细胞能够释放NETs捕获精(如图2白色箭头所示)。并且山奈酚可以在一定程度上减少精子诱导中性粒细胞产生的NETs。
3.定量分析NETs的释放水平
Sperm组为单独的精子组。将提取到的中性粒细胞以2×10^5个/孔接种到96孔板中，贴壁30min，加入山奈酚(25μM、50μM、100μM)预处理30分钟，再将用添加了山奈酚(25μM、50μM、100μM)的精液质量增强剂加入到含有中性粒细胞的96孔板中，在37°条件下孵育90min。同时用添加了山奈酚(25μM、50μM、100μM)的精液质量增强剂稀释精子(2×10^5个/孔)，按照中性粒细胞/精子(1：1)比例加入到另一组含有中性粒细胞的96孔板中，在37°条件下孵育90min。用排枪将中性粒细胞与精子的悬液混匀，抽50μL悬液移入新的96孔板，再加入50μL用1×TE稀释1000倍的PicoGreen细胞膜不透性染料，在37°条件下孵育30min，PicoGreen细胞膜不透性染料可与胞外dsDNA结合。在发射波长为535nm，激发波长为485nm的情况下，可以使用荧光板读取器测量样品。采用PicoGreen dsDNA试剂盒和荧光酶标仪定量分析NETs的释放水平，其结果如图3所示，横坐标为不同处理组；纵坐标为荧光强度。
由图3可知：Sperm+PMN组与单独Sperm组和PMN组相比，明显看出山羊精子诱导了NETs的释放；而山奈酚组与Sperm+PMN组相比，则显著降低精子诱导NETs的释放水平，且都具有显著性意义；Zymason组作为阳性对照，可以显著诱导NETs的释放。以上结果证实山奈酚可降低精子刺激山羊中性粒细胞产生的胞外诱捕网水平。
4.ROS检测
ROS测定用2,7二氯氟树脂双乙酸盐(DCFH-DA)法来检测。将提取中性粒细胞以2×10^5个/孔接种到96孔板中，贴壁30min，加入山奈酚(25μM、50μM、100μM)预处理30分钟，再将用添加了山奈酚(25μM、50μM、100μM)的精液质量增强剂加入到含有中性粒细胞的96孔板中，在37°条件下孵育90min。再加入探针温箱孵育30min。之后用无酚红1640洗涤3次,最后200μL检测。其检测结果如图4所示。
由图4可知：以中性粒细胞作为对照组，山羊精子与母山羊中性粒细胞的共同孵育组作为模型组，Zymason作为阳性对照组，山奈酚处理作为中药处理组。通过用2,7二氯氟树脂双乙酸盐(DCFH-DA)法来检测ROS，结果显示模型组和阳性对照组均能提高ROS含量(P<0.001)，而山奈酚处理则呈现下降趋势，与精子刺激组对比呈现明显显著性(P<0.001)(P值代表概率，P值<0.05代表有统计学差异，说明细胞活力变化显著。0.01<*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
5.精子顶体完整性检测试验
利用姬姆萨染色检测顶体完整率，将提取到的中性粒细胞以2×10^5个/孔接种到96孔板中，贴壁30min，加入山奈酚(25μM、50μM、100μM)预处理30分钟，再将用添加了山奈酚(25μM、50μM、100μM)的精液质量增强剂稀释精子(2×10^5个/孔)，按照中性粒细胞/精子(1：1)比例加入到另一组含有中性粒细胞的96孔板中，在37°条件下孵育90min。首先取孵育1h后的精液中层10μL，滴于载玻片一端，放置于水平桌面，用另一张载玻片进行推片，制作精液涂片。将涂好的玻片置于甲醛溶液中固定30min后，用蒸馏水冲洗掉多余的甲醛溶液，然后自然风干。将玻片浸泡于姬姆萨染液中染色2h，再次洗去姬姆萨浮色，将玻片自然风干。最后在显微镜下镜检(200x)，计算其顶体完整率(重复3次，每次至少200个精子)，顶体完整呈现完整帽状结构，顶体破损或顶体脱落的精子呈现不完整帽状结构。精子顶体完整率＝顶体完整精子数/精子总数x100％。其检测结果如图5所示。
由图5可知：顶体完整性结果显示，山奈酚(25μM)处理组高于对照组(P<0.05)，而山奈酚(50μM、100μM)处理组与对照组相比也具有显著性(P<0.01)。说明山奈酚可以提高精子顶体完整性。
6.精子质膜完整性测定
质膜完整的精子在低渗溶液中孵育30min后，精子尾部由于低渗肿胀会发生弯曲，根据这一原理来检测精子的质膜完整性。精子的弯尾率＝弯尾的精子数/计数精子总数×100％，精子的尾部弯尾率即为精子质膜的完整率。将0.49g柠檬酸钠、0.9g果糖，溶于100mL双蒸水中，配置成低渗液。在预先配好的低渗溶液中取1mL于离心管中，将离心管置于37℃的恒温水浴锅中预热5min；取100μL精液于低渗溶液中，轻轻晃动使其混合均匀；将加有精液的低渗溶液置于37℃恒温水浴锅中孵育30min；用移液枪吸取10μL精液样品于载波片上，盖上盖玻片，放置到37℃恒温载物台上；使用相差显微镜在400×观察5个视野，观察弯尾的精子并计算弯尾率。其检测结果如图6所示。
由图6可知：顶体完整性结果显示，山奈酚(25、50、100μM)处理组高于对照组(P<0.05)。说明山奈酚可以提高精子顶体完整性。
7.精子活率和活力检测
首先将精子从液氮中取出，在37°水浴锅快速解冻，然后将稀释好的精液以2×10^5个/mL放置于灭菌的EP管中并在37°平衡10分钟。将提取的母山羊中性粒细胞接种在24孔板中孵育30分钟，加入山奈酚(25μM、50μM、100μM)预处理30分钟，弃液后加入用精液质量增强剂稀释好的精液(中性粒细胞：精子＝1：1)，在37°恒温箱中孵育1h、1.5h、3h、6h，分别测定精子活率。精子活率＝精子存活数/计数的精子总数×100％。精子活力＝精子直线运动数/计数的精子总数×100％。用移液枪吸取精液10μL于载玻片上，盖上盖玻片，在相差显微镜下观察5个不同的视野，每个视野至少统计200个精子，观察精子的形态。其检测结果如图7所示，图中：横坐标为孵育时间；纵坐标为精子活率以及精子直线运动率。
由图7A可知：精子活率随着时间推移逐渐减低；单独精子组以及精子和中性粒细胞组相比，可以明显看出中性粒细胞降低了精子存活率。同时，加入山奈酚的精液质量增强剂的组别的精子存活率均比单独精子组以及精子和中性粒细胞组高，且山奈酚(50μM)处理下的精子在1.5h、3h、6h的精子活率最高，以上结果证实山奈酚可以提高在中性粒细胞处理下的精子活的存活率。
由图7B可知：精子活力最直接的体现是精子直线运动率；单独精子组以及精子和中性粒细胞组相比，可以明显看出中性粒细胞降低了精子直线运动率。同时，加入山奈酚的精液质量增强剂的组别的精子直线运动率均比单独精子组以及精子和中性粒细胞组高，且山奈酚(50μM)处理下的精子在1.5h、3h、6h的精子直线运动率最高，以上结果证实山奈酚可以提高在中性粒细胞处理下的精子活力。
8.抗氧化酶检测
将提取到的中性粒细胞以2×10^5个/孔接种到96孔板中，贴壁25min，加入山奈酚(25μM、50μM、100μM)预处理30分钟，再将用添加了山奈酚(25、50、100μM)的精液质量增强剂稀释精子(2×10^5个/孔)，按照中性粒细胞/精子(1：1)比例加入到含有中性粒细胞的96孔板中，在37°条件下孵育90min。之后将孵育液以及细胞移至新的1.5mL灭菌后的EP管中，25℃以1600×g离心5min，保留沉淀部分。在样品沉淀中加入1％TritonX-100的400μL，裂解细胞20min，提取抗氧化酶。溶解物在25℃以10000×g离心10min，保留上清液，并按照CAT、GSH、MDA测定试剂盒上说明书对上清液进行测定。
由图8可知：以中性粒细胞作为对照组，山羊精子与母山羊中性粒细胞的共同孵育组作为模型组，精液质量增强剂处理的组别作为处理组。图8A结果显示模型组的细胞胞内CAT相比于对照组含量明显升高，而且中药处理组山奈酚(50μM)细胞的胞内CAT含量也显著提高，说明过氧化氢分解能力得到提高。图8B结果显示处理组中的GSH水平明显比模型组和对照组水平高。图8C结果显示，相比于模型组，处理组明显降低了MDA水平。说明山奈酚可以提高精子的抗氧化能力，并可以保护细胞膜。以上结果证实在中性粒细胞明显降低精子的抗氧化能力，而山奈酚可以提高精子的抗氧化能力。
本实施例的实验结果表明，山羊中性粒细胞能够释放典型的NETs结构捕获精子，同时山奈酚可以极显著的降解捕获山羊精子的NETs结构，说明山奈酚具有降解捕获山羊精子的NETs的应用效果，且浓度为50μM的山奈酚能够极显著降解精子诱导NETs的释放，也进一步证实了山奈酚可应用于提高精液质量的稀释药物中，用于提高反刍动物配种成功率。
本发明通过对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)捕获精子的免疫荧光显微镜观察、NETs释放水平的定量以及抗氧化酶的检测，以研究山奈酚可否在山羊生殖道发生炎症或损伤时能够起到保护精子、提高精子质量的效果。经验证：山羊中性粒细胞能够释放典型的NETs结构捕获精子、降低精子质量，而山奈酚可以显著提高精子质量，为山奈酚用作山羊精液质量增强剂提高反刍动物配种成功率提供了实验依据。用本发明的山奈酚作为山羊精液质量增强剂来改善因生殖道炎症或损伤时大量炎性细胞浸润导致精子质量下降的现象，该增强剂应用方法简便快速，可以起到保护精子，解决因生殖道炎症或损伤引起的精子质量下降问题，该方法也可用于大规模人工繁殖和生产中。
显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用，其特征在于，将山羊精液用加入所述山羊精液质量增强剂的培养基稀释，所述山羊精液质量增强剂主要由山奈酚制备而成。
2.根据权利要求1所述的山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用，其特征在于，所述山羊精液质量增强剂的主要配比为：将山奈酚溶于50mL培养基，所述山奈酚的添加量包括25μM、50μM、100μM中的任一一种。
3.根据权利要求1或2所述的山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用，其特征在于，所述培养基为无酚红1640培养基。
4.根据权利要求1或2所述的山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用，其特征在于，使用所述培养基对山羊精液进行十倍稀释。
5.根据权利要求1所述的山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用，其特征在于，所述山羊精液质量增强剂的制备方法包括以下步骤：
(1)无菌条件下，将无酚红1640培养基37℃预热,0.22μm孔径无菌滤器过滤，4℃保存备用；
(2)无菌条件下，按比例将山奈酚(25μM、50μM、100μM)溶解于50mL无酚红1640培养基，充分溶解20min以上，超声混匀，0.22μm孔径无菌滤器过滤获得山羊精液质量增强剂，-20℃避光保存备用。
6.根据权利要求5所述的山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用，其特征在于，所述山羊精液质量增强剂的制备方法还包括以下步骤：
使用时，将所述步骤(2)的贮液放于室温化冻后，与山羊精液混合均匀。
7.根据权利要求5所述的山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用，其特征在于，所述步骤(2)解冻后保存温度为2-5℃。
8.根据权利要求5所述的山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用，其特征在于，所述步骤(2)保存期限为3-5周。
9.根据权利要求5所述的山奈酚作为山羊精液质量增强剂的应用，其特征在于，所述步骤(2)中的山羊精液质量增强剂的保存方式替换为2-5℃保存。
10.山奈酚作为山羊精液质量增强剂使用方法，其特征在于，所述使用方法为将山羊精液质量增强剂预热至35-37℃，再与山羊精液进行混合使用。
Priority Applications (1)
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